DE69219627T2 - Verfahren zur Bestimmung von einer Nukleinsäuresequenz - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von einer NukleinsäuresequenzInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion einer interessierenden Nukleinsäuresequenz und Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Hintergrund der Erfindung
- Verfahren zur direkten Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresguenzen sind bekannt und im Stand der Technik beschrieben. Kleppe et al. offenbaren in J. Mol. Biol. 56 (1971) S. 341-361 die Verwendung von Nukleinsäureprimern, die benachbart zu einer interessierenden spezifischen Nukleinsäuresequenz hybridisieren. Man läßt die Primer an gegenüberliegende Stränge eines denaturierten DNA-Doppelstrangs assoziiern und verlängert sie unter Verwendung von DNA-Polymerase und Nukleosidtriphosphaten, was zwei Duplexmoleküle der usprünglichen Nukleinsäuresequenz liefert. Aufeinanderfolgende Zyklen von Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung werden durchgeführt, um die Kopien der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz weiter zu amplifizieren.
- Auf das obige Verfahren wird nun als die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction PCR) Bezug genommen, die in den US 4 683 195 und US 4 683 202 weiter beschrieben ist, wobei die Verlängerung der hybridisierten Nukleinsäureprimer entweder mit DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Tag) oder durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I bewirkt wird. Die Nachteile dieses Verfahrens sind unter anderem die Notwendigkeit, die Reaktionstemperaturen alternierend zwischen mittleren (z.B. 55-60ºC) und sehr hohen (z.B. 90- 95ºC) Temperaturen einzustellen (mit wiederholter "Temperaturwechselbehandlung" ("thermal cycling") zu hohen Temperaturen), die für vielfache Zyklen mit großen Temperaturänderungen benötigte ausgedehnte Zeitdauer, um eine Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz zu erzielen, und das Auftreten von Sequenzfehlern in den amplifizierten Kopien der Nukleinsäuresequenz aufgrund von Fehlern, die während des vielfachen Kopierens von langen Sequenzgebieten auftauchen. Zusätzlich sind unbedingt ein oder mehrere weitere Verfahren für die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuresequenz erforderlich (z.B. Gelelektrophorese).
- Verfahren zur Amplifikation von alternierenden Nukleinsäuren sind in der W088/10315 (Siska Diagnostics) und der EP 329 822 (Cangene) und der EP 373 960 (Siska Diagnostics) offenbart, wobei eine zyklische Reaktion, die alternierende DNA und RNA umfaßt, mit zu einer spezifischen DNA-Sequenz benachbarten Oligonukleotiden durchgeführt wird, wobei diese Oligonukleotide einen Transkriptions-Promoter und eine Initiationsstelle umfassen. Die RNA-Kopien der so hergestellten spezifischen Sequenz, oder alternativ eine Input-Probe, die eine spezifische RNA-Sequenz umfaßt, werden dann unter Verwendung eines Nukleinsäure-Primers als DNA-Stränge kopiert, und die RNA aus dem resultierenden RNA:DNA-Hybrid wird entweder durch Denaturierung (W088/10315) entfernt oder unter Verwendung von RNase H (BP 329 022 und EP 373 960) zerstört. Das Hybridisieren von Oligonukleotiden unter Bildung eines Transkriptions-Promoters wird dann wiederholt, um die RNA-Produktion zu wiederholen. Die Amplifikation wird in erster Linie durch die Verwendung von effizienten RNA-Polymerasen erreicht, die bei jedem Zyklus einen Überschuß RNA-Kopien gegenüber DNA-Matrizen herstellen. Die Version dieses Verfahrens mit RNase H hat gegenüber der PCR den Vorteil, daß die Amplifikation potentiell bei konstanter Raumtemperatur erzielt werden kann. Während die PCR zu einer Verdopplung der DNA-Kopien bei jedem Zyklus führt, kann der DNA:RNA-Zyklus potentiell eine viel größere Amplifikation pro Zyklus erreichen, z.B. 10-100 RNA- Kopien pro Zyklus unter Verwendung einer T7 RNA-Polymerase. Ein Nachteil des in der EP 329 822 beschriebenen DNA: RNA-Zyklusverfahrens besteht darin, daß es Testnukleinsäuren mit bekannten, diskreten Enden für die Hybridisierung von Oligonukleotiden zur Bildung des Transkriptions-Promoters erfordert. Dies führt zu Schwierigkeiten bei der Detektion von z.B. spezifischen Genen in langen DNA-Molekülen. Weitere Nachteile dieses Verfahrens sind, daß mindestens 3 Enzyme benötigt werden, um den DNA:RNA-Zyklus durchzuführen, mit möglicherweise nachteiligen Konsequenzen in Bezug auf Stabilität, Kosten und Reproduzierbarkeit, und daß für die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuresequenz unbedingt ein oder mehrere weitere Verfahren erforderlich sind (z.B. Gelelektrophorese).
- Die oben beschriebenen Verfahren betreffen alle Verfahren, bei denen eine spezifische Nukleinsäureregion direkt kopiert wird und diese Nukleinsäurekopien weiter kopiert werden, um eine Amplifikation zu erzielen. Die Variabilität zwischen verschiedenen Nukleinsäuresequenzen ist so, daß sich die Geschwindigkeiten der Amplifikation durch den gleichen Prozeß zwischen verschiedenen Sequenzen wahrscheinlich unterscheiden, was zu Problemen z.B. beim Quantifizieren der usprünglichen Menge spezifischer Nukleinsäure führt. Andere Verfahren erfordern das Kopieren einer spezifischen Testnukleinsäure nicht. Die W087/06270 beschreibt die Verwendung von RNA-Sonden mit Sequenzen zur Amplifikation durch RNA-abhängige RNA-Polymerasen. Insbesondere beschreibt die Patentschrift eine autokatalytische Replikation durch die beta-Replikase des Bakteriophagen Q. Die Verwendung sequenzspezifischer RNA-Sonden mit einem benachbarten Promoter für die autokatalytische RNA-Amplifikation hat den Vorteil potentiell "einheitlicher" Amplifikation der hybridisierten Sonde selbst, statt verschiedener Nukleinsäuresequenzen; die Nachteile schließen jedoch die Notwendigkeit, unhybridisierte Sondenmoleküle vor der Amplifikation zu entfernen, und die Tatsache ein, daß ein Hybridisierungssignal von nur einer einzigen Hybridisierung abhängt (mit wahrscheinlichen Anstiegen in "Hintergrundgeräusch"). Die BP 320 308 beschreibt die Verwendung von Paaren komplementärer, benachbart hybridisierender Nukleinsäuresonden, die dann an der Hybridisierungsstelle zusammenligiert werden, um eine längere Sonde herzustellen. In aufeinanderfolgenden Zyklen von Denaturierung, Hybridisierung und Ligation können sowohl die spezifische Zielnukleotidsequenz als auch vorher ligierte Sonden als Matrize für die Bildung zusätzlicher ligierter Sonden dienen. Somit wird die Zielsequenz nicht selbst amplifiziert, sondern verursacht die Bildung ligierter Sonden, die wiederum als Substrate für weitere -Ligationen dienen. Dieses Verfahren hat die Nachteile, daß die Ligation von einzelsträngigen Enden ("Ligation scharfer Enden") wahrscheinlich ist, und es unbedingt ein oder mehrere zusätzliche Verfahren (z.B. Gelelektrophorese) erfordert, um die ligierten Sondenmoleküle zu detektieren.
- In einem Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Überprüfen des Vorliegens einer interessierenden Nukleinsäurese quenz in einer Probe, bei dem man die Probe mit einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde in Kontakt bringt, wobei die Sonden an die interessierende Sequenz hybridisieren können, so daß die Sonden einander benachbart oder im wesentlichen benachbart sind, und Teile der Sonden, die nicht komplementär zu der interessierenden Sequenz sind, zumindest teilweise hybrisidiert sind; man die Probe behandelt, so daß Kettenverlängerung von mindestens einer der Sonden auftritt und man die verlängerte Sonde detektiert.
- Man kann sich eine weitere Ausführungsform gemäß dem oben definierten Verfahren vorstellen, die ferner die Verwendung einer dritten Sonde und einer vierten Sonde umfaßt, wobei Teile der dritten bzw. vierten Sonde zumindest an einen Teil der Sequenzen der ersten und zweiten Sonde, die der interessie renden Sequenz komplementär sind, hybridisieren können, wodurch andere Teile der dritten und vierten Sonde miteinander hybridisieren können; und das Behandeln der Probe, um eine Kettenverlängerung der dritten oder vierten Sonde zu verursachen, wobei ein Teil der dritten oder vierten Sonde als Matrize fungiert.
- Im allgemeinen soll die erste Sonde eine Sequenz umfassen, die im wesentlichen der interessierenden Sequenz komplementär ist, und ferner eine Sequenz umfassen, die der interessierenden Sequenz im wesentlichen nicht komplementär ist. Üblicherweise enthalten diese 15-25 bzw. 2-10 Nukleotide. Ferner soll die zweite Sonde üblicherwei&e eine Sequenz umfassen, die der interessierenden Sequenz im wesentlichen komplementär ist, und ferner eine Sequenz umfassen, die der interessierenden Sequenz im wesentlichen nicht komplementär ist, die jedoch im wesentlichen zumindest einem Teil der Sequenz der ersten Sonde, die der interessierenden Sequenz nicht komplementär ist, komplementär ist. Üblicherweise enthalten diese Regionen der zweiten Sonde 15-25 bzw. 30-70 Nukleotide. Üblicherweise ist deshalb die zweite Sonde länger als die erste Sonde und kann als Matrize für die Verlängerung der ersten Sonde dienen.
- Als spezielle Variante des Obigen kann eine der Sonden selbstkomplementäre Nukleotide enthalten und deshalb in der Lage sein, die Verlängerung durch Self-Priming zu starten, wobei die gleiche Sonde als Matrize fungiert. Diese kann dann an die andere Sonde ligiert werden, die aufgrund ihrer gemeinsamen Hybridisierung an die interessierende Sequenz in Nachbarschaft zur verlängerten Sonde gehalten wird. Die Hybridisierung jener Teile der Sonden, die der interessierenden Sequenz nicht komplementär sind, wird durch eine vergleichsweise kurze Komplementaritatsregion zwischen den Sonden erreicht. Wie dem Fachmann klar ist, können die Hybridisierungsbedingungen leicht so gewählt werden, daß die beiden Sonden nur hybridisieren, wenn sie durch vorherige Hybridisierung an die interessierende Sequenz ("Ziel"-Sequenz) in Nachbarschaft zueinander stabilisiert sind. Deshalb wird die verlängerte Sonde nur in Gegenwart der interessierenden Sequenz gebildet.
- Das Vorliegen der verlängerten Sonde kann z.B. durch konventionelle Verfahren (z.B. durch Bindungssequenz-spezifische Nukleinsäuren, Proteine oder andere Substanzen oder durch Gelelektrophorese-Größenanalysen der verlängerten Sonde) detektiert werden. Ublicherweise jedoch ist das weitere Processing dieser neu synthetisierten DNA wünschenswert, um eine Amplifikation einer verlängerten Sondensequenz zu erreichen.
- Man kann sich verschiedene Verfahren zur Amplifikation der verlängerten Sonde vorstellen. Diese schließen natürlich Verfahren aus dem Stand der Technik, wie z.B. die Polymerasekettenreaktion (PER), ein. Jedoch zieht man auch andere, neuartige Verfahren in Betracht.
- In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer verlängerten, wie oben definiert hergestellten Sonde vor, bei dem nan:
- Eine weitere Sonde, die zumindest einem Teil der neu synthetisierten Sequenz der verlängerten ersten Sonde im wesentlichen komplementär ist, wird an eine verlängerte erste Sonde hybridisiert; die weitere Sonde wird unter Verwendung einer geeigneten Polymerase verlängert, wobei die verlängerte erste Sonde als Matrize verwendet wird; und die verlängerte erste und die weitere Sonde werden getrennt, so daß die verlängerte weitere Sonde als Matrize für die Verlängerung anderer Moleküle der ersten Sonde dienen kann, und die verlängerte erste Sonde als Matrize für die Verlängerung anderer Moleküle der weiteren Sonde dienen kann.
- Dieser Aspekt der Erfindung ist weiter unten beschrieben im Hinblick auf den unteren Teil von Figur 1.
- Üblicherweise ist die weitere Sonde ein Oligodesoxyribonukleotid, das durch eine DNA-Polymerase, üblicherweise Taq-Polymerase, verlängert werden kann.
- Alternativ zur Verwendung einer weiteren Sonde kann die verlängerte erste Sonde selbstkomplementäre Sequenzen am 3'-Ende enthalten. Nach Abtrennung vom Matrizenstrang kann die verlängerte erste Sonde deshalb mit sich selbst hybridisieren und dadurch ihre eigene Verlängerung durch Self-Priming starten.
- Auf diese Art und Weise kann durch wiederholte Zyklen von Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung die Amplifikation der ursprünglichen verlängerten Sonde erreicht werden. Die Denaturieruung wird vorzugsweise durch mäßiges Erwärmen erzielt.
- In einem bevorzugten Verfahren zur Amplifikation umfassen Teile der neu verlängerten Sonde und der komplementären, als Matrize verwendeten Sonde eine Region doppelsträngiger Nukleinsäuren, die durch eine Polymerase, besonders bevorzugt eine RNA-Polymerasen, erkannt wird. Effiziente RNA-Polymerasen, wie T7- oder SP6-Polymerase, können dann große Mengen RNA von einem der Stränge der doppelsträngigen Nukleinsäure (dem "Sinn"-Strang) herstellen. Zweckmäßigerweise ist die neu verlängerte Sonde der Sinnstrang.
- Wie bei der verlängerten Sondensequenz, kann die RNA-Kopie direkt, z.B. mit konventionellen Verfahren, detektiert werden. Alternativ kann es zweckmäßig sein, die RNA-Kopie weiter zu amplifizieren, um z.B. die Empfindlichkeit zu verbessern. Ein Verfahren zur Amplifikation der RNA ist weiter unten mit Hinweis auf Figur 2 beschrieben. In dieser Ausführungsform wird das RNA-Molekül nach dem Hybridisieren eines einsträngigen DNA-Moleküls verlängert, das der RNA-Kopie zumindest teilweise komplementär ist und somit als Matrize dienen kann. Das neue resultierende doppelstrangige Nukleinsäuremolekül umfaßt eine Erkennungsstelle für eine RNA-Polymerase. Vorzugsweise sollte diese Erkennungsstelle durch eine andere RNA-Polymerase erkannt werden, als die für das Herstellen der ursprünglichen RNA-Kopie verantwortliche. Dies erlaubt das Herstellen von RNA-Kopien. Diese RNA-Kopien können nach Hybridisieren an ein einsträngiges DNA-Molekül, das dem RNA- Molekül zumindest teilweise komplementar ist, wiederum verlängert werden. Das neue resultierende doppelstrangige Nukleinsäuremolekül umfaßt eine Erkennungs-stelle für eine RNA-Polymerase, die in der bevorzugten Ausführungsform das Herstellen von RNA-Kopien erlaubt, die die gleiche Sequenz wie das ursprüngliche RNA-Molekül aufweisen, das den Prozeß begonnen hat. Dies ist eindeutig eine effiziente Art der Amplifikation der RNA-Kopie.
- Eine weitere spezifische Ausführungsform wird vorgestellt, bei der das ursprüngliche hergestellte RNA-Molekül eine Region umfaßt, die durch eine Q-beta-Replikase repliziert und amplifiziert werden kann. Auf diese Art und Weise können vielfache Molekülkopien gebildet werden.
- Unabhängig davon, ob die RNA-Kopien amplifiziert werden oder nicht, können sie auf verschiedene Weisen detektiert werden, z.B. durch Hybridisierung an sequenzspezifische markierte Sonden, oder andere konventionelle Verfahren. Alternativ kann die RNA-Kopie, wie unten mit Hinweis auf Figur 3 detaillierter beschrieben, die notwendigen Translationsstart- und -stoppsignale enthalten, um eine vernünftig effiziente Translation in eine Aminosäuresequenz zu erlauben; deren Vorliegen aufgrund einiger besonderer Merkmale der Aminosäuresequenz einfach detektiert werden kann.
- In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung deshalb ein Verfahren zur Detektion des Vorliegens eines RNA-Moleküls bereit (umfassend Translationsstart- und -stoppcodons), bei dem man: das RNA-Molekül in eine Aminosäureseuqenz mit einem be sonderen Merkmal translatiert und die Aminosäuresequenz detektiert. Die RNA-Sequenz für die Translation hat eine Anzahl bevorzugter Merkmale: ihre Länge beträgt zweckmäßigerweise 100-200 Nukleotide. Das Translationsinitiationscodon sollte vorzugsweise 10 bis 30 Nukleotide vom 5'-Ende entfernt gele gen sein, wobei dieses Ende zweckmäßigerweise einen Triphosphat-verknüpften 7-Methylguanosinrest umfaßt.
- Zweckmäßigerweise wird die Translation unter Verwendung von Komponenten durchgeführt, die durch Kaninchenreticulocytenoder Weizenkeimlysate oder andere Zubereitungen, mit hoher Translationseffizienz bereitgestellt werden.
- Vorzugsweise dient die Aminosäuresequenz als Enzymaktivator, Cofaktor oder Repressor. Zweckmäßigerweise umfaßt die Aminosäuresequenz ein N-terminales Fragment von B-Galactosidase. Nach Zusatz des Rests von B-Galactosidase wird deshalb Enzymaktivität gebildet. Diese kann auf eine dem Fachmann gut bekannte Art detektiert werden (z.B. durch die Verwendung von Enzymsubstraten, die zu farbigen Produkten führen).
- Man kann andere Verfahren zur Amplifikation der erfindungsgemäßen verlängerten Sonde in Betracht ziehen. Diese schließen die Verwendung von 2 Paaren von Sonden ein, wie weiter unten mit Hinweis auf Figur 4 detaillierter beschrieben ist. In dieser Ausführungsform hybridisieren eine erste und zweite Sonde an eine Nukleotidzielsequenz, so daß sie benachbart oder im wesentlichen benachbart sind, so daß eine Sonde des Paars unter Verwendung der anderen Sonde als Matrize verlängert werden kann. Nach der Verlängerung können die erste und zweite Sonde von der Zielsequenz abgetrennt werden (z.B. durch Wärmedenaturierung), jedoch können sie aufgrund der verlängerten komplementären Sequenz selbst ein stabiles Hybrid bilden. Moleküle der dritten und vierten Sonde können dann an das stabile Hybrid der ersten/zweiten Sonde hybridisiert werden, so daß sie über Sequenzen, die den spezifischen Zielregionen der ersten bzw. zweiten Sonde komplementär sind, benachbart oder im wesentlichen benachbart sind. Auf diese Weise kann eine Sonde aus dem Paar der dritten/vierten Sonde unter Verwendung der anderen Sonde als Matrize wie zuvor verlängert werden. Diese Verlängerung ermöglicht es, daß die dritte und vierte Sonde ein stabiles Hybrid zu bilden, das deshalb als eine Zielsequenz für weitere Moleküle der ersten und zweiten Sonde dienen kann, was zu ihrer Hybridisierung und Verlängerung führt. Auf diese Weise kann in aufeinanderfolgenden Zyklen von Denaturierung und Renaturierung die Amplifikation der ursprünglich verlängerten Sondensequenz erreicht werden.
- Als eine Variante dieser Ausführungsform kann die Zielnukleotidsequenz doppelsträngig sein und die erste/zweite und dritte/vierte Sonde an gegenüberliegende Stränge des Ziels binden. Auf diese Weise kann eine Sonde von beiden Paaren während des gleichen Zyklus verlängert werden.
- Eine weitere Variante ist unten in bezug auf Figur 5 beschrieben. In dieser weiteren Ausführungsform können die erste und zweite Sonde an die interessierende Sequenz hybridisieren, so daß sie, wie zuvor, benachbart oder im wesentlichen benachbart sind. Jedoch enthält eines der Sondenpaare eine "Haarnadelschleife". Deshalb können sie nach Verlängerung einer der Sonden mit einer DNA-Ligase behandelt werden, um ein einheitliches, eine Schleife aufweisendes Molekül herzustellen. Wie zuvor können auch dritte und vierte Sonden vorliegen, die entweder an den anderen Strang der Nukleotidzielsequenz oder an das einheitliche, eine Schleife aufweisende Molekülhybrid der ersten und zweiten Sonden hybridisieren. Die Hybridisierung führt dazu, daß die dritte und vierte Sonde benachbart oder im wesentlichen benachbart sind, wodurch Priming und Verlängerung ermöglicht werden. Auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben, erlaubt der Einschluß einer Haarnadelschleife an einem Ende der Sondenmoleküle die Behandlung mit DNA-Ligase, was zur Bildung eines einheitlichen, eine Schleife aufweisenden Molekülhybrids der dritten und vierten Sonde führt.
- Diese Hybridmoleküle können dann an unmodifizierte Sondenpaare hybridisieren, was zur Verlängerung und Ligation der unmodifizierten Sonden führt. So kann durch aufeinanderfolgende Zyklen von Denaturierung und Renaturierung eine Amplifikation der ursprünglich verlängerten Sondensequenz erreicht werden.
- In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der eine Polymerase und Bedienungsvorschriften umfaßt.
- Vorzugsweise sind die Sonden, die an die Zielsequenz hybridisieren ("erste" und "zweite" Sonde), Oligodesoxyribonukleotide, wobei üblicherweise jedes zwischen 15 und 25 zu der Zielnukleotidsequenz (d.h. der interessierenden Sequenz) komplementäre Nukleotide enthält, obwohl sie auch weniger oder mehr komplementäre Nukleotide enthalten können.
- Vorzugsweise ist der Teil der zweiten Probe, der zur Zielsequenz nicht komplementar ist, 30 bis 70 Nukleotide lang und befindet sich üblicherweise am 5'-Ende der Sönde.
- Üblicherweise ist die dem Ziel nicht komplementäre (aber der zweiten Sonde komplementäre) Sequenz der ersten Sonde 2 bis 10 Nukleotide lang und befindet sich üblicherweise am 3'-Ende der Sonde. Die nicht komplementären Sequenzen beider Sonden können länger sein, und die der zweiten Sonde können kürzer sein.
- Es ist ein wesentliches Merkmal der Erfindung, daß die erste und zweite Sonde, wenn sie an die Zielsequenz hybridisiert sind, einander benachbart oder im wesentlichen benachbart sind. Der Begriff "benachbart" soll bedeuten, daß zwischen jenen Teilen der Zielsequenz ("loci"), die eine Basenpaarung an die komplementäre Sequenz der Sonden eingegangen sind, keine Nukleotide der Zielsequenz ohne Basenpaarung übrigbleiben. Diese Nachbarschaft zwischen den Sonden erlaubt die Hybridisierung der dem Ziel nicht komplementären Sequenzen der Sonden. Wie es dem Fachmann einfach offensichtlich ist, können Lücken zwischen den Loci der Zielnukleotidsequenz, an die die Sonden hybridisieren, dadurch eingeführt werden, daß man die Sonden so gestaltet, daß die Hybridisierung aneinander in größeren Abständen von der Zielsequenz möglich ist. In dieser Situation sagt man, daß die Sonden "im wesentlichen benachbart" sind, weil einige Nukleotide der Zielsequenz ohne Basenpaarung zwischen jenen Teil der Zielsequenz, die eine Basenpaarung an die Sonden eingegangen sind, verbleiben kön nen. Es ist klar, daß die Anzahl der dazwischen liegenden ungepaarten Nukleotide der Zielsequenz in Abhängigkeit von der Gestaltung der Sonden variieren kann. Obgleich es bevorzugt ist, daß die erste und zweite Sonde so hybridisieren, daß sie benachbart sind, können die Sonden deshalb durch bis zu 5 Nukleotide von der Zielsequenz entfernt sein.
- In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Primerverlängerung der zweiten Sonde (unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize) durch "Blockieren" des 3'-Endes der Sonde verhindert werden. Dies kann zweckmäßigerweise durch Einschluß von z.B. einem biotinylierten oder thiolasierten Nukleotid oder einem Didesoxynukleotid am 3'-Ende errejcht werden.
- Zweckmäßigerweise sind die erste und zweite Sonde DNA, und die erste Sonde wird durch eine DNA-Polymeraseaktivität verlängert. Geeignete Enzyme schließen AMV-reverse Transkriptase, das Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I oder Taq-Polymerase ein.
- Die Erfinder der vorliegenden Erfindung ziehen weitere Verfahren der Amplifikation in Betracht. So sind in einer Ausführungsform beide Sonden DNA, und die Verlängerung der ersten Sonde führt zur Bildung neu synthetisierter doppelsträngiger DNA (dsDNA), wobei die dsDNA einen Promotor und eine Transkriptionsinitiationsstelle zur Transkription durch eine RNA-Polymerase umfaßt. Der Zusatz einer geeigneten RNA-Polymerase (wie z.B. T7- oder SP6-Polymerase) stellt dabei erste RNA-Kopien des "Sinn"-(+)-Strangs her.
- Vorzugsweise ist die verlängerte erste Sonde der Sinnstrang. Zweckmäßigerweise umfassen die ersten RNA-Kopien 20 bis 40 Ribonukleotide, obwohl sie weniger oder mehr Ribonukleotide enthalten können, wie es für den Fachmann offensichtlich ist.
- Wie es für den Fachmann offensichtlich ist, kann die verlängerte Sonde Amplifikationsverfahren, wie den vorher beschriebenen, unterworfen werden, um DNA-Kopien herzustellen, wobei diese DNA-Kopien dann wiederum als RNA-Moleküle unter Verwendung jener hierin beschriebenen oder in der Technik bekannten Verfahren amplifiziert werden können.
- Es ist ersichtlich, daß das Primerverlängerungsprodukt des erfindunsgemäßen Verfahrens oder die davon erhaltenen RNA-Kopien durch bereits in der Technik bekannte Verfahren weiter amplifiziert werden können. Z.B. kann das Primerverlänge rungsprodukt dem in den US 4 683 195 und US 4 683 202 beschriebenen PCR-Verfahren oder alternativen DNA- und RNA-Zyklen, wie in der EP 329 822 offenbart, oder der Ligation von benachbart hybridisierten Sonden, wie in der BP 320 308 beansprucht, unterworfen werden.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf einer Festphase durchgeführt werden, wobei die Zielnukleinsäure an die Festphase, z.B. einer Membran oder einem Kügelchen, gebunden ist oder sich in der flüssigen Phase (z.B. in Lösung) befindet. Festphasen können auch bei alternativen Aspekten der Erfindung verwendet werden, z.B. dort, wo ein einsträngiges, durch eine amplifizierte RNA geprimtes DNA-Molekül an eine Festphase gebunden ist. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in Zusammenhang mit verschiedenen Verfahren zur Detektion von entweder dem Primerverlängerungsprodukt oder den davon erhaltenen RNA-Kopien verwendet werden. Z.B. können Nukleinsäureprodukte durch die Hybridisierung einer markierten Nukleinsäuresonde oder durch Größenanalyse von Nukleinsäureprodukten durch Gelelektrophorese detektiert werden.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist auf die Detektion einer beliebigen DNA- oder RNA-Zielsequenz und auf den Nachweis von Läsionen im genetischen Material, wie z.B. Dele tionen und Translokationen, anwendbar. Durch die Verwendung kleiner Nukleotidsonden ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet zur Detektion von Punktmutationen oder Einzelbasen-Polymorphismen im genetischen Material, wobei ohne weiteres stringente Hybridisierungsbedingungen eingestellt werden können, so daß normale Hybridbildung durch eine einzige nicht passende Base zwischen Zielsequenz und Sonde ausgeschlossen ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf alle Gebiete der diognostischen Medizin anwendbar, wie die Detektion von Mikroorganismen und die Detektionen von Genen, die mit genetischen Krankheiten zu tun haben, und andere diagnotische Wissenschaften, wie Analyse in der Veterinärmedizin, Landwirtschaft, forensische Analyse, Nahrungsmittelanalyse und molekularbiologische Forschung.
- So kann in Abhängigkeit vom Einsatzweck die "interessierende Sequenz" sehr lang (z.B. ein vollständiges Gen) oder ziemlich kurz (z.B. die Detektion von Punktmutationen) sein. So können die zuvor definierten Sonden an die Zielsequenz hybridisieren, so daß sie an nur eine geringe Länge der interessierenden Sequenz gebunden werden, oder sie können so gebunden werden, daß etwas von der Zielsequenz über die im engeren Sinne interessierenden Sequenz hinausgeht.
- Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden mit Hinweis auf die folgenden veranschaulichenden Beispiele und Zeichnungen besser verstanden, wobei:
- Die Figuren 1-5 schematische Wiedergaben der erfindungsgemäßen Verfahren sind und
- die Figuren 6-8 Autoradiographen der aus den Versuchen erhaltenen Ergebnisse zeigen, die unter Verwendung von erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt wurden.
- In einer schematisch in Figur 1 gezeigten erfindungsgemäßen Ausführungsform hybridisieren eine erste Sonde 1 und eine zweite Sonde 2 (im wesentlichen benachbart zueinander) über zu Zielsequenzen komplementäre Sequenzen an eine interessierende Sequenz 3.
- Diese Anordnung ermöglicht die Primerverlängerung der Sonde 1 aufgrund einer kurzen komplementären Region zwischen den Sonden 1 und 2, die der Zielnukleinsäure nicht komplementär ist und deshalb nicht an die interessierende Sequenz 3 hybridisiert. Diese Verlängerung verwendet 2 als Matrize und kann durch jede geeignete RNA- oder DNA-Polymerase in Abhängigkeit von der Natur der Sonden durchgeführt werden Die Sonde 2 kann nicht verlängert werden (unter Verwendung des Ziels als Matrize), weil sie an ihrem 3'-Ende (z.B. durch ein terminales Thionukleotid, Desoxyribonukleotid oder ein biotinyliertes Nukleotid) blockiert ist. Deshalb führt die Primerverlängerung der Sonde 1 im wesentlichen zur Herstellung der verlängerten Sonde 4.
- Nach Denaturierung wird die Zielnukleotidsequenz 3 für weitere Hybridisierung durch die Sonden 1 und 2 freigesetzt, während die neu zugesetzte, unmodifizierte dritte Oligonukleotidsonde 5 an das Primer-verlängerte Molekül 4 hybridisiert und dann selbst durch die DNA-Polymerase zum verlängerten Molekül 6 verlängert werden kann. Nach Denaturierung werden die Moleküle 4 und 6 dann für weitere Hybridisierung durch die Sonden 5 bzw. 1 freigesetzt, die dann unter Erzeugung weiterer Moleküle 6 bzw. 4 verlängert werden können. Diese können weiteren Zyklen von Denaturierung, Hybridisierung und Primerverlängerung unterworfen werden. So werden bei jedem Zyklus ein neues Molekül 4 aufgrund der Hybridisierung von 1 und 2 an die Zielnukleinsäure 3, ein neues Molekül 6 aufgrund der Hybridisierung und Verlängerung von 5 an einem Molekül 4 als Matrize aus einem vorhergehenden Zyklus und jeweils ein neues Molekül 4 und 6 aufgrund der Verlängerung von 5 bzw. 1 an Molekülen 4 bzw. 6 aus vorhergehenden Zyklen hergestellt
- Eine weitere spezifische Ausführungsform ist schematisch in Figur 2 veranschaulicht. Die Sonden 1 und 2 hybridisieren an eine Zielsequenz 3, wie vorher beschrieben, was die Verlängerung von 1 durch eine DNA-Polymerase erlaubt, was zu einer verlängerten Probe 4 führt, so daß eine neue doppelsträngige DNA-Region aus 4 und 2 gebildet wird, die einen Promotor und eine Transkriptionsinitiationsstelle für den Angriff einer RNA-Polymerase umfaßt, die dann RNA-Kopien 5 herstellen kann. Die RNA-Kopien 5 können dann über eine kurze komplementäre Region an ein einzelsträngiges DNA-Molekül 6 hybrisidieren, was zu einem RNA/DNA-Hybridmolekül 7 führt, das dann vom RNA- Strang aus Primer-verlängert werden kann, was zur Bildung einer neuen doppelsträngigen DNA-Region im Molekül 8 führt, die einen Promotor und eine Transkriptionsinitiationsstelle für den Angriff einer RNA-Polymerase umfaßt, die dann RNA-Kopien 9 herstellt. Die RNA-Kopien 9 können dann über eine kurze komplementäre Region an ein zweites einzelsträngiges DNA-Molekül 10 hybridisieren, was zu einem RNA/DNA- Hybridmolekül 11 führt, das dann vom RNA-Strang aus Primer-verlängert werden kann, was zur Bildung einer neuen doppelsträngigen DNA- Region im Molekül 12 führt, die einen Promotor und eine Transkriptionsinitiationsstelle für den Angriff einer RNA- Polymerase umfaßt, die dann weitere RNA-Kopien 5 produziert, die erneut in den Zyklus von RNA:DNA-Hybridisierung, Primer verlängerung und Herstellung weiterer RNA-Kopien 9 und 5 eintritt.
- Figur 3 veranschaulicht schematisch zwei Alternativen zur Messung der als Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens produzierten RNA-Kopien. In einer Alternative werden RNA-Kopien 13 auf einer Festphase 14 immobilisiert und durch Hybridisierung an eine markierte Sonde 15 detektiert, was zur Bildung eines Hybrids von 13 und 15 führt und somit zur Fixierung des Markierungsstoffes an der Festphase. In einer anderen Alternative umfassen RNA-Kopien 13 Translationsinitiations- und Terminations-Codons zusammen mit einem 5'-Triphosphat-gebundenen 7-Methylguanosinrest, der die effektive Translation der RNA-Kopien 13 in ein Peptidfragment von beta- Galactosidase 16 anregt, das ein inaktives Enzymfragment 17 vervollständigt, was zur Bildung von aktiver beta-Galactosidase 18 führt. Es ist klar, daß andere Enzyme beta-Galactosidase im Schema ersetzen können.
- Ein weiteres im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegendes Ausführungsbeispiel ist schematisch in Figur 4 gezeigt. Das Verfahren ist im wesentlichen den vorher beschriebenen ähnlich, mit der Ausnahme, daß die Zielsequenz 19 doppelsträngig ist und zwei Sondenpaare, 20, 21 und 22, 23, eingesetzt werden.
- So hybridisieren die Oligonukleotidsonden 20 und 23 und die 3'-blockierten Oligonukleotidsonden 21 und 22 im wesentlichen benachbart an ihre entsprechenden Partner auf einer doppelsträngigen Zielnukleotidsequenz 19, so daß die Sonden 20 und 23 über eine kurze komplementäre Region mit den Sonden 21 bzw. 22 unter Verwendung einer DNA-Polymerase verlängert werden können, wodurch die Primer-verlängerten Moleküle 24 und 25 gebildet werden. Nach Denaturierung wird die Zielnukleotidsequenz 19 für eine weitere Hybridisierung durch die Sonden 20 und 23 freigesetzt, während die Primer-verlängerten Moleküle 24 und 25 an die Moleküle 21 bzw. 22 aufgrund der neu verlängerten komplementären Regionen rehybridisieren können. Diese rehybridisierten Moleküle 21/24 und 22/25 umfassen jetzt Zielnukleotidsequenzen zur Hybridisierung der Moleküle 22/23 bzw. 20/21. Diese hybridisierten Moleküle 20 und 23 können jetzt durch die DNA-Polymerase verlängert werden, wodurch zusätzliche Moleküle 24 und 25 hergestellt werden, die für weitere Hybridisierungen durch die Moleküle 21 bzw. 22 freigesetzt werden, so daß der Zyklus der Replikation der Moleküle 24 und 25 fortgesetzt wird. So wird bei jedem Zyklus ein neues Molekül 24 und 25 als Ergebnis der Hybridisierung von 20 und 21 an die Zielnukleinsäure 19 und ein weiteres neues Molekül 24 und 25 als Ergebnis der Hybridisierung und Verlängerung von 20 und 23 an die in einem vorangehenden Zyklus gebildeten Moleküle 22/25 bzw. 21/24 als Matrize hergestellt.
- Eine weitere Ausführungsform ist schematisch in Figur 5 veranschaulicht, wobei die Oligonukleotidsonden 20 und 23 und die 3'-blockierten Oligonukleotidsonden 26 und 27 (die beide kurze 5'-Haarnadelschleifen umfassen), benachbart an eine doppelsträngige Zielnukleotidsequenz 19 hybridisieren, so daß die Sonden 20 und 23 über eine kurze komplementäre Region mit den Sonden 26 bzw. 27 unter Verwendung einer DNA-Polymerase verlängert und unter Verwendung einer DNA-Ligase ligiert werden können, wobei die eine Schleife aufweisenden Moleküle 20/26 und 23/27 entstehen. Nach Denaturierung werden diese zusätzlichen Moleküle 20/26 und 23/27 für weitere Hybridisierungen freigesetzt, so daß ein Replikationszyklus der eine Schleife aufweisenden Moleküle 20/26 und 23/27 fortgesetzt wird. So werden bei jedem Zyklus ein neues, eine Schleife aufweisendes Molekül 20/26 und 23/27 als Ergebnis der Hybridisierung an die Zielnukleinsäure 19 und ein weiteres neues, eine Schleife aufweisendes Molekül als Ergebnis von Hybridisierung, Verlängerung und Ligation hergestellt, was zur Bildung von 20/26 und 23/27 an den eine Schleife aufweisenden Molekülen 23/27 bzw. 20/26 als Matrize, wie in einem vorangehenden Zyklus gebildet, führt.
- Die allgemeinen Verfahren zur detaillierten Herstellung und Verwendung von Nukleinsäuresonden folgten der detaillierten Beschreibung in "molecular Cloning, A Laboratory Manual", Herausgeber Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Press (1989) , auf das im folgenden als "Molecular Cloning" Bezug genommen wird. Die in den Beispielen verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 im Detail beschrieben. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Oligonukleotide auf einem Applied Biosystems 380A-Syntheseautomaten unter Verwendung langkettiger Alkylamino-CPG-Träger und von Cruachem (Glasgow, UK) gelieferten und gemäß den Herstellerinstruktionen verwendeten Nukleosidphosphoramidite synthetisiert. Alle Oligonukleotide wurden mittels HPLC, wie in "Molecular Cloning" beschrieben, gereinigt und schließlich gefrierge trocknetund in Wasser mit 10 pmol/µl gelöst.
- Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Nukleinsäurestrangs als Ergebnis der Wechselwirkung von benachbart hybridisierten Sonden für das CFTR-Gen (cystische Fibrose-Transregulator = CFTR) und die Wirkung der Hybridisierung an die delta-508-Deletion dieses Gens, die mit der Krankheit Cystische Fibrose in Zusammenhang steht.
- Die Oligos 1 und 2 wurden mit einer 3'-Thiolgruppe nach dem Verfahren von Zuckermann et al. (Nucleic Acids Research, 15 (1987), S. 5305-5321) synthetisiert, oder alternativ wurde Oligo 1 mit einem 3'-Biotinterminus von einer kommerziellen Bezugsquelle (Severn Biotech, Kidderminster, UK) bezogen und wie oben angegeben gereinigt.
- DNA-Proben wurden von einer normalen Person&sub1; die in Bezug auf das nicht mutierte CFTR-Gen homozygot ist, und von einer aufgrund einer homozygoten Deletion des Codons 508 im CFTR-Gen an cystischer Fibrose leidenden Person erhalten. Die DNA stammte aus Mundzellen, die von diesen Personen durch sanftes Abkratzen des Mundhöhleninneren mit einem sterilen Zahnstocher erhalten wurden. Die Mundzellen wurden dann in 10 µl sterilem Wasser suspendiert, mit 20 µl 0,1 M Kaliumhydroxid und 0,1% Triton -X-100 bei 65ºC 20 Minuten lang lysiert und mit 20 µl 0,1 M HCl und 0,1% Triton -X-100 neutralisiert.
- Regionen des CFTR-Gens wurden dann durch das Verfahren der Polymerasekettenreaktion (PCR), wie in der EP 200 362 (Cetus Corporation) beschrieben, amplifiziert. 5 µl des Humanzellysats wurden 3 Minuten lang bei 94ºC denaturiert und in 5 µl 20 mM Tris.HCl pH 8,3, 100 mM Kaliumchlorid, 3 mM Magnesiumchlorid, 20 ng/ml Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma, Poole, UK), 400 µM Desoxyribonukleotid-Gemisch (dNTP-Gemisch) (Mischung von Desoxyadenosintriphosphat, Desoxythymidintriphosphat, Desoxyguanosintriphosphat und Desoxycytidintriphosphat (DCTP), alle von Pharmacia, Milton Keynes, UK), 0,1% Triton -X-100, 0,05 Einheiten Thermus aguaticus DNA-Polymerase (United States Biochemicals, Cleveland, Ohio, USA) und 0,5 µM der Oligonukleotid-Amplifikation-Primer 5'- CAGTGGAAGAATGGCATTCTGTT-3 und 5'-GGCATGCTTTGATGACGCTTCTG-3' gemischt. Die Amplifikation wurde mit 40 Zyklen in einem Thermocycler (Techne, Modell PHC-2) durchgeführt und umfaßte die aufeinanderfolgenden Schritte 1 Minute lang bei 93ºC, 1,5 Minuten bei 55ºC und 3 Minuten bei 72ºC. Zusätzliche 0,05 Einheiten Polymerase wurden nach 20 Zyklen zugegeben. PCR- Produkte, die ein Segment des CFTR-Gens umfaßen, wurden schließlich einer Gelelektrophorese (siehe "Molecular Cloning") in einem 1,6%igen niedrigschmelzenden Agarosegel unterworfen und die PCR-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und auf Elutip-d-Säulen (Schleicher und Schuell, Dussel, Deutschland, gemäß den Herstellerinformationen) gereinigt. Die PCR-Endprodukte wurde mit Ethanol gefällt und in 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA (TE-Puffer) bei einer Konzentration von 100 ng/ml gelöst.
- Die Hybridisierungsreaktionen umfassen DNA-Gemische von normalen oder an cystischer Fibrose leidenden Personen entweder mit der Oligonukleotidkombination CFTR und Oligo 1 oder 2 oder der Kombination delta-508 und Oligo 1 und 2. Zusätzlich umfaßten Kontrollen Gemische ohne Human-DNA. Für die Hybridisierung wurden 20 pmol des Oligonukleotids CFTR oder delta-508 mit 20 pmol Oligo 1 oder 2, 20 µl (200 ng) mit PCR-amplifizierter Human-DNA (oder PCR-Pufferblindprobe) in 50 µl 5%igem Formamid, 0,6 M Natriumchlorid, 0,06 M Natriumcitrat bei pH 7 vermischt. Die Gemische wurden dann 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Bei einer alternativen Reaktion wurden weitere 50 µl 0,1 M TrisHCl pH 8,3, die 0,2 mM dNTP-Gemisch enthielten, 12 mM MgCl&sub2;, 80 mM KCl, 20 mM DTT (Dithiothreitol, Sigma Chemicals, Poole, UK) und 10 µCi alpha-32PdCTP (3000 Ci/mmol, Amersham International, Amersham, UK) gefolgt von 40 Einheiten AMV-reverser Transkriptase (Pharmacia) zugegeben, und die Mischung wurde weitere 30 Minuten lang bei 42ºC inkubiert. In einer weiteren Alternative wurden 2 mM dNTP durch 0,2 mM dNTP ersetzt, und das 32PdCTP wurde weggelassen. In einer letzten alternativen Reaktion wurden weitere 250 µl 10 mM Tris.HCl pH 7,5, die 12 µM dNTP- Gemisch enthielten, 60 mM MgCl&sub2;, 100 µM DTT und entweder 1 µCi alpha-32PDCTP (3000 Ci/mmol, Amersham) oder 10 µCi alpha-35SdATP (6000 Ci/mmol, Amersham) gefolgt von entweder 20 Einheiten Klenow-DNA-Polymerase-I (United States Biochemicals) oder 12 Einheiten Klenow-DNA-Polymerase (Life Technologies, Paisley, UK) zugegeben, und die Mischung wurde weitere 30 Minuten lang bei 30ºC inkubiert.
- 5 µl-Aliquote der Reaktionen wurden dann einer Polyacrylamidsequenziergelanalyse (siehe "Molecular Cloning") unterworfen. Figur 6 zeigt ein typisches Ergebnis einer solchen Analyse der obigen letzten alternativen Reaktion mit alpha-35SdATP und mit der Oligonukleotidkombination CFTR und Oligo 1. Figur 6 ist ein Autoradiograph, der die Verlängerung einer für das nicht mutierte CFR-Gen spezifischen, unmodifizierten Oligonukleotidsonde in Gegenwart des nicht mutierten CFTR- Gens (Spur 2), aber die ausbleibende Verlängerung desselben unmodifizierten Oligonukleotids beim Vorliegen der delta-508- Mutation des CFTR-Gens (Spur 1) oder in Abwesenheit des CFTR- Gens (Spur 3) zeigt. Die Ziel-DNA war entweder ein PCR-amplifiziertes CFTR-Gen, ein PCR-amplifiziertes delta-508-mutiertes CFTR-Gen oder die Produkte einer Blind-PCR-Reaktion. Diese zeigt das erwartete Auftreten eines markierten, verlängerten Derivats von Oligo 1 durch Hybridisierung an normale DNA, aber nicht an die DNA, die das delta-508-CFTR-Gen enthält.
- Zur Bestimmung der TCA-unlöslichen Zählimpulse wurden die markierten Nukleinsäuren dann einer TCA-Fällung (siehe "Molecular Cloning") unterworfen. Unmarkierte Nukleinsäuren wurden durch Zusatz von 100 µl 0,2 M NaOH denaturiert und durch Zusatz von 100 µl 2 M Ammoniumacetat neutralisiert. Schließlich wurden 300 µl 10xSSC (SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) zugegeben, und die Mischung wurde auf vorgefeuchtete (20xSSC) Nitrocellulosemembranen (BA85 0,45 Micron, Schleicher und Schuell) unter Verwendung eines "Minifold"- Dot-Blot-Gerätes (Schleicher und Schuell) futriert. Die Membranen wurden dann 2 Stunden lang bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken.
- Für die Hybridisierung an die Filter wurden 10 pmol Oligo 3 (Tabelle 1) unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Life Technologies) und 5 µl gamma-32P ATP (5000 Ci/mmol, Amershäm) am 5'-Ende markiert und mittels Gel gereinigt, wie in "Molecular Cloning" beschrieben. Die Membranen wurden 2 Stunden lang bei 68ºC in 5xSSC, Sxdenhardts Reagenz (siehe "Molecular Cloning"), 1% Glycin, 0,1% SDS, 250 µg/ml tRNA (Brauhefe, Boehringer, Lewes, UK) und 50 mM Natriumphosphat pH 7 prähybridisiert. Die Hybridisierung wurde unter Zusatz von 1 Million Cerenkov-Impulse/min der Sonde und 4stündige Inkubation bei 37ºC durchgeführt. Es wurde zweimal 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und einmal 3 Minuten lang bei 40ºC in 5xSSC gewaschen. Die Filter wurden dann direkt bei -70ºC unter Verwendung eines Kodak -XR-5-Films autoradiographiert.
- Die Tabelle 2 zeigt das Ergebnis der TCA-Fällungsanalyse bezüglich des Einbaus der Markierung durch reverse Transkriptase oder Klenow-Polymerase in die homolog hybridisierte CFTR-Sonde, die an normale DNA hybridisiert ist, oder die delta-508-Sonde, die an DNA hybridisiert ist, die von einer Person stammt, die für delta-508 homozygot ist, wobei wenig Einbau in nicht passende Sonden oder in Sonden in Abwesenheit von Human-DNA erfolgte. Die Ergebnisse sind in Figur 7 gezeigt. Figur 7 stellt mehrere Autoradiographen aus zwei verschiedenen Versuchen dar und zeigt die Hybridisierung einer mit Phosphor-32 markierten Oligonukleotidsonde, die spezifisch für das Primer-verlängerte Molekül 4 von Figur 2 ist, an Nukleinsäure, die nach Hybridisierung der für das CFTR-Gen (CFTR-Gen = cystische Fibrose-Transregulatorgen) oder für das delta-500-Derivat dieses Gens spezifischen Sonden hergestellt wurde, wobei die Hybridisierung in jedem Fall in Verbindung mit der CFTR-spezifischen Sonde, Oligo 2 (Tabelle 1) stattfand, die als Matrize für die Prirnerverlängerung dienen kann. Die Ziel-DNA war entweder ein PCR-amplifiziertes CFTR- Gen ("normal"), ein PCR-amplifiziertes delta-508-mutiertes CFTR-Gen ("delta-508") oder die Produkte einer Blind-PCR-Reaktion ("keine"). Die Ergebnisse zweier getrennter Hybridisierungsanalysen für die reverse Transkriptase-vermittelte Primär-verlängerte CFTR-delta-508 -Sonde weisen darauf hin, daß der Einbau der Markierung gemäß den Daten aus Tabelle 1 auf spezifische Hybridisierung und Verlängerung der hybridisierten CFTR- oder delta-508-Sonde zurückzuführen ist.
- In Tabelle 1 sind die Sequenzen der für die Amplifikation verwendeten Oligonukleotide 4 und 5 im Detail dargestellt. Sie wurden wie oben synthetisiert und gereinigt.
- Die Oligonukleotide CFTR oder delta-SDS und Oligo 2 wurden wie in Beispiel 1 an CFTR-DNA hybridisiert. Nach Hybridisierung wurden Primerverlängerung und Amplifikation entweder mittels reverser Transkriptase und T7-RNA-Polymerase oder mittels Klenow-Polymerase und T7-RNA-Polymerase durchgeführt. Für Primerverlängerung mittels reverser Transkriptase wurde ein 50 µl Gemisch zugesetzt, das 30 pmol Oligo 4, 30 pmol Oligo 5, 0,1 M TrisHCl pH 8,3, 2 mM dNTP, 1 mM NTP (Gemisch aus Adenosintriphosphat (ATP), Uridintriphosphat (UTP), Guanosintrisphosphat (GTP) und Cytidintriphosphat, alle von Pharmacia), 12 mM MgCl&sub2;, SO mM KCl, 20 mM DTT, 100 Einheiten Bnasin (Pharmacia) und 40 Einheiten AMV-reverser Transkriptase (Pharmacia) und 40 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Life Technologies) umfaßte Wahlweise wurden 2 Einheiten RNase H (Life Technologies) in einigen Versuchen (einschließlich jener in Tabelle 3 und Figur 5 dargestellten) mit geringfügigen Änderungen der Ergebnisse zugesetzt. In einigen Versuchen wurden auch 20 µCi alpha-32P-UTP (3000 Ci/mmol, Amersham) zum Gemisch zugesetzt. Es wurde 3 Stunden lang bei 42ºC inkubiert, wonach die radioaktiven Proben einer TCA-Fällung (siehe "Molecular Cloning") und einer Bestimmung der in TCA unlöslichen Zählimpulse, die den Einbau in Ribonukleinsäure repräsentieren, unterworfen wurden. Nicht radioaktive Proben wurden durch Zusatz von 100 µl 37%igem Formaldehyd und lsminütiger Inkubation bei 60ºC denaturiert. 200 µl 20xSSC wurden zugesetzt, und die Proben wurden auf BA85-Nitrocellulosemembranen, wie im Beispiel 1 beschrieben, immobilisiert.
- Die Membran wurde wie oben (Beispiel 1) mit Oligo 3 hybridisiert, das mit 32P markiert war, gewaschen und wie oben autoradiographiert.
- Zur Primerverlängerung durch Klenow-Polymerase wurden 250 µl einer Mischung zugesetzt, die 30 pmol Oligo 4, 30 pmol Oligo 5, 50 mM TrisHCl pH 7,75, 400 µM dNTP, 500 µM NTP, 5 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 100 Einheiten BNasin (Pharmacia), 40 Einheiten Klenow-Polymerase (United States Biochemicals), 40 Einheiten T7-RNA-Polymerase (Life Technologies) und 20 µCi alpha-32P-UTP (3000 Ci/mmol, Amersham) umfaßte. Es wurde 3 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, und danach wurden die radioaktiven Proben einer TCA-Fällung (siehe "Molecular Cloning") und einer Bestimmung der in TCA unlöslichen Zählimpulse, die den Einbau in Ribonukleinsäuren repräsentieren, unterzogen. Tabelle 3 zeigt den erhöhten Einbau von 32P-UTP in Hybridisierungsmischungen, die sowohl die Oligos 4 und 5 als auch die homolog hybridisierenden Oligos CFTR oder delta-505 enthielten. Das Ergebnis zeigt auch eine Erniedrigung der 32P-UTP-Synthese beim Weglassen von entweder Oligo 4 oder Oligo 5. Figur 8 ist ein Autoradiograph, der die Hybridisierung einer Phosphor-32-markierten Oligonukleotidsonde, die für das Primer-verlängerte Molekül 4 (oder das RNA-Molekül 5) von Figur 2 spezifisch ist, an Nukleinsäure zeigt, die nach Hybridisierung der Sonde CFTR an "normale" DNA (ein PCR- amplifiziertes CFTR-Gen), delta-SOS an "CF"-DNA (ein PCR- amplifiziertes delta-SOS CFTR-Gen) oder weder CFTR noch delta-SOS an "keine" (ein PCR-Blindprobe) hergestellt worden ist, in jedem Fall entweder ohne Oligo 2 oder in Verbindung mit Oligo 2 und entweder Oligo 4 (+4), Oligo 5 (+5) oder sowohl Oligo 4 als auch 5 (+4+5), wobei die Oligos 2, 4 und 5 in Tabelle 1 definiert sind.
- Dies veranschaulicht den jeweiligen Anstieg an zum markierten Oligo 3 homologer Nukleinsäure (Primerverlängerung durch reverse Transkriptase, keine R wie in Beispiel 1 RNase H) durch Einverleiben von sowohl Oligo 4 als auch 5 in das Amplifikationsgemisch.
- Die Matrize für die Transkription und Translation eines beta- Galactosidase-Enzymdonorfragements wurde wie folgt hergestellt: 50 pmol-Aliquote der Oligonukleotide 5 und 6 (Tabelle 1) wurde 5 Minuten lang auf 90ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. 2 µg M13mp18 DNA (RF-Form, Life Technologies) wurden mit EcoRI (Life Technologies) gemäß dem Herstelleranweisungen verdaut, und die linearisierte DNA wurde durch Gelelektrophorese auf einem 1,0%igen niedrigschmelzenden Agarosegel und durch Elutip-d-Säulenchromatographie gereinigt. Die DNA wurde schließlich mit Ethanol gefällt und in TE-Puffer gelöst. 0,1 ug (1 µl) EcoRI-verdaute M13-DNA wurden mit dem Ansatz der hybridisierten Oligonukleotide gemischt und durch Wasserzusatz auf 15 µl aufgefüllt. 4 µl 5x Ligationspuffer und 1 µl T4-DNA-Ligase (zusammen durch Life Technologies bereitgestellt) wurden zugesetzt und die Mischung 1 Stunde lang bei 12ºC inkubiert. 10 ng des Gemischs wurden verwendet, um E. coli JM101 (siehe "Molecular Cloning") zu transformieren, und das klonierte Oligonukleotid-5/6-Fragment in rekombinanten M13-Klonen wurde unter Verwendung eines Sequenzierkits (Amersham International) durch Didesoxynukleotid-DNA-Sequenzieren bestätigt. Die RF-Form der DNA wurde aus rekombinanten M13 präpariert, mit EcoRI verdaut und mittels Gel gereinigt, wie ohen für M13mp18-DNA beschrieben. Diese EcoRI verdaute M13mp18-DNA. Diese EcoRI- verdaute M13mpls (5/6)-DNA wurde zu 100 ug/ml in TE-Puffer gelöst.
- Das beta-Galactosidase-Genfragment wurde wie folgt hergestellt: 50 pmol der Oligonukleotide 0 und 9 (Tabelle 1) wurden einzeln mit 29 µl Wasser verdünnt, und 10 µl 5x Kinasepuffer (5x = 0,25 M TrisHCl pH 7,6, 50 mM MgCl&sub2;, 25 mM DTT, 0,5 mM Spermidin-HCl, 0,5 mM EDTA und 1 &sub1;&sub1;M ATP) wurden zugegeben. Zu dieser Mischung wurden ferner 10 µci (1 µl) 5'- gamma-32P-Adenosintriphosphat (Amersham International, 5000 Ci/mmol) und 5 µl T4-Polynukleotid-Kinase (Life Technologies) zugesetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, und die markierten Oligonukleotide wurden auf einem 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgel gereinigt Die gereinigten und markierten Oligonukleotide 8 und 9 wurden als nächstes vereinigt und mit den Oligonukleotiden 7 und 10 (Tabelle 1) in einem Endvolumen von 20 µl gemischt. Die Mischung wurde auf 90ºC erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. 5 µl 5x Ligationspuffer und 1 µl T4-DNA-Ligase (Life Technologies) wurden zugesetzt, und die Mischung wurde bei 16ºC über Nacht inkubiert. Das 130 Basenpaare lange beta- Galactosidase-Genfragment wurde dann auf 16%igen nativen Polyacrylamidgel gereinigt und in 12 µl Wasser gelöst. Dazu wurden 0,1 µg (1 µl) EcoRI-verdaute M13mp18(5/6)-DNA, 5 µl 5x Ligationspuffer und 2 µl T4-DNA-Ligase (Life Technologies) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 12ºC inkubiert und verwendet, um E. coli JM101-Zellen wie oben zu transformieren. Die Unversehrtheit des beta-Galactosidase-Fragments in "M13/bgal"-Rekombinanten wurde wie oben durch Sequenzieren überprüft, und einzelsträngige DNA wurde für die Amplifikationsreaktion hergestellt.
- Die Amplifikation hybridisierter CFTR- oder delta-SOS-Sonden wurde genau wie im Beispiel 2 erreicht, mit der Ausnahme, daß 30 pmol einzelsträngiger M13/bgal-DNA anstelle von Oligo 5 verwendet wurden und 100 µM GTP und 1 mM m7G(5')ppp(5')G (Natriumsalz, Pharmacia) anstelle von 1 mM GTP verwendet wurden. Nach Amplifikation wurde die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt (siehe "Molecular Cloning"). Die gefällten Nukleinsäuren wurden in 40 µl Wasser gelöst, und 20 µl einer Kaninchen-Reticulocytlysat-Zubereitung (Life Technologies, einschließlich aller Aminosäuren) wurde zugesetzt und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Zur Vervollständigung der beta-Galactosidase wurde die M15-Mutante dieses Enzyms nach dem Verfahren von Langley et al., J. Biol. Chem., 250, S. 2587-2592 hergestellt und zu 250 pmol/ml in 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2, und 5 mM beta-Mercaptoethanol gelöst. Zu der Translationsmischung wurden 250 µl 1 M Natriumphosphat pH 7, 2 mM MgSO&sub4;, 2 mM EDTA, 0,02% NaN&sub3; und 0,1% Tween 20 zugesetzt. 250 µl der MiS-Zubereitung wurden dann zusammen mit 1 mg o-Nitrophenol-beta-D-Galactopyranosid (Sigma) zugegeben, und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Proben wurden dann auf Eis gelagert, und die Extinktion wurde bei 414 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt und zeigen das Entstehen von beta-Galactosidase-Aktivität durch Hybridisierung, Ampilfikation und Translation von Nukleinsäuren an CFTR-DNA.
- In Tabelle 1 ist die Sequenz des für die Amplifikation verwendeten Oligonukleotids 11 im Detail dargestellt. Es wurde wie oben synthetisiert und gereinigt.
- 5 pmol der Oligonukleotide CFTR oder delta-SOS und 5 pmol Oligo 2 wurden mit 2 µl CFTR-DNA in 10 µl (Endvolumen) von 20 mM TrisHCl pH 0,3, 100 mM KCl, 3 mM MgCl&sub2;, 400 µM dNTP-Gemisch, 0,1% Triton x-100 (Sigma), 10 µCi alpha-32PdCTP (3000 Ci/mmol, Amersham) und 0,1 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (United States Biochemical) gemischt. Die Proben wurden 2 Minuten lang auf 93ºC erhitzt und Primer-verlängert und durch 25 aufeinanderfolgende thermische Zyklen von 1 Minute bei 55ºC, 1,5 Minuten bei 72ºC und 1 Minute bei 93ºC amplifiziert. Die Proben wurden dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, einer TCA-Fällung unterzogen.
- Die Tabelle 5 zeigt den erhöhten Einbau von 32P dCTP in die Hybridisierungsmischungen, die das Amplifikationsoligonukleotid 11 enthalten. TABELLE 1 Sequenz der Oligonukleotidsonden Tabelle 2 Impulse/min des eingebauten 32P-dCTP Tabelle 3 Impulse/min des eingebauten 32P-UTP Tabelle 4 optische Dichte 414nm Tabelle 5 Impulse/min des eingebauten 32P-dCTP
Claims (27)
1. Verfahren zum Überprüfen des Vorliegens einer
interessierenden Nukleinsäuresequenz in einer Probe, bei dem man die
Probe mit einer ersten Sonde und einer zweiten Sonde in
Kontakt bringt, wobei Teile der Sonden in der Lage sind,
dergestalt an die interessierende Sequenz zu hybridisieren, daß
die Sonden einander benachbart oder im wesentlichen
benachbart sind, so daß andere Teile der ersten und zweiten Sonde
in der Lage sind, aneinander hybridisiert zu werden; man die
Probe behandelt, so daß eine Kettenverlängerung einer der
Sonden verursacht wird, wobei ein Teil einer Sonde als
Matrize fungiert; und man mindestens einen Teil der
verlängerten Sonde detektiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Verwendung einer
dritten Sonde und einer vierten Sonde, wobei Teile jener
dritten und vierten Sonde in der Lage sind, jeweils an
mindestens einen Teil der zur interessierenden Sequenz
komplementären Sequenzen der ersten und zweiten Sonde zu
hybridisieren, so daß andere Teile der dritten und vierten Sonde
aneinander hybridisieren können und das Behandeln der Probe
umfaßt, so daß eine Kettenverlängerung der dritten oder vierten
Sonde verursacht wird, wobei ein Teil der dritten oder
vierten Sonde als Matrize fungiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das ferner die Ligation
von Sondenpaaren nach Verlängerung umfaßt.
4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2 oder 31 bei
dem mindestens ein Teil der verlängerten Sonde amplifiziert
wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem zumindest der genannte
Teil der verlängerten Sonde unter Verwendung einer weiteren
Sonde amplifiziert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die weitere Sonde DNA
umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Amplifikation der
weiteren Sonde durch Zyklen von Hybridisierung, Verlängerung
und Denaturierung erreicht wird.
8. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, bei
dem die Verlängerung der mittels einer mindestens einige
selbstkomplementäre Nukleotide umfassenden Sequenz durch
Self-priming gestartet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der verlängerte Teil
der ersten Sonde mindestens einige selbstkomplementäre
Nukleotide umfaßt, die die weitere Verlängerung durch
Self-priming starten.
10. Verfahren nach irgendeinem der vorslehenden Ansprüche,
bei dem eine zm Self-priming fähige Nukleotidsequenz so
verlängert wird, daß doppelsträngige Nukleinsäure gebildet wird,
die eine Erkennungsstelle für ein Protein umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Protein ein Enzym
ist.
12. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem ferner ein RNA-Molekül synthetisiert wird, das eine
RNA-Kopie von mindestens einem Teil der verlängerten
Sondensequenz umfaßt; mindestens ein Teil des RNA-Moleküls
translatiert wird, um eine Aminosäuresequenz herzustellen; und die
Aminosäuresequenz detektiert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, das ferner die Amplifikation
des RNA-Moleküls umfaßt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Amplifikation des
genannten RNA-Moleküls RNA:DNA-Zyklen umfaßt.
15. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14, bei
dem mindestens ein Teil des RNA-Moleküls transiatiert wird,
um eine Aminosäuresequenz herzustellen, und die
Aminosäuresequenz detektiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Aminosäuresequenz
ein Peptid umfaßt, das über Enzym-regulierende Aktivität
verfügt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Aminosäuresequenz
ein inaktives N-terminales Fragment von β-Galactosidase um-
18. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem eine Sonde DNA umfaßt.
19. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem die zweite Sonde an der 5'-Endregion eine zu der
interessierenden Sequenz nicht komplementäre und zu mindestens
einem Teil der ersten Sonde komplementäre Sequenz umfaßt.
20. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem die zweite Sonde einen 30-70 Nukleotide langen Teil
einschließt, der zu der interessierenden Sequenz nicht
komplementär ist und zu mindestens einem Teil der ersten Sonde
komplementär ist.
21. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem das 3'-Ende der zweiten Sonde blockiert ist, um eine
Verlängerung zu verhindern.
22. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem die erste Sonde an der 3'-Endregion eine zu der
interessierenden Sequenz nicht komplementäre und zu mindestens
einem Teil der zweiten Sonde komplementäre Sequenz umfaßt.
23. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem die erste Sonde einen 2-10 Nukleotide langen Teil
einschließt, der zu der interessierenden Sequenz nicht
komplementär ist und zu mindestens einem Teil der zweiten Sonde
komplementär ist.
24. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem die erste und zweite Sonde zu der interessierenden
Sequenz komplementäre Sequenzen umfassen, die 15-25
Nukleotide lang sind.
25. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
das die Verwendung eines aus der aus Thermus aguaticus (Tag)
Polymerase, E.coli DNA-Polymerase I oder dessen
Klenow-Fragment, der AMV reversen Transkriptase, T7 RNA-Polymerase und
SP6 RNA-Polymerase bestehenden Gruppe ausgewählten Enzyms um-
26. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche,
bei dem es die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
erlaubt, sich nur durch eine Base unterscheidende
Nukleotidsequenzen (eine Substitution, Deletion oder Addition) zu
unterscheiden.
27. Verwendung eines Kits, umfassend eine Polymerase und eine
Bedienungsanleitung, in einem wie in irgendeinem der
Ansprüche 1 bis 26 definierten Verfahren.
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