JPH08504571A - 非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を含有する合成オリゴヌクレオチドをシーケンシングするための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は合成オリゴヌクレオチドに、より詳細には非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を有する合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することに関する。本発明はそのような修飾合成オリゴヌクレオチドをシーケンシングするための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を含有する合成オリゴヌクレオ チドをシーケンシングするための方法 発明の背景発明の分野 本発明は、アンチセンス化学療法薬としての使用を含む様々な目的のために有 効である合成オリゴヌクレオチドに関する。より詳細には、本発明はオリゴヌク レオチド内の１つあるいは２つ以上の位置で非ホスホジエステル・インターヌク レオチド結合を有するようなオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する ことに関する。関連技術の概要 合成オリゴヌクレオチドは広範囲の目的のために有効である。近年関心が高い のは、特異的遺伝子機能を阻害するための合成オリゴヌクレオチドの使用である 。この目的のために有効であるオリゴヌクレオチドは一般にＲＮＡのコーディン グ鎖あるいは「センス」鎖へ相補的であるので、アンチセンス・オリゴヌクレオ チドとして知られている。様々な遺伝子機能を阻害するアンチセンス・オリゴヌ クレオチドは先行技術において既知である。 Zamecnik及びStephenson（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75：280-284（1978） ）はラウス肉腫ウイルスを用いて 組織培養におけるウイルス複製のオリゴヌクレオチド媒介阻害を最初に証明した 。 Zamecnik等（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：4143-4146（1986））はＡＩＤ Ｓに関連するＨＴＬＶ-IIIウイルス（現在はＨＩＶ−１と呼ばれている）の組織 培養における阻害を証明した。 特に興味深いのは、非ホスホジエステル結合である１つあるいは２つ以上のイ ンターヌクレオチド結合を有する合成アンチセンス・オリゴヌクレオチドである 。このようなオリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル・インターヌクレオチ ド結合を有するオリゴヌクレオチドに比較して核溶解性分解に対する相対的耐性 を有することに起因してアンチセンス・化学療法アプローチにとって重要である 。多くのこのような修飾インターヌクレオチド結合は先行技術において記述され てきている。 Agrawal等（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：7079-7083（1988））は、オリ ゴヌクレオチド・ホスホルアミデートおよびホスホロチオエートを用いて、ＨＩ Ｖ−１の組織培養における阻害の有効性が上昇することを教えている。 Sarin等（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：7448-7451（1988））はオリゴヌ クレオシド・メチルホスホネートを用いて、ＨＩＶ−１の組織培養における阻害 の有効性が上昇することを教えている。 Agrawal等（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：7790-77 94（1989））は、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートを用いて、初期感染 の組織培養および慢性感染の組織培養の両方においてＨＩＶ−１のヌクレオチド 配列の特異的阻害を教えている。 Leiter等（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：3430-3434（1990））は、オリゴ ヌクレオチド・ホスホロチオエートによるインフルエンザウイルス複製の組織培 養における阻害を教えている。 あいにくなことに、アンチセンス化学療法アプローチのために有効であるオリ ゴヌクレオチドは従来のシーケンシング方法によって配列順序を決定するには短 か過ぎる。それでも、有効性のためには正確なシーケンシングが必要とされ、合 成オリゴヌクレオチドが望ましいヌクレオチド配列をもっていることを保証する ためには品質管理方法が必要とされる。現在、このようなオリゴヌクレオチドの 配列順序はしばしば、特に非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を有 するオリゴヌクレオチドが関係している場合は、それらの配列順序解析のために 利用できる便利な方法が存在しないので、段階的合成自体に基づいて正確である と仮定されている。 オリゴヌクレオチドを解析するための以前の方法は商業用に適用するには労を 要するものであった。Agrawal等（J．Chromatography 509：396-399（1990）） はホスホロチオエート結合からホスホジエステルへの転換、その後にヘビ毒ホス ホジエステラーゼを用いての消化、ホス ファターゼ処理および逆相ＨＰＬＣ上での塩基組成解析を含むオリゴヌクレオチ ド・ホスホロチオエートの解析を開示している。 特に非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオ チドのためには、より単純およびより確実に合成オリゴヌクレオチドのヌクレオ チド配列を決定する必要が残っている。 発明の簡単な概要 本発明は、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための初め ての有効かつ確実な方法を提供する。特に、本発明はオリゴヌクレオチドの3'末 端に１つあるいは２つ以上の非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を 有するオリゴヌクレオチドのためのそのような方法を提供する。 本発明に従った方法では、４種類のオリゴヌクレオチドを使用する。第１のオ リゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドがシーケンシングされるべきサン プル・オリゴヌクレオチドである。第２のオリゴヌクレオチドはシーケンシング 方法のために十分な長さのオリゴヌクレオチド（「シーケンシング長さ（sequen cing-length）」オリゴヌクレオチドとして知られている）を生じさせるために サンプル・オリゴヌクレオチドの3'末端に連結される「ヘルパー」オリゴヌクレ オチドである。第３のオリゴヌクレオチドは、サンプル・オリゴヌクレオチドの 3'末端およびヘルパー・オリゴヌクレオチドの5'末端 の両方に相補的である配列順序を有する「分子付加（molecular tack）」オリゴ ヌクレオチドである。 これら３種のオリゴヌクレオチドは、ヘルパー・オリゴヌクレオチドの5'末端 とサンプル・オリゴヌクレオチドの3'末端とを一緒に保有している分子付加オリ ゴヌクレオチドとともにアニールされる。その後サンプルおよびヘルパー・オリ ゴヌクレオチドはシーケンシング長さオリゴヌクレオチドを形成するために一緒 に連結される。ヘルパー・オリゴヌクレオチドの一部に相補的である配列順序を 有する標識プライマー・オリゴヌクレオチドである第４のオリゴヌクレオチドは 、その後シーケンシング長さオリゴヌクレオチドとアニールされ、シーケンシン グは例えばサンガー・ジデオキシ・チェインターミネーター法あるいはマキサム ・ギルバート化学開裂法を用いて実施される。 図面の簡単な説明 図１は合成オリゴヌクレオチドをシーケンシングするための本発明に従った方 法を要約している。 図２はヌクレオチド配列5'-ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴ ＴＣＴ-3'を有するオリゴヌクレオチド・ホスホロチオ・エートに対する本発明 の方法に従ったシーケンシングの結果を示している。 図３はヌクレオチド配列5'-ＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡ-3' を有するオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートに対する本発明の方法に従っ たシ ーケンシングの結果を示している。 発明の詳細な説明 第１の観点において、本発明は合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を 決定するための有効かつ確実な方法を提供する。一般に、合成オリゴヌクレオチ ドは有効な鋳型として役立たせるためには短か過ぎるために、ヌクレオチド配列 を決定するための従来の方法をこのような合成オリゴヌクレオチドのために使用 するのは困難である。本発明に従った方法はシーケンシングされるべきサンプル ・オリゴヌクレオチドを含有し、有効な鋳型として役立たせるために十分に長い シーケンシング長さオリゴヌクレオチドを生じさせることによってこの問題を克 服する。 第２の観点において、本発明はオリゴヌクレオチドの3'末端において１つある いは２つ以上の非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を有する合成オ リゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための有効かつ確実な方法を提 供する。オリゴヌクレオチドの3'末端でホスホジエステル結合を有するオリゴヌ クレオチドはシーケンシングに適切な長さの分子を生じさせるために末端デオキ シヌクレオチド・トランスフェラーゼを用いることによって伸長させることがで きる。しかし、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼは伸長するべき オリゴヌクレオチドの3'末端でのホスホジエステル・インターヌクレオチド結合 のための必要条件において やや特異的である。その結果として、3'末端において１つあるいは２つ以上の非 ホスホジエステル・ヌクレオチド結合を有する合成オリゴヌクレオチドは末端デ オキシヌクレオチド・トランスフェラーゼに対しては不良な基質となる傾向があ る。本発明の方法は、サンプル・オリゴヌクレオチドをヘルパー・オリゴヌクレ オチドへ結合するためにリガーゼ酵素を用い、それによってサンガー・ジデオキ シ・チェインターミネーター法あるいはマキサム・ギルバート化学開裂法のよう な従来の核酸シーケンシング方法を用いてシーケンシングするために適切な鋳型 であるシーケンシング長さオリゴヌクレオチドを生じさせることによってこの問 題を克服する。リガーゼは末端インターヌクレオチド結合に対する必要条件にお いて末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼよりは特異的ではないので 、非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチド を結合させるために使用することができる。 本発明のいずれかの観点に従うと、本発明による方法は下記のステップから構 成される。第１に、３種のオリゴヌクレオチド：ヌクレオチド配列を決定される べきサンプル・オリゴヌクレオチド、長さを生じさせるためのヘルパー・オリゴ ヌクレオチド、そしてサンプル・オリゴヌクレオチドとヘルパー・オリゴヌクレ オチドとを一緒に保有する分子付加オリゴヌクレオチドを一緒にアニールする。 第２に、サンプル・オリゴヌクレオチドとヘ ルパー・オリゴヌクレオチドを一緒に連結してシーケンシング長さオリゴヌクレ オチドを形成させる。この連結を実施するためには、入手可能なあらゆる周知の リガーゼを使用することができる。好ましい実施例においては、Ｔ４ ＤＮＡリ ガーゼを使用する。第３に、標識プライマー・オリゴヌクレオチドをシーケンシ ング長さオリゴヌクレオチドのヘルパー・オリゴヌクレオチド部分にアニールす る。第４に、ポリメラーゼ酵素によってプライマーを伸長させる。先行技術にお いて多数のポリメラーゼ酵素が既知である。原則的にはこれらは全てが適切であ る。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼを、最も好ましくはＴaq ＤＮＡポリメラ ーゼを使用する。塩基配列順序決定がサンガー法に従って行われる場合には、こ のプライマー伸長反応ステップにはジデオキシヌクレオチドを含める。マキサム ・ギルバートの配列順序決定法を使用する場合には、ジデオキシヌクレオチドを 使用する必要はない。マキサム・ギルバート法はその後サンガー法では使用され ない追加の化学開裂ステップを必要とする。先行技術においてはサンガー法もマ キサム・ギルバート法も周知であり、ここでこれ以上詳細に記載する必要はない であろう。最後に、ジデオキシ停止オリゴヌクレオチド配列あるいは化学的に開 裂されたオリゴヌクレオチド配列を大きさに従って分子を分離する標準方法（例 、クロマトグラフィー、電気泳動）に従って分別する。好ましい実施例において は、分子をシーケンシングゲル上 で電気泳動法によって分離させる。その後、サンプル・オリゴヌクレオチドのヌ クレオチド配列を決定するために従来の方法によってこの塩基配列の分別パター ンを解釈する。 本発明に従った方法では、原則としてあらゆるサンプル・オリゴヌクレオチド をシーケンシングすることができる。好ましくは、本発明に従った方法における サンプル・オリゴヌクレオチドは長さが約４から約100ヌクレオチドの範囲であ ろう。最も好ましくは、このようなサンプル・オリゴヌクレオチドは約８から約 50ヌクレオチドの範囲であろう。原則としては、そのサンプル・オリゴヌクレオ チドをヘルパー・オリゴヌクレオチドに連結することができ、さらにポリメラー ゼによって伸長させることができる限りにおいて、サンプル・オリゴヌクレオチ ドはあらゆる型のインターヌクレオチド結合あるいは様々な型のインターヌクレ オチド結合のあらゆる組み合わせさえもっていることが可能である。一定のサン プル・オリゴヌクレオチドについては、これらのパラメータは過度の実験を行わ なくとも、本明細書の実験の部において説明されている条件を用いて簡単に試験 連結およびプライマー伸長反応を実施することによって経験的に決定することが できる。好ましい実施例においては、サンプル・オリゴヌクレオチドは3'末端で 非ホスホジエステル結合である少なくとも１つのインターヌクレオチド結合をも っているであろう。このようなサンプル・オリ ゴヌクレオチドは全部が非ホスホジエステル結合をもっている場合まで含めて２ つ以上の非ホスホジエステル結合をもっていることがある。サンプル・オリゴヌ クレオチドに存在する非ホスホジエステル結合は好ましくは少なくともホスホロ チオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホノチ オエート、ホスホジチオエート、およびスルホン、硫酸エステル、ケト、リン酸 エステル、架橋ホスホロチオエートおよび架橋ホスホルアミデート結合を含んで いることがあり、これらは全部が先行技術において既知である。最も好ましいの はホスホロチオエート・インターヌクレオチド結合を有するサンプル・オリゴヌ クレオチドである。 本発明に従った方法においては、ヘルパー・オリゴヌクレオチドはヘルパー・ オリゴヌクレオチドの5'末端あるいはサンプル・オリゴヌクレオチドの3'末端に あるリン酸エステルを介してサンプル・オリゴヌクレオチドへ連結させてシーケ ンシング反応のための鋳型として役立つために十分な長さを有するシーケンシン グ長さオリゴヌクレオチドを生じさせる。重要なパラメータはシーケンシング長 さオリゴヌクレオチド全体の長さであるため、ヘルパー・オリゴヌクレオチドは サンプル・オリゴヌクレオチドの長さに依存して長さが変動することがある。し たがって、長いサンプル・オリゴヌクレオチドには短いヘルパー・オリゴヌクレ オチドを使用することができ、短いサンプル・オリゴヌクレオチドには長いヘル パー・ オリゴヌクレオチドが必要とされる。好ましくは、シーケンシング長さオリゴヌ クレオチドの長さは約８から約50ヌクレオチドの範囲であろう。したがって、ヘ ルパー・オリゴヌクレオチドの長さは一定のサンプル・オリゴヌクレオチドに対 して適切なサイズ範囲のシーケンシング長さオリゴヌクレオチドを生じさせるた めに変動するであろう。ヘルパー・オリゴヌクレオチドはそれをサンプル・オリ ゴヌクレオチドに連結することができ、さらにポリメラーゼによるプライマー・ オリゴヌクレオチドの伸長反応のための鋳型として役立つことができる限りにお いて、あらゆるヌクレオチド配列をもっていることが可能で、さらにあらゆる型 のインターヌクレオチド結合あるいは種々のインターヌクレオチド結合の混合物 をもっていることが可能である。これらのパラメータはヘルパー・オリゴヌクレ オチドに過度の実験を行わなくとも、本明細書の実験の部において説明されてい る条件を用いて簡単に試験連結およびプライマー伸長反応を実施することによっ て経験的に決定することができる。ある好ましい実施例においては、ヘルパー・ オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド・ホスホジエステルであろう。 本発明に従った方法においては、サンプル・オリゴヌクレオチドおよびヘルパ ー・オリゴヌクレオチドは、「分子付加」オリゴヌクレオチドと称されている第 ３のオリゴヌクレオチドによる連結のために一緒に保有される。この分子付加オ リゴヌクレオチドはサンプル・オリ ゴヌクレオチドおよびヘルパー・オリゴヌクレオチドをサンプル・オリゴヌクレ オチドの3'末端およびヘルパー・オリゴヌクレオチドの5'末端とアニーリングに よって一緒に保有する。したがって、分子付加オリゴヌクレオチドはヘルパー・ オリゴヌクレオチドの5'末端へ相補的である5'領域およびサンプル・オリゴヌク レオチドの3'末端へ相補的である隣接3'領域から構成されるヌクレオチド配列を 保有していなければならない。分子付加オリゴヌクレオチドはヘルパー・オリゴ ヌクレオチドおよびサンプル・オリゴヌクレオチドへ相補的である領域がヘルパ ー・オリゴヌクレオチドおよびサンプル・オリゴヌクレオチドの両方をアニール するために十分な長さである限りにおいて、いかなる長さであってもよい。好ま しくは、分子付加オリゴヌクレオチドは長さが約８から約50ヌクレオチドであり 、さらにサンプル・オリゴヌクレオチドの3'末端へ相補的である最低４ヌクレオ チドを有する3'領域に隣接するヘルパー・オリゴヌクレオチドの5'末端へ相補的 である最低４ヌクレオチドを有する5'領域を有しているであろう。最も好ましく は、分子付加オリゴヌクレオチドは長さが約８から約20ヌクレオチドであろう。 本発明に従った方法において使用する第４のオリゴヌクレオチドはポリメラー ゼ伸長反応のためのプライマー・オリゴヌクレオチドである。このプライマー・ オリゴヌクレオチドは、周知の、ＤＮＡシーケンシングあるい はプライマー伸長反応のために一般に使用されている従来の型のあらゆるオリゴ ヌクレオチドであることができる。プライマー・オリゴヌクレオチドはヘルパー ・オリゴヌクレオチドの全部あるいは一部に相補的である配列順序をもっている であろう。好ましくは、プライマー・オリゴヌクレオチドの3'末端はシーケンシ ング長さオリゴヌクレオチドのサンプル・オリゴヌクレオチド部分の3'末端から 約10から約15ヌクレオチドであるヘルパー・オリゴヌクレオチドの部分に対して 相補的であろう。 下記の実施例は本発明に従った方法の一定の好適な実施例を詳細に例示するこ とが意図されており、事実上これに限定することを意図したものではない。他に 特別に指示されていない場合を除いて、下記の実施例において使用する材料およ び条件は次の通りである。 ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（3000Ｃｉ／mmol）は、ＮＥＮ DuPont社から入手した。 Ｔ4-ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ4-ＤＮＡリガーゼ、Ｔaq-ＤＮＡポリメラー ゼおよびジデオキシヌクレオシド三リン酸はPromega社から入手した。オリゴデ オキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートはホスホル アミダイト化学を用いてＤＮＡシンセサイザー（Millipore社、Model 8700）を 使用して調製した。オリゴヌクレオチドの脱保護（deprotection）は濃ＮＨ₄Ｏ Ｈを用いて55℃で８時間かけて実施した。精製は20％ポリアクリルアミド（７M 尿素）ゲル電気泳動法を用いて実施した。 実施例１ サンプルおよびヘルパー・オリゴマーの連結 「ヘルパー・オリゴマー」（5'-ＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴ ＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴ、35-mer）のリン酸化（kination）を冷ＡＴＰ （アデノシン5'-三リン酸）だけを用いること以外は実施例２に記載の条件を用 いることによってＴ4-ポリヌクレオチドキナーゼにより実施した。第３のオリゴ マーである12-mer「分子付加オリゴマー」は5'-末端側の半分の配列順序がＡＴ ＧＧＡＧであり、3'-末端側の半分の配列順序がサンプルの3'-末端と相補的であ る場所で合成した。100 pmoleの5'-リン酸化「ヘルパー・オリゴマー」を200pmo leのサンプルおよび「分子付加オリゴマー］と一緒に２μｌの10×リガーゼ緩衝 液（300 mM Tris.、pH 7.8、100 mM ＭｇＣｌ₂，100 mM ＤＴＴ（ジチオトレイ トール）および10 mM ＡＴＰ）を含有する混合液（最終容積18μｌ）中で混合し た。その反応混合物を37℃で15分間インキュベートし、その後に氷浴中で冷却し た。この混合物に２μｌ Ｔ4-ＤＮＡリガーゼ（3000units/ml）を添加し、４℃ で一晩保持し、その後に70℃で５分間リガーゼの不活性化を実施した。90％以上 の連結を入手した。その後この混合物をそれ以上は精製せずにシーケンシングの 鋳型として使用した。 実施例２ シーケンシング・プライマーの5'-末端のラベリング 200 pmoleのＴ７プライマー（5'-ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ） を300 pmoleの［γ-³²Ｐ］ＡＴＰ（20μＣｉ）および15unitsのＴ4-ポリヌクレ オチドキナーゼと一緒に50 mM Tris.、pH 7.5、10 mM MgCl₂および５mM ＤＴＴ の反応混合物（最終容積15μｌ）中で混合した。その反応混合物を37℃で40分間 インキュベートし、その後に70℃、５分間でキナーゼの不活性化を実施した。5' -末端標識プライマーを20％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精 製し、その後にプライマー・バンドを切断し、0.5Ｍ酢酸アンモニウムを用いて 室温で一晩かけて溶離させ、その後にエタノールによって沈降させた（４容積） 。 実施例３ シーケンシング反応の実施 連結混合物からの5 pmoleの鋳型を15 pmoleの5'-末端³²Ｐ-標識プライマーと 一緒に50 mM Tris.、pH 9.0、および10 mM ＭｇＣｌ₂の混合物（最終容積25μｌ ）中で混合した。その混合物を37℃で10分間インキュベートし、その後に1.5μ ｌのＴaqＤＮＡポリメラーゼ（2500units/ml）を添加し、これを４本の試験管（ 各６μｌ）に分割し、これらにＧ、Ａ、ＴおよびＣとラベル付けした。 対応する試験管に１μｌの適切なd/ddＮＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸/2 ',3'-ジデオキシヌクレオシド三リン酸）ミックス（表Ｉ参照）を添加し、その 反応混合物を70℃で15分間インキュベートし、その後１μｌの 追跡（chase）混合物（dＧＴＰ、dＡＴＰ、dＣＴＰおよびdＴＴＰ各25mM）を各 試験管に添加し、それをその後さらに70℃で15分間インキュベートした。反応を 停止させるために４μｌの停止溶液（10 mM ＮａＯＨ、85％ホルムアミド、0.05 ％ブロモフェノール・ブルーおよび0.05％キシレン・シアノール）を添加し、そ の後にシーケンシング・ゲル上にローディングする前に70℃で５分間に亘って加 熱した。 実施例４ シーケンシング・ゲル電気泳動法 長さ40cm、幅30cmおよび厚さ0.75mmの８％ポリアクリルアミドゲル（尿素7M、 50 mM Tris-borate，pH8.3，2.5 mM ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））を 実施例３の生成物と一緒にローディングした。連続緩衝液（running buffer）は 50 mM Tris-borate，pH 8.3，2.5 mM ＥＤＴＡであった。サンプルをゲル上にロ ーディングし、ブロモフェノール・ブルー染料マーカーがゲル基部から約５cmと なるまで600Ｖ、50mＡで電気泳動法を実施した。ゲルを乾燥させ、オートラジオ グラフィーで調査した。 結果は図２および図３に２種のオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートにつ いて示されている。これらの結果は、本発明が本例ではホスホロチオエート結合 における非リン酸エステルインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチ ドを用いた場合に良好に作用することを例示している。本発明はこれらの異なる 塩基配列の両方に対して上首尾を得たが、これはその成功がサンプル・オリゴヌ クレオチドの塩基組成に依存していることを示している。本方法の唯一の限界は 、5'-末端しかもっていないヌクレオチドの配列順序を決定できないことである と思われる。したがって、このヌクレオチドの性質は末端解析のための方法によ って検証しなければならないであろう。 塩基配列一覧 （１） 一般情報： （ｉ）特許出願人： アグローワル・サディール タン・ジン‐ヤン （ii）発明の名称：非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合を含有す る合成オリゴヌクレオチドをシーケンシングする方法 （iii）塩基配列の数：５ （iv）通信宛て先： （A）宛先：アレグレッティ＆ウィトコフ社 （B）所番地：75ステート・ストリート、スイート 2300 （C）市名：ボストン （D）州名：マサチューセッツ （E）国名：米合衆国 （F）ＺＩＰ番号：02109 （ｖ）コンピュータ・リーダブル・フォーム： （A）媒体の型：フロッピーディスク （B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （C）オペレーティングシステム：ＰＣ-ＤＯＳ／ ＭＳ-ＤＯＳ （D）ソフトウエア：Patentin Release＃1.0， Version＃1.25 （vi）現在の特許出願書データ： （A）特許出願書番号： （B）提出日： （C）分類： （vii）弁理士／代理人に関する情報： （A）氏名：キーオウン、ウェイン エイ． （B）登録番号：第33,923号 （C）関連／協議事項番号：92,620 （viii）遠距離通信に関する情報： （A）電話：617/345-9100 （B） FAX：617/345-9111 （C） TELEX：なし （２） 塩基配列ＩＤ ＮＯ：１についての情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A） 長さ：25塩基対 （B） 型：核酸 （C） 鎖構造：一本鎖 （D） トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮説的：ＮＯ （xi）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣ ＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣ ＣＴＴＣＴ （２） 塩基配列ＩＤ ＮＯ：２に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A） 長さ：12塩基対 （B） 型：核酸 （C） 鎖構造：一本鎖 （D） トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮説的：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡ ＧＧ （２） 塩基配列ＩＤ ＮＯ：３に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A） 長さ：35塩基対 （B） 型：核酸 （C） 鎖構造：一本鎖 （D） トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮説的：ＮＯ （xi）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＣＣＣＴＡＴ ＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴ ＡＴＴＡＴ （２） 塩基配列ＩＤ ＮＯ：４に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A） 長さ：20塩基対 （B） 型：核酸 （C） 鎖構造：一本鎖 （D） トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮説的：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ （２） 塩基配列ＩＤ ＮＯ：５に関する情報 （ｉ）塩基配列の特徴： （A） 長さ：21塩基対 （B） 型：核酸 （C） 鎖構造：一本鎖 （D） トポロジー（位相）：線形 （ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮説的：ＮＯ （xi）塩基配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡ ＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧ Ａ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 タン、ジン−ヤン アメリカ合衆国 01604 マサチューセッ ツ州 ワーセスター ナンバー２エル ウ ェルズ ストリート 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）各々5'および3'末端を有するサンプル・オリゴヌクレオチドおよび ヘルパー・オリゴヌクレオチドを、ヘルパー・オリゴヌクレオチドの5'末端へ相 補的である5'末端領域およびサンプル・オリゴヌクレオチドの3'末端へ相補的で ある隣接3'末端領域を有する分子付加オリゴヌクレオチドと一緒にアニーリング すること； （ｂ）シーケンシング長さオリゴヌクレオチドを生じさせるためにヘルパー・ オリゴヌクレオチドをサンプル・オリゴヌクレオチドへ連結すること； （ｃ）プライマー・オリゴヌクレオチドがヘルパー・オリゴヌクレオチドの部 分へ相補的であるヌクレオチド配列を有するときに標識プライマー・オリゴヌク レオチドをシーケンシング長さオリゴヌクレオチドのヘルパー・オリゴヌクレオ チド部分へアニーリングすること； （ｄ）連鎖伸長および連鎖停止ヌクレオシド・トリホスフェートの存在下でポ リメラーゼを用いてプライマー・オリゴヌクレオチドを伸長させること； （ｅ）標準方法に従って伸長プライマーを分別すること； （ｆ）分別した伸長プライマーからサンプル・オリゴヌクレオチドのヌクレオ チド配列を決定すること、 からなるサンプル・オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方 法。 ２． サンプル・オリゴヌクレオチドが3'末端に１つあるいは２つ以上の非ホス ホジエステル・インターヌクレオチド結合を有する請求項１記載の方法。 ３． 非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合がホスホロチオエート結 合である請求項２記載の方法。 ４． （ａ）各々5'および3'末端を有するサンプル・オリゴヌクレオチドおよび ヘルパー・オリゴヌクレオチドを、ヘルパー・オリゴヌクレオチドの5'末端へ相 補的である5'末端領域およびサンプル・オリゴヌクレオチドの3'末端へ相補的で ある隣接3'末端領域を有する分子付加オリゴヌクレオチドと一緒にアニーリング すること； （ｂ）シーケンシング長さオリゴヌクレオチドを生じさせるためにヘルパー・ オリゴヌクレオチドをサンプル・オリゴヌクレオチドへ連結すること； （ｃ）プライマー・オリゴヌクレオチドがヘルパー・オリゴヌクレオチドの部 分へ相補的であるヌクレオチド配列を有するときに標識プライマー・オリゴヌク レオチドをシーケンシング長さオリゴヌクレオチドのヘルパー・オリゴヌクレオ チド部分へアニーリングすること； （ｄ）プライマー伸長生成物を生じさせるためにポリメラーゼを用いてプライ マー・オリゴヌクレオチドを伸長させること； （ｅ）開裂されたプライマー伸長生成物を生じさせるために適切なマクサム・ ギルバート・シーケンシング試薬を用いてプライマー伸長生成物を開裂すること ； （ｆ）標準方法に従って開裂したプライマー伸長生成物を分別すること； （ｇ）分別した開裂プライマー伸長生成物からサンプル・オリゴヌクレオチド のヌクレオチド配列を決定すること、 からなるサンプル・オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方 法。 ５． サンプル・オリゴヌクレオチドが3'末端に１つあるいは２つ以上の非ホス ホジエステル・インターヌクレオチド結合を有する請求項４記載の方法。 ６． 非ホスホジエステル・インターヌクレオチド結合がホスホロチオエート結 合である請求項５記載の方法。