JPS62282600A - 遺伝的特性決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に、ポリヌクレオチド並びにＤＮＡおよ
びＲＮＡプローブ、それらの調製および遺伝的特徴づけ
におけるそれらの使用に関する。

このような使用は、例えば、人間、動物または植物の起
源の確立を包含し、こうして本発明のポリヌクレオチド
およびプローブは父性の論争（ｐａｔｅｒｎｉｔｙ　ｄ
ｉｓｐｕｔｅｓ）または法医学において、あるいは遺伝
的疾患または素質の予防、診断および処置において使用
できる。

〔背景技術〕

英国特許出願第８５２５２５２号（公告第２１６６４４
５号）には、ヒトおよび動物のゲノム内の多数の多形性
部位において個々にハイブリダイズし、こうして異なる
分子量の標識されたバンドから構成された「フィンガー
プリント」を生成するプローブとして使用することがで
きる種々のＤＮＡが記載されている。フィンガープリン
トは全体として問題の個体に特徴的であり、そして異な
るバンドの起源を個体の系統を通して追跡することがで
き、そしである場合において、ある遺伝的疾患に関連あ
ると仮定することができる。

本発明は、情報を与える遺伝子座を多座プローブ（ｓ＋
ｕｌｔｉ−１ｏｃｕｓ　ｐｒｏｂｅ）の使用によりゲノ
ム中において同定することができ、そして単一のこのよ
うな情報を与える遺伝子座に対して各々が特異的である
ポリヌクレオチドプローブおよびポリヌクレオチドプロ
ーブを調製できるという発見に基づく。

従来、制限された数の超可変遺伝子座（ｈｙｐｅｒ−ｖ
ａｒｉａｂｌｅ　ｆｏｃｉ）がヒトＤＮＡ中において発
見されているだけであり、これらは次のものを包含する
コインシェリン遺伝子に対して５′側のミニサテライト
（Ｂｅ１１．５ｅｌｂｙおよびＲｕｔｔｅｒ、１９８２
）、ｃ−Ｈａ−ｒａｓｅｌ遺伝子に対して３′側のサテ
ライト（Ｃａｐｏｎ　ｅｔ　　ａｌ、、１９８３）　、
Ｕ型コラーゲン遺伝子（Ｓｔｏｋｅｒ旦　ａｌ、、１９
８５）およびζ２およびψζ１グロビン遺伝子の間（Ｇ
ｏｏｄｂｏｕｒｎ　ｅｔ　　ａｌ、、１９８３）、なら
びに染色体１４の長いアームのテロメア領域から誘導さ
れる特徴のないＤＮＡクローンによって定義されるＤ１
４Ｓ１遺伝子座（ＷｙｍａｎおよびＷｈｉｔｅ、１９８
０；Ｂａ１ａｚｅｔ　　ａｌ、、１９８２；Ｗｈｙｍａ
ｎ、ＷｏｌｆｅおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ、　１９８４）
。これらのミニサテライト類はそれらの可変性を実質的
に異にし、コラーゲンの超可変領域において検出される
わずか６つの異なる対立遺伝子（ＳｙｋｅＳ、　０ｇ１
ｌｖｉｅおよびＷｏｒｄｓｗｏｒｔｈ　、　１９８５）
からＤ１４Ｓ１遺伝子座における８０より多く　（Ｂａ
ｌａｚ　　！３１紅、、１９８６）の範囲に及ぶ。ヒト
ゲノムにおける超可変遺伝子座の合計の数は未知である
が、多いように思われる。事実、ヒトゲノムは少なくと
も１５００の超可変領域を含有するであろう。

〔本発明の説明〕

１より多い多形性ミニサテライト領域または超可変遺伝
子座を参照することによってＤＮＡを識別できるポリヌ
クレオチドプローブ、例えば、前述の英国特許出願第８
５２５２５２号（公告第２，１６６．４４５号）中に記
載されかつフレイムされているプローブ３３．６および
３３．１５とゲノムＤＮＡの断片とをハイブリダイズさ
せることによって同定されたＤＮＡ断片をクローニング
することが可能であり、そしてゲノム上の特定の領域ま
たは遺伝子座（前記領域または遺伝子座は情報を与える
遺伝子座である）に対して特異的であるミニサテライト
を含有するＤＮＡ断片に対してハイブリダイズできるポ
リヌクレオチドまたはプローブを、前記ＤＮＡ断片から
調製することが可能であることが発見された。情報を与
える遺伝子座は、１００の不規則に選択した無量の個体
の試料において少なくとも３つの異なる対立遺伝子が識
別され得る遺伝子座であると、この明細書において、定
義する。この明細書においては、この遺伝子座は少なく
とも３　（１００）の対立遺伝子の変動を有すると述べ
ることによってこれを表現する。不規則に選択した無関
係の個体の試料は、好ましくは５００、より好ましくは
１０００であり、そしてこのような試料において少なく
とも３つの異なる対立遺伝子を識別できる能力を、それ
ぞれ、３　（５００）および３　（１０００）で表わす
。

全体集団の十分に大きい数の構成員をスクリーニングす
ることによって、所定の情報を与える遺伝子座に３より
少ない対立遺伝子を有する１００　、５００または１０
００の個体を同定することは通常可能であろうから、１
００　、５００または１０００の不規則に選択した無関
係の個体の試料を実際に不規則に選択することが必須で
ある。

所定の情報を与える遺伝子座におけるこの多形性が高く
なればなるほど、遺伝的特徴づけ、例えば、父性または
法医学的評価のための個体の同定における遺伝子座の特
異的プローブは、より有用でありかつ情報を与える。

これに関して、用語「個体」はヒトばかりでなく、さら
にヒト以外の動物及び植物、並びにこのような人間、動
物および植物から誘導される細胞系を意味するために上
で使用したことが理解されよう。しかしながら、各場合
において、不規則に選択した試料はすべて同一種からの
ものであろう。

本発明のヒトへの適用に関して、ここで使用する表現「
情報を与える遺伝子座」は、アメリカン。

タイプ・カルチャー・コレクシラン（ＡＴＣＣ）に受託
されている次の細胞系から選択された２０の細胞系から
抽出されたＤＮＡにおいて少な（とも３つの異なる対立
遺伝子が識別され得る遺伝子座としても定義することが
できる： 細胞系　　　　　　　ＡＴＣＣ受託番号しＬ４ｔ（ｎａ
ｕｏ）　　　　　　　　　　　　　　（：ＣＬ　　１３
５前述のすべての細胞系はＡＴＣＣ１米国２０８５２−
１７７６マリーランド州ロフクビレ、パークローン・ド
ライブ１２３０１　、から自由に入手可能であり、そし
てＡＴＣＣの細胞系およびハイブリドーマのカタログに
記載されている。前述の細胞系のすべては、１９８５″
′年以前にＡＴＣＣに受託された。

本発明の１つの面によれば、ゲノム中の特定の領域また
は座〔前記領域または座は少なくとも３（１００）の対
立遺伝子の変動（上に定義した）を有する〕に対して特
異的であるミニサテライト（ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔ
ｅ）を含有するＤＮＡ断片にハイブリダイズすることが
できるポリヌクレオチドを調製する方法が提供され、こ
の方法は、次の工程：１より多くの多形性ミニサテライ
ト領域または超可変座に関連してＤＮＡを識別すること
のできるポリヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡの断
片をハイブリダイズせしめることによって同定されたＤ
ＮＡ断片をクローニングし、そしてゲノム中の少なくと
も３　（１００）の対立遺伝子変動（ａｌｌｅｌｉｃ　
ｖａｒｉａｔｉｏｎ）　（上に定義した）を有する特定
の領域または座に関して特異的であるミニサテライトを
含有するＤＮＡ断片にハイブリダイズすることができる
ポリヌクレオチドを前記ＤＮＡ断片から調製する、 ことを含む。

本発明のほかの面によれば、ゲノム中の少なくとも３の
多形度（ａ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ｉｓｍ）　（上に定義した）を有する特定の領域または
座に関して特異的であるミニサテライトを含有するＤＮ
Ａ断片にハイブリダイズすることができるポリヌクレオ
チドを調製する方法が提供され、この方法は、次の工程
： １より多い多形性領域または座に関連してＤＮＡを識別
できるポリヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡ断片と
をハイブリダイズせしめることによって同定されたＤＮ
Ａ断片をクローニングし、そして ゲノム中の少なくとも３の多形度（上に定義した）を有
する特定の領域または座に関して特異的であるミニサテ
ライトを含有するＤＮＡにハイブリダイズすることがで
きるポリヌクレオチドを、前記断片から調製する、 ことを含む。

好ましくは、ポリヌクレオチドプローブは、標識された
成分またはマーカー成分を含めて、少なくとも３つのタ
ンデムの反復（すべてのタンデムに反復する配列の間に
平均して少なくとも７０％の相同性が存在する）の配列
を含乙ゝポリヌクレオチドを含んでなり、前記配列は、
制限エンドヌクレアーゼで試料ＤＮＡを断片化すること
によって得られた対応するＤＮＡ断片へのプローブのハ
イブリダイゼーションを可能とする程度に、ゲノムのミ
ニサテライト領域との相同性を有し、ここで、ａ）反復
の各々は、異なるゲノムの座からの複数のミニサテライ
ト中に存在する、同様な長さのコンセンサスコア領域（
ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｃｏｒｅ　ｒｅｇｉｏｎ）と少な
くとも７０％の相同性をもつコアを含有し、ｂ）コアは
６〜１６クレオチド長さであり、そして Ｃ）コアに寄与しない反復単位内のヌクレオチドの合計
の数は、１５以下である。

有利には、前記ＤＮＡ断片はミニサテライト領域または
超可変座からのミニサテライトを含有し、前記領域また
は座は、配列（相補的配列を含む）：（Ａ）ＡＧＧＧＣ
ＴＧＧＡＧＧ　　　　　　　１（ここでＴはＴまたはり
であり、そして（Ａ）は存在することあるいは存在しな
いことができる）または配列（相補的配列を含む）： ＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧ　　　　　　　　　
２（ここでＴはＴまたはＶである） の少なくとも３つのタンデム反復を含むポリヌクレオチ
ドプローブによって検出可能である。

本発明の他の面によれば、分離されたあるいはクローニ
ングされた形態のポリヌクレオチドが提供され、前記ポ
リヌクレオチドは、単一のミニサテライト領域または超
可変座に関して特異的であり、かつ制限エンドヌクレア
ーゼで試料のゲノムＤＮＡを断片化することによって得
られた対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイ
ブリダイゼーションを可能とする程度に前記領域または
座と相同性であるヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ
断片は前記ミニサテライト領域または超可変座からのミ
ニサテライトを含有し、ここで１）前記領域または座は
少なくとも３　（１００）の対立遺伝子変動（この明細
書で定義するような）を存し、そして ２）前記領域または座は、配列（相補的配列を含む）： （Ａ）ＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧ’Ｇ　　　　　　　　　
　　　　　１（ここでＴはＴまたはりであり、そして（
Ａ）は存在することあるいは存在しないことができる）
、または配列（相補的配列を含む）： ＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧ　　　　　　２（こ
こでＴはＴまたはりである）の少なくとも３つのタンデ
ム反復を含むポリヌクレオチドプローブによって検出可
能である。

本発明は、また、前記領域または座が少なくとも３の対
立遺伝子変動と反対に少なくとも３の多形度を有する、
対応するポリヌクレオチドに関する。

本発明の他の面によれば、本発明のポリヌクレオチドお
よび上に定義した本発明の方法によって調製されるポリ
ヌクレオチドは、クローニングされた物質の微生物学的
再生産により、あるいは直接合成によって調製される。

本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡのポリヌクレオチド、お
よびＤＮＡにハイブリダイズ可能な任意の他の種類のポ
リヌクレオチドに関する。上に定義したポリヌクレオチ
ドは、標識されユおらず、そして二本鎖（ｄｓ）または
−末鎖（ｓ　ｓ）の形態であることができる。

本発明は、プローブとして使用するｓｓ形態の標識され
たポリヌクレオチド類ならびにｓｓプローブの生成に使
用できるそれらの標識されたｄｓ前駆体を包含する。

本発明の他の面によれば、上に定義した本発明のポリヌ
クレオチドまたは上に定義した方法によって調製された
ポリヌクレオチドを含んでなる、標識された成分又はマ
ーカー成分を有するポリヌクレオチドプローブが提供さ
れる。一般に、少なくともポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列は一本鎖の形態であるが、好ましくはプローブ
は完全に一本鎖の形態のポリヌクレオチドからなるであ
ろう。

本発明の他の面によれば、上に定義した本発明のポリヌ
クレオチド、あるいは上に定義した本発明の方法によっ
て調製されたポリヌクレオチドを、標識しまたはマーキ
ング（ｍｅｒｋｉｎｇ）する工程を含んでなる上に定義
したポリヌクレオチドを調製する方法が提供される。

本発明のポリヌクレオチドプローブは、好ましくは任意
の普通の方法によって３２ｐ放射線標識されるが・ノ＼
イブリダイゼーション技術におし）てよく知られた手段
によって、別の方法で放射線標識して、例えば、３ｓ３
放射線標識プローブを調製することができる。それらは
、また、次の文献に記載されている方法によって、ビオ
チンまたは同様な種で標識できる：　ＤＣＷａｒｄ　ｅ
ｔ　　ｇｌ、　１９８１年３月１５〜２０日にキースト
ーン（Ｋｅｙｓ　ｔｏｎｅ）で開催された、精製された
遺伝子を使用する発展的生物学についての１９８１年ｒ
ｃＮ　−ＵＣＬＡシンポジウム（１９８１１ＣＮ−ｕＣ
ＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｕｓｉｎｇＰｕｒｉｆｉｅ
ｄ　Ｇｅｎｅｓ）の会議録、ｖｏｌ、　Ｘ　Ｘ　ｍ　１
９８１．６４７−６５８ページ、アカデミツク・プレス
；Ｄｏｎａｌｄ　Ｄ　Ｂｒｏｗｎ　　ｅｔ　　旦１編；
あるいは、次の文献に記載されている方法によって、酵
素で標識することさえできる：　Ａ　Ｄ　Ｂ　Ｍａｌｃ
ｏ１ｍ旦　旦、英国ケンブリッジに於ける第６０４回生
化学学会の会合（ｔｈｅ　６０４ｔｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｍｅｅｔｉｎｇ）（１９８
３年７月１日の会合）のアブストラクッ。

本発明の他の面によれば、ゲノムＤＮＡの試験試料を１
または２以上の対照との参照によって特徴づける方法が
提供され、この方法は、試料ＤＮＡを１または２以上の
制限酵素で断片化し、前記酵素はタンデム反復に相当す
る配列を有意にな程度に切断せず、ＤＮＡ断片をポリヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドプローブでプロービ
ングし、前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
プローブは、単一のミニサテライト領域または超可変座
に関して特異的であり、かつ前記単一のミニサテライト
領域または超可変座からのミニサテライトを含有する対
応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーションを可能とする程度に前記ＤＮＡ断片と相同性
であるヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡのハイブリダイ
ズした断片を検出し、そしてハイブリダイズした断片を
前記ｌまたは２以上の対照と比較することからなり、こ
こで １）前記ミニサテライト領域または超可変座は少なくと
も３　（１００）の対立遺伝子変動を有し、そして ２）前記領域または座は、１より多い多形性ミニサテラ
イト領域又は超可変座に関してＤＮＡを識別できるポリ
ヌクレオチドプローブによって検出可能である。

本発明は、また、前記領域または座が少なくとも３の対
立遺伝子変動と反対に少なくとも３の多形度を有する、
試験試料を特性づける対応する方法に関する。

本発明の方法は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチ
ドまたは本発明の方法によって調製されたポリヌクレオ
チド、または上に定義した本発明のポリヌクレオチドプ
ローブを使用することによって実施する。

好ましくは、試料ＤＮＡはヒトＤＮＡである。

本発明の理解を助けるため、次の用語の意味を明らかに
する： 以下余白 ｏ　　　　１　（ｈ　　　　ｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）認
識された座または部位におけるヒト、動物または植物の
ＤＮＡの領域は、それが、例えば、長さまたは配列に関
して、多くの異なる形態で存在する場合、超可変である
といわれる。

５二　−−イ　ｍ１ｎｉｅ０ 短いＤＮＡ配列のタンデム反復から構成されている、ヒ
ト、動物または植物のＤＮＡの領域。すべての反復単位
は、完全な同一性を必ずしも示さなくてよい。

′（ｏｌ　ｍａｒ　ｈｉｃ） 個体ごとにあるいは所定の個体の対の染色体の間で可変
性を示す遺伝子または他のＤＮＡセグメントは、多形成
であるといわれる。

′　たは　ンー゛ム　′（ｔ１） 直列に完全にまたは不完全に反復しているポリヌクレオ
チド配列。一般に、タンデムに反復しているといわれる
配列は、少なくとも３回反復しているであろう。

以下余白 拍　　　′　（１） ヌクレオチドの数または種類に関して正確な反復ではな
いが、認識可能にコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）
配列の反復である配列。

ａ　　（ｈｏａ＋ｏｌｏ　　）％ ２つの反復またはタンデム反復の配列ＡおよびＢを比較
するとき、相同性の百分率は、Ａを与えるために必要で
あるＢ中の塩基対の置換、付加または欠失の数をＡにお
ける塩基対の数から滅することによって与えられる。こ
うして、２つの配列ＡＴＧＧおよびＡＣ３間の相同性の
百分率は７５％である。

コンセンサスコア（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　ｃｏｒｅ）西
　ｌ多数の反復配列の間、通常２以上の異なるミニサテ
ライトの反復単位の間で最も密接に合致するとして同定
できる配列。

ヌクレオチド（ｎ　ｔ）およびｌ！Ｊ−（ｂ　ｐ）を同
義で使用する。両者はＤＮＡまたはＲＮＡに関する。略
号Ｃ，Ａ、Ｇ、Ｔは、普通に、（デオキシ）シチジン、
（デオキシ）アデノシン、（デオキシ）グアノシンおよ
びデオキシチミジンまたはウリジンを意味する。しかし
ながら、理解されるように、略号Ａ、Ｃ，ＧおよびＴは
、普通のヌクレオシド類（デオキシ）アデノシン、（デ
オキシ）シチジン、（デオキシ）グアノシンおよびデオ
キシチミジンまたはウリジンを使用して塩基対となるこ
とのできる他の塩基修飾ヌクレオシドを包含することが
できる。このような塩基修飾ヌクレオシドは、（デオキ
シ）イノシンおよび（デオキシ）８−アザグアノシンを
包含する。

本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプロ
ーブがタンデムに反復する配列からなる場合、このタン
デム反復は完全反復または不完全反復あるいはそれらの
混合体であることができる。

プローブ配列中に、好ましくは少なくとも３反復、より
好ましくは少な（とも７反復が存在する。

本発明のプローブは、単一であるいは他の座特異的プロ
ーブと組み合わせて、プローブの混合物すなわちカクテ
ルを用いる、一連の試験または単一の試験において使用
することができこそして次の分野において有用であろう
： １、　ヒトにおける父性または母性の試験。

２、家族の群の評価、例えば、移民の論争または相続の
論争。

３、双生児における接合性（ｚｙｇｏｓｉｔｙ）。

４、　ヒトにおける血族結婚についての試験。

５、　ヒトにおける一般的血統分析。

６、　ヒトにおける遺伝的疾患に関連する遺伝子座の同
定。これにより、特異的プローブを構成して遺伝的疾患
を検出できる。

７、法医学、例えば、（ａ）強姦界からの精液試料のフ
ィンガープリント生成、 （ｂ）例えば、汚れた衣服からの、 血液、毛および精液の試料のフィン ガープリント生成、 （ｃ）ヒト残留物の同定、 （ｄ）他の法医学的組織の試料、例 えば、皮膚の特性づけ。

８、細胞のキメリズム（ｃｈｉｍａｅｒｉｓｍ）の研究
、例えば、骨髄移植後の供与体細胞対受容体細胞の追跡
。

９、家畜類の飼育および血統の分析／証明。（これは、
例えば、動物の純粋な系統の日常的管理および検査、お
よび、例えば、競争馬および犬の飼育を含む訴訟におけ
る血統の検査を包含する。）また、経済的に重要な遺伝
された特性との関連を示すことがある遺伝標識を提供す
るため。

１０、培養した動物または植物の細胞系の日常の品質管
理、純粋な細胞系についての検査および日常の同定作業
の検査。

１１、腫瘍細胞および腫瘍の分子の異常についての分析
。

１２、ポリヌクレオチド類およびそれらから誘導される
プローブは、植物の繁殖において潜在的用途をもつこと
が予測される。

しかしながら、本発明の座特異的プローブば、以後の実
施例３において証明されるように、法医学において特に
有用であり、そして少な（ともプローブｐλｇ３は胎児
ヘモグロビンの遺伝的に永続する異質細胞形態と同時に
分離することができる。また、プローブは父性の試験お
よび関連する実用性（上の実用性２および５を参照）に
おいて、ならびに細胞のキメリズムの研究における協力
な使用法を提供する。

有利には、本発明のポリヌクレオチド、並びに本発明の
方法によって調製されたポリヌクレオチドおよび本発明
のポリヌクレオチドプローブは、次の配列から選択され
る１つの配列もしくはこのタンデム反復又はこれに対し
て相補的な配列を含んでなるポリヌクレオチドプローブ
によって同定される、ミニサテライト領域または超可変
座からのミニサテライトを含有するＤＮＡの断片とハイ
ブリダイズすることができる： 八ＧＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＧＹＧＧＴＧＴＧＧ
ＧＣＡＧＧＧＡＧＲＧＧＣ３ＧＴＧＧＡＹＡＧＧ　　　
　　　　　　４ＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＲＹＡＧＴＧＴＣ
ＴＧ　　　　　　５ＧＡＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＹＧＲＣ
ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＣＡ　　　　６ＧＧＧＣＴＧＧ
ＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧ　　
　　７ＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡ
ＡＧＡＧＴＡＣ８ＴＣＴＧＴＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡＴＡ
ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＧＴＧＴＧ
ＧＹＸ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　９（ここでＹはＣ，Ｔまたはりであり、ＸはＧ
またはＣであり、ＲはＡまたはＧであり、そしてＴはＴ
またはＶである）。

本発明のポリヌクレオチド、本発明の方法によって調製
されるポリヌクレオチドおよび本発明のプローブは、単
一の特定のミニサテライト領域または超可変座からのミ
ニサテライトを含有するＤＮＡ断片とハイブリダイズす
ることができ、こうして座特異的である。一般に、本発
明のポリヌクレオチドおよびプローブは、高いストリン
ジエンシーのハイブリダイゼーション条件下で座特異的
であろう。これに関して、表現［座特異的（ｌｏｃｕｓ
　５ｐｅｃｉｆｉｃ）Ｊは、ポリヌクレオチドまたはプ
ローブが単一の特定の座にのみハイブリダイズすること
を保証するハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレ
オチドまたはプローブを使用できることを意味するため
に、ポリヌクレオチドまたはプローブに関してここで使
用する。

しかしながら、理解されるように、本発明の座特異的プ
ローブは、ハイブリダイゼーションのストリンジエンシ
ーが低下した条件下で使用するとき、１より多い多形性
ミニサテライト領域または超可変座に関連してＤＮＡを
識別する（ｄｉｆｆｅｒｅｎ−ｔｉａｔｅ）することが
でき、こうして他の情報を与える遺伝子座の同定に使用
できる。

こうして、本発明の他の面によれば、ゲノム中の少なく
とも３　（ｔｏｏ）の対立遺伝子の変動（ここで定義し
たような）を有する特定の領域または座に関して特異的
である、ミニサテライトを含むＤＮＡ断片にハイブリダ
イズすることができるポリヌクレオチドを調製する方法
が提供され、この方法は、 上に定義したポリヌクレオチドとゲノムＤ　Ｎ　Ａの断
片とのハイブリダイゼーションによって同定されるＤＮ
Ａ断片をクローニングし、そしてゲノム上の少なくとも
３　（１００）の対立遺伝子の変動（ここに定義したよ
うな）を有する特定の領域または座に関して特異的であ
るミニサテライトを含有するＤＮＡ断片にハイブリダイ
ズすることができるポリヌクレオチドを前記クローニン
グしたＤＮＡ断片から調製することを含んでなり、前記
方法は、１より多い多形性のミニサテライト領域または
超可変座に関連してプローブがＤＮＡを識別できるよう
にするために有効なハイブリダイゼーション条件下で実
施される。

本発明の他の面によれば、分離された形態またはクロー
ニングされた形態のポリヌクレオチドが提供され、前記
ポリヌクレオチドは、単一のミニサテライト領域または
超可変座に関して特異的であり、かつ制限エンドヌクレ
アーゼによる試料ゲノムＤＮＡの断片化によって得られ
た対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイブリ
ダイゼーションを可能とする程度に前記領域または座と
相同性であるヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ断片
は前記ミニサテライト領域または超可変座からのミニサ
テライトを含有し、ここで１）前記領域または座は少な
くとも３　（１００）の対立遺伝子の変動（ここで定義
した）を有し、そして ２）前記領域または座は上に定義した座特異的ポリヌク
レオチドプローブによって検出できる。

本発明は、また、前記領域または座が少なくとも３の多
形度を有する、対応する方法および対応するポリヌクレ
オチドに関する。

本発明は、さらに、このような座特異的ポリヌクレオチ
ドからなるプローブ、およびこのようなポリヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチドプローブを使用する、ＤＮＡ
の試験試料を特性づける方法に関する。

本発明の座特異的ポリヌクレオチドおよびプローブは、
ミニサテライト含有ＤＮＡ断片のミニサテライトと相同
性であり、あるいは好ましさに劣るが、ミニサテライト
を挟む（ｆ　Ｉａｎｋｉｎｇ）配列と相同性である。

本発明のポリヌクレオチドおよびプローブが特定の配列
のタンデム配列を含むとき、このような配列は一般に少
なくとも３回反復し、そしてこのような反復は必ずしも
正確である必要はない。正確でない反復は不完全反復と
記載する。このような反復は、それにもかかわらず、認
識可能に反復する。一般に、このことは、すべての反復
単位の間に平均して少なくとも７０％の相同性が存在す
ることを意味する。好ましくは、すべての反復単位の間
に、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５
％、ことに９０％の相同性が存在する。しかしながら、
理解されるように、ヌクレオチド配列または「反復単位
」は、必要に応じて、まったく反復する必要はない。

反復単位の数、ｈ、は有利には少なくとも５であるが、
好ましくは少なくともｌＯである。便利にはｎは１０〜
４０であるが、原理的にはｎは任意の数、ｌからｔｏ、
ｏｏｏまでであることさえできる。

本発明のポリヌクレオチドおよびプローブが特定の配列
のタンデム配列を含むとき、フランキング配列はほとん
ど無関係である。フランキング配列は省略することがで
き、あるいは任意の数、例えば、５０，０００までのヌ
クレオチドで存在することができるが、この様な長いプ
ローブを用いることは一般に意味がない。それにもかか
わらず、このような大きいポリヌクレオチドは、ことに
プローブとして有用な小さいポリヌクレオチドを切り出
すことができる担体として役立つことができる。

これらのフランキング配列は、反復配列が５ｓ−ＤＮＡ
を有するときでさえ、ｄ　５−ＤＮＡまたはｓ　５−Ｄ
ＮＡの一部分を形成できる。

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチドプローブは、上に定義した式３〜９から選択し
た任意の１つの配列またはそれに対して相補的な配列ま
たはそのタンデム反復（すべてのタンデムに反復する配
列の間に少なくとも７０％の相同性が平均して存在する
）またはそれに対して相同性の配列を含む。

こうして、本発明の１つの好ましいポリヌクレオチドは
、上に定義した式３の配列またはそのタンデム反復また
はそれに対して相補的な配列を含む。このようなヌクレ
オチド配列は、染色体７上に位置する常染色体の座に関
して特異的である。

このような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチドプローブを、ここで９２ｇ３と呼ぶ。

本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式４の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的な配列を含む。このようなヌクレオチド配列は
染色体１上に位置するある座に関して特異的である。こ
のような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレ
オチドプローブを、ここでλＭＳＩと呼ぶ。

本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式５の配列またはそのタンデム反復、またはそれに対
して相補的な配列を含む。このような配列は、染色体７
上に位置するある座に関して特異的である。このような
配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプ
ローブを、こ・こで１ＭＳ３１と呼ぶ。

本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式６の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的配列を含む。このようなヌクレオチド配列は染
色体１上に位置するある座に関して特異的である。この
ような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チド配列を、ここで２ＭＳ３２と呼ぶ。

本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式７および８から選択される配列またはそのタンデム
反復またはそれに対して相補的な配列を含む。このよう
なヌクレオチド配列は染色体５上に位置するある座に関
して特異的である。

このような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチドプローブを、ここで２ＭＳ８と呼ぶ。

本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式９の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的である配列を含む。このようなヌクレオチド配
列は染色体１２上に位置する座に関して特異的である。

このような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチド配列を、ここでλＭＳ４３と呼ぶ。

上に示したように、一般に、反復単位間に少なくとも７
０％、有利には少なくとも８０％、好ましくは少なくと
も８５％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性が
存在する。しかしながら、式３〜９の配列のいずれか１
つは正確に反復することがことに好ましい。これに関し
て、理解されるように、この後者の要件は、各単位が所
望の式の範囲内に入る配列を有する場合に満足されうる
。

こうして、各反復単位が正確に同一の配列を有すること
は必要ではない。

本発明の１つの好ましい実施態様において、試験試料の
供与者と１または２以上の対照の試料供与者と同一性な
どを確立する方法が提供され、この方法においては１ま
たは２以上の対照試料が同様に断片化され、そしてそれ
ぞれの試料からのハイブリダイズした断片の比較が行わ
れる。

他の好ましい実施態様において、試験試料の供与者と１
または２以上の対照試料供与者との間の家族関係を確立
する方法が提供され、この方法においては対照試料が同
様に断片化され、そしてそれぞれの試料からのハイブリ
ダイズした断片が比較される。

前述の方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはプロー
ブを単独で使用して、あるいは本発明の少なくとも２つ
のポリヌクレオチドまたはプローブを使用して、前記ポ
リヌクレオチドまたはプローブの混合物を使用する一連
の試験、または単一の試験において実施できる。

本発明の他の好ましい実施態様において、遺伝病、異常
または形質を診断する方法が提供され、この方法は試験
試料を上に定義した少なくとも１つのポリヌクレオチド
またはポリヌクレオチドプローブでブロービング（ｐｒ
ｏｂｉｎｇ）することからなり、前記プローブは特定の
遺伝病、異常または形質と関連をもつものである。

本発明者等が試験した本発明のプローブのすべては、高
いストリンジエンシーのハイブリダイゼーション条件下
で座持異的プローブとして働く。

本発明者等が試験した本発明のプローブによって検出さ
れる座の極端な可変性は、サザンブロソトハイプリダイ
ゼーションにおけるプローブの感度と組み合わされ、と
くに多座ＤＮＡフィンガープリント分析のために入手可
能なりＮＡが不十分であるとき、英国特許出願第８５２
５２５２号（公告第２．１６６．４４５号）に記載され
かつフレイムされているように、個体の同定においてこ
とに有用な道具を提供する。多座ＤＮＡフィンガープリ
ントは０．５μｇのＤＮＡから得ることができるが、こ
れに対して座持異的プローブは少なくとも１桁感度が高
く、そして１μｉ程度と少ない血液について使用できる
。

なおさらに少ない量の試料の試験を必要とする異常な場
合において、本発明は欧州特許出願第８６３０２２９９
．２号（公開第０２０１１８４号）に記載されている増
幅技術と組み合わせて特に価値があるであろう。

本発明はヒト−ゲノムにおける情報を与える遺伝子座の
同定を可能にし、これにより座持異的プローブの調製を
可能にし、各座持異的プローブは単一の情報を与える遺
伝子座に関して特異的である。本発明者等は６つの異な
る非常に情報Ｇこ冨む遺伝子座を特異的に同定したが、
この遺伝子座は試験した集団において非常に高いヘテロ
接合度（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）　（少なくと
も９０％）を有し、かつこれまで分離されたうちで最も
多形性である。

そして、本発明者等はｐＡｇ３　、λＭＳＬ。

λＭＳ８．λＭＳ３１．λＭＳ３２およびλＭＳ４３（
上に定義した）と表示する座持異的プローブを多座につ
いて調製した。

座持異的プローブによって決定される遺伝子型の個体特
異性の程度は、多座におけるヘテロ接合度Ｈから推定で
きる。ある座における平均対立遺伝子頻度ｑは（１−Ｈ
）により与えられ、そして２つのう、ンダムに選択され
た個体が同じ遺伝子型を共有する確率はｑ”（２−ｑ）
である。２つの個体の誤ワた結合（ｆａｌｓｅ　ａｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ）のこの確率は、１ＭＳ８についての
０．０２から２ＭＳ３１についての０．０００２まで多
様であり、そしてヘテロ接合度（ｑ）がこれらの確率を
減少するだろうということにおいて慎重な推定（ｃｏｎ
ｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｅｓｔｉｍａｔｅ）である。すべ
ての６つのミニサテライトのプローブについての誤った
結合の累積確立は約ｌＯ゛１゜であり、１つの多座プロ
ーブによって検出される２つのランダムに選択されたＤ
ＮＡのフィンガープリントが同一である端数（ｏｄｄｓ
）に匹敵する（英国特許出願第８５２５２５２号参照）
。対照的に、２つのシブ（ｓｉｂ）が所定の超可突座に
ついて同一である機会は１／４（１＋ｑ）”によって与
えられる。

すべての６つのプローブについてシブの同一性の累積確
率は０．０００４であり、これに対して１つの多座プロ
ーブを用いるＤＮＡフィンガープリントについては約１
０−’である。

これらの座特異的超可変プローブは、第１１Ｃ図におい
て分析する殺人の場合によって示されるような、法医学
において特に有用であることが証明され、ここでＤＮＡ
フィンガープリント分析のために法医学的試料の２つか
ら回収されるＤＮＡは不十分であった。２人の被害者か
らの精液は７ＭＳ１および７ＭＳ３１のプローブで容疑
者のそれと異なる共通の表現型を示した。上の考察から
、被害者ＸおよびＹが異なる無関係の人間によって性的
に攻撃された確率は２Ｘ１０−’であると計算できる。

同様に、２人の仮定の攻撃者が第１親等の血縁関係にあ
る、例えば、兄第である機会は０．０７であった。これ
は、ＸおよびＹが同一の男性によって性的に攻撃された
という強い証拠、すなわち、引き続いて、より多い量の
法廷の材料のＤ　Ｎ　Ａフィンガープリント分析によっ
て確証された結論を提供する。さらに、ＸおよびＹから
の精液汚染は、２Å以上の容疑者よりも、はとんど確実
に単一の個体から由来するものである。例えば、第１１
Ｃ図の着色すについて考えると、これは２人の被害者の
対立遺伝子および２人の追加の容疑者の対立遺伝子を示
す。３つの個体（２人の容疑者および１人の被害者）の
プールが４以下の分割可能なされた対立遺伝子を示す機
会は、ｑ　”（５５−２１０ｑ　＋２１６　ｑ　”）に
よって与えられる。この確率はプローブλＭＳＩについ
て０．０２およびプローブλＭＳ３１について０．００
５であり、Ｘが１人ではなく２人の男性に性的に攻撃さ
れた組み合わせた確率、１０−４を与える。これにより
、ＸおよびＹが単一の個体によって攻撃されたことが確
立され、そして座持異的プローブは、多座ＤＮＡフィン
ガープレートプローブと異なり、混合ＤＮＡ試料中に示
される個体の数の推定に使用できることが示される。

超可変ＤＮＡ断片のメンデル遺伝は、また、例えば、父
性の論争において、家族関係を確立するために使用でき
る。所定の座持異的プローブについて、ある子供の父性
対立遺伝子がランダムに選択された男性中に偶然に存在
する確率は２Ｑ−（１”で推定できる。すべての６つの
ミニサテライトについて、父以外の者を誤って含める累
積確率はπ（２Ｑ　ｉ　−（１ｉ”）　＝１０−’であ
り、２つのＤＮＡフィンガープレートプローブを使用し
て得られるものに匹敵する。同様に、真の父の第１親等
の関係者、例えば、兄第、を誤って含める累積確率は０
．０２である。これらの超可変座特異的プローブを引き
続いて使用すると、家族関係を確立するための強力な方
法を得ることができるが、これらの不安定な座における
新しい長さのアレルへの突然変異は誤った排除に導く場
合があることが警告される。これらの超可突座における
突然変異の割合はまだ知られていない。

これらの座持異的プローブの座持異性および感度ハ、多
座サザンプロットパターンを発生せしめるためにプール
されたプローブを使用することを可能とする（第１２図
）。５つのプールされたプローブによって生成される、
これらの「再構成されたＤＮＡフィンガープリント」は
、多座プローブによって検出されるそれらの対応物より
も複雑さがかなり少なく、そしてデンシトメーターの走
査後にディジタル的に符号化することができるであろう
。個体のミニサテライトの可変性が高いにもかかわらず
、プールされたプローブのプロフィルは、主として、異
なる座からのミニサテライト断片の電気泳動的同時移動
の結果、無関係の化ヨーロッパの個体間で共有する断片
の実質的なレベル（１８％）を示す。このバンド共有の
レベルは多座プローブによって生成される普通のＤＮＡ
フィンガープリント中に見られるレベルに類似し、後者
の場合においてバンド共有のレベルはランダムに選択さ
れた個体間で約２５％である。平均８．４のＤＮＡ断片
が混合プローブのパターにおいて分割されるので、１つ
の個体におけるこれらの断片のすべてが第２のランダム
に選択された個体中に存在する機会は慎重に０．１８’
・’　−６Ｘｌ０−’であると推定できる。したがって
、これらのパターンは高いレベルの個体特異性を提供す
るが、このような高いレベルは多座プローブの使用によ
り、あるいは座特異的プローブを使用する連続的ハイブ
リダイゼーション（上を参照）によっては達成できない
。プールされたプローブおよび個々の座特異的プローブ
の両者は、とくに骨髄移植後の引き続くエングラフメン
ト（ｅｎｇｒａｐｈｍｅｎｔ）　のための提供者対受容
者の遺伝標識を得るために、細胞キメリズムの研究にお
いて特に有用であることが明らかとなるであろう。ＤＮ
Ａ混合実験（第１２図）は、これらのプローブを使用し
て低いレベルのキメリズムを検出できることを示す。

以下の実施例において、温度は℃であり、そしてプロー
ブ３３．６および３３．１５は次のコンセンサス反復配
列を有する英国特許公告第２．１６６．４４５号に記載
されているものである： それぞれ、（Ａ）＾ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧ　、および＾
ＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧ。

１隻貫上 この実施例は、ＤＮＡフィンガープリントにおける特定
のミニサテライト断片の分離および性質を記載する。

二股前１汰 Ｊｅｆｆｒｅｙｓ　Ａ　Ｊ　　ｅｔ　　ａｌ、、（１９
８５）Ｎａｔｕｒｅ３１６．７６−７９に記載される白
血球およびＪｅｆｆｒｅｙｓ　　ｅｔ　　ａｌ、＋Ａａ
＋、Ｊ、Ｈｕａ、Ｇｅｎｅｔ、　３９　＋１１−２４に
記載されるＨＰＦＨ血統ｏｆ個体ｍ９から誘導されたニ
ブスティン・バール（ｆ！ｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ）ウ
ィルス形質転換リンパ芽球系（Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｋ　　
旦　ａｌ、（１９７１）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　８
．４４３−４５０参照）から、ＤＮＡを分離した。制限
消化およびサザンブロットハイプリダイゼーションを、
Ｊｅｆｆｒｅｙｓ　Ａ　Ｊ等の前述の文献中に記載され
ているようにして実施した。二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａプローブ
の断片を、叶ｅｔｚｅｎ、Ｇ旦　ａｌ　（１９８１）Ａ
ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｇｅ、　１１２．２９５−２９８に記載さ
れるように、０８８１紙上への電気泳動により分離し、
そしてＦｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ　　旦　ａｌ　（１９
８４）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３７．２６６−
２６７に記載されているように、ランダム・オリゴヌク
レオチド・プライミングによって′Ｊｉｐで標識した。

−末鎖ミニサテライトのプローブ３３．１５をＪｅｆｆ
ｒｅｙｓ　　ｅｔ　　ａｌ　（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１４，６７−７３に記載されているようにして調製し
た。

可・　　　のクローニング ５ａｕ３Ａで消化した６００μｇの個体■９リンパ芽球
細胞系ＤＮＡを０．５％のアガロースゲルを通す電気泳
動によって分画し、そしてＹａｎｇ、ＲＣＡａｔ　　ａ
ｌ、（１９７９）Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｍｏｌ、　６Ｂ、１
７６−１８２に記載されているように、関連する大きさ
の分画を透析膜上への電気溶離によって集めた。２サイ
クルの調製用ゲル電気泳動後、断片ｇは１０００倍精製
された（収量１５０ｎｇのＤＮＡ）。この部分的に精製
された分画の２０ｎｇを、ＢａｍＨＩで切除後単離され
たｅｏｎｇのλＬ４７．１アームに連結しくＬｏｅｎｅ
ｎ、ＷＡＭおよびＢｒａｎｍａｒ、ＷＪ　（１９８０）
Ｇｅｎｅ、２０．２４９−２５９）　［旦　ｖｉｔｒｏ
パッケージされそしてＬｃｏｌｉ　ＷＬ９５（８０３＋
且匹、　ｕｄ、　ｈｓｄＲ，−、ｈｓｄＭｍ”＋旦旦、
　皿−、ｍ旦β、Ｐ２について溶原性）上にプレイティ
ングされた］　［上のＬｏｅｎｅｎの文献およびＪｅｆ
ｆｒｅｙｓ、Ａ　Ｊ　　ｅｔ　　ａｔ　（１９８２）Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１５６．４８７−５０３参照コ、組換え体について選択
した。　１５００の組換えファージの得られたライブラ
リーを、ミニサテライトのプローブ３３．１５とのプラ
ークハイブリダイゼーションによってスクリーニングし
た。４つの陽性プラークを再プレイティングし、Ｅ、コ
リ套工」立■）　ＥＤ８９１０　（８０３，且」。

匣、　ｒｅｃＢ２１　、　ｒｅｃＣ２２、ｕ並）上でス
クリーニングし［上のＬｏｅｎｅｎの文献を参照コそし
て組換えファージＤＮＡをＢｌａｔｔｎｅｒ　　ｅｔ　
　ａｔ、（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９４．１６１−
１６９の方法によって調製した。組換えファージｇ３の
３ａｎ３ＡインサートをｐＵｃ１３のＢａｍＨ１部位中
にサブクローニングしｒＶｔｅｉｒａＪおよびＭｅｓｓ
ｉｎｇ　Ｊ　（１９８２）Ｇｅｎｅ１９．２５９−２６
８１　そしてＬ　匹旦Ｊと８３、Ｊ門８３．Δ　（囚−
５ｒｌＲ）３０６：：ＴｎｌＯのｒｅｃＡ誘導体中で伸
長サセた［Ｍａｔｆｉｅｌｄ、　Ｍ（１９８３）Ｐｈ、
Ｄ、ｔｈｅｓｉｓ、Ｖｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｌｅｉ
ｃｅｓｔｅｒ参照〕。

■双ｆｆ参照室近 ｐλｇ３ＤＮＡを超音波処理し、サイズ選択し、そして
Ｍ１３ｍｐ１９のＳｍａ１部位中にショットガン。

クローニングした［Ｙａｎｉｓ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃｅｔ
　　ａｌ（１９８５）　Ｇｅｎｅ３３．１０３−１１９
参照］、２７ｇ３のタンデム反復領域のＤＮＡ配列を決
定するために、１２のタンデムクローンをジデオキシヌ
クレオチドチェインターミネーション法によって配列決
定した［Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ　　ｅｔ　　ａｌ　（１９７
７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＶＳＡ７４．５４６３　５４６７および旧ｇｇ
ｉｎ　ＭＤ　ｅｔ　　ａｔ（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０．３９６３−３９
６５参照］。これらのクローンの８つを２７ｇ３のタン
デム反復ミニサテライト領域から誘導し、そしてコンセ
ンサス反復配列を明らかにするために使用した。５′お
よび３′フランキング領域を含有するＭ１３クローンを
ｆｆ！ｐ標識フランキングプローブａおよびｂとのハイ
ブリダイゼーションによって検出しく下記の第１図参照
）そして配列決定して、ミニサテライトのフランキング
領域の配列および開始点および末端の点を確立した。

Ｊｅｆｆｒｅｙｓ　　ｅｔ　　ａｌ　［（１９８６）Ａ
ｍ、Ｊ、）Ｉｕａ＋、Ｇｅｎｅｔ、　３９．１１−２４
］に記載されているグジャラティ（Ｇｕｊａｒａｔｉ）
血統からの個体■９はＨＰＦＨ（遺伝性高胎児ヘモグロ
ビン症）冒されており、そして彼女のＤＮＡフィンガー
プリント（Ｓａｎ３Ａ消化物中においてミニサテライト
３３．１５により検出される）は８．２ｋｂの多形性断
片（断片「ｇ」；第１Ａ図）を含有し、この断は、（１
９８６）Ａｍ、Ｊ、）ｌｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、　３９．１
１−２４に記載されているように、この血統の他の構成
員におけるＨＰＦＨとともに同時に分離する（ｃｏｓｅ
ｇｒｅｇａ　ｔｅ）傾向がある。このＤＮＡを、２回の
調製用ゲル電気泳動によって、他のミニサテライト断片
から精製した（第１図）。

第１図は、ゲル電気泳動によるこの精製を示す。

Ｊｅｆｆｒｅｙｓ　　ｅｔ　　ａｌｌに記載されている
血統の個体■９からのＤＮＡを５ａｕ３Ａで消化し、そ
して５−９ｋｂの断片を調製用ゲル電気泳動によって集
めた。これらの断片を再度電泳動にかけて分画２−５を
得た。５ａｕ３Ａで消化したＩＩＩ　９　ＤＮＡのアリ
コートおよび各分画のアリコートを０．８％のアガロー
スゲルの電気泳動にかけ、そしてミニサテライトのプロ
ーブ３３．１５とサザンプロットハイプリダイズせしめ
した。ＨＰＦＨと同時分離する傾向のある断片ｇ（８，
２ｋｂ）は、分画３においてほぼ１０００倍精製された
。

断片「ｇ」　（前述のように５ａｕ３Ａ消化物中に検出
され、そして精製してほぼ１０００倍に濃縮された断片
ｒｇＪの分画を生成した）を、前述のＬｏｅｎｅｎおよ
びＢｒａｍｍａｒの文献に記載されているようにして、
λＬ４７．１中にクローニングし、そしてＰ２？８原性
ｒｅｃ″Ｅ′、コリ上で伸長させて１．ｍ換えファージ
について選択した。得られるライブラリーをプローブ３
３．１５へのハイブリダイゼーションによってスクリー
ニングした。得られた４つの陽性プラークは非常に小さ
い（プラーク＜　Ｑ、ｌ　ｍｍの直径）が、ｒｅｃＢ、
ｒｅｃＣＥ、コリ上で低い効率（Ｏ〜８ｐｆｕ／プラー
ク）で再プレイティングして、正常の大きさのプラーク
（１ｍｍの直径）を生成できた。２つのクローンλｇ１
および２ｇ３をさらに特徴づけ、そしてそれぞれ７、７
　ｋ　ｂおよび７．８　ｋ　ｂの５ａｕ３Ａインサート
を含有することが示された。これらのクローンは両者と
もバンドｇから誘導された（下を参照）が、それぞれ０
．５　ｋ　ｂおよび０．４　ｋ　ｂだけ短かった。

ｒｅｃＢ、ｒｅｃｃＥ、コリ上で増殖させたλｇｌまた
は２ｇ３のいずれにおいても３ａｕ３Ａインサートの大
きさの不均質性が存在しない（データは示されていない
）ので、インサーの一部分がｒｅｃ″Ｅ、コリ中での初
期の増殖の間に各クローンから失なわれていたと結論さ
れる。

ブラフトナー（Ｂｌａｔｔｎｅｒ）法［（１９７７）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ１９４．１６１−１６９１によって調製さ
れたλｇ１および２ｇ３のＤＮＡの収率は非常に低く　
（λＬ４７．１組換えＤＮＡの正常の収量の１％）、再
びこれらのミニサテライトのクローンの異常な増殖の性
質を指摘している。したがって、５ａｕ３Ａインサート
をｐＵｃ１３中にサブクローニングし［Ｖｉｅｉｒａ、
ＪおよびＭｅｓｓｉｎｇ　Ｊ（１９８２）Ｇｅｎｅ１９
．２５９　２６８参照］そしてＥ、コリＪＭ８３のｒｅ
ｃＡ誘導体［Ｍａｔｆｉｅｌｄ　Ｍ（１９８３）Ｐｈ、
Ｄ　ｔｈｅｓｉｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｅ
ｉｃｅｓｔｅｒ参照］中で増殖させてインサートの転位
を最小にした。得られるサブクローンｐλｇ３（下記の
第１Ｂ図参照）は、ｇ３中のインサートよりは０．７ｋ
ｂだけ短い７．１　ｋ　ｂの５ａｕ３Ａインサートを含
有していた。

ミニサテライト　　　の ｐＡｇＳ中のミニサテライト断片の構造を、制限地図の
作成（第１Ｂ図）およびＤＮＡ配列決定（第２図）によ
って決定した。

第１Ｂ図はＤＮＡ断片ｇの構成を示す。９７ｇ３中の５
ａｕ３Ａインサートを、制限エンドヌクレアーゼＡ／ｕ
　Ｉ　　（Ａ）　、Ｄｄｅｌ　　Ｉ　　（Ｄ）、Ｈａｅ
ｍ　（Ｈ）　、ＭｂｏＩ［（Ｍ）　、Ｐｓ　ｔ　Ｉ　　
（Ｐ）および５ａｕ３Ａ（Ｓ）でマツピングした。

）（ｉｎｆ！またはＲｓａＩについての切断部位は存在
しない。７．１４ｋｂのインサートは、３７ｂｐの配列
（第２図）＋７４７ｂｐのフランキングＤＮＡの１７１
タンデム反復を含有する。５′フランキング領域は、逆
位のＡｌｕ要素の開始部位（斜′！ｔｆＡ）を含有する
。ユニーク配列のフランキングプローブａおよびｂの起
源が示されている。

第２図は、超可変断片ｇのＤＮＡ配列を示す。

ミニサテライトの５′および３′フランキング領域およ
び開始および終止配列が、ミニサテライトからの３つの
タンデム領域（ａ−ｃ）の反復配列と一緒に示されてい
る。逆位Ａ１ｕ要素の開始は下線を付した大文字中に示
されており、そして５′フランキング領域中のいくつか
の簡単な配列領域には下線が付されている。３７ｂｐの
ミニサテライトの反復単位のコンセンサス配列（ｃ　ｏ
　ｎ）が示されており、そしてこのコンセンサスとの差
異が個々の反復単位について与えられている。領域Ｃに
おける第２の反復単位はＨａｅｍ部位（下線）を含有し
、したがってこの領域はミニサテライト中の内部のＨａ
　ｅｍ部位にわたる（第１Ｂ図）。

コンセンサス反復配列は、また、英国特許公告筒２．１
６６．４４５号中のそれと同様な方法で「コア」配列と
整列させて示されている。

クローンｐλｇ３は、単一の内部のＨａ　ｅｍ部位を除
外して、制限部位を欠＜　６．３　ｋ　ｂのミニサテラ
イトを含有する。ミニサテライトはＧＴＧＧＧＣＡＧＧ
配列を含有する３７ｂｐ単位の１７１反復がら構成され
ている。この配列は、前にいくつかの異なるヒトミニサ
テライトによって共有されると同定された、１１〜１６
ｂｐのコア配列のほとんど不変部分に正確に相当する（
英国特許公告筒２，１６６．４４５号およびここにおけ
る第２図参照）。反復単位は完全には相同ではない。ミ
ニサテライト内からのい（つかのランダムに選択された
領域の配列の分析は、限定された量の反復配列の変動を
明らかにした。３３ｂｐの反復単位のサブセットを生成
する４ｂｐの欠失を含む、大部分の変動は１より多い反
復単位にわたって拡散している。１つの変動（領域Ｃに
おけるＡ−Ｃのトランスバージョン）はユニーク内部Ｈ
ａ　ｅｍ部位をつくり、それゆえ多分１つの反復単位中
に見い出されるだけである。

ミニサテライトの開始および終りの反復単位は、認めら
れるように、内部の反復単位よりも配列において変化し
ている。

９７ｇ３中のミニサテライトは、正常の密度の制限部位
を含有する非反復ＤＮＡによってフランキングされてい
る（第１Ｂ図）。５′フランキング領域の開始は、逆位
Ａ１ｕ要素の頭部から構成されている。ハイブリダイゼ
ーションプローブａおよびｂによって定められる、残り
の５′および３′フランキング領域は、ユニーク配列Ｄ
ＮＡであり、そして全体のＤＮＡ中のこの座にのみハイ
ブリダイズする（データは示されていない）。

５′フランキング領域は、かなりの量の単純配列のＤＮ
Ａ　［ポリプリンおよび（ＡＣＣ）ｎ］を含有する（第
２図）。

−の　ノ　　　　　　るミニサテライトヒ）ＤＮＡ中の
対応する座を特異的に検出するハイブリダイゼーション
プローブとして、クローニングしたミニサテライトの断
片全体を使用できるかどうかを決定するために、ｐλｇ
３がらの５ａｕ３Ａインサートを、ヒト競争体（ｃｏｍ
ｐｅｔｉｔｏｒ）ＤＮＡの存在下に、Ｈｉｎｆｌ（ＤＮ
Ａフィンガープリント生成に日常的に使用されている制
限酵素）消化ヒトＤＮＡにハイブリダイズさせた。

第３図は、２２ｇ３によって検出された多形性ＤＮＡ断
片のメンデル遺伝を示す。ヒ）ＤＮＡの８μｇの試料を
Ｈｉｎｆ　Ｉで消化し、そして０．８％アガロースゲル
の電気泳動にかけた。消化物を３ａｕ３Ａインサートと
、Ｉｘｓｓｃ中で６５℃において６％のポリエチレング
リコールおよび５０μｇ／ｍｌのアルカリ剪断ヒト胎盤
競争体ＤＮＡの存在下に、サザブロットハイビリダイズ
させ、そしてハイブリダイゼーションの後０．２　Ｘ５
ＳＣ中で６５℃において洗浄した。２２ｇ３は、示す個
体のすべてにおいてへテロ接合性である単−座を検出す
る。対立遺伝子の遺伝（文献により示される）はメンデ
ル的である。

、高いストリンジエンシー（０，２Ｘ５ＳＣ，６５℃）
において、１つまたは２つのハイブリダイズする断片が
すべての検査した個体において検出された。

２２ｇ３は前に試験したｍｇの血族において８．２ｋｂ
の断片を検出し、バンドｇがクローニングされているこ
とを確証した（データは示されていない）。これより低
いストリンジエンシー（ＩＸＳＳＣ。

６５℃）において、追加のかなりハイブリダイズする多
形性ＤＮＡ断片が検出された（データは示されていない
）。

２２ｇ３により高いストリンジエンシー検出されるＤＮ
Ａ断片は、メンデル式に、単−座の対立遺伝子として分
離する。この座は性連鎖されていず、そしてまた、２つ
の大きい血統の研究において有意ではないが、不完全な
性連鎖を示した（６１の試験した子孫、Ｚ＝０．１８、
θ＝０．４３：データは示されていない）；それゆえ、
それは常染色体の座として挙動し、そして染色体７上に
位置している（表１参照）。

このミニサテライト　亡における　ｒな　ン　・止 ７６人の任意に選んだ英国の白人からのＤＮＡの）（ｉ
ｎｆ　Ｉ消化物を、２２ｇ３からのインサートで選別し
た。なおこの場合、選別は最初単独で、次に１４人（１
人当り１ｄｇＤＮＡ）のプール中で行われた。これを長
さ３５ｃｍの０．７％アガロースゲルを通して電気泳動
にかけ、対立遺伝子の分離を最大にした。この集団試料
中において検出された別々の対立遺伝子の長さは、各対
立遺伝子中における反復単位の推定数および対立遺伝子
頻度と共に、第４図に示されている。従って第４図はミ
ニサテライト対立遺伝子の大きさの分布を示している。

最も短い共通対立遺伝子中におけるミニサテライトの長
さは、フランキング単一コピープローブａおよびｂ　（
第１図）（データは示されていない）を用いて、ホモ接
合体中におけるこの断片のゲノム地図を作製することに
より測定した。

各対立遺伝子光りの反復配列の数は大よそのものであり
、ミニサテライト中における３７〜３３のｂｐ反復単位
の比率によって左右される。短い共通の対立遺伝子を除
いて、１回（４２個の対立遺伝子）、２回（１２個の対
立遺伝子）、３回（１２個の対立遺伝子）または４回（
５個の対立遺伝子）、残りの対立遺伝子をサンプリング
した。これら対立遺伝子のすべてが均一に希（ｑ　＝　
０．００８１、”　（４ｄ、ｆ、）＝４．０）であるな
らば、この分布は予想されたものとそれほど違いはない
。従って上記分布状態は１つの共通の短い対立遺伝子（
ｑ　＝　０．１６５）および集団となって存在する１＜
１３個の均一に希薄な対立遺伝子（対立遺伝子１個当り
ｑ　＝　０．００８１）の簡単なモデルと一致している
。

少くとも７７個の別々の対立遺伝子は、この集団試料中
において分離することができ、反復数は対立遺伝子１個
あたり１４〜５２５の範囲内にあった。

集団試料中におけるホモ結合体は、最も短い対立遺伝子
の場合、すべてホモ接合的であった。対立遺伝子の数の
上記推定値および希対立遺伝子の平均頻度はゲル分離に
より制限されており、且つこの試料中における別々の長
さの対立遺伝子の実際の数はそれよりと多いと思われる
。

対立遺伝子の長さの分布は完全にランダムであるように
は見えないが、３種類の遺伝子（第４図）、即ち短い対
立遺伝子（１４〜１６反復配列）、中間対立遺伝子（４
１〜６８反復配列）および長い対立遺伝子（１０７〜５
２５反復配列）を明示している。対立遺伝子の長さの二
項分布はヒトのインスリン遺伝子について５′の位置に
ある超可変部位に関して白人の場合について既に述べら
れている（Ｂｅｌｌ、　ＧＩ等、１９８２年、ネイチャ
ー２９５．３１〜３５頁参照）。

ただしこの二項分布は不明確で明らかではない（Ｌｅｂ
ｏ、ＲＶ等、１９８３年、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、米国８０．４８０４〜４８１２頁）。

断片ｇの分離結果によれば、ＤＮＡフィンガープリント
における大きな且つ高度に多形性のＤＮＡ断片は、各超
可変部位を検査するのに適当な遺伝子座特異性プローブ
を提供するための分子クローニングにかかりやすい。断
片ｇはバクテリオファージλ中においてクローン化する
ことができたが、得られたクローンはｒ　ｅ　ｃ”　Ｅ
、　　Ｃｏ１１．上において異常な増殖特性を示した。

このことはファージ中の従来の増幅されたヒトライブラ
リーからのミニサテライトクローンの涸渇を導く。クロ
ーン化したミニサテライトはｒ　ｅ　ｃ　Ａ　　Ｅ、　
　Ｃｏ１１゜中におけるρＵＣｌ３へのサブクローニン
グ中においてもその後においても不安定である。なぜな
らば最終組換え体ｐλｇ３は断片ｇと比較して約３０個
の反復単位を失ったからである。従ってｐＡｇ３の物理
的地図（第１図）は断片ｇの構成を完全には反映してい
ない。

クローン化したＤＮＡ断片は、ミニサテライトについて
予想される構造を有しており、断片ｇが長いサテライト
ＤＮＡから誘導されたものではないということを立証し
ている。各反復単位中における「コアー」配列および５
′フランキング領域におけるＡｌｕ配列の一部両方の存
在にもかかわらず、クローン化した断片ｇは競合ヒトＤ
ＮＡの存在の下で遺伝子座特異性プローブとして作用す
る。９２ｇ３が他のコア含有ミニサテライトを効率的に
検出することができないのは、他のミニサテライトへの
交差ハイブリダイゼーションを妨げると考えられる各反
復単位中に存在する付加的なコア不在ＤＮＡのためであ
る（英国特許第２．１６６．４４５号参照）。

クローン化したミニサテライトは、多分、各対立遺伝子
における反復単位の数および３７ｂｐ反復型と３３ｂｐ
反復型の比率の両方の点における対立遺伝子変化のため
に、極端に長い多形を示す。

１５８個の染色体のランダム集団試料中において、１つ
の共通の対立遺伝子および少くとも７６個の希対立遺伝
子を分離することができた。この遺伝子座は殆どの、ま
たはすべての今まで特徴付けられているクローン化した
ヒト超可変領域よりもずっと多形性である。なお上記超
可表領域は、「コア」配列を明確にするために最初用い
られていた比較的短いクローン化ミニサテライトを含む
（英国特許第２．１６６．４５５号参照）。この遺伝子
座におけるペテロ接合性は少くとも９６．６％であり、
殆どのへテロ接合体は短い共通対立遺伝子から生じる。

この遺伝子座における新たな対立遺伝子は、反復数の変
更、即ちＤＮＡ複製中におけるすべりまたは「コア」配
列によって生じる不均一な交換、即ち准定上の組換えシ
グナルによって発生する。

中性突然変異ランダム浮動の仮説の下において、パラメ
ーター４ＮｅＶ　（θ）（式中、Ｎｅは有効な集団の大
きさを表し、そして■は配偶子１個当りの新規な長い対
立遺伝子への突然変異率を表す）は、無限の対立遺伝子
モデルを用いて集団試料中において得られた異なる対立
遺伝子の数から最も正確に算出することができる（Ｅｗ
ｅｎｓ　Ｗ　Ｊ、１９７２年、Ｔｈｅｏｒ、　Ｐｏｐｕ
ｌ、Ｂｉｏｌ、３．８７〜１１２頁）、我々はこの遺伝
子座について６０〜９０におけるθを測定する。

なおこのθは短い共通対立連子が含まれるか否かで異っ
てくる。ヒトのＮｅは〜１０’であるので、この遺伝子
座における新規な長い対立遺伝子への突然変異率■は配
偶子１個当り約０．００２である。

■のこの値は低すぎる。なぜならば検出された対立遺伝
子の数はゲル分離により制限されているからであり、且
つ無数の分離可能な対立遺伝子が存在していないからで
ある。この遺伝子座におけるミニサテライトＤＮＡの平
均的長さは５ｋｂであり、従ってミニサテライトｋｂ当
りの突然変異（組換え）率は、他の短いコア含有ミニサ
テライトについて算出しな１０−’／ｋｂおよびヒトＤ
ＮＡに対する１０−’／ｋｂの平均減数組換え率と比べ
て、＞４Ｘ１０−’であるＣＪｅｆｆｒｅｙｓ　Ａ　Ｊ
等、１９８５年、ネイチャー３１４．６７〜７３頁参照
）。従って、このミニサテライト遺伝子座における新し
い対立遺伝子の発生速度は著しく高く、このことは本願
の発明者による先の提案、即ちコアに富んだ領域は組換
えのホットスポットであるということと一致している。

短い対立遺伝子の場合、突然変異率は比較的低い。この
ことは最も短い対立遺伝子がどのように浮動して、この
過程中において不均一な交換により破壊されることなく
、集団においてかなりの頻度を達成するかについて説明
していると思われる。

ＤＮＡフィンガープリントにより、それぞれの同定のた
めの、そして例えば父系および移住争いの点で家族関係
を確立するための強力な方法が立証された。この方法の
精度は、２人の任意に選ばれた人々によってバンドを共
有する低い平均確率Ｘによって決定される。英国の白人
の場合、４ｋｂより大きなりＮＡフィンガープリントＨ
ｉｎｃｌ断片について経験的にＸは０．２と算出された
。

各人々間におけるバンドの共有が生じる場合（即ち、１
人のバンドが、同様な移動度のバンドおよびオートラジ
オグラフィー強度によって別の人のそれに匹敵する場合
）、共有されたバンドが同じミニサテライト遺伝子座の
同一の対立遺伝子を表すかどうかは明らかでない。第４
図における対立遺伝子の分布によれば、４ｋｂ未満の対
立遺伝子のＸを算出することができる。この特定のミニ
サテライトの遺伝子座の場合Ｘ　＝　０．０１６であり
、この値は多遺伝子座ＤＮＡフィンガープリントからの
算定値よりも１桁低い。このクローン化ミニサテライト
がＤＮＡフィンガープリント中において表示されている
対立遺伝子について典型的なものであるならば、無関係
なりＮＡフィンガープリント間に殆どのバンドが共有さ
れていることは、異ったミニサテライト断片の偶然の共
同移動の結果である。この重要な実際の結果によれば、
例えば、子におけるすべての父兄バンドが推定上の父の
ＤＮＡフィンガープリント中に正確に存在する父系争い
において非除外の場合、Ｘ　＝　０．２について正確に
算出したまちがった包含の非常に低い確率は、実際の確
率（Ｘ　＝　０．０１６について）よりも著しく高すぎ
る。

ＤＮＡフィンガープリントプローブ３３．６および３３
、１５を使用するならば、大きなヒト血縁関係における
３４個以内の分散常染色遺伝子座の分離をスコアーする
ことが可能である。試験した殆どの遺伝子座について、
２つの対立遺伝子の１方のみが大きな（４ｋ　ｂ以上）
分離ＤＮＡフィンガープリント断片の組°においてスコ
アー可能であり、このことはミニサテライト対立遺伝子
間に著しい大きさの差が存在することを暗示しており、
多くの対立遺伝子はＤＮＡフィンガープリントのわずか
に分離した（＜４ｋｂ）９Ｍ域に位置している。このこ
とはまたクローン化ミニサテライトについても見ること
ができる。即ち、この遺伝子座における）ｌｉｎｆＩ対
立遺伝子の長さは１．７〜２０．４　ｋ　ｂの間にあり
、且つ第４図における対立遺伝子頻度分布は、この遺伝
子座の両対立遺伝子が個体のわずか４０％のＤＮＡフィ
？ガ・−プリント中において分離されており、一方個体
の１４％においては対立遺伝子がスコアー可能ではない
。

ミニサテライトプローブ３３．６および３３．１５は一
緒になって約６０個の超可変遺伝子座を検出し、これら
座の多くはクローニングにかけられ得るものであって、
例えばヒトにとって連鎖研究に理想的な著しく有益な単
一遺伝子座プローブのバンクを提供するものでなければ
ならない。遺伝的異常の連鎖分析は、また完全なりＮＡ
断片を使用して単一な大きな家族中において可能である
。疾患と共に同時分離するように見える多形性断片が検
出されるならば、この断片をクローン化して、連鎖分析
を連行的な影響家族まで拡大する遺伝子座に特異なプロ
ーブを提供することが必須である。

次の実施例２においては、下記において述べられる材料
および方法が用いられる。

ａ）゛　した　　のミニサテライトのクローニン４０人
のランダムに選んだ人々のそれぞれから５μｇの血液Ｄ
ＮＡがプールされ１．　Ｓ　ａ　ｕ　３　Ａにより完全
消化され、そして０．６％アガロースゲル中における予
備電気泳動により５〜１５ｋｂの断片が分離され、次に
透析膜上に電気溶離された。

精製された分画は第２の調製用ゲル中において電気泳動
にかけられ、すべてのわずかな汚染５ａｕ３Ａ小断片を
除去した。５０ｎＨの５〜１５ｋｂ分画がＢ　ａ　ｍ　
ＨＩ　　（ＬｏｅｎｅｎおよびＢｒａｍｍａｒ　、　１
９８０年、Ｇｅｎｅ２０巻、２４９〜２５９頁）で開裂
した後に単離された１１００ｎλＬ４７．１アームに連
結され、ライブラリーが構成され、ヒトミニサテライト
プローブ３３．６および３３．１５でスクリーニングさ
れ（英国特許第２，１６６．４４５号参照）、さらに陽
プラークが実施例１に述べられているように分離され、
組換えファージＭＳ系を生成した。

組換えファージＤＮＡが５ａｕ３Ａで消化され、そして
大きなインサート断片が低いゲル化温度アガロース（ジ
−プラーク）中における電気泳動によって小さなベクタ
ー断片から分離された。インサートを含むゲルスライス
が６５℃にて３容量の水中に溶解され、１０ｎｇインサ
ートＤＮＡを含むアリコートがランダムオリゴヌクレオ
チドプライミングによって’３２Ｐで標識された（Ｆｅ
ｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９８４年
、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３７巻、２６６〜
２６７頁）。

Ｃ）サザンブロ・・ドハイプリード ゲノムＤＮＡ試料がＪｅｆｆｒｅｙｓ等、１９８６年、
Ａｍ、Ｊ。

Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、＋　３９巻、１１〜２４頁に述べ
られているように限定酵素処理され、そして電気泳動に
かけられた。ＤＮＡがＨｙｂｏｎｄ　−Ｎ　（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）に移行され、紫外線照射によって固定され、
そして０．５　Ｍリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ、１
ｍＭのＥＤＴＡ　（ｐｌ（７，２）中で６５℃で５分間
予備ハイブリダイズされた（ＣｈｕｒｃｈおよびＧ１１
ｂｅｒｔ　、　１９８４年、Ｐｒｏｃ、Ｎａ目。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国、８１巻、１９９１〜１９９５
頁）。フィルターが２５μｇ／ｍｌｌの剪断した単一ス
トランドヒト胎盤競合ＤＮＡの存在の下で０．５μｇ／
ｍｌの３２ｐ標識ラベルＤＮＡ　（特異性活性〜１０ｑ
ｃｐｍ／ｕｇＤＮＡ）で−晩ハイブリダイズされた。ハ
イブリダイゼーションの後、フィルターが４０ｍＭリン
酸ナトリウム、１％ＳＤＳ　（ｐＨ７，２）中において
６５℃で洗浄され、次に０．１　ｘｓｓｃ（１５ｍＭ　
ＮａＣｌ１　、１．５　ｍＭクエン酸３ナトリウム、ｐ
ｌ（７，０）および０．０１％ＳＤＳ中におイテ６０℃
で激しく洗浄された。フィルターが増強スクリーンの存
在の下で一８０℃で３時間から１週間オートラジオグラ
フで処理された。

ｄ）ＭＳ　　　え　の　ンデム　′　　１のゞ各ＭＳ組
換え体ＤＮＡが音波処理され、０．３〜０、６　ｋ　ｂ
の大きさを有する断片がサイズ選択され、そしてショッ
トガン力’Ｍ１３ｍｐ１９のＳｍａ　Ｉ位置にクローン
化された（Ｙａｎｉｓ−Ｐｅｒｒｏｎｓ　Ｖｉｅｉｒａ
およびＭｅｓｓｉｎｇ　−、１９８５年、Ｇａｎｅ　３
３巻、１０３〜１１９頁）。

組換え体ファージが３２ｐ標識ＭＳインサートＤＮＡを
用いてプラークハイブリダイゼーシヨンによって選別さ
れた。与えられたＭＳ組換え体からの１０個の陽性の強
い単鎖ファージＤＮＡがＣ−テストによって対の形で比
較された（ＷｉｎｔｅｒおよびＦｉｅｌｄｓ、１９８０
年、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　　８巻
、１９６５〜１９７４頁）。殆どのＤＮＡは２つの相補
的Ｃ−テストグループになり、従ってλＭＳインサート
の長いタンデム反復領域から誘導されたようであった。

２つの相補的グループのそれぞれからの２つのＮ１３組
換え体はジデオキシヌクレオチドチェインターミネーシ
ョン法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎおよびＣｏｕ
ｌｓｏｎ、　１９７７年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、米国、７４巻、５４６３〜５４６７頁；　
Ｂｉｇｇｉｎ、ＧｉｂｓｏｎおよびＨｏｎｇ、　１９８
３年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国、
８０巻、３９６３〜３９６５頁）によってその後処理さ
れ、両頭上の各ＭＳ組換え体のコンセンサス反復配列が
決定された。

調製ゲル電気泳動分離によりヒｌ−ＤＮＡフィンガープ
リントから選ばれた断片をクローン化し、次にバクテリ
オファージ内でクローン化する方法は実施例１に述べら
れている。様々なミニサテライトを単離するために、４
０人のランダムに選ばれた人々からプールしたＤＮＡか
らの大きさ６〜１５ｋｂの５ａｕ３Ａ断片が、ＢａｍＨ
Ｉ置換ベクターλＬ４７．１にクローン化された（Ｌｅ
ｏｎｅｎおよびＢｒａｍｍａｒ＋　１９８０年；　ｒＡ
　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ｌａｍｂｄａｖｅｃｔ
ｏｒ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｌａｒｇｅ　ＤＮＡ　
ｆｒａｇａ＋ｅｎｔｓ　ｍａｄｅｗｉｔｈ　５ｅｖｅｒ
ａｌ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ　（い
くつかの制限酵素により生成された多量のＤＮＡ断片を
クローン化するバタテリオファージラムダベクター）」
Ｇｅｎｅ、　２０巻、２４９〜２５９頁〕。ヒトミニサ
テライトは実施例１において証明されたように長さの点
で実質的な対立遺伝子変化を示すことができるので、多
量の５ａｕ３Ａ断片をクローン化するためにプールした
ヒトＤＮＡを使用することは、多量の５ａｕ３Ａ対立遺
伝子を有するクローン化可能な超可変遺伝子座の数を最
大限に多くすることができる。２０００の組換え体のラ
イブラリーから５個のファージが、ヒトミニサテライト
プローブ３３．１５へのハイブリダイゼーションにより
単離され、そして５個のファージがプローブ３３．６に
より検出され、ＭＳ系の組換え体を生成した（第１図参
照）。

以下倉自 各λＭＳｍ換体が超可変ミニサテライト用の遺伝子座特
異性プローブとして作用することができるかどうかを決
定するために、各組換え体の５ａｕ３Ｓインサートが、
３人の任意に選ばれた個体のＨｉｎｆ　Ｉ消化物に対し
て、または７ＭＳ３２についてはＡｌｕｌ消化物、即ち
）（ｉｎｆ　Ｉ部位（第５図）を含むミニサテライトタ
ンデム反復単位に対して、ヒト競合ＤＮＡの存在の下で
ハイブリダイズされた。各ヒトＤＮＡ中における１つま
たは２つの大きな可変ＤＮＡ断片にハイブリダイズした
組換え体の１０個のうちの８個が試験された。プローブ
３３．６　（λＭＳ８，４０．４２および４７）によっ
て検出された組換え体の４つが可変ＤＮＡ断片の同じパ
ターンにハイブリダイズし、従って同じ超可変遺伝子座
から誘導される（第５図および第１表）。

第５図は遺伝子座特異的超可変ＤＮＡプローブのための
２Ｍ３組換え体のスクリーニングの例を示している。３
人の無関係な人からのＤＮＡの２μｇの試料が１（ｉｎ
ｆｌで消化され、そして０．８％アガロースゲルにより
電気泳動処理され、そしてｒＭａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｊにおいて述べられているように
して、ｐλｇ３（実施例１）２ＭＳ８および７ＭＳ４０
からの３２ｐ標識５ａｕ３Ａインサートとサザンブロッ
トハイプリダイズされた。

ハイブリダイゼーションの後、フィルターが６５℃の０
．ｌＸ５ＳＣにおいて洗浄され、そして増強スクリーン
の存在の下で１日（左側のパネル）または１週間（右側
のパネル）オートラジオグラフで写真にとられた。なお
、２ＭＳ８および７ＭＳ４０は同じ超可変遺伝子座を検
出し、そして長期オートラジオグラフ法において、追加
の可変性ＤＮＡ断片が検出可能である。

残りの組換え体λＭＳＬ、３１．３２および４３が、す
でに特徴づけられている９２ｇ３遺伝子座を含まない異
る遺伝子座から誘導された（実施例１および第５図参照
）。これら２Ｍ３組換え体はどれも多可変断片のＤＮＡ
　ｒフィンガープリント」を生成しなかったけれども、
殆どのλＭＳプローブは長期オートラジオグラフ露光に
おいて追加の多形性Ｄ　Ｎ　Ａ断片に対して弱く交差ハ
イブリダイズするように見えた（第５図）。プローブ３
３．１５、λＭＳ３および７ＭＳ３０によって検出され
たλＭＳ）Ｊｌ換え体の２つは、）ｌｉｎｆ　Ｉまたは
５ａｕ３Ａで消化したヒトＤＮＡ中の特異的座を、ヒト
競争体ＤＮＡの存在下または不存在下に検出できなかっ
た。延長したオートラジオグラフで、両者の組換え体は
、可変ＤＮＡ断片の同一の淡いパターンを検出した（デ
ータは示されていない）。われわれはこの座持異性の欠
如を説明できず、そしてこれらの２つの２Ｍ３組換え体
をこれ以上特性づけなかった。

こうして従来大きい不安定なヒトミニサテライトのクロ
ーニングにおける報告された困難〔例えば、Ｎ１ｃｈｏ
ｌｌｓ　　ｅｔ　　ａ１０９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３　、７５６９−７５７８およびＷｙｍａｎ旦　ａｌ
（１９８５）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｈ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　７７　、６７５
４−６７５８参照〕にかかわラス、ＤＮＡフィンガープ
レート中に検出された最大の最も可変性のＤＮＡ断片の
少なくともあるものは、インサートがｒｅｃＢＣＥ、　
　ｃｏｌｉ宿主中のファージの増殖により安定化される
場合、バクテリオファージ中でクローニング可能である
ことを、われわれは立証することができた。

各ＡＭＳ組換え体からのインサートＤＮＡのランダムセ
グメントを配列決定して、各クローニングした超可変座
がタンデム反復ミニサテライトから成るかどうかを決定
した（材料および方法を参照）。すべての２ＭＳクロー
ンは、長さがλＭＳｌについての９ｂｐないし２ＭＳ４
３についての４５ｂＰの範囲であるタンデム反復単位か
ら主として成ることが示された（第６図）。

−第６図は、ミニサテライトのλＭＳ系列のコンセンサ
ス反復配列単位を示す。各クローニングしたミニサテラ
イトのランダムセグメントを配列決定して、コンセンサ
ス反復単位を定めた。各コンセンサス中の可変位置は、
次のように示される：Ｒ，ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ、Ｙ＝Ｃ
またはＴ　、　Ｎ。

ｎ＝任意の塩基。７ＭＳ８中のミニサテライトは、長さ
が２９ｂｐおよび３０ｂｐの２つの相互に散在する反復
単位から成る。９２ｇ３のコンセンサス反復配列は、ま
た、第２図に示されている。各反復配列はコア配列と整
列されており、一致するものは大文字で示されており、
そして９２ｇ３゜λＭＳ３１および７ＭＳ３２とコアと
の比較から誘導される新しいコア配列も開示されている
。従来配列決定されたミニサテライトに見られる反復単
位間の変動と一致する、完全に相同の反復単位は、ミニ
サテライト中に存在しない（英国特許公告第２、１６６
、４４５号およびここの実施例１参照）。最も顕著なこ
とには、λＭＳ８中のミニサテライトは、長さが２９ｂ
ｐおよび３ｏｂｐの２つの密に関連するが、異る反復単
位の相互に混合した列から成る（第６図）。

こうして、５つの新しい超可変座が分離され、各々は主
としてタンデム反復ミニサテライトから成る。９２ｇ３
．λＭＳＬ、λＭＳ３１および７ＭＳ３２のタンデム反
復単位の各々は、期待されるように、コア配列を含有す
る（第６図）。しかしながら、コア配列のコピーは不完
全であり、そしてこれらのミニサテライトの反復単位の
比較は、これらの大きい極めて可変性の座と優先的に関
連する新しいコア配列を明瞭に定めない。その代わり、
広い範囲のコア誘導体を大きいミニサテライトと関連づ
けることができるように思われる。より顕著には、コア
配列の高度に分岐した異型（Ｖｅｒｓｉｏｎ）のタンデ
ム配列から成るプローブ３３．６（英国特許公告第２．
１６６．４４５号参照）によって検出されるミニサテラ
イトλＭＳ８および２ＭＳ４３は、コア配列の高度に分
岐した（ｄｉｖｅｒｓｅｄ）異型を含有する（第２図）
。再び、＝λＭＳ８．λＭＳ４３および３３．６の比較
は、これらの３つの座に優先的に関連づけられる新しい
特異的配列を明瞭に明らかにしない（データは示されて
いない）。明らかなように、最も可変性のミニサテライ
トに関連づけられる他の配列のモチーフ（ｍｏｔｉｆ）
　、とくにプローブ３３．６によって検出されるものは
、クローニングしたミニサテライトの非常に大きいスペ
クトルの分析を必要とするであろう。

Ｃ）クローン　ミニサテライトによって分離された５つ
の新しいミニサテライト、λＭＳ　ｌ　、　８．３１．
３２および４３の各々は、単一の大きい可変性の座を検
出する。すべての座のメンデル遺伝は、ＣＥＰ）Ｉプロ
グラムによって提供された大きい水平系統における分離
を分析することによって確証された。

第７図は、７ＭＳ３２によって検出される超可変座のメ
ンデル遺伝を示す。ＣＥＰＩ（家族１４１３からの１μ
ｇのＤＮＡ試料をＡ７！ｕ　Ｉで消化し、そしてλＭＳ
３１からの３２ｐ標ｌ！ｉＳ　ａ　ｕ　３　Ａインサー
トにサザンプロットハイプリダイズさせた。この族はこ
の座において完全に情報提供性（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖ
ｅ）である。

各プローブについての対立遺伝子の変動性の程度は、ラ
ンダムに選択した英国人の個体の間で共有される対立遺
伝子の頻度を分析することによって推定した（第８図）
。第８図は、２ＭＳ４３によって検出された超可変座に
おける対立遺伝子の変動性の推定を提供する。２０人の
不規則に選択した英国人からのＤＮＡの１μｇの試料を
、ＨｉｎｆＩで消化し、そして２ＭＳ４３にサザンブロ
ットハイプリダイズさせた。すべての個体はへテロ接合
性であり、この超可変座におけるヘテロ接合性のレベル
が高い（Ｈ＞０．８６、Ｐ　＞　０．９５）ことを示す
。ヘテロ接合性のより正確な推定は、各個体中の対立遺
伝子をオートラジオグラフ上の６つの最も近い近接体中
の対立遺伝子と比較して、個体間で共有される対立遺伝
子のレベルを推定することによって行うことができる。

例えば、個体５中のより大きい対立遺伝子は７中に存在
するが、２゜３．４．６および８中に存在しないように
思われる。同様に、５中のより小さい対立遺伝子は２〜
４または６〜８中に存在しない。検査したすべての個体
にわたって、Ｓ＝０．１１であり、これから平均の対立
遺伝子の頻度ｑはｑ＝１−　（１−３）１７２＝０．０
５６と推定することができ、そしてヘテロ接合性は（１
−ｑ）＝９４％と推定することができる。

すべての座は高度に可変性であり、ヘテロ接合性は２Ｍ
Ｓ８についての９０％から７ＭＳ３１についての９９％
に及ぶ（表１参照）。１５および１５０の個体のプール
において分離された対立遺伝子のスペクトルを比較する
ことによって、対立遺伝子の長さの変動度をさらに分析
した（第９図）。

第９図は、ヒトＤＮＡのプールにおける超可突座におけ
る対立遺伝子の長さの変動を示す。単一の個体（ａ）、
１５の個体のプール（ｂ）および１５０人のプール（ｃ
）からのＤＮＡの１０μｇの試料を、Ａｊ２ｕＩ（２Ｍ
Ｓ３２について）またはＨｉｎｆＩ（残りのすべてのプ
ローブについて）で消化し、そして示した座特異的超可
変プローブとサザンプロットハイプリダイズさせた。す
べての個体はランダムに選択した北ヨーロッパ人であっ
た。個体ａはプールｂ内に含まれ、そしてすべてのプー
ルｂの個体はプールＣ中に含まれた。

７ＭＳ４３は０でしるしをした短い）ｌｉｎｆ　Ｉ対立
遺伝子によって表わされる第２可変領域を検出すること
に注意すべきである。この領域はそれ以上特徴づけなか
った。

最も可変性の少ない座、２ＭＳ８、について、１５人の
プールにおいて分離可能である２つの主要な長さ５．３
　ｋ　ｂおよび７．２　ｋ　ｂの対立遺伝子＋７つの低
い頻度の対立遺伝子が存在する。２つの主要な対立遺伝
子がこれらの１５人の個体におけるサンプリング誤差の
結果でないことは、１５０人のプールにおけるそれらの
同様な分布、ならびに低い頻度の大きいスペクトルによ
って示される。

同様に、７ＭＳ４３（９４％のへテロ接合率）は１５お
よび１５０の個体のプールによって共有される７つの主
要対立遺伝子、ならびに多くの小比率の対立遺伝子を示
す。対照的に、最も可変性の座λＭＳＩ、３１および３
２および２７ｇ３（ヘテロ接合率は９７−９９％と推定
される）は、個体の両者のプールによって等しい強度で
共有される、有意の集団頻度をもつ対立遺伝子を示さず
（前述の２７ｇ３の最も短い１．６　ｋ　ｂのアレルを
除く）、こうしてこれらの座における対立遺伝子の数は
非常に高いと思わる。例えば、少なくとも５０の異なる
２ＭＳ３２の対立遺伝子を１５０の個体のプールにおい
て分離することができる。これはゲル電気泳動によって
限定される対立遺伝子の合計数の最小の推定値であろう
。

白人における対立遺伝子の長さの分散は、また、これら
の超可突座の間で変化する（第９図および表１参照）。

７ＭＳ３１の大部分の対立遺伝子は５．５〜９．３　ｋ
　ｂの比較的狭い大きさの範囲にわたってかなり均一に
分布し、これに対してスＭＳＩの対立遺伝子は２〜２０
ｋｂの間で大きさを変化させる。対立遺伝子の長さの分
布が不均一である場合が多少あることについての証拠が
存在する。

とくに７ＭＳ４３は５〜６ｋｂおよび８〜１４ｋｂの２
つの主要な対立遺伝子の大きさのクラスを示し、そして
２７ｇ３は１．６〜１．７．２．８〜３．６および５〜
１５ｋｂの３つの大きさのクラスを示し、これらについ
ては実施例１において前述されている。

上に示したように、検出される座は極めて可変性であり
、そして事実ヒトＤＮＡからこれまで分離されてきた大
部分の多形性座の中に存在する。

ｄ）ＣＩ可′　　の汰　　リ。

超可変座特異的プローブのいずれもげっし類ＤＮＡにパ
イプリダイズせず、それゆえこれらの座の分離は人間−
げっし類体細胞雑種において追跡できた〔第１０および
下表２参照〕。６つの座が４つの異なる常染色体に割当
てられ、染色体１および７の各々は２つの超可突座を共
有する。

第１０図は１．Ａ、１ｕＴで消化したヒト−げっし類体
細胞雑種ＤＮＡのパネルにおいて、２ＭＳ３２により検
出された超可突座の分離を示す。この座はヒト染色体１
と同時分離する（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｅ）　（下表２
参照）。興味あることには、雑種細胞系ＭＯＧ２Ｇ２は
、２ＭＳ３２およびλＭＳＩの両者の２つの対立遺伝子
を有した（データは示されていない）。

このことが強く示唆するように、ヒト染色体１の両者の
親のコピーはこの雑種中に保持されており、そして、す
べての他の陽性の雑種はこれらの座の各々において単一
の対立遺伝子のみを含有していたので、これはλＭＳＬ
および２ＭＳ３２のシンチニー（ｓｙｎＬｅｎｙ）につ
いて強く支持する証拠を提供する。雑種Ｆ４ＳＣ１３ｃ
ｌ１２は染色体１ｐを含有するが、２ＭＳ３２について
陰性である。こうして２ＭＳ３２は染色体ｌｑに一時的
に局在化している。次のコードを第１Ｏ図において使用
する： １、　ヒト２ ２、　ハムスター ３、マウス ４、　　ＦＧＩＯ ５、ＰＣＴ　ＢＡ１８ ６．１α９４９８ ？、　　５ＩＦ４Ａ２４ＥＴ ８、　５ＩＦ１５Ｐ５ ９、　　ＣＴＰ３４Ｂ４ １０、　ＴＷＩＮ　１９０１２ １１、７ＷＩＮ　１９　Ｆ９ １２、ＴＷＩＮ　１９　Ｆ６ １３、　ＴＷＩＮ　１９　Ｃ５ １４、門ＯＧ　２Ｃ２ １５、ＭＯＧ　２Ｅ５ １６、　ヒ　ト　１ １７、ラット １８、０ＵＲ４，３ １９、ＦＩＲ５ ２０、Ｃ４Ａ ２１、０ＵＲ４Ｒ３ ２２、３Ｗ４　ｃｌ　５ ２３、クローン２１ ２４、　ＷＩＬＦ　１ ２５、　Ｆ４ＳＣ１３ｃｌ ２６、５ＩＦ４Ａ３１ ２７、　ＦＳＴ　９／１０ ２Ｂ、　ＨＯＲＬ　４１１Ｂ６ ２９、　）ＩＯＲＰ　９．５ 表２はヒト−げっし類体細胞の雑種における超可変座の
染色体帰属を示す。

以下余白 ｃｈｒ、　　　　　　　１２３４５　　　６７８９１０
　　１１１２１３１４１５１８＋＋　−＋　−−−−−
＋　　　　＋　　−＋　　−−１９−＝−−−＋−−−
−−−−− ２０Ｍ−−Ｍ−−−−−＋　　　　−−−−−２１＋　
−−＋＋　　　　−−−一−−＋＋−＋２２　　　　　
　　　　＋−Ｍ＋−−−−Ｍ＋　　　　Ｎ−−−−Ｘ　
　　　　　　　　　　＋＋　−−＋　　　　　−−＋＋
＋　　　　　＋　　＋　　＋　　−＋９７ｇ３　　　　
−−−−＋　　　　＋−ＭＭ　＝　　　−−−−−λＭ
Ｓ　　１　　　　−−Ｍ−一　　　−−＋−−＋−−−
−７ＭＳ８　　　　　−Ｎ−＋−−−−−−−−’＋−
−λＭＳ３１　　　　　−＋　−−＋　　　　＋　−−
−−＋　　　　−−−λＭＳ３２　　　　　−−−−−
　　　−−−−−　　　　＋　　−−−−２Ｍ３４３　
　　　　　＋　−−＋＋　　　　　　−−−＋　　　　
　　　＋　　−−＋−−＋＋＋　　　　　　＋＋＋＋ −−−−−−−＋− −＋−＋＋＋＋−− ＋−−＋＋＋＋＋＋ 一−−＋＋＋＋ＮＮ ＋＋＋−−−−＋＋ −＋　　＋　　−−−−＋　　＋　　　ｃｈｒ、　　７
　１７／１７−　−　　＋　　＋　　＋　　　　−−＋
　　＋　　　ｃｈｒ、　　１　２２／２２＋　　−＋　
　−−−−＋　　＋　　　ｃｈｒ、　　５　２０／２１
−　　＋　　＋　　−−−−＋　＋　　　ｃｈｒ、　　
７　２０／２０−　−　　＋　　＋　　＋　　　−−＋
　　＋　　　ｃｈｒ、　　１　２３／２３−　−　　＋
　　＋　　＋　　　　＋　　＋　　−＋　　　ｃｈｒ、
　　１２　２４／２４表２において、次の体細胞雑種を
類型に分類した： Ｌ　ＤＵＲ４，３；　２、ＦＩＲ５；　３、Ｃ４Ａ；４
、ＤＵＲ４Ｒ３；　５．３Ｗ４ｃ１５；　　６、クロー
ン２１；　　７、ＷｒＬＦ、１；　　８、Ｆ４ＳＣ１３
ｃｌ１２：　９．５ＩＦ４Ａ３１；　１０　、ＦＳＴ９
／１０：１１、ＨＯＲＬ４１１Ｂ６：　１２　、ＨＯＲ
Ｐ９．５：　１３　、ＦＧＩＯ；　１４、ＰＣＴＢ八１
８へ　　１５　　、　１　　α９４９８：　　１６、５
ＩＦ４Ａ２４Ｅ１；　　１７　．５ＩＦ１５Ｐ５；　１
８　、ＣＴＰ３４Ｂ４；　１９　、ＴＷＩＮ　１９０１
２；　２０、ＴＷＩＮ　１９Ｆ９；　２１　、ＴＷＩＮ
　１９Ｆ６；　２２　、ＴＷＩＮ　１９Ｃ５；２３　、
ＭＯＧ　２Ｃ２；　２４、？’１ＯＧ２Ｅ５およびこの
表に使用した記号の意味は次の通りである： ＋、染色体または超可変座の存在−一、染色体または座
の不存在；Ｍ、ある細胞中にのみ存在する染色体、また
は座はサザンブロソトハイプリダイゼーションによって
ほんの弱く検出された；Ｎ、染色体は試験されないかあ
るいは、あいまいな結果、座は試験されなかった；Ｐ、
短いアームの存在：Ｄ、染色体７　ｐｔｅｒ−”　ｑ　
２２が７／Ｘ転位として存在する。各座特異的超可変プ
ローブの推理した染色体帰属とが与えられており、同時
に完全な染色体および超可変座の存在または不存在につ
いて一致した、不明瞭な情報を与える細胞雑種の分画が
与えられている。各超可変プローブについて、１つを除
外したすべての染色体はこの分析において多様に排除さ
れた。

染色体１ｐを含有する雑種８　（Ｆ４ＳＣ１３ｃｌ１２
）へのλＭＳＩのハイブリダイゼーションは、λＭＳＬ
が１ｐ上に存在することを示唆している。逆に、λＭＳ
３２は雑種８にハイブリダイズせず、１ｑへの局在化を
示唆している。ｐｇ３は、染色体７　ｐｔｅｒ＝　ｑ　
２２を含有する雑種２　（ＦＩＲ５）にハイブリダイズ
しない。さらに、それぞれ？　ｐｔｅｒ−＝　ｑ　３１
．３および７ｑ３１．３−＝ｑｔｅｒを含有する雑種Ｊ
ＤＡ　１３．１およびＪＤＡ３は、ｐλｇ３についてそ
れぞれ陰性および陽性であり（データは示されていない
）、ｐλｇ３を７ｑ３１．３−”ｑｔｅｒに位置決定す
る。逆に、２ＭＳ３１はＦＩＲ５およびＪＤＡ　１３．
１にハイブリダイズするが、ＪＤ八へにハイブリダイズ
せず、７　ｐｔｅｒ−ｑ２２への帰属を示唆する。この
集団化の欠如は、シンテニソク標識（ｓｙｎｊｅｎｉｃ
　ｍａｒｋｅｒ）のいずれかの対間の有意の連鎖の不存
在を示す、大きいＣＥＰ）！の親類関係（ｓｉｂｓｈｉ
ｐ）における連鎖の分析によって確証された。

実施例１に記載する９７ｇ３を包含する、すべての６つ
のクローニングしたミニサテライトの座は常染色体のも
のであり、そして分散している。

見い出されたそのうち２つのミニサテライトのジンテニ
ノク対は、いずれも有意の対の方法の連鎖を示さない。

この常染色体の位置決定および集団化の欠如は、ＤＮＡ
フィンガープリントの分離の分析からの前の結果と完全
に−敗し、これにより多コアのプローブによって検出さ
れる多数の超可変ＤＮＡ断片は多数の分散した常染色体
の座から誘導されるが、個々の断片の染色体上の位置は
ＤＮＡフィンガープリントから推理できないであること
が示された。

これまで位置決定されたクローニングしたミニサテライ
トは、それらがヒトゲノム上に不規則に分散している場
合に期待されるように、より大きいヒト常染色体から誘
導される傾向がある（表１）。

正確な領域の位置決定の不存在で、これらのミニサテラ
イトは、単純配列のサテライトＤＮＡ中に濃縮されてい
る、動原体およびテロマーに優先的に位置するという可
能性が残っている。しかしながら、マウスの組換え近親
交配種におけるＤＮＡフィンガープリント断片の分離分
析により、ネズミのミニサテライトは動原体またはテロ
マーに優先的に関連づけられないことが示され、そして
それらのヒト相手は同様に分散されるように思われる。

試験したタンプ４反復ミニサテライトプローブは非常に
感受性であり、それは多分ハイブリダイゼーションプロ
ーブと標的ミニサテライトＤＮＡの両者の反復的性質の
結果であろう。−夜のハイブリダイゼーションの後に得
られたサザンプロットのオートラジオグラフのシグナル
を＞Ｑ、ｌｎｇ／　ｍ　ｌのプローブＤ　Ｎ　Ａ　濃度
に飽和しくデータは示されていない）、そしてシグナル
は６０ｎｇ以下のヒトゲノムＤＮＡから得ることができ
る（第１１Ａ図参照）。同様に、試験した個体の遺伝子
型に依存して、これらのプローブは２％以下の１つの個
体のＤＮＡと他のものとの混合体を検出できる（第１１
Ｂ図参照）。

これらの座持異的ミニサテライトプローブの感度および
可変性は、それらをとくに法医学において有用とする。

第１１Ｃ図は、性的に攻撃されかつ殺された２人の被害
者からの精液種の分析を示し、ここで第２番目の被害者
からのＤＮＡの回収は、少なくとも０．５μｇＤＮＡ／
試験を必要とする従来のＤＮＡフィンガープリント分析
（英国特許公告第２，１６６．４４５号参照）のために
は不十分であった。

こうして、第１１図は、座持異的プローブの感度の評価
、および二重強姦／殺人の事件の法医学的分析へのそれ
らの応用を示す。第１１Ａ図において、Ｈｉｎｆｌで消
化したヒ）ＤＮＡの減少する量を、ＭＳＩからの３２ｐ
標識インサートＤＮＡとハイブリダイズさせた。フィル
ターを増強スクリーンの存在下に１週間オートラジオグ
ラフにかけた。第１１Ｂ図において、減少する量の個体
ＡのＤＮＡを４μｇの個体ＢのＤＮＡと示した比で混合
し、そして第１１Ａ図におけるように、λＭＳＬとサザ
ンブロットハイプリダイズさせた。第１１Ｃ図において
、被害者ＸおよびＹは性的に攻撃されかつ殺されていた
。容疑者ＺはＹの殺人罪で告発されており、そして法廷
の証拠はＸおよびＹの両者が同一個体によって殺されて
いたことを示唆していた。次の法医学的試料からのＤＮ
Ａを分離し、そして分析した；ａ、モーテム後（ｐｏｓ
ｔ−ｍｏｒｔｅｍ）２日目に採取したＸからの髪；ｂ、
Ｘの恥骨の毛から回収した精液と膣液との混合物；Ｃ１
容疑者Ｚからの新鮮な血液；ａ、ｙからモーテム後ＩＥ
目に取った心臓の血液；ｅ、精液、血液および膣液を有
するＹからの膣スワブ；ｆ、精子および血液を有するＹ
のスカートからの汚れ。試料ａおよびｂは４℃で３年間
貯蔵されており、試料ｄおよびｅは４℃で２か月間貯蔵
され、そして試料ｆは４　’Ｃで乾燥状態で２か月間貯
蔵されていた。ＤＮＡはＧ１１ｌ　、　Ｊｅｆｆｒｅｙ
ｓおよびｗｅｒｒｅｔｔ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１
８．５７７−５７９　、の手順に従って抽出し、Ｈ４ｎ
ｆｌで消化し、そして”Ｐ標識λＭｓ１インサートにサ
ザブロフトハイプリダイズさせた。

試料ｅ（０，１μｇのＤＮＡ）およびｆ　（０，０４ｐ
ｇのＤＮＡ）を除外して、各試料において０．８μｇの
ＤＮＡを分析した。オートラジオグラフィーは増強スク
リーンの存在下に１週間であった。精子種す、ｅおよび
ｆの各々は、被害者に帰属しない２つのハイブリダイズ
するＤＮＡ断片を含有することに注意すべきである。さ
らに、試料すは膣ＤＮＡから誘導される被害者の対立遺
伝子を含有する。

ｂ、ｅおよびｆにおける精液の対立遺伝子は区別不可能
であり、被害者ＸおよびＹが同一の男性によって性的に
攻撃されていたことを示唆している。

容疑者Ｚの対立遺伝子は精液種のそれと合致しない。

これらの結果は、２ＭＳ３１と交雑（データは示されて
いない）および大量の法医学的材料のＤＮＡフィンガー
プリントの分析によって確証された。

この証拠に照して、容疑者に対して提出された告発は主
席検察官によって取下げられた。

サザンブロソトハイプリダイゼーションにおけるこれら
のミニサテライトの感度は、プローブのプールを、第１
０図における５プローブのプール（９７ｇ３．λＭＳＬ
、λＭＳ８．λＭＳ３１および２ＭＳ４３）について示
すように、いくつかの座からの可変ＤＮＡ断片の同時検
出のために使用できるようにする。理論的には、５プロ
ーブによって検出可能な異なるＤＮＡ断片の数は Σ（１＋Ｈｉ）であり、ここでＨ４は第１番目のプロー
ブのへテロ接合性である。これらの５１０−ブについて
、平均９．７８の断片が１個体につき検出されるであろ
う。実際には、８．４±１．２（標準偏差）帯＞２ｋｂ
が分割される（４０のランダムに選択した個体を試験し
た）。この分割可能な帯の損失は部分的には小さく（１
，６ｋｂ）比較的共通するｐλｇ３対立遺伝子の排除の
ためである（実施例１、平均堝失／個体＝０．３３帯）
が、主として異なるミニサテライトのアレルの電気泳動
の同時の移動の結果である。

多座サザンブロノトパターンは高度に個体特異的であり
、ＤＮＡ断片のわずかに１８％（標準偏差±１１％）が
不規則に選択した北ヨーロッパ人の対（４０対を試験し
た）間で共有される。同胞（ｓ　ｉ　ｂ）について、断
片の共有レベルは、期待されるように、−５７％に上昇
する（１０の同胞対を試験した）。

父／母／子供のトリオについて、すべての子孫の断片は
親に追跡して戻ることができる（第１２図）。各子孫は
父性起源に特異的である３±０．５（標準偏差）ＤＮＡ
断片と、等しい数の母性特異的ＤＮＡ断片を含有する（
１０の父／母／子供のトリオ）。

こうして上に示すように、第１２図はプールしたミニサ
テライトプローブとのハイブリダイゼーションによる、
ヒトＤＮＡ中の多数の超可表皮の検出を示す。英国人の
不規則の選択（１〜６）、同胞の対（７，８および９．
１０）および父／母／子供の家族の群（１１、１２、１
３および１４　、１５　、１６）からの４μｇのＤＮＡ
の試料を、Ｈｉｎｆ　ｒで消化し、そして２ｋｂより小
さいすべの断片がゲルから電気泳動してしまうまで、０
．８％のアガロースゲルの電気泳動にかけた。消化物を
９７ｇ３゜λＭＳ３１．λＭＳ８．λＭＳ３１および２
ＭＳ４３の各々からの２ｎｇのインサートＤ　Ｎ　Ａと
サザンブロソトハイプリダイズさせた；インサートはプ
ールした後、ランダムオリゴヌクレオチドのブライミン
グによって３２ｐで標識した。帯の標識強度の変動は、
個々のプローブの標識付けおよび交雑の効率の変動性か
ら多分生ずる。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、ＤＮＡフィンガープリントからの特定の超
可変ＤＮＡのゲル電気泳動による精製を示し、断片は「
断片ｇ」と表示されている。 第１Ｂ図は、クローン化ＤＮＡの制限地図にょるＤＮＡ
断片の構成を示す。 第２図は、とくにコンセンサス反復配列および英国特許
公告第２．１６６、４４５号の「コア」配列とのその整
列を目立たせた、超可変断片ｇのＤＮＡ配列を示す。 第３図は、９７ｇ３によって検出される多形性ＤＮＡ断
片のメンデル遺伝を示す。 第４図は、９７ｇ３へのハイブリダイゼーションによっ
て検出されるミニサテライトの対立遺伝子の大きさの分
布を示す。 第５図は、座特異的超可変ＤＮＡプローブについての２
Ｍ３組換え体のスクリーニングを示す。 第６図は、ミニサテライトのλＭＳ系列および９１ｇ３
ミニサテライトのコンセンサス反復配列の単位を示す。 第７図は、ここでλＭＳ３２２と表示するプローブによ
って検出される、超可変座のメンデル遺伝を示す。 第８図は、ここで２ＭＳ４３と表示するプローブによっ
て検出される、超可変座における対立遺伝子の変動の推
定を示す。 第９図は、ヒトＤＮＡのプール中の超可変座における対
立遺伝子長さの変動の分析を示す。 第１０図は、Ａ６ｕＩで消化したヒト−げっし類の体細
胞の雑種ＤＮＡのパネルにおける、ここでλＭＳ３２と
表示するプローブによって検出される超可変座の分離を
示す。 第１１図は、座特異的超可変プローブの感度の評価、お
よび二重の強姦／殺人の場合における法医学における前
記プローブの応用を示す。 第１２図は、本発明のプールしたミニサテライトプロー
ブとのハイブリダイゼーションによる、ヒトＤＮＡ中の
多数の超可変座の検出を示す。 以下余白 〜 Ａ１１＋９　１　２　３ ゛− 争 ８蟲 −ａ　　Ａｉ（＋ 沖−ｍ−−・−Ｈ １８′り≦ −ＩＳ　　　　　　　　　　　　訃 すリへり ９・７ １　　　　　　　　　　遣パ ■ −、匁 が （・　　　゛ ・、″ −−コ ００ぐ）ｃＤ（Ｏａ °゛　＝Ｘへ　・− ！コ甲 ・ｊ′、　　シｙＦｂ、ｆ、ｔＩＨ分　Ｂｐ　　τン「
　ミごＣ情ＢＡ　８Ａ、ＥＡ　ＢＡ　ＥＩＡ日−ｍ−始
　　　　　　　　　　　◆槽槽　　伸壱〜　　　　　砂
Ｆ−・・ （ｙ＞　　　　　　　１４ １）　　　ロ ーー目 °パ曹 １）　　　１　　番 ：′−５？ つ パぐ　　　番　番 ｑｒ　　　　　　ｓ　、　　、　　、、、””””””
’：”’ｌ’、、’、、、’、Ｉ’ｍ番　　Ｉ　　　　
　　　　　　、 ′Ｄ　　　目 Ｃ・　　　　資 −垂　　奪 ・・・　　　　　　手　　　　　　 −　　　　　ビ。 〜・９・ 一′へ　　　　　・−一 一　　　麻　　　　　　　　　−゛ 曹　　會　　１　　　　　　　　拳書　　　１６ン　　
　　　　　　　　　　　　　−・１′？・・・う　　　
　　　　　　　　　　　　　・（Ｂ１、　　　　　　　
　　　　　　　　　２０−Ｂ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　・２３°　　″　　　　　２゜ ・・Ｉ３　　　　　番　　　　　　２２２、　　　　　
　・・〜；４　　　　　　　　　　　　　・　２９番　
　　　　　　　　　゛　・５ ｐ９：　　４２　＋　　（１’諌θ゛＾θりち詑−１・
− Ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　’；：’Ｗｒａｊ＋ｏｆ　　　Ｉ　　　２　４　　
Ｂ　　：６　　′１２　ｆｉ４　　ｊ２８　　つＦｉｇ
。１２ 、／・　昏 手続補正書（方式） 昭和６２年６月、８日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、　事件の表示 昭和６２年特許願第０６２７５４号 ２、　発明の名称 改良された遺伝子プローブ ３、　補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　インペリアル　ケミカル　インダストリーズ静光
虎ノ門ビル　電話５０４−０７２１６、補正の対象 （１）明細書 （２）図　面 ７、補正の内容 ｉｌｌ　　明細書の浄書（内容に変更なし）（２）図面
の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）浄書明細書　　　　　　１通 （２）浄書図面　　　　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ゲノムにおける少くとも３（１００）の対立遺伝子
   変化（この明細書に定義されている通り）又は少なくと
   も３の多形性の程度を有する特定の領域または遺伝子座
   について特異的なミニサテライトを含むＤＮＡ断片にハ
   イブリダイズすることのできるポリヌクレオチドの製造
   方法において、１より多くの多形性ミニサテライト領域
   または超可変遺伝子座にに関連してＤＮＡを識別するこ
   とのできるポリヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡの
   断片とのハイブリダイゼーションにより同定したＤＮＡ
   断片をクローニングし；そして上記ＤＮＡ断片から、ゲ
   ノムにおける少くとも３（１００）の対立遺伝子変化（
   この明細書に定義されている通り）又は少なくとも３の
   多形性の程度を有する特定の領域または遺伝子座につい
   て特異的なミニサテライトを含むＤＮＡ断片にハイブリ
   ダイズすることができるポリヌクレオチドを調製する；
   ことを含んで成る方法。 ２、単一ミニサテライト領域または超可変遺伝子座につ
   いて特異的であり、且つ制限エンドヌクレアーゼで試料
   のゲノムＤＮＡを断片化することにより得られる対応す
   るＤＮＡ断片にヌクレオチド配列がハイブリダイズする
   ことのできる程度に前記領域又は遺伝子座と相同である
   ヌクレオチド配列を含んで成り、上記ＤＮＡ断片が上記
   ミニサテライト領域または超可変遺伝子座からのミニサ
   テライトを含んでおり： １）上記部位または遺伝子座が少くとも３（１００）の
   対立遺伝子変異（ここに定義されている通り）又は少な
   くとも３の多形性の程度を有し；そして２）上記領域ま
   たは遺伝子座が次の配列（相補的配列を含む）： （Ａ）ＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧ　１ （式中、ＴはＴまたはＵであり、そして（Ａ）は存在し
   てもしていなくてもよい）、または次の配列（相補的配
   列を含む）： ＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧ　２ （式中、ＴはＴまたはＵである）の少くとも３つのタン
   デム反復配列から成るポリヌクレオチドプローブによっ
   て検出可能であることを特徴とする、単離された形また
   はクローン化された形のポリヌクレオチド。 ３、特許請求の範囲第１項に記載の方法によって最初に
   生成したポリヌクレオチドを製造する方法または特許請
   求の範囲第２項に記載されているポリヌクレオチドを製
   造する方法において、直接合成又はクローン化物質の微
   生物学的再生産を含んでなることを特徴とする方法。 ４、特許請求の範囲第２項に記載のポリヌクレオチドま
   たは特許請求の範囲第１項に記載の方法で製造したポリ
   ヌクレオチドを含んで成り、且つこのポリヌクレオチド
   が標識成分又はマーカー成分を有することを特徴とする
   ポリヌクレオチドプローブ。 ５、特許請求の範囲第２項に記載のポリヌクレオチドま
   たは特許請求の範囲第１項に記載の方法により製造した
   ポリヌクレオチドに標識又はマーカーを付することを含
   んで成る特許請求の範囲第４項に記載されているポリヌ
   クレオチドプローブを製造する方法。 ６、少くとも３（１００）の対立遺伝子変化（この明細
   書に定義されている通り）又は少なくとも３の多形性の
   程度を有するゲノム中の特定の領域または遺伝子連につ
   いて特異的なミニサテライトを含むＤＮＡ断片にハイブ
   リダイズすることのできるポリヌクレオチドの製造方法
   において、 特許請求の範囲第４項に記載のポリヌクレオチドプロー
   ブまたは特許請求の範囲第５項の方法により製造したポ
   リヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡの断片とのハイ
   ブリダイゼーションにより同定したＤＮＡ断片をクロー
   ニングし；そして上記ＤＮＡ断片から、少くとも３（１
   ００）の対立遺伝子変化（この明細書に定義されている
   通り）又は少なくとも３の多形性の程度を有するゲノム
   上の特定の領域または遺伝子連について特異的なミニサ
   テライトを含むＤＮＡ断片にハイブリッド化することの
   できるポリヌクレオチドを調製することを含んで成り： プローブをして１個より多くの多形性ミニサテライト領
   域または超可変遺伝子連に関連してＤＮＡを識別せしめ
   るのに効果的なハイブリッド化条件の下で行われること
   を特徴とするポリヌクレオチドの製造方法。 ７、単一ミニサテライト領域または超可変遺伝子座につ
   いて特異的であり、且つ制限エンドヌクレアーゼで試料
   ゲノムＤＮＡを断片化することにより得られる対応する
   ＤＮＡ断片にヌクレオチド配列がハイブリダイズするこ
   とのできる程度に相同であるヌクレオチド配列を含んで
   成り、上記ＤＮＡ断片が上記ミニサテライト領域または
   超可変遺伝子座からのミニサテライトを含んでおり、こ
   こで １）上記領域または遺伝子連が少くとも３（１００）の
   対立遺伝子変化（この明細書に定義されている通り）又
   は少なくとも３の多形性の程度を有し、そして ２）上記領域または遺伝子連が特許請求の範囲第２４項
   または第４項に述べられているポリヌクレオチドプロー
   ブまたは特許請求の範囲第５項の方法により製造したポ
   リヌクレオチドプローブによって検出可能であることを
   特徴とする、単離された形またはクローン化された形の
   ポリヌクレオチド。 ８、１つ以上の対照にに対してゲノムＤＮＡの試験試料
   を特徴付ける方法において、タンデム反復配列に対応す
   る配列を有意に開裂せしめない１つ以上の制限酵素で試
   料ＤＮＡを断片化し、単一ミニサテライト領域または超
   可変遺伝子連について特異的であり且つ上記単一ミニサ
   テライト領域または超可変遺伝子連からのミニサテライ
   トを含む対応するＤＮＡ断片にヌクレオチド配列がハイ
   ブリダイズすることのできる程度に相同であるヌクレオ
   チド配列を含んで成るポリヌクレオチドまたはポリヌク
   レオチドプローブでＤＮＡ断片を検査し、ハイブリダイ
   ズしたＤＮＡ断片を検出し、そしてハイブリダイズした
   断片を上記の１つの対照または２つ以上の対照と比較す
   ることを含んで成り、 １）上記ミニサテライト領域または超可変遺伝子座が少
   くとも３（１００）の対立遺伝子変化又は少なくとも３
   の多形性の程度を有し、そして ２）上記領域または遺伝子座が１個より多くの多形性ミ
   ニサテライト領域または超可変遺伝子座に関連してＤＮ
   Ａを識別することのできるポリヌクレオチドプローブに
   よって検出可能であることを特徴とする方法。 ９、試験試料提供者が１又は複数の対照試料提供者と同
   一か否かを確定するために、１又は複数の対照試料を同
   様に断片化し、そして各試料からのハイブリダイズした
   断片を比較することを特徴とする第８項に記載の方法。 １０、次の配列： ＡＧＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＧＹＧＧＴＧＴＧＧ
   ＧＣＡＧＧＧＡＧＲＧＧＣ　３ＧＴＧＧＡＹＡＧＧ　４ ＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＲＹＡＧＴＧＴＣＴＧ　５ＧＡＡ
   ＴＧＧＡＧＣＡＧＧＹＧＲＣＣＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＣ
   Ａ　６ＧＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡ
   ＧＧＴＧＴＴＧＧ　７ＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧ
   ＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣ　８ＴＧＴＧＴＧＴＡＡ
   ＴＧＧＧＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＡＡＧ
   ＧＧＧＧＴＧＴＧＧＹＸ　９ （配列中、ＹはＣ、Ｔ又はＵであり；ＸはＧ又はＣであ
   り；ＲはＡ又はＧであり；そしてＴはＴ又はＵである） から選択されるいずれか１つの配列もしくはそのタンデ
   ム反復配列、又はこれらに相補的な配列を含んで成るポ
   リヌクレオチドプローブ。 １１、特許請求の範囲第１０項に記載の式３の配列又は
   そのタンデム反復配列を含んで成るポリヌクレオチドプ
   ローブ。 １２．１又は複数の対照に対してゲノムＤＮＡの試験試
   料を特徴付ける方法であって、タンデム反復に対応する
   配列を有意な程度に開裂せしめない１又は複数の制限酵
   素により試料のＤＮＡを断片化し、特許請求の範囲第１
   ０項又は第１１項に記載のポリヌクレオチドプローブに
   よりＤＮＡ断片をプローブし、そしてハイブリダイズし
   た断片を前記１又は２以上の対照と比較することを含ん
   で成る方法。