HUT72988A - Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages - Google Patents

Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages Download PDF

Info

Publication number
HUT72988A
HUT72988A HU9500993A HU9500993A HUT72988A HU T72988 A HUT72988 A HU T72988A HU 9500993 A HU9500993 A HU 9500993A HU 9500993 A HU9500993 A HU 9500993A HU T72988 A HUT72988 A HU T72988A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
sequence
tested
helper
oligonucleotides
Prior art date
Application number
HU9500993A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9500993D0 (en
Inventor
Sudhir Agrawal
Jin Yan Tang
Original Assignee
Hybridon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybridon Inc filed Critical Hybridon Inc
Publication of HU9500993D0 publication Critical patent/HU9500993D0/hu
Publication of HUT72988A publication Critical patent/HUT72988A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Description

A találmány tárgyát szintetikus oligonukleotidok - közelebbről: egy vagy több pozícióban nem-foszfodiészter intemukleotid kötést is tartalmazó oligonukleotidok - bázissorrendjének meghatározására szolgáló eljárások képezik.
A szintetikus oligonukleotidok széles körben alkalmazhatók, ideértve az antiszensz kemoterápiás célból történő felhasználást is. A szintetikus oligonukleotidok egyik legújabb alkalmazási területét bizonyos gén funkciók specifikus gátlása képezi. Az e célból használatos oligonukleotidok általában kiegészítői (komplementerei) a kódolódó vagy értelmes, azaz “szesz” RNSszálnak, ezért “antiszensz” oligonukleotidoknak nevezzük őket. Ismertek a szakirodalomból olyan antiszensz oligonukleotidok, melyek különböző génfunkciókat gátolnak.
Zamecnik és Stephenson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 280 (1986)] elsőnek írt le szövetkultúrában oligonukleotid által médiáit vírusreplikációgátlást, Rous-féle sarcoma vírus alkalmazásával.
Zamecnik és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)] az AIDS-vírus, a HTLV-ΠΙ (ma HIV-I) gátlását mutatták ki szövetkultúrában.
Különösen fontosak azok a szintetikus antiszensz oligonukleotidok, melyek egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmaznak. Az ilyen oligonukleotidok antiszensz kemoterápiás alkalmazás szempontjából fontosak, mivel ellentétben a kizárólag foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotidokkal, viszonylag jól ellenállnak a nukleolitikus degradációnak. Számos módosított intemukleotid kötést leírtak a szakirodalomban.
Agrawal és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083 (1988)] foszforamidát és foszforotioát oligonukleotidok alkalmazásával megnövekedett gátló hatásról számolnak be HIV-1-vírustenyészetben.
··· ··· ·
-3 Sárin és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451 (1988)] metilfoszfonát oligonukleozid alkalmazásával emelkedett gátló hatást kaptak HÍV-1 -kultúrában.
Agrawal és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794 (1989)] foszforotioát oligonukleotidok alkalmazásával a HIV-1-vírus nukleotidszekvencia-specifikus gátlásáról számolnak be mind korai, mind krónikus vírusfertőzés esetén.
Leiter és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434 (1990)] az influenza vírus replikációjának foszforotioát oligonukleotidok hatására bekövetkező gátlásáról számolnak be.
Sajnálatos módon az antiszensz kemoterápiában alkalmazott oligonukleotidok túlságosan rövidek ahhoz, hogy azokat hagyományos szekvencia-meghatározási módszerekkel szekvenálni tudjuk. Mindazáltal hatékony alkalmazásukhoz szekvenciájuk pontos ismerete szükséges, így minőségi ellenőrző vizsgálatokat kell végezni, hogy meggyőződjünk arról, hogy az alkalmazott oligonukleotid a kívánt szekvenciával rendelkezik-e. Jelenleg az ilyen oligonukleotidok szekvenciája gyakran csak feltételezett, amely feltételezés magán a lépésről-lépésre történő szintézisen alapul, ugyanis nincs megfelelő eljárás, amely alkalmas szekvenciájuk meghatározására, különösen azon esetekben, melyekben az oligonukleotid nem-foszfodiészter intemukleotid kötéseket is tartalmaz.
Az oligonukleotidok analízisére korábban kidolgozott eljárások széleskörű alkalmazás céljára nehézkesek. Agrawal és munkatársai [J.Cromatography 509, 396-399 (1990)] közzétettek egy foszforotioát oligonukleotidok analízisére alkalmas eljárást, amely szerint a foszforotioát kötéseket foszfodiészter-kötésekké alakítják, majd kígyóméreg foszfodiészterázos és foszfatázos emésztés után a bázis összetételt fordított fázisú HPLC-oszlopon analizálják.
-4Fennáll az igény a szintetikus oligonukleotidok szekvenciájának egyszerűbb és megbízhatóbb meghatározására, különösen azon oligonukleotidok esetében, amelyek nem-foszfodiészter-kötéseket is tartalmaznak.
A találmány szerinti megoldás az első hatékony és megbízható eljárás szintetikus oligonukleotidok nukleotidsorrendjének meghatározására. Különösen jelentős, hogy a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi az olyan oligonukleotidok nukleotidsorrendjének meghatározását, amelyek a 3'-végen egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmaznak.
A találmány szerinti eljárásban négy oligonukleotidot alkalmazunk. Az első a vizsgálandó oligonukleotid, amelyet szekvenálni fogunk. A második a “helper”, azaz segítő oligonukleotid, amelyet a vizsgálandó oligonukleotid 3'végéhez ligálunk, biztosítva ezzel a szekvenáláshoz szükséges megfelelő nukleotid hosszúságot (így alakul ki a “sequencing-length”, azaz “szekvenálható hosszúságú” oligonukleotid). A harmadik oligonukleotid a “molekuláris fércelő” (“molecular tack”) oligonukleotid, melynek szekvenciája komplementer egyrészt a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével, másrészt a segítő oligonukleotid 5'-végével.
A fenti három oligonukleotidot hibridizációra alkalmas körülmények között komplexet képez, amelyben a molekuláris fércelő oligonukleotid a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végét és a segítő oligonukleotid 5'-végét egymás közvetlen közelségében tartja. A minta és segítő oligonukleotidot ezután összeligáljuk, kialakítva ily módon egy szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot. Ezután egy negyedik oligonukleotidot, egy olyan jelzett láncindító (“primer”) oligonukleotidot hibridizálunk a szekvenálható hosszúságú oligonukleotidhoz, melynek szekvenciája komplementer a segítő oligonukleotid szekvenciájának egy részletével, majd végrehajtjuk a szekvenálást például a Sanger-féle didezoxi láncterminációs, vagy a Maxam és Gilbert-féle kémiai hasításos módszer alkalmazásával.
-5 ······· · • ··· ····· ··· * · ······ · ···· «· ·· · ··
Az alábbiakban röviden ismertetjük a csatolt ábrákat.
Az 1. ábra összefoglalva mutatja a szintetikus oligonukleotidok szekvenálására szolgáló találmány szerinti eljárás lépéseit.
A 2. ábra a találmány szerinti eljárás alkalmazásával végzett szekvenálás eredményét mutatja egy 5'- CTCTCGCA CCCATCTCTCTCCTTCT-3' szekvenciájú foszforotioát oligonukleotid esetén.
A 3. ábra a találmány szerinti eljárás alkalmazásával végzett szekvenálás eredményét mutatja egy 5'-CAGAGCAAAATCATCAGAAGA-3' szekvenciájú foszforotioát oligonukleotid esetén.
A találmány tárgyát képezi, egyrészt, egy hatékony és megbízható eljárás szintetikus oligonukleotidok szekvenciájának meghatározására. Általánosságban elmondhatjuk, hogy nukleotidsorrend-meghatározásra használt hagyományos metodikák alkalmazása a szintetikus oligonukleotidokra nehézkes, mivel ezek az oligonukleotidok rövidek ahhoz, hogy megfelelő templátként szolgáljanak. A találmány szerinti eljárás áthidalja ezt a problémát azáltal, hogy alkalmazásával előállítunk egy szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot, amely tartalmazza a szekvenálandó vizsgálandó oligonukleotidot és elegendő hosszúságú ahhoz, hogy megfelelő templátként szolgáljon.
A találmány tárgyát képezi, másrészt, egy hatékony és megbízható eljárás olyan szintetikus oligonukleotidok bázissorendjének meghatározására, amelyek 3'-végükön egy vagy több nem-foszfodiészter-kötést tartalmaznak. A 3'-végen foszfodi észter-kötéseket tartalmazó oligonukleotidok a terminális dezoxinukleotid transzferáz enzim segítségével meghosszabbíthatók, így a molekula hossza elegendő lesz a szekvenáláshoz. A terminális dezoxinukleotid transzferáz enzim azonban meglehetősen specifikusan foszfodi észter intemukleotid kötést igényel a meghosszabbítandó oligonukleotid 3'-végén. Ebből következik, hogy a 3'-végen egy vagy több nem-foszfodiészter-kötést tartalmazó szintetikus oligonukleotidok gyenge szubsztrátjai a terminális dezoxinukleotid transzferáz enzimnek. A találmány szerinti eljárás megoldja ezt ···« • · · · « • · · · · · * · ··· • ······ · • · · · · · · -6a problémát. Az eljárás szerint ligáz enzim alkalmazásával összekötjük a vizsgálandó és a segítő oligonukleotidot, ezáltal létrehozunk egy szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot, amely már megfelelő templát a hagyományos szekvenálási eljárások mint pl. a Sanger-féle didezoxi láncterminációs vagy a Maxarn és Gilbert-féle kémiai hasításos módszer alkalmazásához. A ligázok kevésbé specifikusak a terminális intemukleotid kötésekre, mint a dezoxinukleotid transzferáz, így alkalmazhatók olyan oligonukleotidok összekapcsolására is, amelyek nem-foszfodiészter intemukleotid kötéseket is tartalmaznak.
A találmány bármelyik aspektusát tekintve a találmány szerinti eljárás az alábbi lépésekből áll. Először, három oligonukleotidból - a vizsgálandó oligonukleotidból, melynek szekvenciáját meg fogjuk határozni; a segítő oligonukleotidból, amely a megfelelő hosszúságot biztosítja; és a molekuláris fércelő oligonukleotidból, amely egymás közelében tartja a minta és segítő oligonukleotidot - álló komplexet hozunk létre. Másodszor, a vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat összeligáljuk, és így kialakítjuk a szekvenálható hoszszúságú oligonukleotidot. Bármelyik beszerezhető, jól ismert ligáz alkalmazható a kötés kialakítására. Az eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint T4 DNS ligázt alkalmazunk. Harmadszor, egy jelzett láncindító oligonukleotidot hibridizálunk a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid segítő oligonukleotid részéhez. Negyedszer, a láncindító oligonukleotidot meghosszabbítjuk egy polimeráz enzim segítségével. Számos polimeráz enzim ismert a szakirodalomban. Elvben ezek mindegyike alkalmazható. Előnyösen DNS polimerázt, legelőnyösebben a Taq DNS polimerázt alkalmazunk. Ebben a láncindító meghoszszabbító lépésben didezoxinukleotidokat is beépítünk, amennyiben a szekvencia-meghatározást a Sanger-féle eljárás szerint végezzük. Ha Maxam-Gilbertféle szekvenálást végzünk, didezoxinukleotidok beépítése nem szükségesek. A Maxam-Gilbert-féle módszer tartalmaz egy kémiai hasításos lépést is, amely nem szerepel a Sanger-féle eljárásban. Mind a Sanger-, mind a Maxam-Gilbert• · · • · · • »· · · ··· ···»·· · • · · · ·
- 7féle módszer jól ismert a technika állása szerint, ezért ezeket a továbbiakban nem részletezzük. Végül, a didezoxi-terminálással vagy a kémiai hasítással előállított oligonukleotid szekvenciákat olyan hagyományos eljárások szerint választjuk szét, amelyek molekulaméret alapján frakcionálnak (pl. kromatográfia vagy elektroforézis). A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint a molekulákat szekvenáló gélben elektroforetikusan választjuk szét. A szekvencia-mintázat ezután a hagyományos eljárásokkal értékelhető, s így meghatározható a vizsgálandó oligonukleotid bázissorrendje.
A találmány szerinti eljárás alkalmazásával elvileg bármilyen vizsgálandó oligonukleotid szekvenálható. A találmány szerinti eljárást előnyösen 4 és 100 nukleotid közötti hosszúságú vizsgálandó oligonukleotidok szekvenálására alkalmazzuk. A vizsgálandó oligonukleotidok legelőnyösebben 8 és 50 nukleotid közötti hosszúságúak. Elméletileg a vizsgálandó oligonukleotid bármilyen intemukleotid kötést tartalmazhat, vagy a különböző típusú kötések bármilyen kombinációját mindaddig, amíg a vizsgálandó oligonukleotid ágálható a segítő oligonukleotidhoz és polimeráz alkalmazásával meghosszabbítható. Bármely adott vizsgálandó oligonukleotid esetén ezek a paraméterek empirikusan meghatározhatók, nem elvárható mennyiségű kísérleti munka elvégzése nélkül, egyszerűen kísérleti ligálást és láncindító meghosszabbítást végezve, a leírás kísérletes részében megadott körülmények között. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végén legalább egy nemfoszfodiészter intemukleotid kötés van. A vizsgálandó oligonukleotidban lehet egynél több nem-foszfodiészter-kötés is, sőt az is lehet, hogy egy kötés sem foszfodiészter-kötés. A vizsgálandó oligonukleotid előnyösen tartalmazhat legalább foszforotioát, alkilfoszfonát foszforamidát, alkilfoszfonotioát, foszfoditioát és szulfon, szulfát, keto, foszfát-észter kötéseket, valamint foszforotioát és foszforamidát hidakat. Ezek mindegyikét leírták a szakirodalomban. A vizsgálandó oligonukleotid legelőnyösebben foszforotioát intemukleotid kötéseket tartalmaz.
-8• · · ··· » · ··· • · ···· · · «· ·· · ··
A találmány szerinti eljárás végrehajtásakor egy segítő oligonukleotidot Egálunk a vizsgálandó oligonukleotidhoz vagy a segítő oligonukleotid 5'-végén vagy a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végén lévő foszfátcsoporton keresztül, így kialakul a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid, amelynek hosszúsága elegendő ahhoz, hogy templátként szolgáljon a szekvenálási folyamatban. A segítő oligonukleotid hossza változhat attól függően, hogy milyen hosszú a vizsgálandó oligonukleotid, hiszen a lényeges paraméter a teljes “sequencing-length” oligonukleotid hosszúsága. így hosszabb vizsgálandó oligonukleotid esetén rövidebb segítőt alkalmazunk, míg rövidebb vizsgálandó oligonukleotidhoz hoszszabb segítő oligonukleotid szükséges. A szekvenálható hosszúságú oligonukleotid hossza előnyösen 8 és 50 nukleotid között van. Bármely adott vizsgálandó oligonukleotidhoz a segítő oligonukleotid hossza a megfelelő mérettartományon belül változhat, hogy kialakuljon a szekvenálható hosszúság. A segítő oligonukleotidnak bármilyen szekvenciája lehet és tartalmazhat bármilyen intemukleotid kötést, vagy a különböző kötések keverékét mindaddig, amíg az ligálható a vizsgálandó oligonukleotidhoz és templátként szolgál a láncindító oligonukleotid polimeráz általi meghosszabbításához. Ezek a paraméterek nem elvárható mennyiségű kísérleti munka elvégzése nélkül, gyorsan meghatározhatók bármely adott segítő oligonukleotid esetén egyszerűen kísérleti ligálások és láncindító meghosszabbítások végrehajtása útján, a leírás kísérletes részében megadott körülmények között. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a segítő oligonukleotid foszfodiészter oligonukleotid.
A találmány szerinti eljárás végrehajtásakor a vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat egy harmadik oligonukleotid a “molekuláris fércelő”-nek nevezett oligonukleotid tartja együtt. A molekuláris fércelő oligonukleotid a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végét és a segítő oligonukleotid 5'-végét tartja közelségben, mivel képes egyidejűleg ezekhez a szakaszokhoz hibridizálódni. Tehát a molekuláris férceidnek tartalmaznia kell egy olyan 5'-régiót, amely komplementer a segítő oligonukleotid 5'-végével és egy szomszédos 3' régiót, • ·» • ··· · · ··· • · ··♦·<· · ···· «· ·· « β·
-9amely komplementer a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével. A molekuláris fércelő lehet bármilyen hosszú mindaddig, amíg a segítő és vizsgálandó oligonukleotidokkal komplementer régiója elegendő hosszúságú, hogy mindkettőhöz egyidejűleg kapcsolódni tudjon. A molekuláris fércelő hossza előnyösen 8 és 50 nukleotid között van, és 5'-régiójában legalább 4 nukleotid komplementer a segítő oligonukleotid 5'-végével, szomszédos 3'-régiójában pedig legalább 4 nukleotid komplementer a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével. A molekuláris fércelő hossza legelőnyösebben 8 és 20 nukleotid között van.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott negyedik oligonukleotid egy láncindító oligonukleotid a polimerázos lánchosszabbításhoz. Ez a láncindító oligonukleotid lehet bármelyik hagyományos, jól ismert láncindító oligonukleotid, amelynek használata általánosan elterjedt a DNSszekvenálásban, vagy láncindító meghosszabbítási reakciókban. A láncindító oligonukleotid szekvenciája részben vagy egészben komplementer a segítő oligonukleotid szekvenciájával. A láncindító oligonukleotid 3'-vége előnyösen a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid segítő oligonukleotidból származó azon részletével komplementer, amely a vizsgálandó oligonukleotidból származó rész 3’-végétől számítva a 10-15. nukleotidnál kezdődik.
Az alábbi példákkal meg kívánjuk világítani a találmány szerinti eljárás bizonyos előnyös megvalósítási módjait, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. Ahol nincs külön jelezve a következő példákban az alábbi anyagokat és körülményeket alkalmaztuk.
A (y-32P)-ATP-t (3000 Ci/mmól) a NEN DuPont-tól, a T4 polinukleotid kinázt, a T4 DNS ligázt, a Taq DNS polimerázt és a didezoxinukleotidtrifoszfátokat pedig Promega-tól szereztük be. Az oligodezoxinukleotidok és a foszforotioát oligonukleotidok DNS-szintetizátor (Millipore, 8700-as modell) alkalmazásával, foszforamidit kémiával készültek. Az oligonukleotidok végcsoportvédelmét koncentrált NH4OH-val (55°C, 8 óra) szüntettük meg. A • · * · σ * » « * e • ··· «·· «, w »»» ··»· ··· ··;· \,·
- 10tisztítást 20 %-os poliakrilamid gélben (7 mól/1 karbamid) gélelektroforézissel végeztük.
1. példa
A minta és segítő oligomerek ligálása
Egy 35-tagú (5'-CTCCATTTTTTTTTCCCTATAGTGAGTCGTAT TAT) segítő oligomer foszforilálását T4 polinukleotid kinázzal végeztük a 2. példában leírtak szerint azzal az eltéréssel, hogy csak hideg ATP-t használtunk. Egy 12-tagú molekuláris fércelő oligomert szintetizáltunk, amelyben az 5'-vég felé eső szekvencia ATGGAT volt, a 3'-vég felé eső szekvencia pedig a mintaoligomer 3'-végével volt komplementer. 100 pmol, 5'-végen foszforilált segítő oligomert összekevertünk 200 pmol vizsgálandó és molekuláris fércelő oligomerrel 18 μΐ végtérfogatú reakcióéi eggyé, amely 2 μΐ, lOx-ligázpuffert is tartalmazott (300 mM Tris, pH 7.8; 100 mM MgCl2; 100 mM DTT és 10 mM ATP). A reakcióelegyet 37 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd jeges vízfürdőn lehűtöttük. Ezt követően 2 μΐ T4 DNS ligázt (300 egység/ml) adtunk az elegyhez. Egy éjszakán át 4 °C-on tartottuk, majd a ligázt inaktiváltuk (70 °C, 5 perc). A ligálás hatékonysága meghaladta a 90 %-ot. A szekvenálás során ezt az elegyet további tisztítás nélkül templátként használtuk.
2. példa
A szekvenáló láncindító oligonukleotid 5'-végének jelölése mM Tris, pH 7.5 pufferban, amely 10 mM MgCl2-t és 5 mM DTT-tartalmazott, összekevertünk 200 pmol T7 láncindító oligonukleotidot (5'-TAATACATC AT AGG) 300 pmól (y-32P)-ATP-t és 15 egység T4 polinukleotid-kinázt. A reakcióelegyet 40 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd a kinázt inaktiváltuk (70 °C, 5 perc). Az 5'-végen jelzett láncindító oligonukleotidot 20 %-os denaturáló poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk, láncindító oligonukleotidot tartalmazó a csíkot kivágtuk, a láncindító «· ·
-11 oligonukleotidot 0.5 mól/1 ammónium-acetáttal eluáltuk (1 éjszaka, szobahőmérséklet), végül 4 térfogat etanollal kicsaptuk.
3. példa
A szekvenáló reakció végrehajtása mM MgCl2-t tartalmazó 50 mM Tris, pH 9.0 pufferben 5 pmól ligációs el egyből származó templátot és 15 pmól, 5'-végen 32P-vel jelzett láncindító oligonukleotidot elegyítettünk. Az elegyet 10 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd 1.5 μΐ Taq DNS polimerázt (2500 egység/ml) adtunk. Az elegyet ezután négy, G, A, T ill. C-vel jelzett csőbe szétosztottuk (6 μΐ/cső). Az egyes csövekbe 1 μΐ megfelelő d/dd-NTP elegyet adtunk (lásd 1. táblázat), azokat 70 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd 1 μΐ „chase” keveréket (dGTP, dATP, dCTP, dTTP) egyenként 25mM - adtunk minden csőbe, és újabb 15 percig inkubáltuk 70 °Con. A reakciót 4 μΐ “stop” oldattal (10 mM NaOH, 85 % formamid, 0.05 % brómfenolkék és 0.05 % Xylene Cyanol) állítottuk le, majd az elegyet 70 °C-ra melegítettük (5 perc) és szekvenáló gélre vittük.
• * ·
1. TÁBLÁZAT
A d/ddNTP-ok elegyítés! szabályai a szekvenálás során
Összetevő G-elegy A-elegy T-elegy C-elegy
ddGTP 110 pmól/l - - -
ddATP - 1230 pmól/l - -
ddTTP - - 1600 pmól/l -
ddCTP - - - 890 pmól/l
dGTP 25 pmól/l 230 pmól/l 230 pmól/l 230 pmól/l
dATP 250 pmól/l 23 pmól/l 23 pmól/l 230 pmól/l
dTTP 250 pmól/l 230 pmól/l 23 pmól/l 230 pmól/l
dCTP 250 pmól/l 230 pmól/l 230 pmól/l 230 pmól/l
4. példa
Szekvenáló gélelektroforézis cm hosszú, 30 cm széles és 0,75 mm vastag, 8 %-os poliakrilamidgélre (7 mól/1 karbamid, 50 mmól/1 Tris-borát, pH 8,3 puffer, 2,5 mmól/1 EDTA tartalommal) vittük fel a 3. példa szerinti termékeket. A futtató puffer: 50 mmól/1 Tris-borát, pH=8,3, 2,5 mmól/1 EDTA. A mintákat a gélre vittük és 600 V; 50 mA áramerősséggel futtattuk, amíg a brómfenolkék jelzőfesték a gél aljától 5 cm-re nem ért. A gél szárítása után autoradiográfiás kiértékelést végeztünk.
A 2. és 3. ábra mutatja két különböző foszforotioát oligonukleotid szekvenálásának eredményét. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a találmány szerinti megoldás jól alkalmazható a nem-foszfodiészter - jelen esetben foszforotioát - intemukleotid kötéseket is tartalmazó oligonukleotidok szekvenálására. A találmány szerinti eljárást sikeresen alkalmaztuk mindkét eltérő szekvenciára, ami arra utal, hogy a siker nem a vizsgálandó ·· ·· ·· · «· • ··· ···· · ··· • · «··«·· · ···· ·· ·· · a·
- 13oligonukleotid bázisösszetételétől függ. Az eljárás egyetlen hátránya, hogy alkalmazásával az utolsó 5'-végi nukleotid nem határozható meg. így ezt az egy nukleotidot valamely terminális analízisre szolgáló eljárással kell azonosítani.
• · • ·· · ····· «·· • · ······ · ···· ·· · · · · ·
- ΜΑ SZEKVENCIÁK FELSOROLÁSA
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy szálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 12 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: igen
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGGAGAGAA GG
A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
- 15 • · · · ···· · ··· • · ····** • ·· · ·· ·· · · ·
HÁNY SZÁLÚ: egy szálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
A3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCCATTTTT TTTTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTAT
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy szálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: igen
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATAATACGAC TCACTATAGG
AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomi)
HIPOTETIKUS: nem
AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGAGCAAAA TCATCAGAAG A

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás oligonukleotidok szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy:
    (i) 5'- és 3'-végekkel egyaránt rendelkező vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat olyan molekuláris fércelő oligonukleotidhoz hibridizálunk, amely tartalmaz egy 5'-régiót, ami a segítő oligonukleotid 5'-végével komplementer, és egy szomszédos 3'régiót, ami pedig a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével komplementer;
    (ii) a segítő oligonukleotidot a vizsgálandó oligonukleotidhoz ligáljuk és így szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot hozunk létre;
    (iii) a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid egy segítő oligonukleotidból származó részletéhez olyan jelzett láncindító oligonukleotidot hibridizálunk, melynek szekvenciája komplementer a segítő oligonukleotid egy részletének szekvenciájával;
    (iv) a láncindító oligonukleotidot lánchosszabbító és láncterminációs nukleozid-trifoszfátok jelenlétében polimerázzal meghosszabbítjuk;
    (v) a meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat önmagában ismert eljárás szerint frakcionáljuk; és (vi) a meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulák frakcionálása alapján a vizsgálandó oligonukleotid szekvenciáját meghatározzuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként a 3'-végén egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként foszforotioát intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
  4. 4. Eljárás oligonukleotidok szekvenciájának meghatározására, azzal jellemezve, hogy:
    (i) 5'- és 3'-végekkel egyaránt rendelkező vizsgálandó és segítő oligonukleotidokat olyan molekuláris fércelő oligonukleotidhoz hibridizálunk, amely tartalmaz egy 5'-régiót, ami a segítő oligonukleotid 5'-végével komplementer, és egy szomszédos 3'régiót, ami pedig a vizsgálandó oligonukleotid 3'-végével komplementer;
    (ii) a segítő oligonukleotidot a vizsgálandó oligonukleotidhoz rigaijuk és így szekvenálható hosszúságú oligonukleotidot hozunk létre;
    (iii) a szekvenálható hosszúságú oligonukleotid egy segítő oligonukleotidból származó részletéhez olyan jelzett láncindító oligonukleotidot hibridizálunk, melynek szekvenciája komplementer a segítő oligonukleotid egy részletének szekvenciájával;
    (iv) a láncindító oligonukleotidot polimerázzal meghosszabbítjuk, és így meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat tartalmazó reakcióéi egyet állítunk elő;
    (v) a meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat tartalmazó reakcióelegyet a megfelelő Maxam-Gilbert-féle szekvenáló reagensek hatásának tesszük ki, és így elhasított meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat tartalmazó reakcióelegyet állítunk elő;
    (vi) az elhasított meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulákat önmagában ismert eljárás szerint frakcionáljuk; és • ·· · · ··· (vii) az elhasított meghosszabbított láncindító oligonukleotid molekulák frakcionálása alapján a vizsgálandó oligonukleotid szekvenciáját meghatározzuk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként a 3'-végén egy vagy több nem-foszfodiészter intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizsgálandó oligonukleotidként foszforotioát intemukleotid kötést tartalmazó oligonukleotid szekvenciáját határozzuk meg.
HU9500993A 1992-10-06 1993-10-06 Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages HUT72988A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/958,133 US5403709A (en) 1992-10-06 1992-10-06 Method for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9500993D0 HU9500993D0 (en) 1995-06-28
HUT72988A true HUT72988A (en) 1996-06-28

Family

ID=25500629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500993A HUT72988A (en) 1992-10-06 1993-10-06 Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5403709A (hu)
EP (1) EP0664836B1 (hu)
JP (1) JPH08504571A (hu)
KR (1) KR950704508A (hu)
AT (1) ATE134220T1 (hu)
AU (1) AU670843B2 (hu)
BR (1) BR9307192A (hu)
CA (1) CA2146365A1 (hu)
CZ (1) CZ85095A3 (hu)
DE (1) DE69301570T2 (hu)
DK (1) DK0664836T3 (hu)
ES (1) ES2083299T3 (hu)
FI (1) FI951612A (hu)
GR (1) GR3019910T3 (hu)
HU (1) HUT72988A (hu)
NO (1) NO951328L (hu)
NZ (1) NZ257032A (hu)
PL (1) PL308294A1 (hu)
RU (1) RU95110871A (hu)
WO (1) WO1994008052A1 (hu)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0600965T3 (da) * 1991-08-28 1998-09-23 Boehringer Mannheim Gmbh Primere til matrixafhængige, enzymatiske nukleinsyresynteser
US5525470A (en) * 1994-01-26 1996-06-11 Hybridon, Inc. Method of sequencing [short] oligonucleotides
US5589330A (en) * 1994-07-28 1996-12-31 Genzyme Corporation High-throughput screening method for sequence or genetic alterations in nucleic acids using elution and sequencing of complementary oligonucleotides
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
EP0718409A3 (en) * 1994-12-22 1999-02-03 Hitachi, Ltd. DNA preparation method
AU1710997A (en) * 1996-01-26 1997-08-20 Codon Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs
US5851804A (en) * 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US6291164B1 (en) 1996-11-22 2001-09-18 Invitrogen Corporation Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate
US20040072210A1 (en) * 1997-07-07 2004-04-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6218118B1 (en) 1998-07-09 2001-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method and mixture reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids by mass spectrometry
EP1147219A1 (en) 1999-02-05 2001-10-24 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Analysis method
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7501245B2 (en) * 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
EP1072679A3 (en) * 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
US20020009728A1 (en) * 2000-01-18 2002-01-24 Quantum Dot Corporation Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
US20040219532A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-04 Sampson Jeffrey R. Internal references measurements
WO2005001129A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Applera Corporation Mobility cassettes
US20050170367A1 (en) * 2003-06-10 2005-08-04 Quake Stephen R. Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids
US7169560B2 (en) * 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
EP1716254B1 (en) 2004-02-19 2010-04-07 Helicos Biosciences Corporation Methods for analyzing polynucleotide sequences
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
US20050239085A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Buzby Philip R Methods for nucleic acid sequence determination
US20050260609A1 (en) * 2004-05-24 2005-11-24 Lapidus Stanley N Methods and devices for sequencing nucleic acids
JP2008512084A (ja) * 2004-05-25 2008-04-24 ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション 核酸の配列決定のための方法およびデバイス
US7476734B2 (en) * 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US20070117104A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20070117103A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20060024678A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US20060118754A1 (en) * 2004-12-08 2006-06-08 Lapen Daniel C Stabilizing a polyelectrolyte multilayer
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US20060172328A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-03 Buzby Philip R Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction
US7482120B2 (en) * 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US20070117102A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20090305248A1 (en) * 2005-12-15 2009-12-10 Lander Eric G Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
US20080309926A1 (en) * 2006-03-08 2008-12-18 Aaron Weber Systems and methods for reducing detected intensity non uniformity in a laser beam
US7397546B2 (en) * 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4521509A (en) * 1982-11-24 1985-06-04 Research Corporation Method for degrading DNA
US4797355A (en) * 1985-06-13 1989-01-10 Amgen Inc. Methods for attaching polynucleotides to supports
EP0224126A3 (en) * 1985-11-25 1989-02-01 The University of Calgary Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers
KR910700348A (ko) * 1988-12-07 1991-03-14 원본미기재 삽입을 함유하는 또는 결실에 해당하는 dna의 풍부화 및 클로닝 방법

Also Published As

Publication number Publication date
FI951612A (fi) 1995-05-10
RU95110871A (ru) 1997-06-10
JPH08504571A (ja) 1996-05-21
PL308294A1 (en) 1995-07-24
EP0664836B1 (en) 1996-02-14
US5652103A (en) 1997-07-29
CA2146365A1 (en) 1994-04-14
AU670843B2 (en) 1996-08-01
US5403709A (en) 1995-04-04
DE69301570D1 (de) 1996-03-28
NO951328D0 (no) 1995-04-05
KR950704508A (ko) 1995-11-20
WO1994008052A1 (en) 1994-04-14
NZ257032A (en) 1997-06-24
HU9500993D0 (en) 1995-06-28
FI951612A0 (fi) 1995-04-05
DK0664836T3 (da) 1996-03-11
ATE134220T1 (de) 1996-02-15
CZ85095A3 (en) 1995-12-13
GR3019910T3 (en) 1996-08-31
EP0664836A1 (en) 1995-08-02
ES2083299T3 (es) 1996-04-01
DE69301570T2 (de) 1996-06-27
BR9307192A (pt) 1999-03-30
NO951328L (no) 1995-05-22
AU5324194A (en) 1994-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT72988A (en) Methods for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages
US5075216A (en) Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase
US5518900A (en) Method for generating single-stranded DNA molecules
CA2220418C (en) Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5863732A (en) Diagnostic kits for detection of target nucleic acid sequences
JP2788034B2 (ja) ポリヌクレオチドのアツセイのための増幅方法
US5527899A (en) Oligonucleotides with inverted polarity
US5739311A (en) Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5916777A (en) Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3&#39;-ribonucleotide primers
US5650271A (en) Enzymatic synthesis of oligonucleotides
JPH08322600A (ja) ３’−固有の校正活性を有するｄｎａポリメラーゼの使用
CA2270132A1 (en) Dna diagnostics based on mass spectrometry
JPH07270425A (ja) ターミナルトランスフェラーゼによる３’−ｒｎａ標識方法
WO2001062961A1 (de) Ligase/polymerase-verfahren zur detektion von cytosin-methylierung in dna proben
CA2180722A1 (en) A method of sequencing short oligonucleotides
WO1996040901A1 (en) Template and primer based synthesis of enzymatically cleavable oligonucleotides
US5869236A (en) Mutation detecting method using photobridging-stabilized double-stranded DNA denaturing gradient electrophoresis
US5652126A (en) Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
US6864049B1 (en) Method for producing hybridization complexes whose stability is substantially independent of the base composition of two hybridized nucleic acid molecules
JP2002507883A (ja) マススペクトロメトリーに基づくｄｎａ診断法

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee