KR20010043339A

KR20010043339A - 유전자 전사 패턴의 식별방법

Info

Publication number: KR20010043339A
Application number: KR1020007012315A
Authority: KR
Inventors: 도미닉 지. 스피넬라
Original assignee: 나가야마 오사무; 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2001-05-25
Also published as: US6461814B1; WO2000053806A1; AU2741899A; CA2331412A1; EP1105527A1; JP2003533966A

Abstract

본 발명은 신속하고, 인공물이 없고, 향상된, 짧은 DNA "태그" 또는 그것의 배열들 얻는 방법을 제공하며, 이 방법은 주어진 mRNA 집단내에 유전자 전사의 상대적 어번던스를 측정할 수 있게 하고 그리고 새로운 유전자들을 확인하는 것 뿐만아니라 유전자 전사의 패턴을 식별하는 것에 유용하다.

Description

유전자 전사 패턴의 식별방법{METHOD OF IDENTIFYING GENE TRANSCRIPTION PATTERNS}

＜110＞ Chugai Pharmaceutical Co. Ltd

＜120＞ Method of Identifying Gene Transcription Patterns

＜150＞ US263196

＜151＞ 1999-03-05

＜160＞ 8

＜170＞ KopatentIn 1.55

＜210＞ 1

＜211＞ 66

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

＜400＞ 1

gccgaattcg aaacggccga tgtcttcagt cgacctgtat ggcccttagc attagggctg 60

tgcagc 66

＜210＞ 2

＜211＞ 68

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

＜400＞ 2

cggctgcaca gccctaatgc taagggccat acaggtcgac tgaagacatc ggccgtttcg 60

aattcggc 68

＜210＞ 3

＜211＞ 62

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

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＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

＜400＞ 3

ccggagatct gcggccgctc gactgcaaga cgacagtcta acgcaaagga aaaggctaac 60

tg 62

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＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

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＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

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cagttagcct tttcctttgc gttagactgt cgtcttgcag tcgagcggcc gcagatctcc 60

ggnn 64

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＜213＞ Artificial Sequence

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＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

＜400＞ 5

aattcagata aggcgcgccg atgtcttcat ttgtgcagc 39

＜210＞ 6

＜211＞ 37

＜212＞ DNA

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＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

＜400＞ 6

cggctgcaca aatgaagaca tcggcgcgcc ttatctg 37

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＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

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ccggagttta aacagc 16

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＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

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＜223＞ Description of Artificial Sequence sythetic

＜400＞ 8

ggccgctgtt taaactccgg nn 22

발현서열 태그(EST) 프로그램은 인간 게놈에 있어서 발현 인간 유전자 (Fields, C. et. al., Nature Genetics 7:345-346 (1994))의 상당한 부분에 대해서 DNA 서열정보를 제공해준다. 그러나, DNA 서열 정보 단독으로는 유전자 기능 및 조정을 완전히 이해하는데 부족하다.

완전한 유전적 레파토리의 일부분만이 주어진 시간에서 세포 중에서 발현되기 때문에, 그리고, 유전자 발현은 세포 표현형을 초래하기 때문에, 유전자 전사를 정성적으로, 그리고 정량적으로 모니터하기 위한 도구가 필요하다.

노던 블로팅 및 뉴클리아제 보호분석과 같은 고전적인 정성 및 정량기술은 정확하고 정량적이지만, 글로발 유전자 발현 프로필을 생성하기에 충분할정도로 신속하게 정보를 제공할 수 없다.

더욱 최근의 접근법은 cDNA 라이브러리로부터 무작위 단리물의 서열분석, 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 및 혼성화-배열-기초-방법(hybridization-array-based methodologies)를 포함하지만, 이들 방법들은 각각 제한을 갖는다.

공지의 유전자에 상응하는 RNA 또는 cRNA의 고밀도 미세배열 혼성화(Ramsay, G. Nature Biotechnology 16:40-44 (1998))은 글로발 유전자 발현의 유사한 분석에 대해서 신속한 방법이다. 그러나, 이 방법은 공지 유전자에 제한되며, 단일 미세배열에서 유전자의 수효는 마찬가지로 제한된다.

EST들을 생성하기 위하여 cDNA 라이브러리로부터 무작위 단리물을 서열화하면 정량적인 결과를 제공하지만, 이것은 주저되는 일이다(Adams, M.D., et al., Science 252:1651-1656 (1991); Adams, M.D. et al., Nature 355:632-634 (1992)). cDNA 라이브러 중에서, cDNA 클론의 빈도는 RNA가 유래하는 세포 또는 조직의 RNA집단 중에서 전사하는 것의 고정상 태양에 비례해야 한다 (Okubo K. et al., Nature Genetics 2:173-179 (1992): Lee, N.H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 92:8303-8307 (1995)). 그러나, 이 접근법은 대부분의 실험의 용량을 넘어서 DNA 서열화 노력을 필요로 한다.

PCR 기초법은 mRNA 풀로부터 DNA단편을 생성할 수 있으며, 상기 풀은 크기와 발현 프로파일을 형성하기 위해 분리 및 식별을 가능하게해주는 서열이 다르다. 다른 세포 또는 조직 집단으로부터의 프로파일은 다르게 발현현 유전자를 검출한다. 이 방법을 mRNA단편으로부터 데이타 베이스를 수립하기 위하여 사용되어 왔었다 (Williams, J.G.K., Nucl. Acids Res. 18:6531 (1990): Welsh, J., et al. Nucl. Acids Res., 18:7213 (1990); Woodward, S.R., Mamm. Genome, 3:73 (1992): Nadeau, J.H., Mamm. Genome 3:55 (1992)). 2개 이상의 샘플 사이에서 mRNA 집단들을 비교하기 위하여 이들 방법을 적응시키기 위한 몇개의 접근법이 시도되었다 (Liang, P. et al., Science 257:967 (1992): 또한 Welsh, J. et al., Nucl. Acids Res. 20:4965 (1992)참조; Liang, P. et al., Nucl. Acids Res 3269 (1993), 및 1995변 5월 18일자 공개된 WO 95/13369). 예를 들면 차별 표시(Differential Display) 및 증폭 단편길이 다형성(AFLP) (Liang P. and Pardee, A.B. Science 257:967-971 (1992)), (Vos, P. et al., Nucleic Acids Res. 23:4407-4414 (1995))은 적당한 속도와 규모로 유전자 발현 정보를 제공할 수 있지만, 이들 방법은 정량적인 PCR 인공물에 대한 감수율 때문에 정밀 및 재현성의 결핍을 갖는다.

최근에, 랜덤 cDNA 서열화 접근법의 PCR의 변형이 벨쿨레스큐 등에 의해 보고되었다(Velculescu, V.E. et al., Science 270:484 (1995)). 유전자 발현의 연속적분석(SAGE)로 칭하는 이 기술은, 말단에서 말단형으로 랜덤하게 연결하고, PCR에 의해서 확대되어 "di-태그를 형성하는 cDNA로부터 짧고, 한정된 서열을 생성한다. 이어서, 이들 di-태그는 DNA 서열화에 의해 클론되고, 분석되는 배열로 연결된다. 각 서열화 주형은 많은 유전자에 상응하는 식별가능한 태그를 함유하고 있기 때문에, SAGE의 잠재적 처리율은 관습적인 cDNA 사열화을 초과해서, 많은 실험실에서 유전자 전사 프로파일링을 허용해준다.

그러나, 다른 PCR법과 같이, SAGE의 결과도 개시 주형 어번던스(abandance) 이외의 요인들에 의하여 영향을 받는다. "증폭 효율"에서 서열 특이 차이는 생성물 수득량에 있어서 인공적 차이를 증가시키는 것으로 알려졌다. 즉, PCR 생성물의 양은 개시 주형에 있어서 실체적인 차이가 없음에도 불구하고 다를 수 있다. 예를들면, 동일한 주형 제조의 증폭은 6배 정도 많게 변할 수 있는 생성물 수득량을 산출한다 (Gilliand et al. PCR Protocols. Academic Press, pp 60-69 (1990)). 그리하여, 증폭에 의해서 생성된 생성물의 양으로부터 개시 주형 어번던스를 추론하려는 PCR 기초법은 스트링전트 공-증폭 조절을 필요로 한다.

따라서, 유전자 전사를 검출 및 정량하고, 유전자를 식별하며, 미지의 유전자에 대해서 PCR 및 기타 인공물에 없는 개개의 세포 또는 조직 중에 유전자 전사 패턴 및 빈도를 제공하고, 샘플 사이에서 신속한 검출 및 비교를 허용하기에 충분할 정도로 신속한, 간단하고도 재현할 수 있는 방법이 필요하다.

본 발명은 세포 또는 조직 중에서 유전자 전사 패턴을 식별하는 방법에 관한 것이다.

종래기술에서 발견된 문제들을 회피하기 위하여, 본 발명자들은 PCR 증폭 인공물을 피하는 TALEST(Tandem Arrayed Ligation of Expressed Sequence Tags)로 칭하는 cDNA 태그 기초기술을 개발했다. 이 기술은 유전자 발현 프로파일링에 대한 랜덤 cDNA 서열화 접근법에 관련한 처리율에 있어서 25배 증가를 제공한다.

본 발명은 주어진 mRNA 집단 내에서 유전자 전사의 상대적인 풍부를 측정하게 해주는 짧은 DNA "태그" 서열을 얻는 개량된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 태그들의 배열을 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 유전자전사의 패턴을 식별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 두개 이상의 mRNA 집단 사이에서 유전자 전사의 차이를 찾아내는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 mRNA 집단에서 개별적인 유전자 전사의 빈도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 세포 또는 조직에 대해서 약제의 효과를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 표적 유기체 중에서 스트레스, 질병, 질환, 발육 또는 분화의 초기 또는 진행, 외인성 물질(화학약품, 조인자, 생체분자 또는 약품), 이상병태(열, 삼투압 등의 환경적인 이상병태 포함), 수용기 활성(수용기 중의 리간드 또는 다른 방법에 기인함), 애버란트(abberant)세포 이상상태(변이, 유별난 전사수효 등)의 존재를 찾아내는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 유전자를 단리시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 태그 또는 태그들의 배열을 얻기 위한 키트를 제공하는 것이다. 본 발명의 이해를 돕기 위해 다음의 정의가 제공되는데, 정의는 본 분야에서 일반적으로 사용되는 용어로부터는 벗어난다.

"유전자 전사 패턴"은 RNA분자를 형성하기 위해 전사 또는 나타나는 특정 조직 또는 세포 타입 내의 유전자 세트를 의미한다. 유전자는 특정 세포 라인 또는 조직 내에서 발현되며 유전자가 나타나는 조직 또는 세포의 타입, 세포, 조직 또는 표적 유기체의 분화 단계 및 세포가 정상인가 또는 암세포와 같은 변성된 것인가 등의 인자에 의존한다. 예를 들면, 유전자는 특정 표적 유기체의 분화에서 배 또는 태아 단계에서 발현되며 표적 유기체가 성숙함에 따라 비-발현된다. 또는, 다른 예로서, 유전자는 간 조직에서는 발현되지만 성인의 뇌 조직에서는 발현되지 않는다. 다른 예에서는, 유전자는 정상 폐 조직에서는 낮은 단계로 나타나지만 질병이 있는 폐 조직에서는 높은 단계로 나타난다.

"중단(punctuating) 제한 엔도뉴클레아제"는 cDNA의 각 복사체 내의 서열을 인식하는 가능성을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 의미한다. 바람직하게, 중단 엔도뉴클레아제는 6개 이하의 염기로 이루어진 서열을 인식한다. 더욱 바람직하게, 중단 엔도뉴클레아제는 4개의 염기로 이루어진 서열을 인식한다. 가장 바람직하게, 중단 엔도뉴클레아제는 Mspl, HaeIII 또는 Sau3al, 또는 그것의 이소시조머 (isoshizomer)이다.

"타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제"는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열로부터 떨어져 있는 DAN의 한 부위에서 DNA 절단을 허용하는 제한 엔도뉴클레아제를 의미한다. 바람직하게, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 4 내지 7 염기를 인식하며 인접 DNA 10-18 염기, 또한 바람직하게는 10 이상의 염기를 인식 서열로 절단한다. "떨어져 있는"은 타입 IIs 또는 타입 IIs-유사 제한 엔도뉴클레아제의 범위 내를 의미한다. 더욱 바람직하게, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 Bsgl, BseRl, Fofl BsmFl이다.

여기에 사용된 "5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제"는 상응하는 메틸라제 또는 효소 절단으로부터 모든 DNA를 보호할 수 있는 다른 보호를 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 의미한다. 바람직하게는, 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 4 내지 10 염기의 서열을 인식한다. 가장 바람직한 예로는, 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 EcoR1, BamH1, HindIII이다.

여기에 사용된 "3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제"는 인간 게놈에서 드물게 나타나는 인식 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 의미한다. 바람직하게는, 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 6개 및 그 이상의 염기, 바람직하게는 6개 보다 많은 염기로 구성되는 서열을 인식한다. 더 바람직하게는, 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 안에 CG 디뉴클레오티드를 함유하는 8개 또는 그 이상의 염기로 구성되는 서열을 인식한다. 더 바람직하게는, 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 5' 제한 효소에 의해 발생되는 절단 말단에 용이하게 연결되지 않는 절단 말단을 제공한다. 가장 바람직한 예는 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제 Notl이다.

여기서 사용되는 "3'-최대 cDNA 단편"은 올리고 dT 프라이머로부터 관심의 mRNA 집단으로부터 전사된 이중 가닥 cDNA의 단편을 의미하며, 비오틴화시키는 것이 바람직하고, 3'-최대 중단 제한 엔도뉴클레아제 부위와 cDNA의 3'-종결 사이의 전체 길이 cDNA의 부위를 구성하고 있다. 상기 3'-최대 cDNA 단편은 중단 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키는 것에 의해 생산된 다른 cDNA 단편으로부터 단편을 분리하기 쉽도록 스트렙타비딘을 포함하는 고형상 매트릭스 상에서 단리시킬 수 있다.

여기서 사용되는 "3'-최대 cDNA 단편"은 5' 어댑터에 연결되는 3'-최대 cDNA 단편으로 이루어진 cDNA 구조체를 의미한다. A 5' 어댑터는 제1 cDNA 구조체를 제공하는 cDNA 단편의 말단에 연결된다. 이 5' 어댑터는 그곳에 사용하기 위해서 계획한 엔도뉴클레아제를 위해서 적당한 인식 부위를 제공하는 것이 바람직하며, 태그로부터 분해하기 위해서 충분한 분자량을 제공하는 것이 바람직하다. 물론 이러한 요구는 효소, 분해 방법 등의 선택을 변경시키게 된다. 5' 어댑터는 제1 cDNA 구조체가 단리가 쉽게 될 수 있도록 스트렙타비딘을 함유하는 고형상 매트릭스에 포획되도록 비오틴화될 수 있다.

여기서 사용되는 "제2 cDNA 구조체"는 5' 어댑터 내에 있는 서열을 인식하지만 cDNA 단편내에 있는 DNA를 절단하게 되는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제로 제1 cDNA 구조체를 절단시키는 것에 의해 제공되는 cDNA 구조체를 의미한다.

여기서 사용되는 "제3 cDNA 구조체"는 제2 cDNA 구조체와 3' 어댑터로 이루어진 cDNA 구조체를 의미한다. 3' 어댑터는 제3 cDNA 구조체를 제공하는 제 2 cDNA 구조체의 3' 말단에 연결되어 있다. 바람직하게는 제3 cDNA 구조체는 비오틴화되고, 그의 분리가 쉽게 될 수 있도록 스트렙타비딘을 함유하는 고형성 매트릭스에 포획될 수 있다

여기서 사용되는 "제4 cDNA 구조체"라 함은 제3 cDNA 구조체를 5'와 3' 어댑터에 각각 위치하고 있는 부위라고 생각되는 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제와 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 절단시켜서 된 cDNA 구조체를 의미한다.

여기서 사용되는 "5' 어댑터"라 함은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열을 포함하는 이중 가닥 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 이루어진 어댑터를 의미한다. 상기 5' 어댑터는 중단 제한 엔도뉴클레아제로 cDNA를 절단시켜서 생긴 cDNA 단편의 5' 말단에 연결시키게 된다. 또한, 상기 5' 어댑터는 중단 제한 엔도뉴클레아제로 cDNA 단편을 절단시켜서 된 오버행 서열과 회합성의 단일 가닥의 오버행 서열을 추가로 포함한다(여기서, 여기서 사용한 "오버행"은 이중 나선의 DNA 또는 DNA/RNA 가닥이 광범위하게 이중 가닥으로 되어 있으며 하나 또는 둘 모두의 말단에 하나 또는 둘 모두의 가닥에 하나 또는 그 이상의 쌍을 이루지 않거나 또는 결합되어 있지 않는 염기를 가진다는 결과로 정의한 것이지만, 다른 가닥에는 상보성을 갖고 있지 않다. 이들은 여기서 하나의 가닥이 한쪽 선단에 오버행부분을 가지며, 다른 가닥은 이중 나선의 DNA의 다른쪽 선단에 오버행 부분을 갖게 된다.). 또한, 5' 어댑터는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 위한 제한 서열에 대해 5'에 위치하는 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 5' 어댑터에서, 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 절단 서열에 대한 뉴클레오티드 5'를 약 4 이상, 바람직하게는 10 이상, 더욱 바람직하게는 12 이상, 가장 바람직하게는 30 이상 그리고 약 90 이하, 바람직하게는 70 이하, 더욱 바람직하게는 60 이하로 위치하고 있다. cDNA 단편에 대한 연결에 의해 5' 어댑터는 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열을 재현한다. 5' 어댑터의 센스 가닥은 SEQ ID NO. 1에 나타낸 서열을 갖는 것이 바람직하며, 5' 어댑터의 안티센스 가닥은 SEQ ID NO. 2에 나타낸 서열을 갖는 것이 바람직하다.

여기서 사용되는 "3' 어댑터"는 제3 cDNA 구조체를 제공하는 제2 cDNA 구조체의 3' 말단에 연결시키기 위한 이중 가닥으로 된 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 이루어진 어댑터를 의미한다. 바람직하게, 3' 어댑터는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제의 흡수작용에 의해 생산된 제2 cDNA 구조체의 모든 가능한 말단과 회합성의 축퇴성 단일 가닥으로 된 말단으로 이루어진 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 3' 어댑터는 축퇴성 말단에 대해 3'에 위치하는 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위해 추가로 인식 서열을 포한한다. 3' 어댑터에서, 중단 제한 엔도뉴클레아제의 인식 서열은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의해서 생산된 제2 cDNA 구조체의 말단과 회합되는 축퇴성 단일 가닥으로 된 말단에 인접하는 것이 바람직하다. 또한, 3' 어댑터는 추가로 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열에 대해 3'에 위치하는 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 상기 3' 어댑터는 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열에서 3'에 위치하는 하나 또는 그 이상의 비오틴 분자를 포함하는 것이 바람직하다. 여기서, 3' 제한 엔도뉴클레아제는 SEQ ID NO. 3의 전부 또는 일부, 바람직하게는 SEQ ID NO. 3으로 이루어진 3' 어댑터의 센스 가닥과 SEQ ID NO. 4의 모두 또는 일부, 바람직하게는 SEQ ID NO. 4로 이루어진 3' 어댑터의 안티센스 가닥이 아니다.

여기서 사용된 "태그"는 다음으로 이루어진 DNA 서열을 의미한다.

(1) cDNA에 있는 3'-최대 중단 제한 엔도뉴클레아제에 가장 가까운쪽에 위치하는 cDNA 서열에 상응하는 이중 가닥으로 된 10-14 데옥시리보뉴클레오티드,

(2) 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열로부터 유래된 cDNA-유래된 서열의 양 말단의 플랭크된 이중 가닥으로 된 염기쌍, 및 선택적으로

(3) 자기-회합성 응집성 말단을 일으키는 중단 제한 엔도뉴클레아제로부터 유래된 단일 가닥으로 된 오버행 서열.

증폭시키기 전에, 하나의 태그는 하나의 mRNA 복사체를 나타내고, 두 개의 동일한 태그는 하나의 mRNA 카피로부터 만들어지지 않는다. 태그는 cDNA 서열로 이루어져 있다. 바람직하게, 태그는 DNA 리가제와 서로 연결되어진다. 태그 말단의 처리는 오버행들과 함께 둔단되거나 응집되어질 수 있다. 이러한 이유에 대해 당업자는 올바로 인식할 것이며, 오버행이 바람직하게 된다. 더 바람직하게는 태그들은 서로 연결될 경우, 중단 서열에 의해 이들이 분리되기 때문에 분리된 cDNA-유래된 서열의 인식을 허용하게 되는 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열을 재현하게 된다.

여기서 사용되는 "태그 서열"은 적어도 하나의 태그 서열로 이루어진 DNA 서열을 의미한다. 태그들의 배열은 하나 또는 그 이상의 서열을 가지는 다수의 태그를 포함한다. 상기 태그 서열은 벡터 등에서 선형 올리고뉴클레오티드에 포함시킬 수 있다.

여기서 사용되는 "cDNA 태그 라이브러리"는 (1) 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 5' 어댑터의 연결 단편, (2) 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 절단된 연결 단편, 및 (3) 태그로 이루어진 벡터에서 제조된 cDNA 라이브러리를 의미한다. cDNA 태그 라이브러리는 클로닝 벡터로 클론되며, 숙주 세포에서 증폭시킬 수 있다.

여기서 사용되는 "태그들의 배열"은 그들의 응집성 말단 또는 둔단 말단과 연결되어 이중 가닥으로 된 DNA 서열을 형성하는 태그를 의미한다. 또한, 태그의 배열은 연결된 태그를 의미하는 "연결체"로 언급되어진다. 이들 태그의 배열은 벡터에 포함시킬 수 있다. 바람직하게는 태그의 배열은 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열에 의해서 산재된 cDNA 서열로 이루어진다. 상기 연결된 태그의 배열은 대체적으로 최소한 10태그, 바람직하게는 최소한 30태그, 더욱 바람직하게는 최소한 40태그 그리고 70 태그 이하, 더욱 바람직하게는 60태그, 더욱 바람직하게는 51태그이다. 더욱 바람직하게는 태그의 배열은 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열로 시작해서 끝나게 된다. 가장 바람직하게 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열은 각 태그 사이에 위치하게 된다.

여기서 사용되는 "중단 서열"은 DNA 뉴클레오티드 서열을 중단하게 되는 태그 배열의 서열에서 발견되는 중단 제한 엔도뉴클레아제로 흡수된 두 개의 말단을 연결시켜서 형성된 서열을 의미한다.

여기서 사용되는 "클램프"는 태그가 중단 제한 엔도뉴클레아제에 흡수되는 것에 의해 발생되는 경우 cDNA-유래된 서열에 부착되어 남아 있는 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열로부터 유래된 염기쌍을 의미한다. 클램프의 염기 조성은 구아닌(G)과 시토신(C)로 구성되는 것이 바람직하며, "GC-클램프"는 G와 C로 구성되어 있는 클램프를 의미한다. GC-클램프의 기능은 중단 제한 엔도뉴클레아제로의 소화 이후에 태그의 평행하지 않은 가닥을 잡고 있는 수소결합의 수를 증대시켜서 태그의 열안정성을 향상시키기 위한 것이다.

여기에서 사용되는 "GC 풍부한"은 G 또는 C가 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상의 염기 백분율을 갖는 서열을 의미한다.

여기서 사용되는 "상응(대응)"은 최소한 핵산 분자의 일부가 제2 핵산 분자와 상보적이거나 동일한 것을 의미한다. 따라서, cDNA 분자는 mRNA 분자에 상응할 수 있는데, mRNA는 cDNA 분자를 생산하기 위해 역전사를 위한 주형으로서 사용된다. 이와 유사하게, 유전자의 게놈성 서열은 cDNA 서열에 상응할 수 있다. 여기서, 게놈성 서열의 일부는 cDNA 서열과 상보적 또는 동일하다.

여기서 사용되는 "하이브리드"는 뉴클레오티드 폴리머의 염기쌍의 상호 작용의 형성을 의미한다. 염기쌍의 존재는 두 개의 뉴클레오티드의 각각에서 뉴클레오티드의 분율(예를 들어, 뉴클레오티드에서의 인접 염기 군의 적어도 80%)이 통상적으로 허용되는 염기쌍 규칙에 따라 다른 것에 대해 상보적임을 암시한다. ㅍ뉴클레오티드의 정확한 분율은 뉴클레오티드 서열을 포함해서 인자의 수, 용액의 농도, 온도 및 pH에 따라 변할 수 있는 안정한 하이브리드를 얻기 위해서 상보적이어야만 한다.

여기서 사용되는 "스트링전트 조건"은 상보적인 올리고뉴클레오티드의 안정한 혼성화가 유지되는 조건을 의미한다. 그러나, 부적당한 짝은 아니다(Sambreok et al, Molecular Cloning (1989), see for example, 11.46 : RNA hybrids and 9.51, RNA:DNA hybrids). 바람직하게는 스트링전트 조건은 1-6 X SSC에서 25 ~ 65℃에서의 배양을 의미한다. 더욱 바람직하게는 스트링전트 조건은 4-6 X SSC에서 42 ~ 65℃에서의 배양을 의미한다.

여기서 사용되는 "프로브"는 RNA 또는 DNA의 풀과 이 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 알려진 여러 가지 방법 중 어느 것에 의해서 관심있는 핵산의 발견을 위해서 혼성화에 사용되는 올리고뉴클레오티드 또는 태그를 포함하는 벡터 또는 태그-유래된(즉, 태그의 전부 또는 일부로부터 유래됨) 서열을 의미한다.

여기서 사용되는 "벡터"는 본 발명의 DNA를 연결에 의해 적당한 숙주세포에 있는 삽입물과 작용제 모두의 복제를 허용하는 작용제의 DNA로 삽입할 수 있는 작용제를 의미한다. 일례로, 벡터 종류로는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스 (예를 들면, 박테리아파아제) 등을 들 수 있다. 클로닝 벡터는 태그 서열을 이루는 DNA 서열을 클로닝하는데 사용하여 cDNA 태그 라이브러리를 형성하게 된다. 더욱 상세하게는, 클로닝 벡터로서, pUC18과 pUC19가 사용된다. 바람직하게는, 클로닝 벡터내에 있는 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 내인성 인식 부위는 부위 지정 돌연변이체에 의해서 파괴되어진다. 서열 벡터는 DNA 서열 분석 준비시 태그 또는 태그 배열을 클론하는데 사용된다. 벡터를 서열화하는데 pUC18과 pUC19가 바람직하다.

본 발명은, 다음과 같은 단계로 이루어지는 태그를 얻는 방법을 제공하기 위한 것이다.

(a) 이중 가닥으로 된 cDNA를 제공한다.

(b) 이중 가닥으로 된 cDNA를 중단 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 cDNA 단편을 제공한다.

(c) 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제와 회합성인 단일 가닥으로 된 오버행을 둔단 하거나 바람직하게는 함하는 5 어댑터를 cDNA 단편에 연결시킨다. 이러한 연결은 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열이 재현되게 되는 제1 cDNA 구조체를 생산하게 된다. 또한, 상기 5'어댑터는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열로부터 떨어져 있는 cDNA 단편이 있는 부위에서 DNA를 절단하게 되는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열을 포함한다.

(d) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제로 제1 cDNA 구조체를 절단하여 제2 cDNA 구조체를 제공하되 바람직하게 이 구조체는 cDNA-유래된 서열의 10-14 염기쌍을 가지며, 5' 어댑터로부터 유래된 추가 서열과 마찬가지로 랜덤한 단일 가닥으로 된 오버행에 의해서 그의 3' 말단에서 그리고 중단 효소의 인식 서열에 의해서 그의 5' 말단에서 측면에 위치하게 된다.

(e) 제2 cDNA 구조체를 3' 어댑터와 연결시키되, 여기서 상기 어댑터는 오버행이고, 제1 cDNA 구조체에 존재하는 모든 가능한 오버행과 회합성의 축퇴성 단일 가닥으로 된 오버행을 포함한다. 또한, 상기 3' 어댑터는 만일 사용한다면 축퇴성 단일 가닥으로 된 말단에 인접하는 곳에 위치하는 것이 바람직한 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열을 포함한다. 따라서, 제1 cDNA 구조체에 대한 3' 어댑터의 연결은 10-14 염기의 cDNA 유래된 서열이 중단 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 서열에 의해서 양쪽 말단에서 측면에 위치하고 추가 서열이 둘 중 어느 하나의 말단에 위치하는 cDNA 구조체를 발생시킴으로써 제3 cDNA 구조체를 제공한다.

(f) 제3 cDNA 구조체를 5'와 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제를 소화시켜서 제4 cDNA 구조체를 제공한다. 여기서 제4 cDNA 구조체는 유사 소화 클로닝 벡터(여기서, "유사 소화"의 의미는 벡터나 구조체의 말단에 연결될 수 있는 말단을 제공하기 위해서 소화시킨 것을 의미한다)로 연결되어 진다. 그리고 적당한 숙주에서 배양하는 것에 의해 증폭되어 태그 라이브러리를 형성한다.

(g) 선택적으로, 벡터 DNA를 태그 라이브러리로부터 단리하고, 중단 제한 엔도뉴클레아제로 DNA를 소화시켜 상기 벡터로부터 태그를 방출하는 단계

(f) 태그(들)의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계.

바람직하게, 본 발명은

(a) 비오틴화된 올리고 dT 프라이머를 사용하여 mRNA로부터 이중가닥 cDNA 를 제공하는 단계,

(b) cDNA 단편의 개체를 제공하는 cDNA 내에서 절단되는 중단 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 이중가닥 cDNA를 절단하는 단계,

(c) cDNA 단편을

ⅰ)중단 엔도뉴클레아제를 사용한 절단에 의해 생산된 말단과 회합성의 단일가닥 말단;

ⅱ) 단일가닥 말단의 5'에 위치한 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열;

ⅲ)제1 cDNA 구조체를 제공하는, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열의 5'에 위치된 5'클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열

로 이루어진 어댑터에 연결하는 단계,

(d)(크로마토그래피, 루즈 비드, 마그네틱 배지등과 같은) 친화 포획에 의한 제1 cDNA 구조체를 격리시키는 단계,

(e)제1 cDNA 구조체를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 고체상 및/또는 제2 cDNA 구조체를 제공하는 스트렙타비딘으로부터 절단하는 단계,

(f) 제2 cDNA 단편을

ⅰ)IIs타입 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 말단과 회합성의 축퇴성 단일가닥 말단;

ⅱ) 축퇴성 말단의 3'에 위치한 중단 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열;

ⅲ)제3 cDNA 구조체를 제공하는, 중단 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열의 3'에 위치된 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열

로 이루어진 3' 어댑터에 연결하는 단계,

(g)제4 cDNA 구조체를 제공하는, 제3 cDNA 및 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 제3 cDNA 구조체를 소화하는 단계,

(h)제4 cDNA 구조체를 제3 및 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 클로닝 벡터로 삽입하는 단계,

(i)적당한 숙주 균주에서 벡터 DNA를 복제하는 단계,

(j)벡터 DNA를 분리하는 단계,

(k)cDNA 서열 및 GC 풍부 클램프로 이루어진 태그를 제공하는 중단 엔도뉴클레아제로 벡터 DNA를 소화시키는 단계,

(l)적어도 10 태그 및 GC 풍부 클램프로 이루어진 태그의 배열을 제공하도록 태그를 연결하는 단계,

(m)선택적으로 태그의 배열을 서열 벡터에 삽입하는 단계,

(n)선택적으로 태그의 배열의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계

로 이루어지는, 태그 배열을 얻는 방법을 제공한다.

이중가닥 cDNA는 올리고-dT 프라이머를 사용한 표준법에 의해 표적 mRNA 풀로부터 제조된다. 올리고-dT 프라이머는 바람직하게 비오틴화 된다. 바람직하게, 이중가닥 cDNA는 5'-콜로니 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 3' 콜로니 제한 엔도뉴클레아제의 어떤 내인성 엔도뉴클레아제 제한 부위를 보호하기 위해 메틸라제 또는 기타 보호수단으로 처리된다.

이중가닥 cDNA는 cDNA단편을 제공하는 공지의 조건하에서 중단 엔도뉴클레아제로 절단된다. 중단 제한 엔도뉴클레아제는 cDNA 단편내에서 절단된다.

준단 제한 엔도뉴클레아제와 회합성의 단일가닥 오버행을 갖는 합성, 이중가닥 어댑터 분자가 cDNA에 연결된다. 그 후, 3'-최대 cDNA 단편이, 제1 cDNA 구조체를 제공하는 프리 5' 어댑터를 제거하기 위해 광범위하게 세척되는 고체상에서 바람직하게 비오틴 및 스트렙타비딘과 같은 친화 포획에 의해 분리된다. 5' 에덥터는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레오타제, 바람직하게 Bsgl에 대한 인식 서열을 cDNA 단편의 5' 바로 옆에 도입한다. 바람직하게, 5'어댑터는 나중 클로닝을 촉진하기 위해 5' 종결에서 5'클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 함유한다.

어댑터가 연결된, 바람직하게는 고체상이 연결된 cDNA 단편의 절단은 용액상으로 어댑터 자체 및 제2 cDNA 구조체를 제공하는 중단 서열에 의해 어댑터로부터 분리된 미지의 cDNA의 추가 뉴클레오티드로 이루어진 선형 DNA 단편을 방출한다.

그 후, 제2 cDNA 구조체는, 2개의 염기 오버행과 같은 오버행이 사용되는 경우, 제3 cDNA 구조체를 제공하는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의해 방출되는 모든 가능한 cDNA 오버행 서열와 회합되도록 하는 3' 어댑터의 5' 말단에서 16배 축퇴성 오버행을 갖는 3' 어댑터 분자에 연결된다. 바람직하게, 3' 어댑터는 3'클로닝 제한 엔노뉴클레아제에 대한 인식 서열을 함유한다. 이 어댑터는 중단 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 제2 cDNA 구조체의 3' 말단에 도입하여, 상기 구조체가 5' 및 3' 어댑터에 의해 생성된 중단 서열에 의해 양쪽 말단에서 측면에 있는 cDNA-유도 "태그" 서열을 함유하도록 한다.

제3 cDNA 구조체는 당업자들에게 공지된 조건하에서 중단 엔도뉴클레아제로 소화되어 태그를 제공한다. 중단 엔도뉴틀레아제에 의한 소화는 그 말단에서 중단 엔도뉴클레오타제에 대한 인식 서열을 갖는 cDNA 서열을 포함하는 태크를 제공한다. 생성된 태그는 예를 들면, 미생물에서 증폭되기 위해 클로닝 벡터로 삽입될 수 있다. 증폭 후, 태그 서열은 공지의 방법으로 결정된다.

선택적으로, 중단 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제3 cDNA 구조체의 소화 대신, 생성된 제3 cDNA 구조체가 5' 및 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 의해 소화되어 제4 cDNA 구조체를 제공한다.

제3 cDNA 구조체는 5' 또는 3' 제한 엔도뉴클레아제에 의해 초기에 소화되거나 또는 동시에 두 제한 엔도뉴클레아제에 의해 소화된다. 이와 같은 경우, 제4 cDNA 구조체는 연결에서 함께 생성되는 어댑터의 다이머로부터 해리하기 위해 겔 전기영동법등과 같은 공지의 방법에 의해 분리된다. 이러한 조작은 5' 및 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제-테일된 DAN 단편이 중단 서열에 의해 양쪽 말단에서 면제된 cDNA 테그를 함유하게 한다. 생성된 제4 cDNA 구조체는 공지의 방법으로 분리수단 또는 해리수단에 의해 분리되어 겔로부터 용출되고 에탄올 침전에 의해 회수된다.

제4 cDNA 구조체를 (5' 및 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 소화된)클로닝 벡터로 삽입하기 전에, 벡터에서 내인성 중단 엔도뉴클레아제 제한 부위는 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 제거된다. 클로닝 벡터와 같이, pUC18 또는 pUC19가 사용되는 것이 바람직하다. 클로닝 벡터는 5' 및 3' 클로닝 제한 엔도뉴클레오타제로 소화되고 제4 cDNA 구조체는 클로닝 벡터 안으로 삽입된다.

클로닝 벡터는 본 분야에서 공지된 방법을 사용하여 복제된다. 바람직하게, cDNA 구조체로 이루어진 클로닝 벡터는 cDNA 구조체로 이루어지고, 형질전환된 세포를 성장시키며, 및 세포 배양에서 클로닝 벡터를 분리하는 벡터에 의해 제1 형질전환 E.coli에 의한 E.coli 등의, 그러나 제한되지는 않는 숙주 세포 내에서 증폭된다.

바람직하게, 배양된 숙주 세포를 원심분리에 의해 모은 후, 플라스미드 DNA가 벡터 DNA를 분리하기 위한 공지의 절차에 의해 침전으로부터 제조된다.

플라스미드 DNA는 태그를 방출하기 위해 중단 제한 엔도뉴클레아제로 소화된다. 각 테그는 cDNA로부터 유도된 10-14 염기-쌍 서열로 이루어진 DNA 단편이다. 생성된 태그는, 바람직하게 중단 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열로부터 유도된 회합성의 단일가닥 오버행에 의해 양쪽 말단의 측면에 있다. 중단 엔도뉴클레아제가 Mspl 일때, 태그는 GC 단일 가닥 3' 오버행 및 GC 단일 가닥 5' 오버행을 갖는다. GC 클램프는 주변 온도 및 수반된 바이어스(attendant bias)에서 AT가 풍부한 서열에 대한 태그의 용융을 막는다. 태그 단편은 아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 플라스미드 백본으로부터 분리되고, 겔로부터 용출되며, 제조시 에탄올 침전에 의해 회수된다.

태그는 태그 배열을 형성하기 위한 회합성의 말단을 통해 함께 연결된다. 태그의 배열은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리된다.

태그의 배열은 DNA 서열분석의 준비 중 서열 벡터로 삽입된다. 서열 벡터로서 어떠한 벡터도 유용하다. 바람직하게, pGEM(Promega Corp., Madison, WI), pBluescript(Straragene, La Jolla, CA), pUC18, 또는 pUC19등이 사용된다. 가장 바람직하게, pUC 19가 사용된다. 각 배열은 바람직하게, 서로에서 분리되고 제한된 4-염기 중단 서열에 의해 플라스미드 백본으로부터 분리된 10-14 염기 쌍 태그 서열로 구성된다.

어떠한 공지의 절차도 태그 또는 태그 배열의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 서열 분석에 사용할 수 있다.

이러한 방법은 mRNA가 주어진 세포 집단에서 검출될 수 있는 다수의 복사체를 갖는 것을 허용한다. 세포 중에서 유전자 전사 프로파일을 비교함으로써, 이 방법이 그 전사가 병리상 표현형과 관련된 개개의 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

높은 처리율 DNA 서열화를 이용하여, 본 발명의 방법은 또한, 글로벌 유전자 전사 프로파일의 산출을 허용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 글로벌 유전자 전사 프로파일을 얻고 및 관심있는 유전자를 확인하기 위해 당업자들에게 알려진 정보 시스템에서 사용하기 위해 충분한 자료를 얻는 단순하고 빠른 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 두개 이상의 세포 또는 조직 중에서 특이한 유전자 전사를 확인하는데 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법을 사용하여, 주어진 세포 형태, 조직 또는 표적 유기체 내에서 전사되는 유전자 또는 유전자들을 다른 세포 형태, 조직 또는 표적 유기체에서와는 다른 수준에서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 동일 세포 타입 또는 조직 타입에서 다양한 단계의 발육에서 다양한 유전자 전사 패턴을 확인하기 위해, 또는 질병의 또는 이상 세포에서 유전자 전사 패턴의 변화를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 더우기, 본 발명은 외부 조건의 변화 또는 약제처리로 인한 유전자 전사 패턴의 변화를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 이것을 위해, 유전자 전사의 패턴을 관심있는 다양한 mRNA 집단으로부터 얻은 이중가닥 cDNA를 사용하여 비교할 수 있다.

또한, 본 발명은 다음 단계로 이루어진 유전자 전사의 패턴을 확인하는 방법을 제공한다.

(a) 본 발명에 따른 관심의 출처원으로부터 테그를 제공하는 단계, 및

(b) 유전자 전사 패턴을 확인하는 단계.

생성된 태그의 서열은 유전자 전사의 패턴을 확인하기 위해 공지의 서열 데이타와 비교한다.

또한, 본 발명은 다음 단계로 이루어진 두개 이상의 mRNA 집단 사이의 유전자 전사의 차이를 결정하기 위한 방법을 제공한다.

(a) 본 발명에 따른 제1 mRNA 집단로부터 유전자 전사 패턴을 확인하는 단계,

(b) 본 발명에 따른 제2 mRNA 집단로부터 유전자 전사 패턴을 확인하는 단계, 및

(c)(a)와 (b)로부터 유전자 전사 패턴을 비교하는 단계.

바람직하게, 제1 mRNA 집단은 정상 세포 또는 티슈로부터 얻는다. 그 후, 제1 mRNA 집단으로부터 유전자 전사의 패턴을 확인한다. 바람직하게, 제2 mRNA 집단 및/또는 어떤 추가의 mRNA 집단은 질병 또는 장애를 갖는 표적 유기체, 다른 발생 단계에서의 세포 또는 조직, 동일 표적 유기체 또는 다른 표적 유기체의 다른 세포 또는 조직으로부터 얻고 유전자 전사의 패턴을 확인한다.

제1 및 제2 mRNA 집단으로부터 얻은 패턴을 비교하고 그 차이를 관찰하였다. 추가로, 기타 mRNA 집단으로부터의 패턴을 초기 유도된 패턴과 비교할 수 있다. 또한, 본 방법은 발육, 장애, 약제, 스트레스, 질병등에 의해 변조된 유전자를 확인하는데 유용하다.

또한, 본 발명은 mRNA 집단으로 전사된 기타 유전자와 비교한 집단특정 유전자의 전사의 상대적 빈도를 결정하는 다음의 단계로 이루어진 방법을 제공한다.

(a) 관심의 태그 배열을 제공하는 단계,

(b) 태그의 배열을 서열화하는 단계, 및

(c) 특정 또는 모든 테그의 상대적 빈도를 결정하는 단계.

태그의 배열은 mRNA 집단으로부터 cDNA 라이브러리로부터 본 발명을 기초로 제조된다.

태그의 배열은 혼성화(예를 들면, 미국 특허 제 5,202,231호 참조)에 의한 서열화와 같은 공지의 방법을 사용하여 서열화될 수 있다.

일단 태그의 서열화가 완성되면, 태그 빈도의 결정은 사용할 수 있는 어떠한 방법으로도 이루어진다. 예를 들면, 수작업 또는 적당한 알고리즘 및/또는 컴퓨터로 조사가능한 데이타베이스를 사용하여 실시될 수 있다.

본 발명은 하기와 같은 단계들을 포함하고 질환, 장애, 또는 세포 또는 조직에 약제의 효과를 포함하여 상기에서 정의된 바와 같은 스트레스를 선별하는 방법을 또한 제공한다:

(a) 본 발명에 따라서 정상 세포에서 유전자 전사의 패턴을 확인하는 단계,

(b) 본 발명에 따라서 스트레스 등의 존재하에서 유전자 전사의 패턴을 확인하는 단계,

(c) (a) 및 (b)로부터의 유전자 전사의 패턴을 비교하는 단계.

예를들면, 약제하에 배양된 세포들과 약제 없이 배양된 세포들 간에 유전자 전사의 패턴에서 차이가 그 약제가 유전자 전사 프로파일을 변경하는 가를 결정하기 위하여 비교된다. 이 방법은 (1) 혈액 테스드 등에 의함과 같이, 질환 또는 상기에서 정의된 바와 같은 다른 스트레스의 진단에 유용한 마커, 및/또는 (2) 치료를 위한 표적 효소 또는 단백질을 결정해서 약제 설계 또는 개발에 조력을 제공하는 것에 대한 정보를 산출한다.

본 발명은 또한 하기의 단계들을 포함하고 표적 유기체에서 질환 또는 상기에서 정의된 바와 같은 다른 스트레스의 존재를 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 본 발명에 따라서 정상 세포 또는 조직에서 차별적으로 발현된 (질환 또는 상기에서 정의된 바와 같은 다른 스트레스인 발현된 더 어번던스하게-증가된 발현,또는 발현된 덜 어번던스하게-감소된 발현은 어떤 방식으로 발현을 조절한다) 유전자의 태그 서열을 제공하는 단계,

(b) 제1 표적 유기체로부터 얻은 cDNA 라이브러리를 상기 태그와 혼성화시키는 단계,

(c) 제2의 정상 또는 질환을 앓고 있는 (또는 상기에 정의된 바와 같은 다른 스트레스에 의해 영향받은) 표적 유기체를 상기 태그 서열과 혼성화시키는 단계, 및

(d) 상기 제1 표적 유기체에서의 유전자 전사 수준과 제2 표적에서 유전자의 전사 수준을 비교하는 단계.

모든 공지의 방법들이 제1 표적 유기체에서의 유전자 전사 수준과 제2 표적에서 유전자의 전사 수준을 비교하기 위하여 제1 표적 유기체에서 질환 또는 상기에서 정의된 바와 같은 다른 스트레스의 존재를 검출하도록 채용될 수 있다.

본 발명은 또한 하기의 단계들을 포함하는 유전자를 분리하는 방법을 제공한다:

(a) 본 발명에 따른 태그 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계,

(b) 관심의 cDNA 라이브러리를 프로브하는 단계, 및

(c) 유전자를 분리하는 단계.

관심의 모든 태그는 관심의 태그 서열을 포함하는 프로브를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이 프로브는 신규한 유전자를 찾고, 세포에서 유전자를 검출하거나, 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 태그 서열을 포함하는 프로브는 합성 올리고뉴클레오티드 또는 태그 서열을 포함하는 벡터를 이용하여 제조된다. 프로브는 바람직하게는 검출을 위해 방사성 동위원소, 형광 등과 같은 것에 의해, 또는 분리를 위해 비오틴, 스트렙트아비딘 등에 의해 표지화된다.

태그의 뉴클레오티드 서열은 분리할 유전자를 결정하기 위해 공지의 뉴클레오티드 서열들과 비교된다. 공지의 뉴클레오티드 서열들은 GenBank와 같은 서열 데이타베이스를 사용하여 모든 출처원으로부터 얻을 수 있다. 본 발명은 또한 하기와 같이 구성되고 태그 또는 태그들의 배열을 얻기 위한 키트를 제공한다:

(a) 5' 어댑터,

(b) 3' 어댑터,

(c) 클로닝 및/또는 서열화 벡터를 포함하여 적절한 벡터, 및

(d) 여기서 개시한 바와 같은, 적절한 제한 엔도뉴클레아제.

키트는 반응 완충액 및/또는 cDNA 라이브러리 및 다른 구성성분들을 더 포함할 수 있다.

이런 연유로, 본 발명은 관심의 유전자 전사 프로파일을 정량적으로 분석하고 그리고 관심의 숙주에 대한 다른 출처원간의 프로파일을 비교하는 신속하고 정확한 수단을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 의해 발생된 10~14bp 태그 서열이 기능이 아직 알려져 있지 않은 관심의 태그된 유전자들의 분리를 촉진하기 위한 혼선화 프로브들로서 역활을 할 수 있기 때문에, 신규한 유전자 발견에 조력할 수 있다.

본 발명의 이해를 돕고자, 일련의 실험들의 결과를 기재하는 하기의 실시예들이 포함되어 있다. 물론, 본 발명에 관한 이 실험들은 본 발명을 구체적으로 제한하는 것은 아니며 또는 알려진 또는 추후에 개발될 당업자의 시야 속에 속하는 본 발명의 변형은 여기에 기재된 바와 같이 그리고 뒤에 청구된 바와 같은 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

여기에서 사용된 상표명들은 단지 예이며, 본 발명시에 사용된 예시적인 재료들을 반영하는 것이다. 당업자는 제조과정 등에서 변형이 기대될 수 있음을 인식할 것이다. 이런 연유로, 실시예들, 및 그것들에 사용된 상표명들은 비-제한적이고, 그리고 제한할 의도가 아니라, 단순히 당업자가 본 발명의 하나 이상의 구체예들을 수행하기 위해 선택할 수 있는 예시일 뿐이다.

실시예 1. cDNA 태그 라이브러리의 제조 (1)

(a) cDNA 합성

정상 성인 인간의 폐 유래의 폴리A+ RNA 10㎍ (Clontech, Inc., Palo Alto, CA)을 5' 비오틴화된 올리고 dT(25)로 프라이밍시켰고 cDNA로 복사하였다 (Superscript IIcDNA synthesis kit from GIBCO Life Technologies, Gaithersburg, MD). 그 cDNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시켰다. 그 펠렛을 Mspl (NEB) 200 유니트를 함유하는 완충액 (뉴 잉글랜드 바이오랩(NEB), Tozer MA로부터의 1×NEB 완충액 #2) 50㎕에 용해하고 37℃에서 1 시간동안 소화하고 효소를 불활성화 하기 위해 65℃에서 20분간 유지하였다.

반응 혼합물을 미리 세척되고 모든 세척 완충액이 제거된 스트렙타비딘 자기 비드 (Dynal, Inc., Lake Success, NY) 600㎕가 첨가된 자기 비드 결합 완충액에서 800㎕가 되게 하였다. 이 용액의 총 용량은 800㎕였다. 이 용액을 완만히 회전시키면서 실온에서 밤새 인큐베이트하였다. 비드는 자기 포획 장치를 사용하여 10mM 트리스-HCl, pH 7.6으로 5번 세척하고 마지막으로 0.5×T4 리가제 완충액 (GIBCO)에서 세척하였다.

(b) 어댑터 연결 및 라이브러리 제조

올리고뉴클레오티드 어댑터 (5' 어댑터)를 합성 올리고들을 혼합하여 95℃로 열을 가하고 그리고 실온으로 서서히 냉각하여 제조하였다. 이 올리고뉴클레오티드 어댑터의 센스 가닥은 서열 ID NO.5의 서열을 갖고 이 올리고뉴클레오티드 어댑터의 안티센스 가닥은 서열 ID NO.6의 서열을 갖는다. 5' 어댑터 DNA 7.6㎍을 T4 리가제 (GIBCO) 50 유니트를 함유하는 0.5×T4 리가제 완충액 100㎕의 용량중의 자기 비드 혼합물에 첨가하고 실온에서 2시간동안 인큐베이트하였다. 그리고 나서 비드를 10mM 트리스-HCl, pH 7.6의 10ml에서 5번 세척하였다. 그리고 나서 비드를 80μM SAM (5-아데노실메티오닌)을 함유하는 NEB 완충액 4의 360㎕에 재현탁시켰다.

비드를 각각 90㎕의 4 분취량으로 나누고 40 유니트 Bsgl (NEB)를 각각의 분취량에 첨가하였다. 그리고 나서 이 비드를 37℃에서 1.5시간동안 인큐베이트하였다. 태그-함유 상징액을 모았다. 이 용액을 페놀/클로로포름으로 추출하고 홍합(mussel) 글리코겐 담체 20㎍으로 에탄올 침전시켰다.

두번째, 16-배 축퇴성 어댑터 (3' 어댑터) 분자를 어닐링 합성 올리고들로 제조하였다. 이 16-배 축퇴성 어댑터의 센스 가닥은 서열 ID NO. 7의 서열을 갖고, 이 16-배 축퇴 어댑터의 안티센스 가닥은 서열 ID NO. 8의 서열을 갖는다.

3' 어댑터 7.9㎍을 T4 리가제 10 유니트를 함유하는 리가제 완충액 30㎕의 총 용량중의 태그 DNA 펠렛에 첨가하고 실온에서 2시간동안 인큐베이트하였다. 리가제 혼합물을 65℃에서 20분간 인큐베이트시켜 열 불활성화시켰다.

반응 혼합물을 어댑터의 다중체로부터 cDNA 태그들을 함유하는 68bp 단편들을 분리하기 위하여 15% TAE (1×TAE; 20mM 트리스-아세테이트, 1mM EDTA) 아크릴아미드 겔상에 로딩하였다. cDNA 태그 단편들을 에티디움 브로마이드(EtBr)-염색된 겔로부터 적출하고, TE (10mM 트리스, 1mM EDTA) 500㎕에서 밤새 용출하고, 그리고 홍합 글리코겐 담체 20㎍으로 에탄올 침전시켰다. 태그 DNA를 분광광도계로 정량하고 내인성 Mspl 부위들이 3:1의 삽입체:벡터의 비로 부위-지정 돌연변이에 의해 파괴된 pUC19 벡터 (Bayou Biolabs, Harahan, LA)의 탈인된 EcoRI 및 NotI 부위들로 16℃에서 밤새 연결하였다. 연결 혼합물을 100㎍/ml 암피시린을 함유하는 LB 배지 5L에서 배양된 수용체 세포 (XL-10 Goldfrom Stratagene, La Jolla, CA)로 형질전환하였다.

(c) 태그 분리 및 연쇄체 형성

형질전환된 세균을 윈심분리에 의해 회수하고 플라스미드 DNA를 분리하였다 (Mega Plasmid Prep Kit from Qiagen, Inc., Valencia, CA). 플라스미드 DNA 1㎎을 총 용량 1ml에 20℃에서 5000 유니트의 Mspl로 1시간 동안 소화시켰다. 이 반응물을 15% TAE 아크릴아미드 겔의 12레인으로 로딩시켰다. 태그 단편들을 EtBr-염색된 겔로부터 적출하고, 약 TE 1ml에서 밤새 용출하고, 그리고 홍합 글리코겐 담체 20㎍으로 에탄올 침전시켰다.

정제된 태그들을 T4 리가제 10 유니트를 함유하는 20㎕ 리가제 완충액에 재현탁하고 1.5시간동안 실온에서 인큐베이트 하였다. 그리고 나서 클레노우 단편 5 유니트와 dNTP 2mM로 20분 더 인큐베이트 하였다. 그리고 나서 이 반응물을 EtBr을 함유하는 1% TAE 아가로스 겔에 로딩시켜 전기영동하였다. 600~1200bp 길이의 핵산을 겔로부터 분리하고, 에탄올 침전시키고 그리고 50ng Smal-절단, 알카리 포스파타제-처리된 pUC19, 및 T4 리가제 5 유니트를 함유하는 연결 완충액 10㎕에 재현탁하고 16℃에서 밤새 인큐베이트하였다. 연결 혼합물 1㎕를 수용체 세포 (XL-10 Gold^Rfrom Stratagene) 100㎕로 형질전환시켰다. 이 반응혼합물을 IPTG-Xgal을 갖는 LB-Amp 플레이트상에 도말하고 개별의 흰 콜로니들을 DNA 서열 분석을 위해 취하였다.

(d) DNA 염기서열 분석

~600bp 이상의 배열은 아가로스 겔 전기영동법에 의해 정제되었고 pUC19로 클론되었다. 약 700 독립 클론들에서 서열화-등급 플라스미드 주형들은 96-웰 플레이트에서 제조되었다 (Qiagen BioRobot 9600). 주형들은 M13 역 프라이머로 사이클 서열화 (PE-ABI BigDyeterminator chemistry from PE Applied Biosystems,Forster City, CA)하였다. 반응들은 자동화된 서열기(ABI 377 자동화된 서열기)상에서 행하여졌다. 추출된 자료는 SyBase 데이터 베이스에 저장되어 자동화된 DNA 서열 분석(BioLIMS Sequencing Analysis, ver. 3.1.3. system from PE-ABD)을 받았다.

태그들의 빈도 분포가 생성되었고 소 전사 프로파일을 생성하기 위하여 데이터 베이스에서 검색하였다. 그 프로파일은 2560 독립유전자들을 나타내는 14,496의 명확한 태그 서열들을 포함했다. 각 배열에서 확인가능한 태그들 수의 범위는 2 에서 63사이며 배열당 평균 32 태그이었다.

이 프로파일에서 확인가능한 유전자들에 상응하는 많은 태그들의 대부분은 폐(Itoh, K.et al., DNA Res. 1:279(1994))나 대부분의 인간 조직들(Adams, M.D. et al., Nature 377:(Suppl.)3(1995))에서 많이 발현되는 것으로 이전부터 기술되어 왔다.

실시예 2. cDNA 태그 라이브러리의 제조 (2)

(a) cDNA 합성

정상 성인의 폐(Clontech,Inc.)로부터 polyA+RNA의 10㎍이 5′비오틴화된 올리고 dT(25)로 프라이밍하고 cDNA로 복사하였다 (Superscript IIcDNA 합성 키트 from GIBCO). cDNA는 에탄올로 침전하였다. 펠렛은 80μM의 S-아데노실메티오닌(SAM) (NEB)과 320 유니트 EcoR1 메틸라아제 (NEB)를 포함하는 80㎕ EcoRI 메틸화 완충용액에서 용해되었고 37℃에서 1 시간 인큐베이트한 다음 효소를 비활성화 하기 위하여 65℃에서 15분 동안 인큐베이트하였다. 반응 혼합물은 물로 800 ㎕로 채워서 스핀 여과를 통하여 60㎕가 남을 때까지 회전되었다(Microcon 50, Amicon Inc., Beverly,MA).

Mspl 소화는 10mM MgCl₂와 400 유니트 Mspl(NEB)를 포함하는 80㎕ 완충용액(1X NEB 완충용액 #2)에서 수행되었고 37℃에서 2시간 소화한 다음 효소를 비활성화 하기 위하여 65℃에서 20분 동안 인큐베이트하였다. 반응 혼합물은 물로 880㎕로 채워서 스핀 여과를 통하여 약60㎕가 될때까지 회전되었다(Microcon 30, Amicon ).

(b) 어댑터 연결과 라이브러리 생성

올리고뉴클레오티드 어댑터(5＇어댑터)들은 합성 올리고들을 혼합하고, 95℃로 가열하며 그것들을 실온으로 서서히 냉각시키므로서 만들어졌다. 올리고뉴클레오티드 어댑터의 센스 가닥은 SEQ ID NO.1의 서열을 갖으며 올리고뉴클레오티드 어댑터의 안티센스가닥은 SEQ ID NO.2의 서열을 갖는다.

54㎍의 5＇어댑터 DNA가 37.5 유니트의 T4 DNA 리가제(GIBCO)를 포함하는 150㎕ 용량의 1×T4 DNA 리가제 완충용액 속에서 Mspl 소화된-cDNA에 첨가하였고 실온에서 2시간동안 인큐베이트하였다. 10mM 트리스, 1mM EDTA, 1M NaCl의 150 ㎕가 반응에 첨가된 다음에 효소를 비활성화 하기 위하여 65℃에서 20분 수행하였다. 300㎕ 반응 혼합물은 미리 세척되어 모든 세척용액이 제거되었던 900㎕ streptavidin 자기 비드들(Dynal, Inc.)에 첨가되었다. 이 용액은 느린 회전으로 실온에서 하룻밤 배양하였다. 비드들을 자기 포획장치를 이용하여 10mM 트리스-HCl pH 7.6의 10ml 속에서 5번 세척하였다. 비드들을 250mM 염화나트륨으로 2ml 5mM 트리스-pH 7.6에서 재현탁하였고, 효소를 더욱 비활성화 하기 위하여 65℃에서 20분 동안 인큐베이트하였다. 비드들을 그 다음에 10mM 트리스-HCl, pH 7.6의 각 10ml 속에서 5번 세척하였다. 비드들을 그 다음에 80 μM의 SAM을 포함하는 1X NEB 완충용액 4의 1㎖로 한 번 세척하였다.

그 비드들을 80μM의 SAM과 100 유니트의 Bsgl(NEB)을 포함하는 200㎕ 1X NEB 완충용액에서 부유되었다. 비드들을 느린 회전으로 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 상징액을 포함하는 태그는 건져내고 비드들을 200㎕ 10mM 트리스-pH 7.6로 두 번 세척하였다. 모아진 세척제들과 상징액들에 30㎕의 5M 염화나트륨을 첨가하였다. 모아진 상징액과 세척제들을 그 다음에 효소를 비활성화 하기 위하여 65℃에서 20분 동안 인큐베이트하였다. 이 용액은 부피가 약 30㎕일때까지 Microcon 10 (Amicon) 회전 여과기로 회전하였다.

다른 16-배 축퇴성 어댑터 분자(3＇어댑터)는 합성 올리고들을 어닐링하여 제조하였다. 16-배 축퇴성 어댑터의 센스가닥은 SEQ ID NO.3의 서열을 갖으며 16-배 축퇴성 어댑터의 안티센스 가닥은 SEQ ID NO. 4의 서열을 갖는다. 3＇어댑터는 올리고 합성 중에 올리고의 3＇말단 위에 편입된 하나 혹은 그 이상의 비오틴화된 포스포아미디트들을 갖는다.

10.8㎍ 3＇어댑터가 10 유니트 T4 DNA 리가제를 포함하는 T4 DNA 리가제완충액의 총부피 45㎕ 속에 태그 DNA에 첨가하고 실온에서 2 시간동안 인큐베이트하였다. 리가제 혼합물은 65℃ 에서 20 분동안 배양하므로써 열 비활성화되었다.

태그 DNA를 1X 소혈청 알부민(BSA)과 625 유니트의 Notl(Gibco)를 포함하는 1X 반응 3 완충액(Gibco)의 총부피 250㎕속에서 Notl로 소화하고 37℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다.

Notl 소화 반응은 1250 유니트인 EcoR1로 만들어진 1X 반응 3 완충액속에서 EcoRl로 소화하고 37℃ 에서 2시간 동안 인큐베이트한 다음 5㎕ 0.5M EDTA와 90㎕ 5M 염화나트륨을 첨가하였다. 반응은 65℃ 에서 20 분동안 인큐베이트함으로서 열 비활성화되었다.

500㎕ 반응 혼합물은 미리 세척되어 모든 세척용액이 제거되었던 300 ㎕ streptavidin 자기 비드들(Dynal, Inc.)에 첨가되었다. 이 용액은 느린 회전으로 실온에서 하룻밤 배양되었다.

결합으로부터 생겨난 상징액이 수집되어 보유부피가 약 30㎕ 일 때까지 회전 여과기(Microcon 10 Amicon)상에서 회전되었다.

농축된 반응 혼합물은 어댑터의 다중체로부터 cDNA 태그들을 포함하는 93 bp 단편들을 분해하기 위하여 10％ TAE 아크릴아미드겔에 로딩하였다. cDNA 태그단편들은 EtBr-염색된 겔로부터 절개되고 300㎕ TE와 15 GLYCOBLUE(AMbion Inc., Austin,TX) 담체로 침전된 에탄올속에서 용출되었다. 태그 DNA는 분광광도계로 정량화되어 탈인된 EcoRI와 내인성 Mspl 부위들이 1:4의 삽입대 벡터 비로 부위 지정 돌연변이에 의해 파괴되어진 벡터 pUC19의 Notl 부위로 16℃에서 하룻밤 연결하였다. 연결 혼합물은 100㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 2L의 LB 배지 속에서 성장된 수용성 균주로 형질전환하였다 (XL-10 Gold from Stratagene, La Jolla,CA).

(c) 태그 분리와 연쇄체 형성

형질전환된 세균은 원심분리에 의해 회수되어 플라스미드 DNA가 분리되었다 (Mega Plasmid Prep Kit from Qiagen, Inc.). 1㎎ 플라스미드 DNA가 20℃ 에서 1시간동안 전체부피 1㎖ 속에서 5000 유니트의 Mspl로 소화되었다. 이 반응물을 15％ TAE 아크릴아미드겔의 12 레인들에 로딩하였다. 태그 단편들을 EtBr-염색된 겔로부터 적출하고 15㎍ GLYCOBLUE (Ambion) 담체로 침전된 에탄올과 어림잡아 1㎖ TE 속에서 하룻밤 용출하였다.

정제된 태그들을 10 유니트 T4 DNA 리가제를 포함하는 20㎕ 리가제 완충액 속에서 재현탁하여 실온에서 1 시간반 동안 인큐베이트하였다. 이 다음에는 5 유니트 클레노우 단편들과 2mM dNTPs와 함께 추가하여 20분 배양하였다. 반응물을 그 다음에 EtBr을 포함하는 1％ TAE 아가로즈 겔 상에 로딩하고 전기영동하였다.

600 내지 1200bp 길이의 핵산들은 겔로부터 분리하고 에탄올 침전하고, 50ng Smal-cut,알칼린 포스포타아제 처리된 pUC19와 5 유니트의 T4 DNA 리가제를 포함하는 10㎕ 연결 완충액속에 재현탁하고 16℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 1㎕ 의 연결혼합물을 100㎕의 수용성 균주로 형질전환하였다 (XL-10 Gold from Stratagene). 반응 혼합물을 이소프로필-1-티오-B-D-갈락토피라노시드 (IPTG, Stratagene)와 5-브로모-4-클로로-인도실-B-D-갈락토피라노시드 (Xgal,Stratagene)을 함유하는 LB-Amp 플레이트 상에 도말하였다. 각각의 흰색 콜로니들을 DNA서열분석을 하기위하여 취하였다.

(d) DNA 염기 서열 분석

~600bp 이상의 배열을 아가로스 겔 전기영동법에 의해 정제하였고 pUC19로 클론하였다. 서열화-등급 플라스미드 주형들을 96-well 플레이트에서 제조하였다 (Qiagen BioRobot 9600). 주형들은 M13 역 프라이머로 사이틀 서열화 (PE-ABI BigDyeterminator chemistry from PE Applied Biosystems,Forster City, CA) 하였다. 반응들은 자동화된 서열기(ABI 377 자동화된 서열기)상에서 행하여졌다. 추출된 데이타는 SyBase 데이터 베이스에 저장되어 자동화된 DNA 서열 분석(BioLIMS Sequencing Analysis, ver. 3.1.3. system from PE-ABD)을 하였다.

실시예 3. cDNA 태그 라이브러리와 표준 cDNA 라이브러리의 비교

유전자들에 상응하는 것으로 태그를 특성화하기 위하여, 우리는 람다-gt10에 약 1,000,000 1차 플라크들의 표준 올리고 dT-프라이밍된 cDNA 라이브러리를 제작했다 (Huynh, T.V. et al., DNA Cloning: A Practical Approc\ach, D. Glover, Ed.(IRL Press, Oxford) (1984)).

일련의 복제 니트로셀룰로스 필터 리프트들이 ~18,000 플라크들을 포함하는 큰 플레이트로부터 제조되었다. 이 여과들은 확인된 태그 서열에 상응하는 말단-표지화된 올리고뉴클레오티드로 프로빙하였다. 프로브 혼성화의 빈도들은 프로파일에서 대응 태그 빈도들과 잘 부합한다. 태그에 혼성화하는 클론들을 분리하여 DNA 서열분석을 하였다.

이 분석은 태그된 유전자와 그 유전자의 상대적으로 발현된 어번던스가 cDNA 라이브러리와 비교하여 그 동일성을 확증했다.

실시예 4. 정량상의 PCR 증폭에 기초한 방법 오류의 검출

합성 앰플리콘에 상응하는 상보적인 두 쌍의 올리고뉴클레오티드를 합성하고 어닐링시켰다. 각각의 앰플리콘은 Velculescu et al. Science, 270:484(1995)에 기재된 바대로, 고정 효소 서열들 (CATG) 및 PCR 프라이밍 부위들에 의해 플랭크된 18-염기 길이의 단일 di-Tag를 함유한다. 각각의 앰플리콘에서 태그들중 하나는 동일한 9-염기 임의의 서열(CTGTTAGTA)이다. 이 보통의 태그 서열은 인공 di-태그들을 형성하기 위해 AT-풍부한 비-회문성 구조 "태그" 서열 (앰플리콘 1에 대해 TATAATAAA) 또는 GC-풍부한 회문성 구조 서열 (앰플리콘 2에 대한 CCCGATCGG)과 쌍을 이루었다. 전체 이중-가닥 합성 앰플리콘은 클로닝을 촉진하기 위하여 BamH1 및 HindIII 소화된 벡터와 회합성인 단일-가닥 말단들로 종료한다.

이들 인공 앰플리콘들을 플라스미드 벡터로 연결하고, 정확히 플라스미드 DNA의 동등량을 각각으로부터 제조하였다. 이 플라스미드 DNA를 희석하고 6-FAM (6-카르복시플포레센) 말단-표지된 프라이머 및 Velculescu et al. Science, 270:484(1995)에 기재된 증폭 조건을 이용하여 15 또는 20 사이클 증폭하였다.

대응하는 PCR 생산물로부터 유래된 밴드들의 강도는 동일하지 않았다. 15 사이클의 증폭 후에, 앰플리콘 2로부터 유래된 PCR 생성물은 보이지 않은 반면에 앰플리콘 1로부터 유래된 밴드는 분명히 눈에 띠었다. 사이클의 수가 20으로 증가되었을 때, 양자의 PCR 생성물들은 모두 눈에 보였으나, 피크 영역 분석 (PE Biosystems Prism 377 Genescan^TMsoftware from PE , Santa Fe, N.M.)은, 개시 주형 농도 또는 PCR 프라이머에서 차이가 없는 데도 불구하고, 앰플리콘 1로부터 유래된 생성물의 양이 앰플리콘 2의그것 보다 5배 많다는 것을 드러내었다. 이것은 증폭 후에 생성된 PCR 생성물의 양은 그것 안의 모든 태그의 서열에 의해 극적으로 영향을 받을 수 있음을 분명히 암시한다.

여기에 인용된 모든 참고 문헌들은, 구체적으로 그것들이 참고문헌으로 병합되는 여부에 대한 언급에 상관없이, 그것들이 담고있는 사항들에 대해 기재된 전체로서 이 명세서에 의하여 참고문헌으로 병합된다.

Claims

하기의 단계를 포함하는 태그를 얻는 방법:

(a) 이중-가닥 cDNA를 제공하는 단계,

(b) 상기 이중-가닥 cDNA를 중단(punctuating) 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 cDNA 단편을 제공하는 단계,

(c) 상기 cDNA 단편에, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레제에 대한 인식 서열로부터 떨어져 있는 cDNA 단편의 하나의 부위에서 DNA 절단을 허용하는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 포함하는 5' 어댑터를 연결하여 제1 cDNA 구조체를 제공하는 단계,

(d) 상기 제1 cDNA 구조체를 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 제2 cDNA 구조체를 제공하는 단계,

(e) 상기 제2 cDNA 구조체에 3' 어댑터를 연결하여, 상기 제2 cDNA 구조체의 3'에 인접하여 위치된 중단 엔도뉴클레아제에 대한 제한서열을 생성함에 의해 제3 cDNA 구조체를 제공하는 단계,

(f) 상기 제3 cDNA 구조체를 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 cDNA 서열들을 포함하는 태그를 제공하는 단계, 및

(g) 상기 태그의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제는 MspI이고 그리고 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 BsgI인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 태그들을 연결하여 태그들의 배열을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 태그들의 배열을 벡터로 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기와 같은 단계를 포함하는 태그의 배열을 얻는 방법:

(a) 비오틴화된 올리고 dT 프라이머를 사용하여 mRNA로부터 이중가닥 cDNA를 제공하는 단계,

(b) 상기 이중 가닥 cDNA 안을 중단 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 cDNA 단편의 집단을 제공하는 단계,

(c) 상기 cDNA 단편을 하기와 같이 구성되는 5' 어댑터에 연결하여 제2 cDNA 구조체를 제공하는 단계:

i) 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제로 절단함에 의해 생성된 말단들과 회합성의 단일 가닥 말단;

ii) 상기 단일 가닥 말단의 5'에 위치된 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열; 및

iii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열의 5'에 위치된 5'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식서열,

(d) 상기 제1 cDNA 구조체를 고체상 스트렙타비딘 상에서 친화성 포획에 의해 분리하는 단계,

(e) 상기 제1 cDNA 구조체를 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 제2 cDNA 구조체를 제공하는 단계,

(f) 상기 제2 cDNA 구조체를 하기와 같이 구성되는 3' 어댑터에 연결하여 제3 cDNA 구조체를 제공하는 단계:

i) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 말단들과 회합성의 축퇴성 단일 가닥 말단;

ii) 상기 축퇴성 말단의 3'에 위치된 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열; 및

iii) 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식서열의 3'에 위치된 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,

(g) 상기 제3 cDNA 구조체를 5' 및 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 제4 cDNA 구조체를 제공하는 단계,

(h) 제4 cDNA 구조체를 상기 5' 및 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 클로닝 벡터로 삽입하는 단계,

(i) 상기 벡터 DNA를 적절한 숙주 균주에서 복제하는 단계,

(j) 상기 벡터 DNA를 분리하는 단계,

(k) 상기 벡터 DNA를 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여 cDNA 서열을 포함하는 태그 및 GC 클램프를 제공하는 단계, 및

(l) 상기 태그들을 적어도 10태그 및 GC 풍부 클램프들을 포함하는 태그들의 배열을 제공하도록 연결하는 단계.
제 5항에 있어서, 상기 중단 제한 엔도뉴클레아제는 Mspl이고 그리고 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 Bsgl인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 5' 클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 EcoR1이고 상기 3'-클로닝 제한 엔도뉴클레아제는 Notl인 것을 특징으로 하는 방법.
유전자 전사 패턴을 식별하는 방법으로, 상기 방법은 관심의 출처원으로부터 유래된 제1항에 따른 하나 이상의 태그를 제공하고 그리고 유전자 전사의 패턴을 확인하는 것으로 이루어지는 방법.
2 이상의 mRNA 집단들 사이에 유전자 전사에서 차이점을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 하나 이상의 샘플에서 제8항에 따른 유전자 전사 패턴을 식별하고 그리고 제1 mRNA 집단으로부터 유전자 집단의 패턴들을 또 다른 샘플로부터의 유전자 전사의 패턴과 비교하는 것으로 이루어지는 방법.
하기의 단계들을 포함하는 mRNA 집단에서 유전자 전사의 상대적 빈도를 결정하는 방법:

(a) 제5항에 따른 태그들의 배열을 제공하는 단계,

(b) 태그들의 배열을 서열화하는 단계, 및

(c) 태그의 상대적 빈도를 측정하는 단계.
하기의 단계들을 포함하는 세포상의 스트레스를 선별하는 방법:

(a) 스트레스, 또는 관심의 생리학적 스트레스 없이 유전자 전사의 패턴을 확인하는 단계,

(b) 관심의 스트레스 존재하에 유전자 전사의 패턴을 확인하는 단계, 및

(c) 제8항에 따라서 (a) 및 (b)로부터의 유전자 전사의 패턴을 비교하는 단계.
하기의 단계들을 포함하는 표적 유기체에서 스트레스 존재를 검출하는 방법:

(a) 정상 세포 또는 조직에서 차별적으로 발현된 유전자의 태그 서열을 제공하는 단계,

(b) 제1 세포 또는 조직으로부터 얻은 cDNA 라이브러리를 상기 태그와 혼성화시키는 단계,

(c) 제2 세포 또는 조직으로부터 얻은 cDNA 라이브러리를 상기 태그 서열과 혼성화시키는 단계, 및

(d) 상기 제1 및 제2 세포 또는 조직에서 상기 유전자의 전사 수준을 비교하는 단계.
유전자를 분리하는 방법으로, 상기 방법은 제1항에 따른 태그를 포함하는 프로브로 cDNA 라이브러리를 프로빙하고 그리고 유전자를 분리하는 것으로 이루어지는 방법.
태그 또는 태그들의 배열을 얻기 위한 키트로,

(a) 5' 어댑터,

(b) 3' 어댑터,

(c) 벡터, 및

(d) 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제.