JPH06510433A - Ｄｎａサイクル配列決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡサイクル配列決定法 発明の背景 本発明は、１９９１年９月２７日出願の米国特許出願筒０７／７６７．１３７号 の一部継続出願であって、出典明示によりこれを本明細書の一部とする。

本発明は、チェイン・ターミネーション（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ）配列決定法を行っている間に、鎖伸長しているＤＮＡ分子中に標識されたヌク レオチドを取り込ませるＤＮＡ配列決定法に関する。

ＤＮＡ分子中のヌクレオチド塩基の配列は種々の方法で決定される。一般的には 、チェイン・ターミネーション法は、鋳型鎖の一部にハイブリダイズ可能なプラ イマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させることにより、配列決定すべき鋳型 差に相補的なりＮＡを合成することを包含する。合成反応の間、例えば、ジデオ キシヌクレオチド三りん酸（ｄｄＮＴＰ）が取り込まれるまで、デオキシヌクレ オノド三りん酸（ｄＮＴＰ）を取り込んでＤＮＡ断片が形成される。ｄｄＮＴＰ の取り込みは、さらなるＤＮＡ合成を妨げる（チェイン・ターミネーションと呼 ばれる方法）。ついで、この方法で合成された各ＤＮＡ断片の大きさをゲル電気 泳動により測定し、この情報を用いて元の鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定 する。例えば、タボ−（Ｔａｂｏｒ）およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｏｎ）の米国特許第４．７９５．６９９号には、標識段階において標識されてい ないプライマーを標識し、ついで、鎖伸長終結段階において、過剰のｄＮＴＰお よび１種のｄｄＮＴＰの存在下で伸長を行う２段階配列決定法が記載されている 。標識段階において、低濃度のｄＮＴＰ　（うち１種が標識されている）を供給 して少量のプライマー伸長を行う。

ジデオキシ法において、ポリヌクレオチドキナーゼを用いた方法により、例えば Ｕｐでプライマーを標識してもよい。かかる標識は、ゲル電気泳動後得られたゲ ルのオートラジオグラフィーによる伸長したプライマーの検出を可能にする。

別法として、ＤＮＡ合成の途中で標識ｄＮＴＰを取り込ませ、がかる標識ｄＮＴ Ｐの存在を、オートラジオグラフィーまたは他の方法により検出てもよい。この 目的のために、３２ｐまたは３ｓＳのいずれかでｄＮＴＰを放射性標識してもよ い。

別の方法として、プライマーを１種またはそれ以上の蛍光検出用の蛍光性残基で 標識してもよい。さらに別法として、ｄｄＮＴＰを、例えば蛍光マーカーで標識 してもよい。

これらの方法の例は、以下の出版物に記載されており、いずれも本発明の先行技 術でない。

マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）　、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ）第１７巻８８８９頁（１９８９年）には、３ｔ ｐ−標識プライマーの使用が記載されている。ポリヌクレオチドキナーゼおよび ガンマ−５ｚｐ標識ＡＴＰを用いてプライマーを標識する。

ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびオチマン（Ｏｃｈ＋＊ａｎ）　、　ヌクレイツ ク・アシッド・リサーチ第１７巻５８６５頁（１９８９年）にはポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）により生成したＤＮＡ断片の配列決定用のためのキナーゼ−標 識プライマーの使用が記載されている。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸 長される２つのプライマーを使用して所望の核酸に相補的なりＮＡ断片のペアー を生じるようにすることにより、所望の核酸を増幅する方法である。このプロセ スを１５〜３０回繰り返す。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、プ ライマー伸長に適した温度（７０〜７５℃）に反応温度を維持し、ついで変性に 適した温度（９０〜１００℃）に維持することによりＤＮＡ断片を分離し、次の サイクルのための鋳型を供給し、ついでアニーリングに適した温度（４２〜５５ ℃）に維持して鋳型にプライマーを結合させることにより、該プロセスを最も有 効に行える。

ストラウス（Ｓｔｒａｕｓ）およびザグルスキ−（Ｚａｇｕｒｓｋｙ）　、バイ オテクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）第１０巻３７６頁（１９９１年 ）には、配列決定反応中におけるα−”ＰｄＡＴＰの使用が記載されている。

スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、バイオテクエックス第９巻５２頁（１９９０年）およ びアダムスーブレイクスリー（Ａｄａｍｓ−Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ）　、フォーカ ス（Ｆｏｃｕｓ）第１３巻５６頁（４９９１年）には、標識したプライマーを用 いたＰＣＲ生成物の配列決定が記載されている。

クリノユナン（Ｋｈｒｉｓｈｎａｎ）ら、ヌクレイツク・アノラド・リサーチ第 １９巻１１５３頁（１９９１年）には、ラムダＤＮＡの配列決定のための標識プ ライマーの使用が記載されている。チェイン・ターミネーション法を数回繰り返 して（サイクル化して）多数の生成物を生成させる。反応を４２〜５５℃で進行 させ、ついで９５℃で停止し、そして再び４２〜５５℃にするため（該方法を熱 サイクル配列決定法という）、このサイクルはＰＣＲと同様である。一旦プロセ スが始まると、新たな試薬を添加する必要がない。該サイクル化により、鎖伸長 終結段階において大部分の標識プライマーが確実に伸長される。

スバーノオン（Ｓｐｕｒｇｅｏｎ）およびバーテ（Ｂｕｒｋｅ）　、アブストラ クト（＾ｂｓｔｒａｃｔ）　１２５頁、ヒユーマン・ゲノム−ＩＩ　（Ｈｕｍａ ｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　ＩＩ）　（１９９０年１０月２２日付）には、末端が標識さ れたプライマーまたは標識されていないプライマーを用いる熱サイクル配列決定 用の修飾ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの使用が記載されている。蛍光標識ｄｄＮＴ Ｐおよび放射性標識手法も用いられている。

ミード（Ｍｅａｄ）ら、アブストラクトＮｏ、　９９．　ヒユーマン・ゲノム・ ＩＩ（１９９０年１０月２２日付）には、放射性同位元素および蛍光性標識を用 いたポリメラーゼ連鎖反応による反応におけるラムダＤＮＡの配列決定が記載さ れている。

発明の概要 本発明は、繰り返して行う標識反応において標識していないプライマーを伸長さ せる新規なりＮＡ配列決定法に関する。かかる方法は、ｓｘｐ末端標識プライマ ー（ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−”ＰＡＴＰを用いて調製する）を用い る先行技術よりも有利である。なぜなら、通常の配列決定用試薬以外の試薬（例 えばポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３２ＰＡＴＰ）を必要とせず、標識プ ライマーを調製するプロセスが不要で、該方法に用いる器具は熱サイクル配列決 定法に用いるのと同じであり、これらの２方法を都合よく一緒に用いることがで きるからである。この方法は、ポリヌクレオチドキナーゼといっしょには使用で きない標識物（例えばα−３５ＳｄＮＴＰ、蛍光ヌクレオチドおよびビオチンの ごとき他の有用な残基で標識したヌクレオチド）を用いることができる。

本発明の特徴は、少な（とも１種の標識ヌクレオチドをサイクル化した標識段階 に用いることである。一般的には、サイクル化した鎖伸長終結段階に続いてこの 段階を行う。プライマーからのＤＮＡ合成の繰り返しサイクル化により、配列決 定に用いる鋳型ＤＮＡ分子以外の多くの新たに合成されたＤＮＡ分子が生成する 。したがって、単一ラウンドのみの複製的合成を行う場合には通常量の鋳型（０ ，５〜１．Ｏｐｍｏｌ）を用いる配列決定が可能であるが、サイクル化した段階 を行わずにより少量の鋳型ＤＮＡ　（例えば０．０５ｐｍｏｌ）を用いて配列決 定するのは困難である。限定量の鋳型を用いる標識段階の繰り返しサイクル化に より、−晩露出するオートラジオグラフィーのごとき通常の検出方法にとり十分 なレベルにまで生成物量が増加する。

本発明方法において、配列決定反応に必要な４種のｄＮＴＰのうち多くとも３種 が標識段階に存在し、それらのうち１種またはそれ以上が標識される。このこと によりプライマーが有効に標識され、既知の長さくすなわち、存在していないｄ ＮＴＰがさらなる合成に必要とされる長さ）までに伸長が制限される。本発明方 法において、鎖伸長に適する温度および伸長したプライマーと鋳型分子を変性さ せるのに適した温度の間で反応をサイクル化（通常、１０ないし１００回を１時 間および１時間半ないし６時間かけて）する。この標識段階後、通常は、反応物 を４部に分け、適当な鎖伸長終結混合物（存在していなかったｄＮＴＰを含んで いる）を反応混合物に供給して、プライマー伸長および変性に適する温度にて１ ０および２００回の範囲で繰返し反応を行う。この段階において、さらなるＤＮ Ａポリメラーゼを必要とせず、反応は１．５ないし１６時間のうちに終了しうる 。

本発明方法は、放射性標１！　（３５Ｓ）物質に関して１８ないし３６時間の露 出で０．０１マイクログラム（０，００５ピコモル）程度のＭ１３ＤＮＡの配列 決定を可能にする。２本鎖プラスミドについては、前以てアルカリでプラスミド ＤＮＡを変性させなくても、０．０３マイクログラム（０，０１５ピコモル）程 度から情報が得られる。さらに、さらにプラークを成長させなくても、単にプラ ークを反応容器に入れ、適当な試薬を添加することにより、単一のＭ１３プラー クから直接信頼できるデータを得ることができる。さらに、ｆ１複製開始点を有 するプラスミド（例えばｐＴＺ１８ＲまたはｐＵｃ１１８）を含んでいる細菌（ ヘルパーファージＭ１３　ＫＯ７に感染している）の単一コロニーから、あるい はへルバーファージに感染していない細菌のプラスミドからさえも配列を得るこ とができる。

本発明によれば、少量の鋳型の配列決定が可能であるため、クローンを成育させ て、そこからＤＮＡを精製する必要がな（、鋳型ＤＮＡ以外の不純物が配列決定 反応物中に混入する機会が少なくなる。さらに、本発明方法によりＤＮＡを有効 に末端標識するため、バンド強度の変化がほとんどなく、配列決定用ゲルにおい て下部に近いほどバンドが薄くなる傾向もない。

そのうえ、本発明にればり、前以てアルカリ処理しな（でも、プラスミドおよび 他の２本鎖ＤＮＡ鋳型の配列決定ができる。これらの変性方法は冗長で、熟達し た者でも変性および次の沈殿作業に１時間またはそれ以上かかる。よって、本発 明によれば、現有器具を用い、請求の範囲記載のＤＮＡ配列決定反応を行うのに 必要な方法のために僅かな変更を加えてＤＮＡ配列決定を行うことができる。

したがって、本発明は、１番目の態様において、配列決定すべきＤＮＡの領域に 相補的なポリヌクレオチドブライマーを提供し、配列決定すべきＤＮＡを提供し 、ＤＮＡポリメラーゼおよび１種ないし３種の間のｄＮＴＰ　（少なくとも該ｄ ＮＴＰのうち１種は標識されている）の存在下でプライマーとＤＮＡとを接触さ せる段階からなるＤＮＡ配列決定法を提供する。プライマーの３°−末端に１種 またはそれ以上のｄＮＴＰを添加することによりプライマーを伸長させる条件下 で、プライマーおよびＤＮＡを接触させる。ついで、一般的には加熱によりプラ イマーとＤＮＡを解離または分離させ、接触および分離段階を複数回（通常は１ ０〜２００回）繰り返す。最終的に、ＤＮＡポリメラーゼ（通常は、最初の標識 化段階に用いたのと同じもの）、４種すべてのｄＮＴＰ、および鎖伸長終結試薬 の存在下で、伸長したプライマーをＤＮＡと接触させる。

好ましい具体例において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ 例えば５゛−３°エキソヌクレアーゼ活性のないＴａｑポリメラーゼ形態）、Ｔ ７　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼの低エキソヌクレアーゼ活性の形態、フレノウ（Ｈ ｅｎｏｖ）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｂｓ　ｔ％ＴｔｈまたはＶｅｎｔ　ＤＮＡポリ メラーゼ、あるいはかかるポリメラーゼのエキソヌクレアーゼのない形態である 。ｄＮＴＰは、３５Ｓまたは蛍光、化学発光あるいは他の標識（例えば、ビオチ ンのごとき間接的酵素結合アッセイによりリガンドとして検出されるような標識 ）で標識されたものである。鎖伸長終結試薬の存在下における最終的な接触段階 に続いて、伸長したプライマーをＤＮＡから分離する段階を行う。そして、３゛ 末端でジデオキシヌクレオチドにより鎖伸長終結した標識伸長プライマー（約０ ．１〜１．０ピコモル、好ましくは０．５ピコモル）が得られるまで、これら２ つの段階を複数回繰り返す。

他の好ましい具体例において、該方法を用いて、精製Ｍ１３　ＤＮＡ（１本鎖、 ＳＳ）、精製プラスミドＤＮＡ　（２本鎖、ｄｓ）、精製ラムダＤＮＡ（ｄｓ） 、 プラークまたは液体培養からのＭ１３　ＤＮＡ　（ｓ　ｓ）、コロニーまたは液 体培養からのプラスミドＤＮＡ　（ｄｓ）コロニーからのｆ１複製開始点を有す るプラスミド、好ましくはヘルパーファージに感染している細菌のもの（Ｓ　Ｓ ）、例えばゲル精製されたＰＣＲ生成物（ｄｓ）、ｗ／ＥｘｏＩおよびアルカリ ホスファターゼ処理されたＰＣＲ生成物（ｄｓ）、アルカリホスファターゼ処理 された非対称ＰＣＲ生成物（Ｓ　Ｓ）、精製コスミドＤＮＡ、および 例えば酵母または細菌のゲノムあるいは他のＤＮＡファージ由来のＤＮＡの配列 決定を行う。

本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい具体例および請求の範囲の記載 から明らかであろう。

好ましい具体例の説明 まず、図面について簡単に説明する。

図面 図１は、本発明のＤＮＡ配列決定法を模式的に示したものである。

図２〜７は、下に記載した種々の条件を用いたＤＮＡ配列決定実験により得られ たオートラジオグラムのコピーである。

図８は、アプライド・バイオンステムダ（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ Ｉｓ）社の装置による、配列決定実験の結果を示すデータである。

次に、本発明の方法の実施例を示す。これらの実施例は、本発明を限定するもの ではなく、当業者は、反応に用いられる成分を当該分野で知られた他の同等物に 置き換えることができることを認識するであろう。

方法 図１のごと（、本発明方法の最初の段階は、鋳型の配列（一般的にはベクターの 配列）を調べ、プライマーおよび標識ヌクレオチドの組み合わせを選択すること である。当該分野で知られた標準的な判断基準によりプライマーを選択して対象 とする配列の近傍においてＤＮＡ合成を開始する。プライマーは、典型的には、 長さが１６〜２５塩基のオリゴヌクレオチドである。

３種のヌクレオチドの混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの ４種のうちの）を以下のように選択するニプライマーの３′末端より下流にｄＡ ＭＰが取り込まれる最初の場所があること。同様に、ｄＧＭＰＳｄＣＭＰおよび ｄＴＴＰの最初の取り込み部位が見いだされること。これらの部位のうちの１つ は他のすべてのものよりもプライマーから遠く離れていること。この部位に必要 なヌクレオチドをプロトコールの標識化のところで除く（図１ではｄＣＴＰ）。

残存する３種のヌクレオチドのうちの１種またはそれ以上を標識する（例えばα −ｓ！Ｐ、α−５ｓＳまたは蛍光性分子で）。除いたヌクレオチドにより伸長が 停止する点で伸長が終結する前に、少な（とも２個のの標識ヌクレオチドが取り 込まれるように組み合わせを選択する。図１において、ｄＣＭＰが必要とされる 最初の部位の前に、４個のｄＡＭＰヌクレオチドが取り込まれている。したがっ て、標識ｄＡＴＰは、この実験にとり良い選択である。

プライマーおよびヌクレオチド混合物の適当な選択は、通常は難しいものではな い。しかしながら、最もうまく配列を標識できるようにベクターを特別に作るこ とができる。必要ならば、どのｄＮＴＰを標識混合物がら除外するかを、ランニ ングテスト標識により経験的に決定することができる。

実施例１．精製Ｍ１３　ＤＮＡまたは精製プラスミドＤＮＡの配列決定以下の成 分（０，Ｏ０５ｐｍｏｌまたはそれ以上のＭｌ３　ＤＮＡ（例えばＭｌ　３ｍｐ 　１８を０．０１μｇ）または０．０３μｇの２本鎖プラスミドＤＮＡ　（例え ばｐＵｃ１９）＋２μｌのΔＴＡＱ反応用緩衝液（オハイオ州クリーブランドの ユナイティッド・スティッ・バイオケミカル・コーポレーション（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社製、２６ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９，５，６５ｍＭ　ＭｇＣｈ）；Ｉμｌの３． ＯμＭ　ｄＧＴＰ：１μ＋の３．０μＭ　ｄＴＴＰ；０．５μｍ　（５μＣｉ） の［α−”Ｓｌ　ｄＡＴＰ　（約１２００Ｃ４／ｍｍｏｌ）；１μｍの塩基４０ 個以内のプライマー（０，５μＭ；０．５ｐｍｏｌ／μｍの５°−ＧＴＴＴＴＣ ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）；　２ａＮＯΔＴＡＱ　ＤＮＡポリメラーゼ（ ３２Ｕ／μｌ）（オハイオ州クリーブランドのユナイティッド・スティッ・バイ オケミカル・コーポレーションから入手、２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ８， ５）中、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５９ｆｉ　ＮＰ−４０，０，５％　ＴＷＥＥＮ−２０およ び５０％グリセロールを含有、これを希釈用緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ Ｉ。

ｐＨ８，Ｑ、１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．５％　ＴＷＥＥＮ−２０ ゜０．５％　ＮＰ−４０含有）で８倍に希釈したもの）：および水を総体積１７ ．５μｌとして、サーモサイクラ−（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌａｒ）装置（例えば パーキン−エルマー　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社のＤＮＡ−サーマル・サ イクラ−（ＤＮＡ　Ｔｈｅｒ＋ｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）　）に挿入された微小遠 心バイアル（０，４ｍｌ容）に添加した。

これらの成分を混合し、１０μｌの軽鉱物油（ユナイティッド・スティッ・バイ オケミカル・コーポレーション社製）を重層した。バイアルをサーモサイクラ− に置き、４５℃１分から７０℃０．５分のサイクルを３０〜１００回（６０サイ クル以上は必要ない）を行った。所望ならば、５５〜７０℃からサイクルさせる かまたは６２℃に維持する（プライマーおよび配列決定すべき鋳型の融点による ）。かかる等温標識は可能であるが、終了までに長時間を要する（サイクル温度 により約４〜６時間）。プライマー／鋳型の融点温度が有意に高いかまたは低い 場合には、これらの温度がプライマー／鋳型にとり最適である。７０℃の代わり に９５℃を用いて同じ結果を得ることができる。この段階は、サイクル当たり３ 分で終了する。

４本のバイアルにＡ、Ｃ，ＧおよびＴのラベルを貼り、対応する４μｌのΔＴＡ Ｑ鎖伸長終結混合物、すなわちｄｄＡ鎖伸長終結混合物（各１５μＭのｄＡＴＰ 、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび３００μＭのｄｄＡＴＰ）＋ｄｄＴ鎖伸 長終結混合物（各１５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび４ ５０μＭのｄｄＴＴＰ）；ｄｄＣ鎖伸長終結混合物（各１５μＭのｄＡＴＰ、ｄ ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび２２５μＭのｄｄＣＴＰ）：ｄｄＧ鎖伸長終 結混合物（各１５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび２２． ５μＭのｄｄＧＴＰ）（いずれもオハイオ州クリーブランドのユナイテイ・ノド ・スティン・バイオケミカル・コーポレーション社製）を入れた。該鎖伸長終結 用／くイアルにはさらに酵素を添加しなかった。前の段階からの酵素で十分であ る。

サイクル化した標識反応生成物を４本の鎖伸長終結用ノくイアルに等分（各鎖伸 長終結用バイアルに４μＩ）Ｌ、１０μｌの軽鉱物油を重層した。

該４本のバイアルをサーモサイクラ−に置き、９５℃１５分から５５℃３０秒、 ついで７２℃１２０秒のサイクルを２０〜２００回（６０サイクＩし以上は必要 ない）行った。この段階は、便利なことに、−晩で終了した。他の時間および温 度も効果的である。

６μ】の反応混合物（油を除（）を取り、これに３μｍの反応停止溶液（９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー。

０．０５％キシレンンアノールＦＦ）を添加し、配列決定用ゲルに負荷する直前 に７０〜８０℃に素早く加熱する。コダック（Ｋｏｄａｋ）社のＸＡＲ−５フィ ルムを用いる場合、オートラジオグラムには１８〜３６時間必要である。

図２は、示した量の精製Ｍ１３ｍｐ１８　ＤＮＡ　（０，００１〜０．１ｔｔｇ 、それぞれレーンＥ−Ａ）を、塩基４０個以内のプライマーおよび上記ヌクレオ チドを用いて配列決定した結果である。標識段階を（４５℃から９０℃）３０回 サイクルさせ、鎖伸長終結段階（９５℃、５５℃ついで７２℃）を３５回サイク ルさせて行った。レーンＦの結果が、サイクル化した標識段階において４種すべ てのｄＮＴＰ　（各３ピコモル）が存在していた場合の例である。

上記標識段階をサイクル化せずに行った場合、０．１μｇのＭ１３ｍｐ１８鋳型 ＤＮＡは、プライマーから最初の２００塩基がないことを示すバンドのオートラ ジオグラムを生じた。より少量のＤＮＡを用いるとより薄い配列決定結果が得ら れた。

実施例２：Ｍ１３ファージの直接配列決定Ｍ１３プラーク（Ｍ１３ｍｐ１８）を 、１８−３６時間インキュベーションした平板から、大型のピペットチップを用 いて拾い上げた。開口を約１．５ｍｍ径にまで広げたチップを用いると、より多 くのファージが得られる。少量の軟寒天がチップに付着する。ピペット中の液体 を出し入れすることにより、軟寒天を２μｍの反応用緩衝液および１０μｌの水 とよく混合した。チューブに栓をして、９５〜１００℃で１０分間加熱し、つい で素早（振り混ぜて沈澱物を集めた。ついで１２μＩを素早く（寒天が固化しな いうちに）取り、配列決定に供した。実施例１に説明した方法を配列決定に用い た。

図４は、ＪＭＩＯＩを塗った平板から拾い上げたＭ１３ｍｐ１８の単一プラーク からのＤＮＡ配列決定を示す。配列決定用緩衝液中９５〜１００℃、１０分の加 熱により、プラークからＤＮＡを抽出した。該ＤＮＡを、前記のごとく、塩基４ ０個以内のプライマーおよびヌクレオチドを用いて配列決定した。標識化段階（ ４５℃から９５℃）を９９回のサイクルで行い、鎖伸長終結段階（９５℃、５５ ℃ついで７２°Ｃ）を１９８回のサイクルで行った。

実施例３．プラスミドを含んでいるコロニーの直接配列決定クローニングベクタ ー（例えばｐＵｃ１９）を含むコロニーを、滅菌ワイヤーまたはループを用いて ３６時間インキュベーションした平板（Ｌブロス）から拾い上げ、２μｌの反応 用緩衝液および１０μｍの水中に懸濁し、よく混合した。

該コロニー液を５９〜１００℃で２０分加熱し、素早く遠心分離して残渣を沈澱 させ、上清１２μｍを取り、配列決定に供した。ついで実施例１記載の方法を配 列決定に用いた。

図３に、プラスミドＤＮＡ　（ｐＵＣ１９）のサイクル化した標識化配列決定を 示す。示した量の精製ｐＵｃ１９ＤＮＡ　（０，０１〜３μｇ）を、前記のごと （、塩基４０個以内のプライマーおよびヌクレオチドを用いて配列決定した。標 識化段階（４５℃から９５℃）を８５回のサイクルで行い、鎖伸長終結段階（９ ５℃。

５５℃ついで７２℃）を１９８回のサイクルで行った。

実施例４．ヘルパーファージに感染したプラスミド含有コロニーの直接配列決定 ｆ１複製開始点を有するプラスミドを含む細胞をヘルパーファージに感染させて 、１本鎖プラスミドＤＮＡを含有する大量のファージ様粒子を得た（得られた鎖 をｆ１複製開始点の方向により決定する）。これらを細胞から分泌させる。ヘル パーファージ粒子も少量（ヘルパーファージの複製開始点か変わったため）産生 されるが、使用プライマーでは配列決定されない。したがって、コロニーかへル バーファージに感染している場合、より多くのプラスミドＤＮＡ　（１本鎖だけ ではない）が配列決定に使用できる。おそらく十分量の鋳型ＤＮＡが常に得られ るとは限らないので、単一コロニーからのプラスミドの配列決定は限界的なもの である。ヘルパーファージでの感染により、より多くの鋳型が得られ、配列決定 が容易になる。

バクテリオファージｆ１由来の複製開始点を含むプラスミドベクター（ｐＴＺ１ ８Ｕ：ミードら、ヌクレイツク・アンラド・リサーチ第１３巻１１０３頁（１９ ８５年））で、宿主ＪＭＩＯＩ株を形質転換させた。コンピテントな細胞を該プ ラスミドとともに０℃で４５分、ついで４２℃で２分インキュベーションした後 、細胞をＬブロス中に希釈し、３７℃で３０分インキュベーションした。Ｍ１３ ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ビエラ（Ｖｉｅｒｒａ）およびメリック（Ｍｅ ｓｓｉｎｇ）　。

メソソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　）第１５３巻３頁 （１９８７年））を添加し、３７℃で２０分インキュベーションを続けた。つい で形質転換体をアンピンリンおよびカナマイシンを含む平板上に移した。１８〜 ３６時間インキュベーションした後、単一コロニーを拾い上げた。

１８〜３６時間平板上でインキュベーションしたコロニーを、滅菌ワイヤーまた はループを用いて拾い上げ、２μｍの反応用緩衝液および１０μｍの水中に懸濁 した。該混合物を９５〜１００℃で２０分加熱した。別法として、３７℃で３０ 分し、遠心分離して上清を９５〜１００℃で１０分加熱してもよい。ついで上清 を素早（振り混ぜて残渣を沈降させ、１２μｌを上記配列決定用に取った。

図５に、ｐＴＺＦ８Ｕを含むＭ１３ＫＯ７感染ＪＭＩ感染の単一コロニーからの ＤＮＡ配列決定を示す。配列決定用緩衝液中で９５〜１００℃で１０分間加熱す ることにより、ＤＮＡをコロニーから抽出した。前記のごとく、塩基４０個以内 のプライマーおよびヌクレオチドを用いてＤＮＡを配列決定した。標識化段階（ ４５℃から９５℃）を９９回のサイクルで行い、鎖伸長終結段階（９５℃、５５ ℃ついで７２℃）を１９８回のサイクルで行った。

実施例５ニラムダ・バクテリオファージから抽出したＤＮＡの配列決定ラムダ・ バクテリオファージ（５μｍの水中１μｇ）からの精製ＤＮＡを、１ｕｌ（０， ５μｍｏｌ）のプライマー（配列番号＝１＝５°−ＧＧＴＴＡＴＣ，ＧＡＡＡＴ ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ、ラムダ・バクテリオファージの７６３０〜７６０ ６番目の塩基に対応）、２μＩのΔＴＡＱ緩衝液、１μｍの３μＭ　ｄＧＴＰ、 １μｍの３μＭ　ｄＴＴＰ、０．５μｌのα−”５ｄＣＴＰ（１２００Ｃｉ／ｍ ｍｏ１．１（ｂｚＣｉ／μｌ）および希釈（４Ｕ／μｌ）されたΔＴＡＱ　ＤＮ Ａポリメラーゼを２μｌ、および５μｌのＨｉＯと混合した（総体積１７．５μ ｌ）。この混合物を、ＤＮＡサーマルサイクラ−中、５０℃で６０秒、ついで９ ０℃で３０秒のインキュベーションのサイクルを９９回行った。ヌクレオチド混 合物を用いて、該プライマーは伸長した７塩基（配列番号・２　：ＴＣＣＣＧＴ Ｔ（Ｃを標識））であった。

ついで該混合物を４部に分け、１つ目を４μｌのｄｄＧＴＰ鎖伸長終結用混合物 （各１５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；２２．５μＭのｄｄ ＧＴＰ）と混合し、２つ目を４μｌのｄｄＡＴＰ鎖伸長終結用混合物（各１５μ ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ：３００μＭのｄｄ、ＡＴＰ）と 混合し、３つ目を４μｌのｄｄＴＴＰ鎖伸長終結用混合物（各１５μＭのｄＡＴ Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ：４５０μＭのｄｄＴＴＰ）と混合し、４つ 目を４μｍのａａｃＴｌｌ伸長終結用混合物（各１５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ 。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；２２５μＭのｄｄｅＴＰ）と混合した。それぞれの混合物 に１０μｍの鉱物油を重層し、バイアルに栓をした。ついで、これらの４本のバ イアルをサーマルサイクラ−に置き、９５℃１５秒、５５℃３０秒ついで７２℃ １２０秒のサイクルを１９８回行った。−晩で該サイクルを終了し、各バイアル から６μｍの水層を取り、３μｍの反応停止溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍ ＭＥＤＴＡ、０．０５％　ブロモフェノールブルー、０．０５％　キシレンンア ノールＦＦ）を添加した。該混合物を７５℃で２分間加熱し、配列決定用ゲルに 適用した。配列決定には、わずか１〜２μｇ（０，０３〜０．０５ピコモル）し か要さなかった。

図６に、サイクル化標識化段階のプロトコールを用いたラムダ・バクテリオファ ージＤＮＡの配列決定を示す。図中に示したように０．５〜５μｇのラムダ・Ｄ ＮＡを用いた。示したオートラジオグラムは６０時間露出後の結果である。

実施例６：ポリメラーゼ連鎖反応により得られたＤＮＡの配列決定ポリメラーゼ 連鎖反応終了後、反応混合物には、まだ過剰のプライマー、ｄＮＴＰおよび非特 異的に増幅された１本鎖ＤＮＡが含まれている。典型的には、沈澱法、ゲル精製 法または他の物理的手法により、これらを所望の２本鎖生成物から除去する。通 常、これらの方法は時間がかかり、遠心分離あるいはゲル電気泳動については手 作業を必要とする。本発明者は、エキソヌクレアーゼ■とともにインキュベーシ ョンするだけで、所望でない１本鎖ＤＮＡおよびプライマーを除去できることを 見いだした。同様に、アルカリホスファターゼで同時処理することにより、過剰 のｄＮＴＰ　（本発明配列決定法の標識段階を妨害する）を、除去できることを 見いだした。加熱により両方の酵素を簡単に失活させることができる。したがっ て、ＰＣＲ生成物を、実施例１に説明した方法を用いて配列決定することかでき る。

詳細には、２００μＭのｄＮＴＰ、１０１００ｐ　Ｉの各プライマー、ｌｎＨの 鋳型ＤＮＡおよび緩衝液（総体積１００μＩ）を用いて、パーキン−エルマー・ セタス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）社のＧＥＮＥＭＡＰキットに 説明されているようにしてＰＣＲを行う。鋳型ＤＮＡはｐＴ７Ｌ−２１（ｐＵｃ １８中のテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のりポザイムを改変したクロ ーン；ザウグ（Ｚａｕｇ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２７巻８９２４〜８９３１頁（１９８８年）参照）であり、プライマーは塩 基４０個以内の汎用配列決定用プライマー（配列番号・３　：　５’−ＧＴＴＴ ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧ）および逆配列用プライマーである（配列番号：　 ４　：　５’−ＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ）である。

これらのプライマーは、５１８ヌクレオチドの生成物を生じる。９４℃１分、３ ７℃１分ついで７２℃２分の３０回のサイクルを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応 を行った。

ＰＣＲ混合物の１０μｍを取った。エキソヌクレアーゼＩ　（ＵＳＢ製品番号７ ００１３番；ＩＯＵ／μｌを１μＩ）およびエビ・アルカルホスファターゼ（Ｕ ＳＢ製品番号７００９２番、ＩＵ／μｍを１μｍ）を添加した。この混合物を３ ７℃で１５分インキユーベーションし、ついで７０℃で１５分間熱失活させた。

この混合物をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５および１ｍ ＭＥＤＴＡ）で２００〜２０００μｌに希釈し、その１０μｌを、塩基４０個以 内のプライマーを用いる実施例１の方法によるサイクル−配列決定に用いた。エ キソヌクレアーゼまたはエビ・アルカリホスファターゼいずれかでの処理を除い た対照実験では、良い配列決定のデータが得られないことがわかった。

図７に、サイクル化標識化段階のプロトコールを用いたポリメラーゼ連鎖反応生 成物のＤＮＡ配列決定を示す。標識段階（４５℃から７０℃）のサイクルを６５ 回行い、鎖伸長終結段階（９５℃、５５℃ついで７２℃）のサイクルを１９８回 行った。ＰＣＲ反応混合物の一部を、上記のごとくエキソヌクレアーゼＩ　（レ ーンＡおよびＣ）および／またはエビ・アルカリホスファターゼ（レーンＢおよ びＣ）で処理し、あるいは処理しなかった（レーンＤ）。ついで、酵素を熱失活 させ、ＤＮＡを２０倍希釈した。前記のごと（、塩基４０個以内のプライマーお よびヌクレオチドを用い、該２０倍希釈したＤＮＡ（１０μｍ）を鋳型として用 いた。エキソヌクレアーゼおよびアルカリホスファターゼ両方での前処理により 、最良の配列決定結果（Ｃ）が得られた。

実施例７　フルオレセイン標識ｄＵＴＰおよび蛍光検出を用いたサイクル配列決 定 この実施例において、放射性標識を非放射性標識であるフルオレセイン標識した ヌクレオチド（フルオレセイン−ｄＵＴＰ）（ベーリンガー・マン／％＜ム／く イオケミカルズ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　ｉｌａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ）社製）に置き換えた。１本鎖Ｍ１３ＤＮＡまたは２末鎖ｐＵｃ１８プ ラスミドＤＮＡのいずれかを鋳型として、サイクル配列決定を行った。ｄＡＴＰ 、ｄＧＴＰおよびフルオレセイン−ｄＵＴＰの存在下、塩基４０個以内の汎用配 列決定用プライマーを用いて、サイクル化標識段階を行った。反応生成物を、Ａ ＢＩモデル３７３Ａ　ＤＮＡ配列決定装置にマウントした配列決定用電気泳動ゲ ルに適用し、蛍光により生成物を検出した。サイクル化標識段階用に、０．０５ ピコモル（またはそれ以上）のＭ１３ＤＮＡ　（０，１２５μｇ）または０．３ ６μｇの２本鎖プラスミドＤＮＡ　（ｐＵＣ１８）、２μ＋のΔＴＡＱ反応用緩 衝液（２６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，５）および６５ｍＭ　ＭｇＣ ＩＪ　、３μｌのフルオレセイ：／−ｄＵＴＰ標識混合物（１０μＭフルオレセ インーｄＵＴＰ、１μＭ　ｄＧＴＰ、１μＭ　ｄＡＴＰ）、１μｍの塩基４０個 以内のプライマー（０５μＭ、０．５ピコモル／μｍの５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣ ＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３°）、２μｌのΔＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０（１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０ ，５％ＴＷＥＥＮ−２０，０，５％ＮＰ−４０含有）中８Ｕ／μｍ）および水を 合一して０．５ｍｌｍｌ微量遠心チューブ中種１８μｌとし、よく混合し、つい で１５μｌの軽鉱物油を重層した。ノくイアルをサーモサイクラ−（パーキン− エルマー・セタス社製）に置き、９５℃１５秒ついで６０℃３０秒のサイクルを ３０〜５０回行った。

この標識反応の組み合わせにより、アニールされたプライマー当たりフルオレセ イン−ｄＵＴＰ３分子という最大の取り込みが行われた。その理由としては、ｄ ＣＴＰは下記のようにしてポリマー化混合物から消失するからである。

鋳型 標識化サイクルの後、４本のバイアルにＡ、ＣＳＧおよびＴの印を付け、４μｍ の対応するΔＴａｑ鎖伸長終結合物を入れた。ついでサイクル化標識反応物を４ 本の鎖伸長終結バイアルに等分しく各鎖伸長終結バイアルに３５μＩＬ１５μ】 の軽鉱物油を重層した。

４本のバイアルをサーモサイクラ−に置き、３０〜５０サイクル（９５℃３０秒 から６０℃６０秒、ついで７２℃６０秒）を行った。４μｍの反応停止液（９５ ％ホルムアミド、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ）を、鉱物油下の鎖伸長終結反応物に添加 することにより反応停止した。配列決定用ゲルに負荷する直前に、これらの試料 を短時間７５〜８０℃に加熱した。試料（５μｍ）を４本の隣接したレーン（ｄ ｄＡＳｄｄＣＳｄｄＧおよびｄｃｌＴ４のつの鎖伸長終結反応物の１つずつに対 応）（６％アクリルアミド、７Ｍ尿素配列決定用ゲル）に負荷した。アプライド ・パイオンステムダ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３７３Ａ　 ＤＮＡ配列決定装置を用いて、３５ワツト（一定）で１６時間、配列決定用反応 生成物の電気泳動を行った。ゲルの下部に配置された高感度蛍光検出器により、 電気泳動中にゲルを通るＤＮＡバンドを検出した。各レーンの蛍光強度を、付属 のＡＢＩコンピューターソフトウェアおよび蛍光検出に最適なフィルターチャン ネルを用いて集積した。

このソフトウェアを用いてデータを正規化し、バックグラウンドの変動を消去し た。

図８は、Ｍ１３ｍｐ１８　ＤＮＡの配列決定結果であり、プライマーの５゛末端 から１７５〜２１７番目の塩基領域を示している。パネルＡには、４本の隣接レ ーンの生のデータを示す。これらを以下のように色分けした。黒はｄｄＧ反応物 、青はｄｄｅ反応物、緑はｄｄＡ反応物；赤はｄｄＴ反応物。パネルＢに、バッ クグラウンドの変動を除去し、平均ピーク高さを正規化するソフトエア分析後の 同じデータを示す。この領域の鋳型ＤＮＡの既知配列をピークの上に示す。手作 業によるグラフと配列の比較により、本発明方法が、この領域の１または２個の 塩基を除くすべての配列を正確に示した二とが分かった。

実施例８　アルカリホスファターゼでの前処理による非対称ＰＣＲ生成物の配列 決定 通常は、等濃度の２種のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を 行い、それらのアニーリング部位間の配列の増幅を行う。原理的には、各サイク ルにより、反応混合物中の生成りＮＡ量は２倍になる。かかる「対称」なＰＣＲ 反応生成物は直鎖状２本鎖ＤＮＡ分子である。時々プライマーを、等しくない濃 度（１０：１ないし５００　：　１の割合）で増幅反応物に添加する。最初の数 サイクルの間はかかる「非対称」なＰＣＲ反応を行い、得られる２本鎖ＤＮＡの 量を部分的に増加させる。最終的には低濃度で供給されたプライマーは使い果た される。この点からは、さらなる増幅サクルは、１種のみのプライマーしか利用 できないので、得られるのは１本鎖ＤＮＡのみとなる。この１本鎖生成物の濃度 は、さらにサイクルを行うと直線的に増加する。かくして、反応生成物は、相対 的に少量の２本鎖直鎖状ＤＮＡおよび多量の１本鎖直鎖状ＤＮＡとなる。この１ 本鎖ＤＮＡをＤＮＡ配列決定の鋳型として用いることができる。

ギレンステン（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ）およびエーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）　、 プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニー ニスエイ（Ｐｒｏｃ。

１本鎖生成物の配列決定法が記載されている。該方法は、遠心分離中の限外濾過 の使用、ついで濃縮されたＤＮＡの乾燥を必要とするこの方法は終了までに数時 間を要し、フィルターを使用するため経費が高い。他の研究者（ブロク（Ｂｒｏ ｗ）　。

「ビーシーアール・プロトコールズ：ア・ガイド・トウ・メソッズ・アンド・ア プリケーションズ（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　：＾Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　Ｊ中１８９頁、アカデミツク ・プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　、１９９０年）は、アルコール沈 殿を用いて配列決定前にＤＮＡを精製することを記載している。この方法もまた 終了までに数字時間かかる。ＤＮＡ精製の必要はないが、ＰＣＲ法において標識 プライマーおよび低濃度のｄＮＴＰの使用が必要である別法が示唆される。特に わずかの配列が決定される場合には、プライマーの標識は付加的であり、時間を 浪費し経費のかかる段階である。

ＰＣＲに用いたｄｌ’ＪＴＰが配列決定段階を妨害するため、精製または他の段 階が必要である。出願人は、少量の熱的に不安定なアルカリホスファターゼを添 加することにより、これらのｄＮＴＰをずっと早く、簡単に、しかも経費をかけ ずに除去できることを見いだした。好ましいアルカリホスファターゼには、６０ 〜７０℃の加熱に感受性のあるエビ・アルカリホスファターゼ（ユナイティッド ・スティン・バイオケミカル・コーポレーション社製）および子ウシ・腸アルカ リホスファターゼが包含される。

緩衝液中５０ｐｍｏｌの１のプライマーおよびｌｐｍｏＩのもう１つのプライマ ーを用いて１００μｍ体積として、２　、５−ＬニットのＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｔ ａｑＤＮＡ　ポリメラーゼとともにＧｅｎｅＡｍｐ　ｋｉｔ　（パーキン・エル マー・セタス社製）に供してＰＣＲを行った。ｄＮＴＰを０．２ｍＭになるよう 添加した。約ＩＫｂのサイズの挿入部位を含む単−Ｍ１３プラークにより鋳型を 供給した。プラークから１００μ＋の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＣ１，ｐＨ７，５ ，１ｍＭＥＤＴＡ中に該ファージを溶出し、ＰＣＲに用いた。バイアルをサーモ サイクラ−に！き、９５°Ｃ１分、５５℃１分ついで７２℃２分のサイクルを５ ０回行った。

増幅後、一部（１０μｍ）を取り、２ユニツトのアルカリホスファターゼを添加 した。この混合物を３７℃で１０分インキュベーションし、ついで、７０℃で１ ０分インキュベーションすることによりホスファターゼを失活させた。

この処理の後、７μｌを取り、ノーフェンス・バージョン・２．０　ＤＮＡ・／ −フェンス・キット（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．ＯＤＮＡ　ｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ）　（ユナイティソド・スティッ・バイオケミカル・ コーポレーション社製）による通常の方法で配列決定を行った。配列決定は、ア ルカリホスファターゼ前処理を用いると非常に良好であったが、アルカリホスフ ァターゼなしでは不安定であった。この方法は、早（終了し、自動化ロボットに より容易に行われつる簡単なピペッティングしか必要としない。試薬類は容易に 入手でき高くない。同様に、いくつかのプライマーで増幅されたヒト・ゲノムＤ ＮＡを用いて、高品質の配列決定結果が得られた。

他の具体例は以下の請求の範囲に包含される。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人・カール・ダブリュー・フラー（Ｃａｒｌ　ｆ、Ｆｕｌｌｅｒ）（ ｉ　ｉ）発明の名称：ＤＮＡサイクル配列決定法（ｉ　ｉ　ｉ）配列の数＝４ （ｖｉ）連絡先： （Ａ）名称ニライオン・アンド・ライオン（Ｌｙｏｎ　＆　Ｌｙｏｎ）（Ｂ）通 り名　ウェスト・シックスス・ストリート（ｌｅｓｔ　５ｉｘｔｈ　５ｔｒｅｅ ｔ）　６１１番地 （Ｃ）都市名：ロサンジェルス（Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｓ）（Ｄ）州名：カルフォ ルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）州（Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９００１７ （Ｖ）コンピューター・リーダプル・フオーム：（Ａ）媒体形態＝３．５インチ ・ディスケット（Ｄｉｓｋｅｔｔｅ）　、１．４４Ｍスト−リッジ（Ｓｔｏｒａ ｇｅ） （Ｂ）コンピューター　１８Ｍコンパチブル（Ｃ）オペレーティングンステム： ＩＭＢ　ｐ、ｃ、ＤＯ８（バージョン５゜（Ｄ）　ソフトウエア：ワードパーフ ェクト（ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ）　（バージョン５１）（ｖｉ）現在の出願デ ータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願口： （Ｃ）分類 （ｖｉｉ）優先権データ： 下記出願を含めた先の出願総数：１ （Ａ）出願番号＋０７／７６７．１３７（Ｂ）出願臼：１９９１年９月２７日 （ｖｉｉｉ）代理人等の情報。

（Ａ）氏名、ワーバーグ、リチャード・ジェイ（ｆａｒｂｕｒｇ、Ｒｉｃｈａｒ ｄ　Ｊ）（Ｂ）登録番号：３２．３２７ （Ｃ）代理人等における処理番号：１９９／１３１（ｉｘ）テレコミュニケーシ ョンの情報（Ａ）ｉｔ話番号：　（２１３）４８９−１６００（Ｂ）ファックス 番号：　（２１３）９５５−０４４０（Ｃ）テレックス番号：６７−３１５０（ ２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ・２５塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の記載、配列番号：１：ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡ　ＡＴＣＡＧＣＣ ＡＣＡ　ＧＣＧＣＣ２５（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ＝７塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：１１ｉ鎖状 （１１）配列の記載　配列番号、２： ＴＣＣＣＧＴＴ　７ （２）配列番号・３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝１７塩基 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）配列の記載：配列番号＝３゜ ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧ　ＴＣ，ＡＣＧＡＣ１７（２）配列番号：４に関する情報 ： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６塩基 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数＝１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （百）配列の記載：配列番号＝４＝ ＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ　ＡＡＡＣＡＧ　１６ＦＩＧ　／ １プライマー（塩基４０個以下の汎用プライマー、過剰に存在）Ｃ丁ＴＴＴＣＣ ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ ＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧ 鋳型　（Ｍ１３ｍｐ１８　） ＋ ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡ（１分子の鋳型につき ５０〜１００コピー）ＤＮＡ配列決定 ＲＧ　２ａ　Ｆ／Ｇ２ｂ　ＦＩＧ、２ｃ　Ｆ／Ｇ２ｄ　Ｆ／Ｇ２ｅ、　ＦＩＧ　 ２ｆＦσ４　ＦＩＧ　５ ＲＧ６σ、んＧ、　６ｂ、　ＦＩＧ　６ｃ、ｈσ６ｄＡ、　Ｂ、　Ｃ，Ｄ。

０．５ＰｇＤＮ＾　１．ｏＩＬｇ　２．０ｐｇ　５．ａＰ９ＲＧぞ　んＧ、　７ ０　ｈσそ　Ｅσん

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１種のｄＮＴＰが標識されている １種ないし３種のｄＮＴＰの存在下で、配列決定すべきＤＮＡの領域に相補的な ポリヌクレオチドプライマーと配列決定すべきＤＮＡとを接触させて、１種また はそれ以上の該ｄＮＴＰを該プライマーに付加させることにより該プライマーを 伸長させて、伸長したプライマーを形成し、ｂ）該プライマーを該ＤＮＡより解 離させ、ｃ）段階ａ）およびｂ）を複数回繰り返し、ついでｄ）ＤＮＡポリメラ ーゼ、４種のｄＮＴＰおよび鎖伸長終結試薬の存在下で、該伸長したプライマー を該ＤＮＡと接触させる段階からなるＤＮＡ配列決定法。
2. ２．該ポリメラーゼがＴａｑＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載の方法。
3. ３．該ポリメラーゼがΔＴａｑＤＮＡポリメラーゼである請求項２記載の方法。
4. ４．該ポリメラーゼが、低エキソヌクレアーゼ活性を有するＴ７ＤＮＡポリメラ ーゼ、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）、ＡＭＶ逆転写酵素、ＢｓｔＤＮＡポリメラー ゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ活 性のないＶｅｎｔポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性のないクレノウか ら選択される請求項１記載の方法。
5. ５．該標識が３５Ｓである請求項１記載の方法。
6. ６．該標識が蛍光標識である請求項１記載の方法。
7. ７．該標識が化学発光標識である請求項１記載の方法。
8. ８．該標識が間接的な酵素結合アッセイにより検出されるリガンドである請求項 １記載の方法。
9. ９．該複数回が１０ないし２００回の間である請求項１記載の方法。
10. １０．さらに該方法が、段階ｄ）の後にさらに該ＤＮＡから該伸長したプライマ ーを分離する段階ｅ）からなる請求項１記載の方法。
11. １１．該段階ｄ）およびｅ）をさらに複数回繰り返す請求項１０記載の方法。
12. １２．該複数回が１０ないし２００回の間である請求項１１記載の方法。
13. １３．該ＤＮＡがＭ１３ＤＮＡである請求項１記載の方法。
14. １４．該ＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求項１記載の方法。
15. １５．該ＤＮＡがｆ１複製開始点からなる請求項１記載の方法。
16. １６．該ＤＮＡがラムダＤＮＡである請求項１記載の方法。
17. １７．該ＤＮＡが増幅により生成されたものである請求項１記載の方法。
18. １８．該増幅がＰＣＲによるものである請求項１７記載の方法。
19. １９．該ＤＮＡを増幅し、ついで該増幅されたＤＮＡをアルカリホスファターゼ と接触させることからなるＤＮＡ調製法。
20. ２０．エキソヌクレアーゼＩをも核増幅されたＤＮＡと接触させる請求項１９記 載の方法。
21. ２１．さらに該方法が、該接触段階の後に該ＤＮＡを配列決定することからなる 請求項１９記載の方法。
22. ２２．エキソヌクレアーゼＩおよびアルカリホスファターゼからなるＤＮＡ調製 キット。