KR100393131B1 - 단백질 나노 결정화 방법, 및 결정화 챔버 및 그를포함하는 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 nl 정도의 극미량 시료를 이용한 단백질 결정화 방법, 그를 위한 나노 결정화 챔버와, 상기 챔버를 포함하는 칩에 관한 것이다.

Description

단백질 나노 결정화 방법, 및 결정화 챔버 및 그를 포함하는 칩{METHOD FOR CRYSTALIZING PROTEINS IN NANO SCALE, AND CHAMBER FOR CRYSTALIZING PROTEINS AND CHIP COMPRISING THE SAME}

본 발명은 단백질의 나노 결정화 방법, 그를 위한 나노 결정화 챔버와, 상기 챔버를 포함하는 칩에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 결정화칩을 이용한 단백질 나노 결정화 방법, 제1 로딩 모세관 (41), 제2 로딩 모세관 (42), 결정화 챔버 (43), 확산 채널 (44), 완충 챔버 (45) 및 결정화 용액 저장기 (46)을 포함하는 단백질 나노 결정화를 위한 결정화 챔버, 및 기판에 미세회로 설계기법을 사용하여 제작한 상기 챔버를 포함하는 나노 결정화 칩에 관한 것이다.

생물 고분자 물질의 구조 연구는 그 물질의 생물학적 기능 연구나 구조에 기초한 의약품 개발에 중요하다. DNA의 이중나선 구조는 분자생물학의 발전에 기폭제가 되었으며, 단백질화학의 많은 부분은 헤모글로빈의 구조 연구에서부터 출발하였다. 수많은 HIV 프로테아제와 약품들과의 결합체구조가 연구되었으며, 이 연구들로부터 병원에서 이용되고있는 AIDS 치료제들이 개발되었다.

매일 10개 이상의 새로운 단백질 구조들이 보고되고 있지만, 우리는 아직도 가장 중요한 약물 수용체의 구조들마저도 모르고 있다. 더욱 놀라운 일은 이 분야에서 새로운 돌파구가 있기 전에는 이러한 상황이 쉽게 변화하지 않을 것이라는 점이다. 인간의 생존은 이들 약물들에 의존하고 있음에도 불구하고 아직까지 우리는 그 정확한 화학적 기초마저도 알지 못하고 있다.

단백질 구조 연구에서 가장 큰 문제는 결정화에 필요한 충분한 양의 단백질을 구하는 것이다. 대부분의 구조 연구에 필요한 단백질은 20~100mg 정도이며, 이를 분리하기 위해서는 최소한 6개월 이상의 기간이 소요되며 불가능한 경우도 많다. 그러나 최신 x선 구조 결정 기법을 이용하면 약 50㎛ 정도 크기의 결정 하나로 구조를 해석할 수 있는데 이 정도 크기의 결정에는 약 0.1㎍ 정도의 단백질만이 함유되어 있으며, 나머지 99%이상의 단백질들은 최적 결정화 조건을 찾기 위해 "낭비"되고 있는 실정이다.

종래에는, 도1에 예시된 바와 같이, 단백질 용액 2㎕ 와 같은 양의 여러 가지 결정화 용액 방울을 유리 슬라이드 위에서 섞은 후 결정화 장치를 조립하고 진공 그리스를 이용하여 밀봉하였다. 이 때 결정화 방울에서 단백질과 결정화 용액의 초기농도는 원래 용액의 절반이며, 수증기의 증기 확산을 통하여 천천히 원래 농도에 이를 때까지 증가하게 된다. 이 과정 중에 적당한 조건이 형성되지 않으면단백질은 결정이 아닌 침전이 되기도 한다. 이러한 실험을 ㎕에서nl로 그 규모를 감소시키기 위해서는 수증기의 증발 속도를 조정하여야 하며 단순히 방울의 부피만을 줄여주면 표면적과 부피의 비율이 현저히 증가하여 방울은 순식간에 말라버리게 된다.

본 발명자는 이러한 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 단백질 사용량을 천 배 이상 줄임으로써 단백질 구조연구에 획기적 전기를 마련할 수 있는 신규 단백질의 나노 결정화 방법, 그를 위한 나노 결정화 챔버, 및 상기 챔버를 포함하는 칩을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따르면, 단백질 결정화 조건을 찾는 데에 사용되는 단백질의 양을 현저하게 감소시켜 전체 구조연구에 필요한 단백질의 양 역시 현저하게 감소시킬 수 있다.

또한, 기판 위에 미세회로 기술을 사용하여 본 발명의 챔버를 설계한 나노 결정화 칩의 경우 대량 생산이 가능하여, 이를 통해 기존의 방법으로는 오랜 시간이 필요하거나 충분한 양의 단백질을 구할 수가 없어 불가능했던 단백질의 구조를 단시간 내에 파악할 수 있음을 알아내었다.

도 1은 종래의 마이크로 결정화 챔버를 예시한다.

도 2는 종래의 마이크로 결정화 챔버를 예시한다.

도 3는 본 발명의 결정화 챔버의 상세도이다.

도 4는 본 발명에 따라 유리판에 미세가공된 결정화 칩을 예시한다.

<도면의 부호에 대한 간단한 설명>

11 : 유리 슬라이드

12 : 단백질과 결정화 용액으로 이루어진 결정화 방법

13 : 진공 그리스

14 : 결정화 용액

15 : 결정화 챔버

21 : 유리 슬라이드

22 : 단백질과 결정화 용액으로 이루어진 결정화 방울

23 : 진공 그리스

24 : 결정화 챔버

25 : 오일층

31 : 유리판

32 : 결정화 챔버

41 : 제1 로딩 모세관

42 : 제2 로딩 모세관

43 : 결정화 챔버

44 : 확산 채널

45 : 완충 챔버

46 : 결정화 용액 저장기

본 발명의 목적은, 종래의 마이크로 스케일 대신 나노 스케일의 단백질 시료를 사용하여 단백질을 결정화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 단백질의 나노 스케일 결정화를 위한 챔버를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은, 반도체 칩 분야에서 일반적으로 이용되는 기판에 미세회로 설계기법을 사용하여 제작한 상기 챔버를 포함하는 나노 결정화 칩을 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적은, 도4에 예시되어 있는 바와 같이, 제1 로딩 모세관 (41), 제2 로딩 모세관 (42), 결정화 챔버 (43), 확산 채널 (44), 결정화 용액 저장기 (46), 및 임의로 완충 챔버 (45)를 포함하는 단백질 나노 결정화를 위한 결정화 챔버, 및 기판에 미세회로 설계기법을 사용하여 제작한 상기 챔버를 포함하는 나노 결정화 칩에 의해 달성된다.

본 발명의 단백질 나노 결정화 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(A) 마이크로인젝터 또는 잉크젯 프린팅 헤드를 이용하여 단백질 시료 1 내지 20 nl 및 결정화 용액 1 내지 20 nl를 제1 로딩 모세관을 통하여 결정화 챔버에 로딩하는 단계;

(B) 상기 단백질 시료 및 결정화 용액의 혼합물을 결정화 챔버에서 수 일에서 수 개월 이상 동안 정치하고, 확산 채널을 통하여 수증기를 증발시켜 단백질 결정을 얻는 단계.

이 때, 마이크로인젝터 또는 잉크젯 프린팅 헤드는 시중에서 일반적으로 구입할 수 있는 것, 예를 들어, Eppendorf 사의 FemtoJet, 또는 Packard Instrument사의 BioChip Arrayer등을 이용할 수 있다. 결정화 챔버 (43)은 1 내지 20 nl 용량, 바람직하게는 4 nl 용량의 실린더형이며, 로딩 모세관 (41)을 통하여 1 내지 20 nl, 바람직하게는 2 nl의 단백질과, 1 내지 20 nl, 바람직하게는 2 nl의 결정화 용액을 넣어준다. 확산 채널(44)는 실험의 목적에 따라 그 길이와 모양을 조절해 준다. 바람직하게는 확산 채널(44)는 길이가 0.1mm 내지 5 mm, 바람직하게는 1mm 정도이고, 직경이 1 μm 내지 20 μm, 바람직하게는 10 μm인 실린더 모양이며, 확산 채널 (44) 내에는 임의로 완충 챔버(45)가 설치되어 있는데 이를 통하여 수증기의 증발속도를 조절할 수 있다. 확산 채널 중간의 완충 챔버(45)에 투과성 오일 또는 중합체 층을 넣어주면 수증기의 증발 속도를 추가로 조절할 수도 있다. 완충 챔버는 결정화 용액이 저장기로부터 결정화 챔버로 넘어가는 것을 막아주는 역할도 한다.

결정화 용액 저장기는 20 내지 100 nl, 바람직하게는 30 nl의 부피를 가지며, 20 nl의 용액을 로딩 모세관을 통하여 넣어 준다. 로딩 모세관들은 용액의 주입이 끝난 후에는 진공 그리스나 파라핀 오일로 봉합한다.

한편, 상기 결정화 챔버를 포함하는 결정화 칩의 제작은, Ramsey의 방법 [문헌 Jacobson, S.C. et al (1994) Analytical Chemistry66, 3472-3476 참조]에 따라 통상적인 미세회로 설계 기법을 사용하여 제작할 수 있으며, 이 때 사용되는 기판 역시 반도체 칩 분야에서 통상적으로 이용되는 것일 수 있다. 기판은, 바람직하게는 유리판, 석영판, 실리콘 기판, 갈륨 아르세나이드 판, 폴리디메틸실록산, 폴리 에틸렌 글리콜 및 폴리 메틸메타크릴레이트로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

미세가공 기술은 각종 반도체 칩의 가공에 이용되는 기술로서 실리콘 웨이퍼 가공 이외에도 유리를 포함한 다른 재료의 미세 가공에도 응용되고 있다. 이 기술을 이용하면 유리 표면에 ㎛크기의 모세관이나 반응 용기를 쉽게 제작할 수 있다.

이 기술을 이용하여 유리나 중합체 표면에 나노 결정화 용기를 가공하면 확산 채널의 표면적을 조절함으로써 수증기의 증발 속도를 조정할 수 있다.

본 발명의 칩을 이용하여 단백질을 결정화하는 방법에 있어서, 확산 채널의 길이와 표면적을 조절함으로써 수증기의 증발속도를 조정할 수 있다.

결정화 칩의 모양은 도 3 및 도 4에 나타나 있다. 결정화 챔버, 확산 채널, 저장기의 모양과 크기는 실험 목적에 따라 조절할 수 있다.

예를 들어 통상의 유리 칩 제작 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

(A) 포토 마스크 제작 단계:

포토 마스크는 CAD 시스템으로 설계하며, 레이저 마이크로기계 시설을 이용하여 크롬이 흡착된 유리 판 위에 제작한다.

(B) 포토 레지스터 코팅 단계:

칩 제작에 사용될 유리 슬라이드를 세척한 후, 포지티브형 포토 레지스터를 방사 코팅한 후, 예비베이킹한다.

(C) 노광 및 현상 단계:

포토 마스크를 코팅이 된 유리 슬라이드 위에 놓고, UV (365nm)로 노광하여 준다. 노광된 유리는는 현상액으로 현상시킨 이후에 예비베이킹한다.

(D) 에칭 단계:

현상된 유리는 HF/NH4F 용액에서 에칭시켜 준다. 에칭이 완료된 후, 아세톤으로 포토 레지스터를 녹여낸다.

(E) 접합 단계:

덮개로 사용될 유리에는 다이아몬드 드릴로 시료 주입용 구멍을 뚫어준다. 에칭된 유리와 덮개 유리는 고온, 예를 들어 550 내지 650 ℃, 바람직하게는 610 ℃에서 접합시킨다.

이렇게 제작한 본 발명에 따른 단백질 결정화 칩은 다음과 같은 여러 가지 장점을 지니고 있다.

첫째, 확산채널의 단면적과 길이를 자유롭게 바꿀 수 있다. 이를 통하여 결정 형성에 중요한 수증기의 확산 속도를 조절할 수 있다.

둘째, 결정화 용기의 모양을 자유롭게 바꿀 수 있다. 결정화 용기의 모양을 둥굴게 하면 결정이 자랄 수 있는 공간이 최대로 넓어진다.

셋째, 수백 개의 결정화 용기를 한 유리판 위에 가공할 수 있기 때문에 여러 결정화 실험을 동시에 할 수 있다.

넷째, 결정화 칩은 일정한 규격을 가지게 되므로 로봇을 이용한 자동화가 가능하다.

다섯째, 결정화 칩의 대량생산이 가능하다. 결정화 칩은 반도체 칩 가공과 비슷한 공정으로 생산되기 때문에 기존의 반도체 생산시설을 활용하여 저렴한 비용으로 대량으로 생산할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 단백질 결정화 칩은 대량으로 생산이 가능하고 로봇을이용한 자동화가 가능하다.

따라서, 적당한 단백질 결정화 용액을 찾기 위하여 보통 3000 내지 4000가지 이상의 다른 용액들을 시험해야 하는 단백질 결정화 분야에 있어서, 일회용이며 단순하고 쉽게 사용할 수 있고, 기존의 반도체 생산 시설을 활용할 수 있으며, 로봇을 이용한 자동화 공정에 의해서도 제작될 수 있는 본 발명의 칩은 매우 큰 잇점을 가진다.

또한 결정화에 흔히 사용되는 결정화 용액을 본 발명의 칩에 미리 로딩한 상태에서 본 발명의 칩을 상업화할 수도 있다. 이 경우, 사용자는 단백질만 로딩하면 되므로, 훨씬 효율적으로 단백질 결정화 실험을 수행할 수 있다. 이 때, 결정화 용액은 0.5 nl 내지 10 nl 의 양으로 결정화 챔버 내에 로딩될 수 있다. 이와 유사하게, 특정 단백질의 결정화에 적합한 결정화 용액을 선택하기 위하여, 단백질 용액을 본 발명의 칩에 미리 로딩한 상태에서 본 발명의 칩을 상업화할 수도 있다. 이 경우, 단백질 용액은 0.5 nl 내지 10 nl 의 양으로 결정화 챔버 내에 로딩될 수 있다.

나노 결정화 연구를 통해서 얻어진 결정은 단백질 구조분석을 위해 사용된다.nl부피의 단백질과 결정화 용액을 정확히 피펫팅하는 데에는 상기한 바와 같이 마이크로 인젝터나 잉크젯 프린팅 기술이 사용될 수 있다. 마이크로 인젝터는nl이하의 미량 용액을 살아있는 세포에 주입시키는 기술로써 전 세계의 수많은 세포 생물학 연구실에서 사용되고 있으며, 피죠 일렉트릭 방식의 잉크젯 프린팅기술은 저가의 컴퓨터 프린터에 사용되는 기술로서 피코 리터 부피의 용액을 피펫팅하는 생화학 분석에 성공적으로 응용되고 있다.

나노 결정화 기술로 적당한 결정화 조건이 발견되면,nl에서 ㎕로 스케일 업(scale-up)하여 구해진 결정들로 x-선 회절실험을 통한 구조연구에 사용된다. 단백질 구조해석에는 주로 다중파장 회절 (MAD) 기술이 사용되는데 MAD 기술을 이용하면 단 하나의 결정만으로도 구조해석이 가능하다. 이 기술은 이미 단백질 x-선 결정학의 주요 기술로 자리 잡았다. 비정상적 산란의 신호원으로서는 메티오닌 잔기에 치환된 셀레노메티오닌이나 시스테인 잔기에 결합시킨 수은 이온이 이용될 수 있다. 적당한 메티오닌이나 시스테인 잔기가 단백질 서열 상에 없는 경우에는 사이트-디렉티드 (site-directed) 돌연변이유발 실험으로 적당한 위치에 넣어 줄 수도 있다.

본 발명의 나노 결정화 기술은 기초 생물학의 발전에 큰 영향을 미칠 것이다. DNA의 복제, 전사, 스플라이싱 및 번역 등의 가장 기본적인 생물 현상들은 대부분 단백질 복합체나 리보핵단백질의 복합체들이다. 리보좀, 스플라이스좀, 복제원점 (origin) 인식 입자, 전사 예비개시 복합체, 핵 포어 복합체 등은 대표적인 예로서 이들 복합체들은 수많은 구성분자 들로 이루어져 있기 때문에 단백질들을 각각 다량으로 제조하여 재구성하는 일은 현실적으로 거의 불가능하다. 그러나 나노 결정화에 필요한 정도의 소량의 복합체는 쉽게 분리할 수 있는 경우가 많기 때문에 구조 연구가 가능할 것으로 예상된다.

또한, 본 발명은 기능 유전체 연구에도 이용될 수 있다. 인간 게놈 연구는 수많은 기능을 모르는 단백질 아미노산 서열 정보를 생산하였으며, 이들의 기능연구는 21세기 생물학의 가장 중요한 목표이다. 단백질의 기능은 구조로부터 예측할 수 있는 경우가 많기 때문에 구조연구는 기능 유전체 연구의 중요한 수단으로 떠오르고 있다. 그러나 인간 전체 유전자의 20%이하 만이 기존의 기술로 쉽게 구조연구가 가능할 것으로 추정된다. 인간 유전자의 반 정도는 지금까지의 방법으로는 거의 연구 불가능한 막 단백질들이고, 그 외의 단백질들도 구조연구에 필요한 만큼의 양을 만들기 어려운 경우가 많다. 따라서 나노 결정화 기술은 기능 유전체 연구에도 필수적인 연구 수단이 될 수 있을 것이다.

추가로 본 발명은 막 생물학 연구에도 이용될 수 있다. DNA 이중나선 구조가 분자 생물학에 끼친 영향과 같이, 구조연구는 막 생물학에 혁명적인 변화를 가져올 것이다. 막 단백질들은 인간 유전자의 절반 정도로서 가장 중요한 의약품의 수용체들이다. 불행하게도 이들의 대량생산 기술은 아직 개발되지 않았으며 그 구조연구 역시 지금까지의 결정화 기술로는 거의 불가능하다. 자세한 구조적 이해의 부족은 막 생물학 발전의 중요한 장애 요인이 되고 있기 때문에 나노 결정화 기술이 성공적으로 개발되면 이들 막 단백질 연구의 폭발적인 발전을 가져올 것으로 예상된다.

또한, 본 발명은 구조에 기초한 신약 개발(Structure-based drug design)에도 이용될 수 있다. 구조에 기초한 신약 개발은 에이즈 치료제 개발과 항 인플루엔자 신약 개발에서 그 경제성과 효율성을 확인 받았다. 약물 수용체의 구조 연구는 이 방법을 여러 다른 신약 개발에 적용하는 데에 가장 흔한 기술적 장애 요소이다. 막 단백질 수용체나 이온 채널, 펌프는 가장 중요한 약물 수용체들이지만 이를 전통적인 구조연구에 필요한 양만큼 구하는 것은 거의 불가능하기 때문에 12,000개 이상의 알려진 단백질 구조 중 단지 서너 개만이 진핵생물 막 단백질 구조이다. 이들 막 단백질 중 상당수는 나노 결정화 방법으로 연구가 가능할 것으로 예상된다.

한편, 단백질 구조는 특허가 가능하며 상업적인 가치를 가지고 있다. 미국, 영국, 캐나다 등지에서 최소한 다섯 개 이상의 기업들이 다량의 단백질 구조해석과 상업화를 추구하고 있다. 따라서, 본 발명의 나노 결정화 방법으로 연구될 많은 단백질들은 중요한 약물 수용체들로 일반 단백질과는 비교할 수 없는 상업적 가능성을 가질 것으로 예상된다.

미국 정부는 다음 5년 간 매년 1억 5천만 달러의 연구비를 구조 유전체 연구에 투자할 예정이다(Service R.F., 2000, Science289, 2254-2255 Gershon, D., 2000, Nature408, 273-274). 이는 단지 구조 유전체 연구의 가능성 테스트를 위한 것으로 대규모 투자가 뒤따를 것이다. 인간 게놈연구가 이 보다 훨씬 적은 투자에서 시작된 것을 감안하면 구조 유전체 연구의 중요성과 가치를 짐작할 수 있다. 비슷한 양의 투자가 다량의 단백질 구조 연구와 그 상업화에 전념할 기업체에도 투자되고 있다.

따라서, 본 발명의 나노 결정화 방법, 그를 위한 챔버 및 칩은 기존의 결정화 방법들을 대체하며 시장을 독점할 수도 있다. 이외에도 전 세계에는 수많은 구조 생물학 연구팀들이 있으며 이들은 나노 결정화 기구들의 중요한 시장이 될 것이다.

이하, 본 발명을 실시예로 예시할 것이지만, 본 발명은 그에 의해 한정되는 것은 결코 아니다.

실시예 1

마이크로 인젝터나 잉크젯 프린팅 헤드를 이용하여 단백질 글루코스 이소머라제 (10mg/ml) 시료 2 nl 및 결정화 용액 (1.2~1.4M 황산암모늄, 0.1M 아세트산 나트륨, pH 5.5) 2 nl를 제1 로딩 모세관을 통하여 결정화 챔버에 로딩하고, 이어서 상기 단백질 시료 및 결정화 용액의 혼합물을 결정화 챔버에서 일주일 동안 정치한다. 이때 확산 채널을 통하여 수증기가 증발되므로써 단백질 결정을 얻었다.

실시예 2

유리판을 기판으로 하고, 통상의 미세회로 설계기법을 이용하여 본 발명의 챔버를 포함하는 단백질 결정화 칩을 제작하여, 상기 칩을 실험에 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 실험을 행하였다. 그 결과, 나노 스케일의 단백질 시료로부터 단백질 결정을 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따르면, 단백질 결정화 조건을 찾는 데에 사용되는 단백질의 양을 나노 스케일로 현저하게 감소시켜 전체 구조연구에 필요한 단백질의 양 역시 현저하게 감소시킬 수 있다.

또한, 기판 위에 미세회로 기술을 사용하여 본 발명의 챔버를 설계한 나노 결정화 칩의 경우 대량 생산이 가능하여, 이를 통해 기존의 방법으로는 오랜 시간이 필요하거나 충분한 양의 단백질을 구할 수가 없어 불가능했던 단백질의 구조를단시간 내에 파악할 수 있다.

Claims (9)

1. 단백질의 결정화 방법에 있어서,

   (A) 마이크로인젝터 또는 잉크젯 프린팅 헤드를 이용하여 단백질 시료 1 nl 내지 20 nl 및 결정화 용액 1 nl 내지 20 nl 를 제1 로딩 모세관을 통하여 결정화 챔버에 로딩하는 단계;

   (B) 상기 단백질 시료 및 결정화 용액의 혼합물을 결정화 챔버에서 수일 이상 동안 정치하고, 확산 채널을 통하여 수증기를 증발시켜 단백질 결정을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 확산 채널 내에 투과성 오일이나 중합체 층을 넣어 수증기의 증발 속도를 추가로 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1 로딩 모세관, 제2 로딩 모세관, 1 nl 내지 20 nl 용량의 결정화 챔버, 길이가 0.1mm 내지 5 mm이고, 직경이 1 μm 내지 20 μm인 확산 채널, 및 20 nl 내지 100 nl 용량의 결정화 용액 저장기를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 결정화 챔버.
4. 제3항에 있어서, 확산 채널 내에 완충 챔버를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 결정화 챔버.
5. (A) CAD 시스템으로 설계하며, 레이저 마이크로기계 시설을 이용하여 기판 상에 포토마스크를 제작하는 단계;

   (B) 칩 제작에 사용될 유리 슬라이드를 세척한 후, 포지티브형 포토 레지스터를 방사 코팅한 후, 예비베이킹하는 단계;

   (C) 포토 마스크를 코팅이 된 유리 슬라이드 위에 놓고, 파장이 365 nm인 UV로 노광하고, 노광 유리를 현상액으로 현상시킨 후 예비베이킹하는 단계;

   (D) 현상된 유리를 HF/NH₄F 용액에서 에칭한 후, 아세톤으로 포토 레지스터를 용해시키는 단계;

   (E) 덮개로 사용할 유리에 다이아몬드 드릴로 시료 주입용 구멍을 뚫어주는 단계;

   (F) 에칭된 유리와 덮개 유리를 550 내지 650 ℃에서 접합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제작되며, 제1 로딩 모세관, 제2 로딩 모세관, 1 nl 내지 20 nl 용량의 결정화 챔버, 길이가 0.1mm 내지 5 mm이고, 직경이 1 μm 내지 20 μm인 확산 채널, 및 20 nl 내지 100 nl 용량의 결정화 용액 저장기를 포함하는 단백질 결정화 챔버를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 결정화 칩.
6. 제5항에 있어서, 기판이 유리판, 석영판, 실리콘 기판, 갈륨 아르세나이드 판, 폴리디메틸실록산, 폴리 에틸렌 글리콜 및 폴리 메틸메타크릴레이트로 구성된군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 결정화 칩.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 확산 채널 내에 완충 챔버를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 결정화 칩.
8. 제7항에 있어서, 단백질 용액 0.5 nl 내지 10 nl 가 결정화 챔버 내에 로딩되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 결정화 칩.
9. 제7항에 있어서, 결정화 용액 0.5 nl 내지 10nl 가 결정화 챔버 내에 로딩되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 결정화 칩.