HUT72988A - Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages - Google Patents
Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages Download PDFInfo
- Publication number
- HUT72988A HUT72988A HU9500993A HU9500993A HUT72988A HU T72988 A HUT72988 A HU T72988A HU 9500993 A HU9500993 A HU 9500993A HU 9500993 A HU9500993 A HU 9500993A HU T72988 A HUT72988 A HU T72988A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- sequence
- tested
- helper
- oligonucleotides
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
- C12Q1/6855—Ligating adaptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgyát szintetikus oligonukleotidok - közelebbről: egy vagy több pozícióban nem-foszfodiészter intemukleotid kötést is tartalmazó oligonukleotidok - bázissorrendjének meghatározására szolgáló eljárások képezik.
A szintetikus oligonukleotidok széles körben alkalmazhatók, ideértve az antiszensz kemoterápiás célból történő felhasználást is. A szintetikus oligonukleotidok egyik legújabb alkalmazási területét bizonyos gén funkciók specifikus gátlása képezi. Az e célból használatos oligonukleotidok általában kiegészítői (komplementerei) a kódolódó vagy értelmes, azaz “szesz” RNSszálnak, ezért “antiszensz” oligonukleotidoknak nevezzük őket. Ismertek a szakirodalomból olyan antiszensz oligonukleotidok, melyek különböző génfunkciókat gátolnak.
Zamecnik és Stephenson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 280 (1986)] elsőnek írt le szövetkultúrában oligonukleotid által médiáit vírusreplikációgátlást, Rous-féle sarcoma vírus alkalmazásával.
Zamecnik és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)] az AIDS-vírus, a HTLV-ΠΙ (ma HIV-I) gátlását mutatták ki szövetkultúrában.
Különösen fontosak azok a szintetikus antiszensz oligonukleotidok, melyek egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmaznak. Az ilyen oligonukleotidok antiszensz kemoterápiás alkalmazás szempontjából fontosak, mivel ellentétben a kizárólag foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotidokkal, viszonylag jól ellenállnak a nukleolitikus degradációnak. Számos módosított intemukleotid kötést leírtak a szakirodalomban.
Agrawal és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 (1988)] foszforamidát és foszforotioát oligonukleotidok alkalmazásával megnövekedett gátló hatásról számolnak be HIV-1-vírustenyészetben.
··· ··· ·
-3 Sárin és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451 (1988)] metilfoszfonát oligonukleozid alkalmazásával emelkedett gátló hatást kaptak HÍV-1 -kultúrában.
Agrawal és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794 (1989)] foszforotioát oligonukleotidok alkalmazásával a HIV-1-vírus nukleotidszekvencia-specifikus gátlásáról számolnak be mind korai, mind krónikus vírusfertőzés esetén.
Leiter és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 (1990)] az influenza vírus replikációjának foszforotioát oligonukleotidok hatására bekövetkező gátlásáról számolnak be.
Sajnálatos módon az antiszensz kemoterápiában alkalmazott oligonukleotidok túlságosan rövidek ahhoz, hogy azokat hagyományos szekvencia-meghatározási módszerekkel szekvenálni tudjuk. Mindazáltal hatékony alkalmazásukhoz szekvenciájuk pontos ismerete szükséges, így minőségi ellenőrző vizsgálatokat kell végezni, hogy meggyőződjünk arról, hogy az alkalmazott oligonukleotid a kívánt szekvenciával rendelkezik-e. Jelenleg az ilyen oligonukleotidok szekvenciája gyakran csak feltételezett, amely feltételezés magán a lépésről-lépésre történő szintézisen alapul, ugyanis nincs megfelelő eljárás, amely alkalmas szekvenciájuk meghatározására, különösen azon esetekben, melyekben az oligonukleotid nem-foszfodiészter intemukleotid kötéseket is tartalmaz.
Az oligonukleotidok analízisére korábban kidolgozott eljárások széleskörű alkalmazás céljára nehézkesek. Agrawal és munkatársai [J.Cromatography 509, 396-399 (1990)] közzétettek egy foszforotioát oligonukleotidok analízisére alkalmas eljárást, amely szerint a foszforotioát kötéseket foszfodiészter-kötésekké alakítják, majd kígyóméreg foszfodiészterázos és foszfatázos emésztés után a bázis összetételt fordított fázisú HPLC-oszlopon analizálják.
-4Fennáll az igény a szintetikus oligonukleotidok szekvenciájának egyszerűbb és megbízhatóbb meghatározására, különösen azon oligonukleotidok esetében, amelyek nem-foszfodiészter-kötéseket is tartalmaznak.
A találmány szerinti megoldás az első hatékony és megbízható eljárás szintetikus oligonukleotidok nukleotidsorrendjének meghatározására. Különösen jelentős, hogy a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi az olyan oligonukleotidok nukleotidsorrendjének meghatározását, amelyek a 3'-végen egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmaznak.
A találmány szerinti eljárásban négy oligonukleotidot alkalmazunk. Az első a vizsgálandó oligonukleotid, amelyet szekvenálni fogunk. A második a “helper”, azaz segítő oligonukleotid, amelyet a vizsgálandó oligonukleotid 3'végéhez ligálunk, biztosítva ezzel a szekvenáláshoz szükséges megfelelő nukleotid hosszúságot (így alakul ki a “sequencing-length”, azaz “szekvenálható hosszúságú” oligonukleotid). A harmadik oligonukleotid a “molekuláris fércelő” (“molecular tack”) oligonukleotid, melynek szekvenciája komplementer egyrészt a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével, másrészt a segítő oligonukleotid 5'-végével.
A fenti három oligonukleotidot hibridizációra alkalmas körülmények között komplexet képez, amelyben a molekuláris fércelő oligonukleotid a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végét és a segítő oligonukleotid 5'-végét egymás közvetlen közelségében tartja. A minta és segítő oligonukleotidot ezután összeligáljuk, kialakítva ily módon egy szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot. Ezután egy negyedik oligonukleotidot, egy olyan jelzett láncindító (“primer”) oligonukleotidot hibridizálunk a szekvenálható hosszúságú oligonukleotidhoz, melynek szekvenciája komplementer a segítő oligonukleotid szekvenciájának egy részletével, majd végrehajtjuk a szekvenálást például a Sanger-féle didezoxi láncterminációs, vagy a Maxam és Gilbert-féle kémiai hasításos módszer alkalmazásával.
-5 ······· · • ··· ····· ··· * · ······ · ···· «· ·· · ··
Az alábbiakban röviden ismertetjük a csatolt ábrákat.
Az 1. ábra összefoglalva mutatja a szintetikus oligonukleotidok szekvenálására szolgáló találmány szerinti eljárás lépéseit.
A 2. ábra a találmány szerinti eljárás alkalmazásával végzett szekvenálás eredményét mutatja egy 5'- CTCTCGCA CCCATCTCTCTCCTTCT-3' szekvenciájú foszforotioát oligonukleotid esetén.
A 3. ábra a találmány szerinti eljárás alkalmazásával végzett szekvenálás eredményét mutatja egy 5'-CAGAGCAAAATCATCAGAAGA-3' szekvenciájú foszforotioát oligonukleotid esetén.
A találmány tárgyát képezi, egyrészt, egy hatékony és megbízható eljárás szintetikus oligonukleotidok szekvenciájának meghatározására. Általánosságban elmondhatjuk, hogy nukleotidsorrend-meghatározásra használt hagyományos metodikák alkalmazása a szintetikus oligonukleotidokra nehézkes, mivel ezek az oligonukleotidok rövidek ahhoz, hogy megfelelő templátként szolgáljanak. A találmány szerinti eljárás áthidalja ezt a problémát azáltal, hogy alkalmazásával előállítunk egy szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot, amely tartalmazza a szekvenálandó vizsgálandó oligonukleotidot és elegendő hosszúságú ahhoz, hogy megfelelő templátként szolgáljon.
A találmány tárgyát képezi, másrészt, egy hatékony és megbízható eljárás olyan szintetikus oligonukleotidok bázissorendjének meghatározására, amelyek 3'-végükön egy vagy több nem-foszfodiészter-kötést tartalmaznak. A 3'-végen foszfodi észter-kötéseket tartalmazó oligonukleotidok a terminális dezoxinukleotid transzferáz enzim segítségével meghosszabbíthatók, így a molekula hossza elegendő lesz a szekvenáláshoz. A terminális dezoxinukleotid transzferáz enzim azonban meglehetősen specifikusan foszfodi észter intemukleotid kötést igényel a meghosszabbítandó oligonukleotid 3'-végén. Ebből következik, hogy a 3'-végen egy vagy több nem-foszfodiészter-kötést tartalmazó szintetikus oligonukleotidok gyenge szubsztrátjai a terminális dezoxinukleotid transzferáz enzimnek. A találmány szerinti eljárás megoldja ezt ···« • · · · « • · · · · · * · ··· • ······ · • · · · · · · -6a problémát. Az eljárás szerint ligáz enzim alkalmazásával összekötjük a vizsgálandó és a segítő oligonukleotidot, ezáltal létrehozunk egy szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot, amely már megfelelő templát a hagyományos szekvenálási eljárások mint pl. a Sanger-féle didezoxi láncterminációs vagy a Maxarn és Gilbert-féle kémiai hasításos módszer alkalmazásához. A ligázok kevésbé specifikusak a terminális intemukleotid kötésekre, mint a dezoxinukleotid transzferáz, így alkalmazhatók olyan oligonukleotidok összekapcsolására is, amelyek nem-foszfodiészter intemukleotid kötéseket is tartalmaznak.
A találmány bármelyik aspektusát tekintve a találmány szerinti eljárás az alábbi lépésekből áll. Először, három oligonukleotidból - a vizsgálandó oligonukleotidból, melynek szekvenciáját meg fogjuk határozni; a segítő oligonukleotidból, amely a megfelelő hosszúságot biztosítja; és a molekuláris fércelő oligonukleotidból, amely egymás közelében tartja a minta és segítő oligonukleotidot - álló komplexet hozunk létre. Másodszor, a vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat összeligáljuk, és így kialakítjuk a szekvenálható hoszszúságú oligonukleotidot. Bármelyik beszerezhető, jól ismert ligáz alkalmazható a kötés kialakítására. Az eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint T4 DNS ligázt alkalmazunk. Harmadszor, egy jelzett láncindító oligonukleotidot hibridizálunk a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid segítő oligonukleotid részéhez. Negyedszer, a láncindító oligonukleotidot meghosszabbítjuk egy polimeráz enzim segítségével. Számos polimeráz enzim ismert a szakirodalomban. Elvben ezek mindegyike alkalmazható. Előnyösen DNS polimerázt, legelőnyösebben a Taq DNS polimerázt alkalmazunk. Ebben a láncindító meghoszszabbító lépésben didezoxinukleotidokat is beépítünk, amennyiben a szekvencia-meghatározást a Sanger-féle eljárás szerint végezzük. Ha Maxam-Gilbertféle szekvenálást végzünk, didezoxinukleotidok beépítése nem szükségesek. A Maxam-Gilbert-féle módszer tartalmaz egy kémiai hasításos lépést is, amely nem szerepel a Sanger-féle eljárásban. Mind a Sanger-, mind a Maxam-Gilbert• · · • · · • »· · · ··· ···»·· · • · · · ·
- 7féle módszer jól ismert a technika állása szerint, ezért ezeket a továbbiakban nem részletezzük. Végül, a didezoxi-terminálással vagy a kémiai hasítással előállított oligonukleotid szekvenciákat olyan hagyományos eljárások szerint választjuk szét, amelyek molekulaméret alapján frakcionálnak (pl. kromatográfia vagy elektroforézis). A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint a molekulákat szekvenáló gélben elektroforetikusan választjuk szét. A szekvencia-mintázat ezután a hagyományos eljárásokkal értékelhető, s így meghatározható a vizsgálandó oligonukleotid bázissorrendje.
A találmány szerinti eljárás alkalmazásával elvileg bármilyen vizsgálandó oligonukleotid szekvenálható. A találmány szerinti eljárást előnyösen 4 és 100 nukleotid közötti hosszúságú vizsgálandó oligonukleotidok szekvenálására alkalmazzuk. A vizsgálandó oligonukleotidok legelőnyösebben 8 és 50 nukleotid közötti hosszúságúak. Elméletileg a vizsgálandó oligonukleotid bármilyen intemukleotid kötést tartalmazhat, vagy a különböző típusú kötések bármilyen kombinációját mindaddig, amíg a vizsgálandó oligonukleotid ágálható a segítő oligonukleotidhoz és polimeráz alkalmazásával meghosszabbítható. Bármely adott vizsgálandó oligonukleotid esetén ezek a paraméterek empirikusan meghatározhatók, nem elvárható mennyiségű kísérleti munka elvégzése nélkül, egyszerűen kísérleti ligálást és láncindító meghosszabbítást végezve, a leírás kísérletes részében megadott körülmények között. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végén legalább egy nemfoszfodiészter intemukleotid kötés van. A vizsgálandó oligonukleotidban lehet egynél több nem-foszfodiészter-kötés is, sőt az is lehet, hogy egy kötés sem foszfodiészter-kötés. A vizsgálandó oligonukleotid előnyösen tartalmazhat legalább foszforotioát, alkilfoszfonát foszforamidát, alkilfoszfonotioát, foszfoditioát és szulfon, szulfát, keto, foszfát-észter kötéseket, valamint foszforotioát és foszforamidát hidakat. Ezek mindegyikét leírták a szakirodalomban. A vizsgálandó oligonukleotid legelőnyösebben foszforotioát intemukleotid kötéseket tartalmaz.
-8• · · ··· » · ··· • · ···· · · «· ·· · ··
A találmány szerinti eljárás végrehajtásakor egy segítő oligonukleotidot Egálunk a vizsgálandó oligonukleotidhoz vagy a segítő oligonukleotid 5'-végén vagy a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végén lévő foszfátcsoporton keresztül, így kialakul a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid, amelynek hosszúsága elegendő ahhoz, hogy templátként szolgáljon a szekvenálási folyamatban. A segítő oligonukleotid hossza változhat attól függően, hogy milyen hosszú a vizsgálandó oligonukleotid, hiszen a lényeges paraméter a teljes “sequencing-length” oligonukleotid hosszúsága. így hosszabb vizsgálandó oligonukleotid esetén rövidebb segítőt alkalmazunk, míg rövidebb vizsgálandó oligonukleotidhoz hoszszabb segítő oligonukleotid szükséges. A szekvenálható hosszúságú oligonukleotid hossza előnyösen 8 és 50 nukleotid között van. Bármely adott vizsgálandó oligonukleotidhoz a segítő oligonukleotid hossza a megfelelő mérettartományon belül változhat, hogy kialakuljon a szekvenálható hosszúság. A segítő oligonukleotidnak bármilyen szekvenciája lehet és tartalmazhat bármilyen intemukleotid kötést, vagy a különböző kötések keverékét mindaddig, amíg az ligálható a vizsgálandó oligonukleotidhoz és templátként szolgál a láncindító oligonukleotid polimeráz általi meghosszabbításához. Ezek a paraméterek nem elvárható mennyiségű kísérleti munka elvégzése nélkül, gyorsan meghatározhatók bármely adott segítő oligonukleotid esetén egyszerűen kísérleti ligálások és láncindító meghosszabbítások végrehajtása útján, a leírás kísérletes részében megadott körülmények között. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a segítő oligonukleotid foszfodiészter oligonukleotid.
A találmány szerinti eljárás végrehajtásakor a vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat egy harmadik oligonukleotid a “molekuláris fércelő”-nek nevezett oligonukleotid tartja együtt. A molekuláris fércelő oligonukleotid a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végét és a segítő oligonukleotid 5'-végét tartja közelségben, mivel képes egyidejűleg ezekhez a szakaszokhoz hibridizálódni. Tehát a molekuláris férceidnek tartalmaznia kell egy olyan 5'-régiót, amely komplementer a segítő oligonukleotid 5'-végével és egy szomszédos 3' régiót, • ·» • ··· · · ··· • · ··♦·<· · ···· «· ·· « β·
-9amely komplementer a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével. A molekuláris fércelő lehet bármilyen hosszú mindaddig, amíg a segítő és vizsgálandó oligonukleotidokkal komplementer régiója elegendő hosszúságú, hogy mindkettőhöz egyidejűleg kapcsolódni tudjon. A molekuláris fércelő hossza előnyösen 8 és 50 nukleotid között van, és 5'-régiójában legalább 4 nukleotid komplementer a segítő oligonukleotid 5'-végével, szomszédos 3'-régiójában pedig legalább 4 nukleotid komplementer a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével. A molekuláris fércelő hossza legelőnyösebben 8 és 20 nukleotid között van.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott negyedik oligonukleotid egy láncindító oligonukleotid a polimerázos lánchosszabbításhoz. Ez a láncindító oligonukleotid lehet bármelyik hagyományos, jól ismert láncindító oligonukleotid, amelynek használata általánosan elterjedt a DNSszekvenálásban, vagy láncindító meghosszabbítási reakciókban. A láncindító oligonukleotid szekvenciája részben vagy egészben komplementer a segítő oligonukleotid szekvenciájával. A láncindító oligonukleotid 3'-vége előnyösen a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid segítő oligonukleotidból származó azon részletével komplementer, amely a vizsgálandó oligonukleotidból származó rész 3’-végétől számítva a 10-15. nukleotidnál kezdődik.
Az alábbi példákkal meg kívánjuk világítani a találmány szerinti eljárás bizonyos előnyös megvalósítási módjait, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. Ahol nincs külön jelezve a következő példákban az alábbi anyagokat és körülményeket alkalmaztuk.
A (y-32P)-ATP-t (3000 Ci/mmól) a NEN DuPont-tól, a T4 polinukleotid kinázt, a T4 DNS ligázt, a Taq DNS polimerázt és a didezoxinukleotidtrifoszfátokat pedig Promega-tól szereztük be. Az oligodezoxinukleotidok és a foszforotioát oligonukleotidok DNS-szintetizátor (Millipore, 8700-as modell) alkalmazásával, foszforamidit kémiával készültek. Az oligonukleotidok végcsoportvédelmét koncentrált NH4OH-val (55°C, 8 óra) szüntettük meg. A • · * · σ * » « * e • ··· «·· «, w »»» ··»· ··· ··;· \,·
- 10tisztítást 20 %-os poliakrilamid gélben (7 mól/1 karbamid) gélelektroforézissel végeztük.
1. példa
A minta és segítő oligomerek ligálása
Egy 35-tagú (5'-CTCCATTTTTTTTTCCCTATAGTGAGTCGTAT TAT) segítő oligomer foszforilálását T4 polinukleotid kinázzal végeztük a 2. példában leírtak szerint azzal az eltéréssel, hogy csak hideg ATP-t használtunk. Egy 12-tagú molekuláris fércelő oligomert szintetizáltunk, amelyben az 5'-vég felé eső szekvencia ATGGAT volt, a 3'-vég felé eső szekvencia pedig a mintaoligomer 3'-végével volt komplementer. 100 pmol, 5'-végen foszforilált segítő oligomert összekevertünk 200 pmol vizsgálandó és molekuláris fércelő oligomerrel 18 μΐ végtérfogatú reakcióéi eggyé, amely 2 μΐ, lOx-ligázpuffert is tartalmazott (300 mM Tris, pH 7.8; 100 mM MgCl2; 100 mM DTT és 10 mM ATP). A reakcióelegyet 37 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd jeges vízfürdőn lehűtöttük. Ezt követően 2 μΐ T4 DNS ligázt (300 egység/ml) adtunk az elegyhez. Egy éjszakán át 4 °C-on tartottuk, majd a ligázt inaktiváltuk (70 °C, 5 perc). A ligálás hatékonysága meghaladta a 90 %-ot. A szekvenálás során ezt az elegyet további tisztítás nélkül templátként használtuk.
2. példa
A szekvenáló láncindító oligonukleotid 5'-végének jelölése mM Tris, pH 7.5 pufferban, amely 10 mM MgCl2-t és 5 mM DTT-tartalmazott, összekevertünk 200 pmol T7 láncindító oligonukleotidot (5'-TAATACATC AT AGG) 300 pmól (y-32P)-ATP-t és 15 egység T4 polinukleotid-kinázt. A reakcióelegyet 40 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd a kinázt inaktiváltuk (70 °C, 5 perc). Az 5'-végen jelzett láncindító oligonukleotidot 20 %-os denaturáló poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk, láncindító oligonukleotidot tartalmazó a csíkot kivágtuk, a láncindító «· ·
-11 oligonukleotidot 0.5 mól/1 ammónium-acetáttal eluáltuk (1 éjszaka, szobahőmérséklet), végül 4 térfogat etanollal kicsaptuk.
3. példa
A szekvenáló reakció végrehajtása mM MgCl2-t tartalmazó 50 mM Tris, pH 9.0 pufferben 5 pmól ligációs el egyből származó templátot és 15 pmól, 5'-végen 32P-vel jelzett láncindító oligonukleotidot elegyítettünk. Az elegyet 10 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd 1.5 μΐ Taq DNS polimerázt (2500 egység/ml) adtunk. Az elegyet ezután négy, G, A, T ill. C-vel jelzett csőbe szétosztottuk (6 μΐ/cső). Az egyes csövekbe 1 μΐ megfelelő d/dd-NTP elegyet adtunk (lásd 1. táblázat), azokat 70 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd 1 μΐ „chase” keveréket (dGTP, dATP, dCTP, dTTP) egyenként 25mM - adtunk minden csőbe, és újabb 15 percig inkubáltuk 70 °Con. A reakciót 4 μΐ “stop” oldattal (10 mM NaOH, 85 % formamid, 0.05 % brómfenolkék és 0.05 % Xylene Cyanol) állítottuk le, majd az elegyet 70 °C-ra melegítettük (5 perc) és szekvenáló gélre vittük.
• * ·
1. TÁBLÁZAT
A d/ddNTP-ok elegyítés! szabályai a szekvenálás során
| Összetevő | G-elegy | A-elegy | T-elegy | C-elegy |
| ddGTP | 110 pmól/l | - | - | - |
| ddATP | - | 1230 pmól/l | - | - |
| ddTTP | - | - | 1600 pmól/l | - |
| ddCTP | - | - | - | 890 pmól/l |
| dGTP | 25 pmól/l | 230 pmól/l | 230 pmól/l | 230 pmól/l |
| dATP | 250 pmól/l | 23 pmól/l | 23 pmól/l | 230 pmól/l |
| dTTP | 250 pmól/l | 230 pmól/l | 23 pmól/l | 230 pmól/l |
| dCTP | 250 pmól/l | 230 pmól/l | 230 pmól/l | 230 pmól/l |
4. példa
Szekvenáló gélelektroforézis cm hosszú, 30 cm széles és 0,75 mm vastag, 8 %-os poliakrilamidgélre (7 mól/1 karbamid, 50 mmól/1 Tris-borát, pH 8,3 puffer, 2,5 mmól/1 EDTA tartalommal) vittük fel a 3. példa szerinti termékeket. A futtató puffer: 50 mmól/1 Tris-borát, pH=8,3, 2,5 mmól/1 EDTA. A mintákat a gélre vittük és 600 V; 50 mA áramerősséggel futtattuk, amíg a brómfenolkék jelzőfesték a gél aljától 5 cm-re nem ért. A gél szárítása után autoradiográfiás kiértékelést végeztünk.
A 2. és 3. ábra mutatja két különböző foszforotioát oligonukleotid szekvenálásának eredményét. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a találmány szerinti megoldás jól alkalmazható a nem-foszfodiészter - jelen esetben foszforotioát - intemukleotid kötéseket is tartalmazó oligonukleotidok szekvenálására. A találmány szerinti eljárást sikeresen alkalmaztuk mindkét eltérő szekvenciára, ami arra utal, hogy a siker nem a vizsgálandó ·· ·· ·· · «· • ··· ···· · ··· • · «··«·· · ···· ·· ·· · a·
- 13oligonukleotid bázisösszetételétől függ. Az eljárás egyetlen hátránya, hogy alkalmazásával az utolsó 5'-végi nukleotid nem határozható meg. így ezt az egy nukleotidot valamely terminális analízisre szolgáló eljárással kell azonosítani.
• · • ·· · ····· «·· • · ······ · ···· ·· · · · · ·
- ΜΑ SZEKVENCIÁK FELSOROLÁSA
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy szálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 12 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: igen
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGGAGAGAA GG
A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
- 15 • · · · ···· · ··· • · ····** • ·· · ·· ·· · · ·
HÁNY SZÁLÚ: egy szálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
A3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCCATTTTT TTTTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTAT
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy szálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: igen
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATAATACGAC TCACTATAGG
AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGAGCAAAA TCATCAGAAG A
Claims (6)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás oligonukleotidok szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy:(i) 5'- és 3'-végekkel egyaránt rendelkező vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat olyan molekuláris fércelő oligonukleotidhoz hibridizálunk, amely tartalmaz egy 5'-régiót, ami a segítő oligonukleotid 5'-végével komplementer, és egy szomszédos 3'régiót, ami pedig a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével komplementer;(ii) a segítő oligonukleotidot a vizsgálandó oligonukleotidhoz ligáljuk és így szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot hozunk létre;(iii) a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid egy segítő oligonukleotidból származó részletéhez olyan jelzett láncindító oligonukleotidot hibridizálunk, melynek szekvenciája komplementer a segítő oligonukleotid egy részletének szekvenciájával;(iv) a láncindító oligonukleotidot lánchosszabbító és láncterminációs nukleozid-trifoszfátok jelenlétében polimerázzal meghosszabbítjuk;(v) a meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat önmagában ismert eljárás szerint frakcionáljuk; és (vi) a meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulák frakcionálása alapján a vizsgálandó oligonukleotid szekvenciáját meghatározzuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként a 3'-végén egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként foszforotioát intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
- 4. Eljárás oligonukleotidok szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy:(i) 5'- és 3'-végekkel egyaránt rendelkező vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat olyan molekuláris fércelő oligonukleotidhoz hibridizálunk, amely tartalmaz egy 5'-régiót, ami a segítő oligonukleotid 5'-végével komplementer, és egy szomszédos 3'régiót, ami pedig a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével komplementer;(ii) a segítő oligonukleotidot a vizsgálandó oligonukleotidhoz rigaijuk és így szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot hozunk létre;(iii) a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid egy segítő oligonukleotidból származó részletéhez olyan jelzett láncindító oligonukleotidot hibridizálunk, melynek szekvenciája komplementer a segítő oligonukleotid egy részletének szekvenciájával;(iv) a láncindító oligonukleotidot polimerázzal meghosszabbítjuk, és így meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat tartalmazó reakcióéi egyet állítunk elő;(v) a meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat tartalmazó reakcióelegyet a megfelelő Maxam-Gilbert-féle szekvenáló reagensek hatásának tesszük ki, és így elhasított meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat tartalmazó reakcióelegyet állítunk elő;(vi) az elhasított meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat önmagában ismert eljárás szerint frakcionáljuk; és • ·· · · ··· (vii) az elhasított meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulák frakcionálása alapján a vizsgálandó oligonukleotid szekvenciáját meghatározzuk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként a 3'-végén egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként foszforotioát intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/958,133 US5403709A (en) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | Method for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9500993D0 HU9500993D0 (en) | 1995-06-28 |
| HUT72988A true HUT72988A (en) | 1996-06-28 |
Family
ID=25500629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500993A HUT72988A (en) | 1992-10-06 | 1993-10-06 | Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5403709A (hu) |
| EP (1) | EP0664836B1 (hu) |
| JP (1) | JPH08504571A (hu) |
| KR (1) | KR950704508A (hu) |
| AT (1) | ATE134220T1 (hu) |
| AU (1) | AU670843B2 (hu) |
| BR (1) | BR9307192A (hu) |
| CA (1) | CA2146365A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ85095A3 (hu) |
| DE (1) | DE69301570T2 (hu) |
| DK (1) | DK0664836T3 (hu) |
| ES (1) | ES2083299T3 (hu) |
| FI (1) | FI951612A (hu) |
| GR (1) | GR3019910T3 (hu) |
| HU (1) | HUT72988A (hu) |
| NO (1) | NO951328L (hu) |
| NZ (1) | NZ257032A (hu) |
| PL (1) | PL308294A1 (hu) |
| RU (1) | RU95110871A (hu) |
| WO (1) | WO1994008052A1 (hu) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2113478C (en) * | 1991-08-28 | 2001-06-12 | Hartmut Seliger | Functionalized carrier materials for the simultaneous synthesis and direct labelling of oligonucleotides as primers for template-dependent enzymatic nucleic acid syntheses |
| US5525470A (en) * | 1994-01-26 | 1996-06-11 | Hybridon, Inc. | Method of sequencing [short] oligonucleotides |
| US5589330A (en) * | 1994-07-28 | 1996-12-31 | Genzyme Corporation | High-throughput screening method for sequence or genetic alterations in nucleic acids using elution and sequencing of complementary oligonucleotides |
| US6645943B1 (en) | 1994-10-25 | 2003-11-11 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
| US6608035B1 (en) * | 1994-10-25 | 2003-08-19 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
| EP0718409A3 (en) * | 1994-12-22 | 1999-02-03 | Hitachi, Ltd. | DNA preparation method |
| JP2000505418A (ja) * | 1996-01-26 | 2000-05-09 | コドン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチド類縁体 |
| US5851804A (en) * | 1996-05-06 | 1998-12-22 | Apollon, Inc. | Chimeric kanamycin resistance gene |
| US6291164B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-09-18 | Invitrogen Corporation | Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate |
| US20040072210A1 (en) * | 1997-07-07 | 2004-04-15 | Billing-Medel Patricia A. | Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast |
| US7875440B2 (en) | 1998-05-01 | 2011-01-25 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US6780591B2 (en) * | 1998-05-01 | 2004-08-24 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US6218118B1 (en) | 1998-07-09 | 2001-04-17 | Agilent Technologies, Inc. | Method and mixture reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids by mass spectrometry |
| JP2002535999A (ja) * | 1999-02-05 | 2002-10-29 | アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド | ゲノム分析方法 |
| US6818395B1 (en) * | 1999-06-28 | 2004-11-16 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences |
| US7501245B2 (en) * | 1999-06-28 | 2009-03-10 | Helicos Biosciences Corp. | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
| EP1072679A3 (en) * | 1999-07-20 | 2002-07-31 | Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) | Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure |
| US20020009728A1 (en) * | 2000-01-18 | 2002-01-24 | Quantum Dot Corporation | Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization |
| WO2002072892A1 (en) | 2001-03-12 | 2002-09-19 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension |
| US20040219532A1 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-04 | Sampson Jeffrey R. | Internal references measurements |
| US20050239089A1 (en) * | 2003-06-06 | 2005-10-27 | Johnson Martin D | Mobility cassettes |
| US20050170367A1 (en) * | 2003-06-10 | 2005-08-04 | Quake Stephen R. | Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids |
| US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
| EP1716254B1 (en) | 2004-02-19 | 2010-04-07 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for analyzing polynucleotide sequences |
| US20060046258A1 (en) * | 2004-02-27 | 2006-03-02 | Lapidus Stanley N | Applications of single molecule sequencing |
| US20050239085A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-10-27 | Buzby Philip R | Methods for nucleic acid sequence determination |
| US20050260609A1 (en) * | 2004-05-24 | 2005-11-24 | Lapidus Stanley N | Methods and devices for sequencing nucleic acids |
| US20070117104A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| EP1766090B1 (en) * | 2004-05-25 | 2011-04-27 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for nucleic acid immobilisation |
| US7476734B2 (en) * | 2005-12-06 | 2009-01-13 | Helicos Biosciences Corporation | Nucleotide analogs |
| US20070117103A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US20060024678A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Helicos Biosciences Corporation | Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing |
| US20060118754A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-08 | Lapen Daniel C | Stabilizing a polyelectrolyte multilayer |
| US7220549B2 (en) | 2004-12-30 | 2007-05-22 | Helicos Biosciences Corporation | Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing |
| US20060172328A1 (en) * | 2005-01-05 | 2006-08-03 | Buzby Philip R | Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7482120B2 (en) * | 2005-01-28 | 2009-01-27 | Helicos Biosciences Corporation | Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7666593B2 (en) | 2005-08-26 | 2010-02-23 | Helicos Biosciences Corporation | Single molecule sequencing of captured nucleic acids |
| US20070117102A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US20090305248A1 (en) * | 2005-12-15 | 2009-12-10 | Lander Eric G | Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing |
| US20080309926A1 (en) * | 2006-03-08 | 2008-12-18 | Aaron Weber | Systems and methods for reducing detected intensity non uniformity in a laser beam |
| US7397546B2 (en) * | 2006-03-08 | 2008-07-08 | Helicos Biosciences Corporation | Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4521509A (en) * | 1982-11-24 | 1985-06-04 | Research Corporation | Method for degrading DNA |
| US4797355A (en) * | 1985-06-13 | 1989-01-10 | Amgen Inc. | Methods for attaching polynucleotides to supports |
| EP0224126A3 (en) * | 1985-11-25 | 1989-02-01 | The University of Calgary | Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers |
| NZ231641A (en) * | 1988-12-07 | 1991-09-25 | Gen Hospital Corp | A method of enriching a gene sequence involving hybridisation of two populations of nucleic acid molecules |
-
1992
- 1992-10-06 US US07/958,133 patent/US5403709A/en not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-10-06 AU AU53241/94A patent/AU670843B2/en not_active Ceased
- 1993-10-06 WO PCT/US1993/009592 patent/WO1994008052A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-10-06 CA CA002146365A patent/CA2146365A1/en not_active Abandoned
- 1993-10-06 HU HU9500993A patent/HUT72988A/hu unknown
- 1993-10-06 KR KR1019950701316A patent/KR950704508A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-10-06 PL PL93308294A patent/PL308294A1/xx unknown
- 1993-10-06 EP EP93923306A patent/EP0664836B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-06 JP JP6509423A patent/JPH08504571A/ja active Pending
- 1993-10-06 AT AT93923306T patent/ATE134220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-10-06 NZ NZ257032A patent/NZ257032A/en unknown
- 1993-10-06 CZ CZ95850A patent/CZ85095A3/cs unknown
- 1993-10-06 RU RU95110871/13A patent/RU95110871A/ru unknown
- 1993-10-06 DK DK93923306.0T patent/DK0664836T3/da active
- 1993-10-06 ES ES93923306T patent/ES2083299T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-06 BR BR9307192A patent/BR9307192A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-10-06 DE DE69301570T patent/DE69301570T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-03-29 US US08/412,913 patent/US5652103A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-05 FI FI951612A patent/FI951612A/fi not_active Application Discontinuation
- 1995-04-05 NO NO951328A patent/NO951328L/no unknown
-
1996
- 1996-05-15 GR GR950403607T patent/GR3019910T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2083299T3 (es) | 1996-04-01 |
| RU95110871A (ru) | 1997-06-10 |
| CZ85095A3 (en) | 1995-12-13 |
| US5403709A (en) | 1995-04-04 |
| US5652103A (en) | 1997-07-29 |
| NZ257032A (en) | 1997-06-24 |
| HU9500993D0 (en) | 1995-06-28 |
| FI951612A0 (fi) | 1995-04-05 |
| ATE134220T1 (de) | 1996-02-15 |
| BR9307192A (pt) | 1999-03-30 |
| AU5324194A (en) | 1994-04-26 |
| NO951328D0 (no) | 1995-04-05 |
| FI951612A (fi) | 1995-05-10 |
| NO951328L (no) | 1995-05-22 |
| DE69301570T2 (de) | 1996-06-27 |
| EP0664836B1 (en) | 1996-02-14 |
| JPH08504571A (ja) | 1996-05-21 |
| DE69301570D1 (de) | 1996-03-28 |
| WO1994008052A1 (en) | 1994-04-14 |
| GR3019910T3 (en) | 1996-08-31 |
| AU670843B2 (en) | 1996-08-01 |
| CA2146365A1 (en) | 1994-04-14 |
| DK0664836T3 (da) | 1996-03-11 |
| EP0664836A1 (en) | 1995-08-02 |
| KR950704508A (ko) | 1995-11-20 |
| PL308294A1 (en) | 1995-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT72988A (en) | Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages | |
| US5075216A (en) | Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase | |
| US5518900A (en) | Method for generating single-stranded DNA molecules | |
| CA2220418C (en) | Oligonucleotide sizing using cleavable primers | |
| US5863732A (en) | Diagnostic kits for detection of target nucleic acid sequences | |
| JP2788034B2 (ja) | ポリヌクレオチドのアツセイのための増幅方法 | |
| US5527899A (en) | Oligonucleotides with inverted polarity | |
| US5739311A (en) | Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases | |
| US5650271A (en) | Enzymatic synthesis of oligonucleotides | |
| JPH08322600A (ja) | ３’−固有の校正活性を有するｄｎａポリメラーゼの使用 | |
| JPH07270425A (ja) | ターミナルトランスフェラーゼによる３’−ｒｎａ標識方法 | |
| WO2001062961A1 (de) | Ligase/polymerase-verfahren zur detektion von cytosin-methylierung in dna proben | |
| CA2180722A1 (en) | A method of sequencing short oligonucleotides | |
| WO1996040901A1 (en) | Template and primer based synthesis of enzymatically cleavable oligonucleotides | |
| US5869236A (en) | Mutation detecting method using photobridging-stabilized double-stranded DNA denaturing gradient electrophoresis | |
| US5652126A (en) | Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides | |
| US6864049B1 (en) | Method for producing hybridization complexes whose stability is substantially independent of the base composition of two hybridized nucleic acid molecules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |