CZ85095A3 - Determination method of nucleotide sequence of an oligonucleotide sample - Google Patents

Determination method of nucleotide sequence of an oligonucleotide sample Download PDF

Info

Publication number
CZ85095A3
CZ85095A3 CZ95850A CZ85095A CZ85095A3 CZ 85095 A3 CZ85095 A3 CZ 85095A3 CZ 95850 A CZ95850 A CZ 95850A CZ 85095 A CZ85095 A CZ 85095A CZ 85095 A3 CZ85095 A3 CZ 85095A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
oligonucleotide
sample
primer
helper
sequencing
Prior art date
Application number
CZ95850A
Other languages
English (en)
Inventor
Sudhir Agrawal
Jin Yan Tang
Original Assignee
Hybridon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybridon Inc filed Critical Hybridon Inc
Publication of CZ85095A3 publication Critical patent/CZ85095A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Description

etHAGAGAGOTA·!·
3’CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTCTCCAT(T) CCCTATAGTGACTCGTATTAT (57) Způsob stanovení nukleotidové sekvence syntetických oligonukleotidů, zejména oligonukleotidů, které obsahují v jedné nebo více polohách nefosfodiesterové internukleotidové vazby, při němž se při jednom provedení postupuje tak, že se a) vzorkový oligonukleotid teplotně hybridizuje s pomocným oligonukleotidem, z nichž každý obsahuje 5’ a 3’-konec a s oligonukleotidem s příchytnou molekulou, jehož 5’-oblast je komplemetární k 5’-konci pomocného oligonukleotidu a jehož sousední 3’-oblast je komplemetární k 3’-konci vzorkového oligonukleotidu; b) pomocný oligonukleotid se liguje k vzorkovému oligonukleotidu za vzniku oligonukleotidu se sekvenční délkou; c) značený primerový oligonukleotid se teplotně hybridizuje k části oligonukleotidu se sekvenční délkou, která pochází z pomocného oligonukleotidu, přičemž příměrový oligonukleotid obsahuje oligonukleotidovou sekvenci, která je komplementární k části pomocného oligonukleotidu; d) primerový oligonukleotid se prodlouží působením polymerasy za přítomnosti nukleosidtrifosfátů prodlužujících a terminujících řetězec; e) prodloužené primery se standartním postupem frakcionují a f) stanoví se nukleotidová sekvence vzorkového oligonukleotidu z frakcionovaných prodloužených primerů.
Ugace
T y-CTCTCOCACCCATCTCTCTCCTTCTCTCCATmjCCCTATACTGAOTClirATTAT (oligonukleotid se sekvenačni délkou) teplotní hybridizace aekvenatnlho primem ggatatsactgagcataata Í-ctctcgcacccatctctct cctt ct ct ce ATfn ccct at ACTGAeresT att at i 8
I prodlužování polymerasou/
I didnoxy-terminace sekvenačnt gel IB% PÁCE)
01-642-95-Če
Způsob stanovení nukleotidové nukleotidu
C- í ' Z fs. t
sekvence vzorkového oTig (
f
Oblast techniky
Vynález se týká syntetických oligonukleotidu, které jsou užitečné pro řadu účelů, včetně pro použití jako antimediátorových chemoterapeutických činidel. Vynález se zejména týká způsobu stanovení nukleotidové sekvence těchto oligonukleotidu, které obsahují v jedné nebo více polohách nefosfodiesterové internukleotidové vazby.
Dosavadní stav techniky
Syntetické oligonukleotidy jsou užitečné pro celou řadu účelů. V nedávné době se stalo zajímavým použití syntetických oligonukleotidů k inhibiči specifické genové funkce. Oligonukleotidy užitečné k tomuto účelu jsou obvykle komplementární ke kódujícímu mediátorovému řetězci RNA, a proto jsou označovány názvem antimediátorové oligonukleotidy. Antimediátorové oligonukleotidy, které inhibují řadu genových funkcí jsou již v tomto oboru známy.
Zámečník a Stephenson (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 280 až 284 (1978)) jako první popsali oligonukleotidem zprostředkovanou inhibiči replikace viru v tkáňové kultuře za použití viru Rousova sarkomu.
Zámečník et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA,
73: 4143 až 4146 (1986)) popsali inhibiči viru HTLV-III (nyní nazývaného HIV-1), který se podílí na AIDS, v tkáňové kultuře.
Obzvláštní zájem je upřen na syntetické antimediátorové oligonukleotidy obsahující jednu nebo více internukleotidových vazeb, kterými jsou nefosfodiesterové vazby. Takové oligonukleotidy jsou důležité pro antimediátorové chemoterapeutické přístupy díky své relativní resistenci vůči nukleolytické degradaci ve srovnání s oligonukleotidy obsahujícími výlučně fosfodiesterové internukleotidové vazby. Mnoho takových modifikovaných internukleotidových vazeb již bylo popsáno v tomto oboru.
Agrawal et al. popsali v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7079 až 7083 (1988) inhibici HIV-1 v tkáňové kultuře za použiti oligonukleotidových fosforamidátů a fosforothioátů, při níž se dosahuje zvýšené účinnosti.
Sarin et al. popsali v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7448 až 7451 (1988) inhibici HIV-1 v tkáňové kultuře za použití oligonukleotidových methylfosfonátů, při níž se dosahuje zvýšené účinnosti.
Agrawal et al. popsali v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 7790 až 7794 (1989) inhibici HIV-1 jak v nedávno infikované, tak v chronicky infikované buněčné kultuře za použití oligonukleotidových fosforothioátů. Tato inhibice probíhá specificky s ohledem na sekvenci nukleotidů.
Leiter et al. popsali v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3430 až 3434 (1990) inhibici replikace chřipkového viru v tkáňové kultuře za použití oligonukleotidových fosforothioátů.
Oligonukleotidy, které jsou užitečné pro antimediátorový chemoterapeutický přístup, jsou však bohužel příliš krátké, než aby je bylo možno sekvenovat konvenčními sekvenačními metodami. Pro dosažení dobré účinnosti je však třeba znát správné sekvence, a také z hlediska kontroly kvality je nutno zajistit, aby syntetické oligonukleotidy měly požadované sekvence nukleotidů. V současné době se oligonukleotidové sekvence často považují za správné na základě provedené stupňovité syntézy, poněvadž neexistuje žádná vhodná metoda pro analýzu jejich sekvence, zejména jedná-li se o oligonukleotidy obsahující nefosfodiesterové internukleotidové vazby.
Dříve známé metody analýzy oligonukleotidú jsou příliš pracné pro obchodní aplikace. Agrawal et al. popisují v J. Chromatography 509: 396 až 399 (1990) analýzu oligonukleotidových fosforothioátú, která zahrnuje konversi fosforothioátových vazeb na fosfodiesterové vazby, po níž se provede štěpení fosfodiesterasou z hadího jedu, zpracování fosfatasou a analýza složení bází HPLC s obrácenými fázemi.
Stále přetrvává potřeba vyvinout jednodušší a spolehlivější způsob stanovení nukleotidové sekvence syntetických oligonukleotidú, zejména oligonukleotidú obsahujících nefosfodiesterové internukleotidové vazby.
Podstata vynálezu
Tento vynález poprvé poskytuje účinnou a spolehlivou metodu stanoveni nukleotidové sekvence syntetických oligonukleotidú. Vynález zejména poskytuje tuto metodu pro oligonukleotidy obsahující jednu nebo více nefosfodiesterových internukleotidových vazeb u 3'-konce těchto oligonukleotidú.
Při způsobu podle vynálezu se používá čtyř oligonukleotidů. Prvním oligonukleotidem je vzorkový oligonukleotid, tj. oligonukleotid, který má být sekvenován. Druhým oligonukleotidem je pomocný oligonukleotid, který se liguje k 3'-konci vzorkového oligonukleotidu za vzniku oligonukleotidu z dostatečnou délkou pro sekvenační postup (známý pod názvem oligonukleotid se sekvenační délkou). Třetím oligonukleotidem je oligonukleotid s příchytnou molekulou” (molecular tack), který má sekvenci komplementární jak k 3'-konci vzorkového oligonukleotidu, tak 5'konci pomocného oligonukleotidu.
Tyto tři oligonukleotidy se spolu teplotně hybridizují, přičemž oligonukleotid s příchytnou molekulou přidržuje 3'-konec vzorkového oligonukleotidu u 5'-konce pomocného oligonukleotidu. Potom se vzorkový oligonukleotid liguje s pomocným oligonukleotidem za vzniku oligonukleotidu se sekvenační délkou. Čtvrtý oligonukleotid, kterým je značený primerový oligonukleotidový, jehož sekvence je komplementární k části pomocného oligonukleotidu, teplotně hybridizuje s oligonukleotidem se sekvenační délkou a potom se provede sekvenace za použití například Sangerovy dideoxy-terminační metody nebo pomocí Maxamovy a Gilbertovy chemické metody štěpení.
Přehled obr, na výkresech
Na obr. 1 je znázorněn způsob sekvenování syntetických oligonukleotidů podle vynálezu.
Na obr. 2 je znázorněn výsledek sekvenačního postu pu podle vynálezu v případě oligonukleotidového fosforothio átu s nukleotidovou sekvencí.
5’-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3'
Na obr. 3 je znázorněn výsledek sekvenačního postu pu podle vynálezu v případě oligonukleotidového fosforothio átu s nukleotidovou sekvencí
5'-CAGAGCAAAATCATCAGAAGA-3'
Následuje podrobnější popis tohoto vynálezu.
Prvním aspektem tohoto vynálezu je účinný a spolehlivý způsob stanovení nukleotidové sekvence syntetických oligonukleotidů. Konvenční způsoby stanovení nukleotidové sekvence jsou obvykle obtížné použitelné pro syntetické oligonukleotidy, poněvadž takové oligonukleotidy jsou příliš krátké, než aby mohly sloužit jako účinný templát. Způsob podle vynálezu překonává tento problém tím, že se při něm zkonstruuje oligonukleotid se sekvenační délkou, zahrnující vzorkový oligonukleotid, který má být sekvenován, přičemž zkonstruovaný oligonukleotid je dostatečně dlouhý, aby mohl sloužit jako účinný templát.
Druhým aspektem tohoto vynálezu je účinný a spolehlivý způsob stanovení nukleotidové sekvence syntetických oligonukleotidů obsahujících jednu nebo více nefosfodiesterových internukleotidových vazeb u 3’ konce tohto oligonukleotidu. Oligonukleotidy obsahující fosfodiesterové vazby u 3’-konce je možno prodloužit za použití terminální deoxynukleotid transferasy za vzniku molekuly, která má vhodnou délku pro sekvenování. Terminální deoxynukleotid transferasa je však značně specifická, pokud se týče jejího požadavku na fosfodiesterovou internukleotidovou vazbu u 3’-konce prodlužovaného oligonukleotidů. V důsledku tohoto jsou syntetické oligonukleotidy obsahující jednu nebo více nefosfodiesterových nukleotidových vazeb u 3'-konce špatnými substráty pro terminální deoxynukleotid transferasu.
Způsob podle vynálezu překonává tento problém tím, že se při něm používá enzymu ligasy pro připojení vzorkového oligonukleotidů k pomocnému oligonukleotidů. Tím vzniká oligonukleotid se sekvenační délkou, který je vhodným templátem pro sekvenování 2a použití konvenčních sekvenačních postupů pro nukleové kyseliny, jako je Sangerova dideoxy-metoda termi- nace řetězců nebo Maxamova a Gilbertova chemická štěpící metoda. Ligasy jsou méně specifické ve svých požadavcích na terminální internukleotidové vazby než terminální deoxynukleotid transferasa, a může se jich proto použít pro připojování oligonukleotidů obsahujících nefosfodiesterové internukleotidové vazby.
Všechny způsoby podle vynálezu zahrnují následující stupně. Nejprve se spolu teplotně hybridizují tři oligonukleotidy: vzorkový oligonukleotid, jehož nuleotidová sekvence má být stanovena, pomocný oligonukleotid pro zajištění délky a oligonukleotid s příchytnou molekulou, který slouží pro přidržování vzorkového oligonukleotidu u pomocného oligonukleotidu. Potom se vzorkový oligonukleotid liguje s pomocným oligonukleotidem za vzniku oligonukleotidu se sekvenačnx délkou. Tato ligace se může provádět za použití jakékoliv dostupné dobře známé ligasy. V přednostním provedení se používá T4 DNA ligasy. Třetí stupeň spočívá v tepelné hybridizaci značeného příměrového oligonukleoti- ί dového k části oligonukleotidu se sekvenační délkou pocházející z pomocného oligonukleotidu. čtvrtý stupeň spočívá v prodloužení primeru za použití enzymu polymerasy.
V tomto oboru je známo velké množství různých polymeras.
V podstatě je možno použít kterékoliv z nich, přednostně se však používá DNA polymerasy a nej výhodně ji Taq DNA polymerasy.
Ve stupni prodlužování primeru se přidávají dideoxynukleotidy, pokud se má sekvenace provádět Sangerovou metodou. Pokud se má použít Maxamovy a Gilberty metody sekvenace, není nutno používat dideoxy-nukleotidů. Maxamova a Gilbertova metoda potom vyžaduje přídavný stupeň chemického štěpení, kterého se nepoužívá při Sangerově metodě. Jak Sangerova, tak Maxamova a Gilbertova metoda je dobře známa v tomto oboru a dále nebude podrobněji popisována. Nakonec
Ί se dideoxy-terminované nebo chemicky štěpené oligonukleotidové sekvence frakcionují standardními postupy, při nichž se molekuly oddělují podle své velikosti (například chromatograf ií nebo elektroforézou). V přednostním provedení se molekuly oddělují elektroforeticky na sekvenačním gelu. Frakcionační diagram sekvencí se potom interpretuje konvenčními postupy, a tak se zjistí nukleotidová sekvence vzorkového oligonukleotidu.
Při způsobu podle vynálezu se v podstatě může sekvenovat jakýkoliv vzorkový oligonukleotid. Přednostně se při způsobu podle vynálezu používá vzorkových oligonukleotidu o délce v rozmezí od asi 4 do asi 100 nukleotidů. Přednostní délka vzorkových oligonukleotidu leží v rozmezí od asi 8 do asi 50 nukleotidů. Vzorkové oligonukleotidy mohou v podstatě obsahovat jakýkoliv typ internukleotidových vazeb, a dokonce i jakoukoliv kombinaci různých typů internukleotidových vazeb, za předpokladu, že může být vzorkový oligonukleotid ligován k pomocnému oligonukleotidu a prodloužen působením polymerasy.
Pro každý daný vzorkový oligonukleotid mohou být tyto parametry zjištěny empiricky, aniž by to vyžadovalo rozsáhlé experimentování. Provede se jednoduše zkouška ligace a prodlužovací reakce příměrového oligonukleotidu za použití podmínek uvedených v experimentální části tohoto popisu. V přednostním provedení obsahují vzorkové oligonukleotidy přinejmenším jednu oligonukleotidovou vazbu u 3'-konce, která nemá povahu fosfodiesterové vazby.
Vzorkové oligonukletoidy mohou obsahovat více než jednu nefosfodiesterovou vazbu a mezním případem je situace, kdy jsou všechny internukleotidové vazby nefosfodiesterové.
Nefosfodiesterové vazby přítomné ve vzorkovém oligonukleotidu zahrnují přednostně fosforothioátové, δ
alkylfosfonátové, fosforamidátové, alkylfosfonothioátové, fosfodithioátové, sulfonové nebo sulfátové vazby, ketovazby, fosfátoesterové vazby, přemostěné fosforothioátové a přemostěné fosforamidátové vazby. Všechny tyto vazby jsou známé v tomto oboru. Největší přednost se dává vzorkovým oligonukleotidům obsahujícím fosforothioátové internukleotidové vazby.
Při způsobu podle vynálezu se pomocný oligonukleotid liguje s vzorkovým oligonukleotidem přes fosfát na 5'konci pomocného oligonukleotidú a 3' -konci vzorkového oligonukleotidu za vzniku oligonukleotidú se sekvenační délkou, tj. oligonukleotidú, který má dostatečnou délku pro to, aby mohl sloužit jako templát při sekvenačních reakcích. Pomocné oligonukleotidy mohou mít proměnlivou délku v závislosti na délce vzorkového oligonukleotidú, poněvadž důležitým parametrem je délka výsledného oligonukleotidú se sekvenační délkou. U delších vzorkových oligonukleotidú se tedy může použít kratších pomocných oligonukleotidú, zatímco u kratších vzorkových oligonukleotidú bude zapotřebí použít delších pomocných oligonukleotidú.
Oligonukleotid se sekvenační délkou má přednostně délku v rozmezí od asi 8 do asi 50 nukleotidů. Délka pomocného oligonukleotidú se tedy bude měnit tak, aby se za použití každého vzorkového oligonukleotidú získal oligonukleotid se sekvenační délkou ležící ve výše uvedeném rozmezí. Pomocný oligonukleotid může obsahovat jakoukoliv sekvenci oligonukleotidú a může obsahovat internukleotidové vazby jakéholikov typu nebo směs různých internukleotidových vazeb, pokud může být ligován ke vzorkovému oligonukleotidú a pokud může sloužit jako templát pro prodloužení oligonukleotidového primeru polymerasou. Tyto parametry je možno snadno zjistit bez nadměrného experimentování pro jakýkoliv daný pomocný oligonukleotid tím, že se provedou zkušební ligace a prodlužovací reakce primeru za podmínek uvedených v experimentální části tohoto popisu. Podle jednoho přednostního provedení se jako pomocného oligonukleotidu používá oligonukleotid fosfodiesteru.
Při způsobu podle vynálezu je vzorkový oligonukleotid přidržován u pomocnému oligonukleotidu,za účelem ligace, působením třetího oligonukleotidu, který je označován názvem oligonukleotid s příchytnou molekulou. Oligonukleotid s příchytnou molekulou přidržuje vzorkový oligonukleotid u pomocného oligonukleotidu tím, že se teplotně hybridizuje k 3'-konci vzorkového oligonukleotidu a 5'konci pomocného oligonukleotidu.
Oligonukleotid s příchytnou molekulou tedy musí obsahovat nukleotidovou sekvenci, zahrnující 5'-oblast, která je komplementární k 5'-konci pomocného oligonukleotidu a sousední 3'-oblast, která je komplementární k 3'-konci vzorkového oligonukleotidu. Oligonukleotid s příchytnou molekulou může mít jakoukoliv délku za předpokladu, že jeho oblasti, které jsou komplementární k pomocnému oligonukleotidu a vzorkovému oligonukleotid, mají dostatečnou délku, aby došlo k tepelné hybridizaci jak s pomocným oligonukleotidem, tak se vzorkovým oligonukleotidem. Přednostně má oligonukleotid s příchytnou molekulou délku v rozmezí od asi 8 do asi 50 nukleotidů, přičemž zahrnuje 5'-oblast s alespoň čtyřmi nukleotidy, která je komplementární k 5'-konci pomocného oligonukleotidu, s níž sousedí 3'-oblast s alespoň čtyřmi nukleotidy, která je komplementární k 3'-konci vzorkového oligonukleotidu. Přednostní délka oligonukleotidu s příchytnou molekulou leží v rozmezí do asi 8 do asi 20 nukleotidů.
Čtvrtým oligonukleotidem, kterého se používá při provádění vynálezu, je primerový oligonukleotid pro pro10 dlužování působením polymerasy. Tímto příměrovým oligonukleotidem může být jakýkoliv oligonukleotid konvenčního typu, který je v tomto oboru dobře znám a kterého se obvykle používá při sekvenování DNA nebo při prodlužovacích reakcích primeru. Oligonukleotid, který slouží jako primer obsahuje sekvenci, která je komplementární k celé sekvenci pomocného oligonukleotidu nebo její části. Přednostně je 3'-konec oligonukleotidového primeru komplementární k části pomocného oligonukleotidu, která se nalézá ve vzdálenosti od asi 10 do asi 15 nukleotidů od 3'-konce oligonukleotidové části oligonukleotidu se sekvenační délkou, kterážto část pochází ze vzorkového oligonukleotidu.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady podrobněji popisují přednostní provedení vynálezu. Jejich účelem je vynález pouze ilustrovat a nemají žádný vliv na omezení rozsahu vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, používá se v příkladech následujících materiálů a podmínek.
[Gamma-32p] ATP (3 000 Ci/mmol) je produkt získaný od firmy NEN DuPont. T4-polynukleotid kinasa, T4-DNA ligasa, Taq-DNA polymerasa a dideoxynukleosidtrifosfáty jsou produkty získané od firmy Promega. Oligonukleotidy a oligonukleotidové fosforothioáty se vyrábějí za použití syntetizátoru DNA (Millipore, Model 8700), který pracuje za použití fosforamiditové chemie. Deprotekce oligonukleotidů se provádí koncentrovaným hydroxidem amonným při teplotě 55 *C po dobu 8 hodin. Purifikace se provádí elektroforézou na 20% polyakrylamidovém gelu obsahujícím močovinu (7M).
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Ligace vzorkového oligomeru s pomocným oligomerem
Kinace pomocného oligomeru (5'-CTCCATTTTTTTTTCCCT ATAGTGAGTCGTATTAT, 35-meru) se provede působením T4-polynukleotidkinasy za podmínek popsaných v příkladu 2, pouze s tím rozdílem, že se použije chladného ATP. Třetí oligomer, 12-merový oligomer s příchytnou mokekulou, se syntetizuje tak, aby byla 5'-polovinou sekvence ATGGAG a aby byla 3'-polovina sekvence komplementární k 3'-konci vzorku. 100 pmol 5'-kinovaného pomocného oligomeru se smíchá s 200 pmol vzorku a oligomerem s příchytnou molekulou ve směsi (celkový objem 18 μΐ) obsahující 2 μΐ lOx ligasového pufru (300mM Tris o pH 7,8, lOOmM chlorid hořečnatý, lOOmM DTT a lOmM ATP). Reakční směs se 15 minut inkubuje při 37’C a potom se ochladí v ledové lázni. Ke směsi se přidají 2 μΐ T4-DNA ligasy (3 000 jednotek/ml a směs se udržuje přes noc při 4’C, načež se ligasa inaktivuje pětiminutovým působením teploty 70°C. Dosáhne se více než 90% ligace. Vzniklé směsi se použije jako templátu pro sekvenování bez toho, že by byla dále purifikována.
Příklad 2
Značení 5'-konců sekvenačního primeru
200 pm T7 primeru (5 ' -TAATACGACTCACTATAGG) se smíchá s 300 pm [gamma-32p] ATP (20 μϋί) a 15 jednotkami T4-polynukleotid kinasy v reakční směsi (celkový objem 15 μΐ) obsahující 50mM Tris o pH 7,5, lOmM chlorid hořečnatý a 5mM DTT. Reakční směs se 40 minut inkubuje při 37‘C a potom se kinasa inaktivuje pětiminutovým působením teploty 70’C. Primer se značeným 5'-koncem se purifikuje denaturační elektroforézou na 20% polyakrylamidovém gelu, pás primeru se vyřízne a eluuje 0,5M roztokem octanu amonného přes noc při teplotě místnosti a potom vysráží ethanólem (4 objemy).
Příklad 3
Provádění sekvenační reakce pm templátu z ligační směsi se smíchá s 15 pm primeru s 32P-značeným 5'-koncem ve směsi (celkový objem 25 μΐ) 50mM Tris o pH 9,0 a lOmM chloridu hořečnatého). Směs sé 10 minut inkubuje při 37”C a potom se k ní přidá 1,5 μΐ Taq DNA polymerasy (2 500 jednotek/ml). Vzniklá směs se rozdělí do čtyř zkumavek (každá obsahuje 6 μΐ) a tyto zkumavky se označí písmeny G, A, T a C. Do odpovídající zkumavky se přidá vždy 1 μΐ příslušné d/ddNTP směsi (viz tabulka I) a reakční směs se 15 minut inkubuje při 70*C. Potom se do každé zkumavky přidá 1 μΐ směsi chase (obsahující dGTP, dATP, dCTP a dTTP, vždy 25mM koncentraci) a zkumavky se dalších 15 minut inkubují při-70’C. Pro zastavení reakce se přidají 4 μΐ zastavovacího roztoku (stop-roztok) (lOmM hydroxid sodný, 85% formamid, 0,05% bromfenolová modř a 0,05% Xylen Cyanol). Vzniklá směs se 5 minut zahřívá na 70*c a potom se přenese na sekvenační gel.
Tabulka 1
Složení d/ddNTP pro použití při sekvenování
složka β směs λ směs Τ směs c směs
ddGTP 110 μΜ - - -
ddATP - 1230 μΜ «to -
ddTTP - - 1600 μΜ «*
ddCTP - - - 890 μΜ
dGTP 25 μΜ 230 μΜ 230 μΜ 230 μΜ
dATP 250 μΜ 23 μΜ 23 μΜ 230 μΜ
dTTP 250 μΜ 230 μΜ 23 μΜ 230 μΜ
dCTP 250 μΜ 230 μΜ 230 μΜ 230 μΜ
Příklad 4
Elektroforéza na sekvenačním gelu
Produkt z příkladu 3 se nanese na 8% polyakrylamidový gel (7M močovina, 50mM Tris-borátový pufr o pH 8,3 a 2,5mM EDTA) o délce 40 cm, šířce 30 cm a tlouštce 0,75 mm. Jako mobilní fáze se použije 50mM Tris-borátového pufru o pH 8,3 s obsahem EDTA ve 2,5mM koncentraci. Vzorky se nanesou na gel a podrobí elektroforéze při napětí 600 V a intenzitě proudu 50 mA. Elektroforéza se provádí tak dlouho, dokud se značka z bromfenolové modři nedostane do vzdálenosti asi 5 cm od spodního konce gelu. Potom se gel usuší a provede se autoradiograf ie.
Výsledky pro dva různé oligonukleotidové fosforothioáty jsou uvedeny na obr. 2 a 3. Tyto výsledky ukazují, že způsob podle vynálezu dobře pracuje s oligonukleotidy obsahujícími nefosfátové internukleotidové vazby, v tomto případě fosforothioátové vazby. Způsob je úspěšný u obou těchto různých sekvencí, což ukazuje, že úspěšnost je nezávislá na složení bází vzorkového oligonukleotidu. Tato metoda má zřejmě pouze jedno omezení, spočívající v tom, že nelze stanovit jeden nukleotid u 5'-konce. Povaha tohoto nukleotidu se tedy musí ověřit způsoby terminální analýzy.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Agrawal, Sudhir Tang, Jin-Yan (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Způsob sekvenování syntetických oligonukleotidů obsahuj ících nefosfodiesterové internukleotidové vazby (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Allegretti & Witcoff, Ltd.
(B) ULICE: 75 State Street, Suitě 2 300
(C) MĚSTO: Boston
(D) STÁT: Massachusetts
(E) ZEMĚ: USA
(F) PSČ: 02109 (ZIP)
(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze #1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) ZATŘÍDĚNÍ:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: Keown, Wayne A.
(B) ČÍSLO LICENCE: 33,923 (C) SPISOVÁ ZNAČKA: 92,620 (ix) INFORMACE O TELEKOMUNIKAČNÍM SPOJENÍ (A) TELEFON: 617/345-9100 (B) TELEFAX: 617/345-9111 (C) TELEX: není (2) INFORMACE O SEQ ID NO:1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 25 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:
CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
ATGGAGAGAA GG (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
CTCCATTTTT TTTTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTAT (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTIMEDIÁTOROVÁ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:
ATAATACGAC TCACTATAGG (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:
CAGAGCAAAA TCATCAGAAG A

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob stanoveni nukleotidové sekvence vzorkového oligonukleotidú, vyznačující se tím, že se
    a) vzorkový oligonukleotid teplotně hybridizuje s pomocným oligonukleotidem, z nichž každý obsahuje 5' a
    3'-konec a s oligonukleotidem s příchytnou molekulou, jehož 5'-oblast je komplementární k 5'-konci pomocného oligonukleotidú a jehož sousední 3'-oblast je komplementární k 3'konci vzorkového oligonukleotidú?
    b) pomocný oligonukleotid se liguje k vzorkovému oligonukleotidú za vzniku oligonukleotidú se sekvenační délkou;
    c) značený primerový oligonukleotid se teplotně hybridizuje k části oligonukleotidú se sekvenační délkou, která pochází z pomocného oligonukleotidú, přičemž primerový oligonukleotid obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k části pomocného oligonukleotidú;
    d) primerový oligonukleotid se prodlouží působením polymerasy za přítomnosti nukleosidtrifosfátů prodlužujících a terminujících řetězec;
    e) prodloužené primery se standardním postupemm frakcionují a
    f) stanoví se nukleotidové sekvence vzorkového oligonukleotidú z frakcionovaných prodloužených primerů.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vzorkový oligonukleotid obsahuje jednu nebo více nefosfodiesterových internukleotidových vazeb u 3'-konce.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že nefosfodiesterovou internukleotidovou vazbou je fosforothioátová vazba.
  4. 4. Způsob stanovení nukleotidová sekvence vzorkového oligonukleotidu, vyznačující se tím, že se
    a) vzorkový oligonukleotid teplotně hybridizuje s pomocným oligonukleotidem, z nichž každý obsahuje 5' a 3'-konec a s oligonukleotidem s příchytnou molekulou, jehož 5'-oblast je komplementární k 5'-konci pomocného oligonukleotidu a jehož sousední 3'-oblast je komplementární k 3'konci vzorkového oligonukleotidu;
    / b) pomocný oligonukleotid se liguje k vzorkovému oligonukleotidu za vzniku oligonukleotidu se sekvenační fc délkou;
    c) značený primerový oligonukleotid se teplotně hybridizuje k části oligonukleotidu se sekvenační délkou, která pochází z pomocného oligonukleotidu, přičemž příměrový oligonukleotid obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k části pomocného oligonukleotidu;
    d) primerový oligonukleotid se prodlouží působením polymerasy za vzniku prodlouženého příměrového produktu;
    e) prodloužený primerový produkt se štěpí vhodnými činidly pro Maxamovo a Gilbertovo sekvenování za vzniku štěpných produktů prodlouženého primeru;
    f) štěpné produkty prodlouženého primeru se standardními postupy frakcionují? a
    f) stanoví se nukleotidová sekvence vzorkového oligonukleotidu z frakcionovaných štěpných produktů prodlouženého primeru.
  5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že vzorkový oligonukleotid obsahuje jednu nebo více nefosfodiesterových internukleotidových vazeb u 3'-konce.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že nefosfodiesterovou internukleotidovou vazbou je fosforothioátová vazba.
    01-642-95-Če
    5 - CTCT CGC ACCC AT CT CT CT CCTT CT (vzorkový oligonukleotid) teplotní hybridizace (oligonukleotid s příchytnou molekulou)
    GGAAGAGAGGTA
    5'-CTCCAT(T)^CCT AT AGTGAGTCGT ATT AT (pomocný oligonukleotid)
    GGAAGAGAGGTA-5'
    5*CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTCTCCAT(T) CCCT AT AGTGAGTCGT ATT AT ligace
    5‘-CT CT CGC ACCCAT CT CT CT CCTT CT CT CC AT (T)gCCCT AT AGT GAGT CGT ATT AT (oligonukleotid se sekvenačni délkou) teplotní hybridizace sekvenačního primeru
    V
    GGATATCACTCAGCATAATA 5‘*CT CT CGCACCCAT CT CT CTCCTT CT CT CC AT (η CCCT AT AGTGAGTCGT ATT AT prodlužování polymerasou/ dideoxy-terminace sekvenačni gel (8% PAGE)
CZ95850A 1992-10-06 1993-10-06 Determination method of nucleotide sequence of an oligonucleotide sample CZ85095A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/958,133 US5403709A (en) 1992-10-06 1992-10-06 Method for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ85095A3 true CZ85095A3 (en) 1995-12-13

Family

ID=25500629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ95850A CZ85095A3 (en) 1992-10-06 1993-10-06 Determination method of nucleotide sequence of an oligonucleotide sample

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5403709A (cs)
EP (1) EP0664836B1 (cs)
JP (1) JPH08504571A (cs)
KR (1) KR950704508A (cs)
AT (1) ATE134220T1 (cs)
AU (1) AU670843B2 (cs)
BR (1) BR9307192A (cs)
CA (1) CA2146365A1 (cs)
CZ (1) CZ85095A3 (cs)
DE (1) DE69301570T2 (cs)
DK (1) DK0664836T3 (cs)
ES (1) ES2083299T3 (cs)
FI (1) FI951612A (cs)
GR (1) GR3019910T3 (cs)
HU (1) HUT72988A (cs)
NO (1) NO951328L (cs)
NZ (1) NZ257032A (cs)
PL (1) PL308294A1 (cs)
RU (1) RU95110871A (cs)
WO (1) WO1994008052A1 (cs)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0600965T3 (da) * 1991-08-28 1998-09-23 Boehringer Mannheim Gmbh Primere til matrixafhængige, enzymatiske nukleinsyresynteser
US5525470A (en) * 1994-01-26 1996-06-11 Hybridon, Inc. Method of sequencing [short] oligonucleotides
US5589330A (en) * 1994-07-28 1996-12-31 Genzyme Corporation High-throughput screening method for sequence or genetic alterations in nucleic acids using elution and sequencing of complementary oligonucleotides
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
EP0718409A3 (en) * 1994-12-22 1999-02-03 Hitachi, Ltd. DNA preparation method
AU1710997A (en) * 1996-01-26 1997-08-20 Codon Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs
US5851804A (en) * 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US6291164B1 (en) 1996-11-22 2001-09-18 Invitrogen Corporation Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate
US20040072210A1 (en) * 1997-07-07 2004-04-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6218118B1 (en) 1998-07-09 2001-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method and mixture reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids by mass spectrometry
EP1147219A1 (en) 1999-02-05 2001-10-24 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Analysis method
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7501245B2 (en) * 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
EP1072679A3 (en) * 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
US20020009728A1 (en) * 2000-01-18 2002-01-24 Quantum Dot Corporation Oligonucleotide-tagged semiconductor nanocrystals for microarray and fluorescence in situ hybridization
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
US20040219532A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-04 Sampson Jeffrey R. Internal references measurements
WO2005001129A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Applera Corporation Mobility cassettes
US20050170367A1 (en) * 2003-06-10 2005-08-04 Quake Stephen R. Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids
US7169560B2 (en) * 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
EP1716254B1 (en) 2004-02-19 2010-04-07 Helicos Biosciences Corporation Methods for analyzing polynucleotide sequences
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
US20050239085A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Buzby Philip R Methods for nucleic acid sequence determination
US20050260609A1 (en) * 2004-05-24 2005-11-24 Lapidus Stanley N Methods and devices for sequencing nucleic acids
JP2008512084A (ja) * 2004-05-25 2008-04-24 ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション 核酸の配列決定のための方法およびデバイス
US7476734B2 (en) * 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US20070117104A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20070117103A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20060024678A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US20060118754A1 (en) * 2004-12-08 2006-06-08 Lapen Daniel C Stabilizing a polyelectrolyte multilayer
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US20060172328A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-03 Buzby Philip R Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction
US7482120B2 (en) * 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US20070117102A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20090305248A1 (en) * 2005-12-15 2009-12-10 Lander Eric G Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
US20080309926A1 (en) * 2006-03-08 2008-12-18 Aaron Weber Systems and methods for reducing detected intensity non uniformity in a laser beam
US7397546B2 (en) * 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4521509A (en) * 1982-11-24 1985-06-04 Research Corporation Method for degrading DNA
US4797355A (en) * 1985-06-13 1989-01-10 Amgen Inc. Methods for attaching polynucleotides to supports
EP0224126A3 (en) * 1985-11-25 1989-02-01 The University of Calgary Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers
KR910700348A (ko) * 1988-12-07 1991-03-14 원본미기재 삽입을 함유하는 또는 결실에 해당하는 dna의 풍부화 및 클로닝 방법

Also Published As

Publication number Publication date
FI951612A (fi) 1995-05-10
RU95110871A (ru) 1997-06-10
JPH08504571A (ja) 1996-05-21
PL308294A1 (en) 1995-07-24
EP0664836B1 (en) 1996-02-14
US5652103A (en) 1997-07-29
CA2146365A1 (en) 1994-04-14
AU670843B2 (en) 1996-08-01
US5403709A (en) 1995-04-04
DE69301570D1 (de) 1996-03-28
NO951328D0 (no) 1995-04-05
KR950704508A (ko) 1995-11-20
WO1994008052A1 (en) 1994-04-14
NZ257032A (en) 1997-06-24
HU9500993D0 (en) 1995-06-28
FI951612A0 (fi) 1995-04-05
DK0664836T3 (da) 1996-03-11
HUT72988A (en) 1996-06-28
ATE134220T1 (de) 1996-02-15
GR3019910T3 (en) 1996-08-31
EP0664836A1 (en) 1995-08-02
ES2083299T3 (es) 1996-04-01
DE69301570T2 (de) 1996-06-27
BR9307192A (pt) 1999-03-30
NO951328L (no) 1995-05-22
AU5324194A (en) 1994-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ85095A3 (en) Determination method of nucleotide sequence of an oligonucleotide sample
US11396673B2 (en) Closed nucleic acid structures
EP0437459B1 (en) Methods for dna sequencing with thermus aquaticus dna polymerase
US5683869A (en) Method of nucleic acid sequencing
JP6301881B2 (ja) 等温核酸増幅
EP3620533B1 (en) Closed nucleic acid structures
US5739311A (en) Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
CA2220418C (en) Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5932450A (en) Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US5916777A (en) Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
WO1998039485A2 (en) Compositions and methods for analysis of nucleic acids
JPH08322600A (ja) ３’−固有の校正活性を有するｄｎａポリメラーゼの使用
O'Donnell et al. Complete replication of templates by Escherichia coli DNA polymerase III holoenzyme.
EP0227772B1 (en) Nucleic acid sequencing by exonuclease inhibition
CA2180722A1 (en) A method of sequencing short oligonucleotides
EP0747479A1 (en) Template and primer based synthesis of enzymatically cleavable oligonucleotides
US5652126A (en) Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
Tang et al. Method for sequencing synthetic oligodeoxynucleotide phosphorothioates