JPH05506998A - イントロン配列分析法を用いた直接ハプロタイピングによるゲノム地図作成方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 イントロン配列分析法を用いた直接ハブロイドツムによるゲノム地図作成方法。

発明の分野 本発明は、非暗号配列変異の分析により、個体のハブロタイブを直接同定するこ とに関する。この発明は、ゲノム全域において特定部位の多型を迅速に試験し、 また、独特の表現型によって同定される未知のヒトの遺伝病遺伝子の位置クロー ニングを促進する等の広範囲な応用性を持つものである。

発明の背景 クローン化疾患遺伝子は、ヒト遺伝病の原因となる突然変異の型を定めるのに用 いられ（Ｓ、　Ｈ，０ｒｋｉｎ、　ｅｔ　ａｌＡｎｎ、Ｒｅａ、Ｇｅｎｅｔ　１ ８　二　１３１−１７１　（１９８４））　、胎児期における異常遺伝子の検出 を可能にしくｃ、　ｆ、　Ｒ。

Ｖ、　Ｌｅｂｏ、　ｅｔ　ａｌ　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ４７　： 　５８３−５９０　（１９９０））、また、これらの遺伝子を作用組織に導入さ せることにより遺伝子置換治療が試みられるようになった（Ｓ、Ａ、　Ｒｏｓｅ ｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ　Ｈｕｍａｎ　ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ　１　：　７ ３−９２　（１９９０）　）　、最終的にはヒトの完全なゲノム配列決定の目標 へ至る過程で、ヒトゲノム計画がかなりのマツピングデータを生み出し、分離し 、ＲＦＬＰの配列標識部位（ＳＴＳ）　、及びｃ　ＤＮＡ（ＥＳＴｓ　；表現配 列標識；　Ｍ、　Ｄ、　Ａｄａｍｓ、　ｅｔ　ａｌ　Ｓｃｉ。

２５２・１６５１−１６５６　（１９９１））を地図化するなろう。現在、多型 性マーカーの最も普通の同定方法は、多くの制限エンドヌクレアーゼを用いた制 限酵素分析法である。この方法は、労働集約型である。本発明は、かなり多くの 情報部位を急速に発生させることを提案し、これによりゲノムの地図作成を促進 し、未知の疾患遺伝子を同定し、危険な胎児における胎児期診断に関する情報を 提供するものである。

ヒトゲノム計画： ヒトゲノム計画は、ヒト遺伝子の地図を作成し、発生、組織特異性発現またヒト 遺伝病を理解するのに重要な遺伝子を同定するという個別の努力の論理的な延長 である。

困難な点は、情報の大きさと厄大な量である：すなわち、それぞれのヒトの親か ら得られるそれぞれのハブロイドツムは、３ＸＩＯ’個のＤＮＡの塩基対をもっ ている。

ゲノム計画の当初の長期目標は、正常なヒトからそれぞれの塩基対を配列するこ とにある。計画に関係している個々の科学者達は、関連のある他の目標を含めて 計画の範囲と費用をひろげている。最初の第一段階は、ゲノムを通して、およそ １０センチモルガンの多型性連鎖遺伝子座のマツプを作り出すことにあった。個 体の染色対の数十センチモルガン地図が作られ、そして１対の染色体は１センチ モルガン地図に近づいている。一方、生成された最も密集した多型地図は、特別 に識別可能な表現型の未知に疾患遺伝子の領域にある。位置クローニング計画で は、１２の未知疾患遺伝子（下記参照）に関する同定に成功し、疾患遺伝子領域 における高密度の地図を作成した。染色体連鎖地図の作成に最も有用なマーカー は、はとんどすべての交配で情報を与える多くの対立遺伝子をもったこれらの多 型性マーカーである。これらの部位・は、交配による情報提供が少ない隣接部位 を、より情報提供型にする。本発明は、連鎖研究上の最終点として、かなり多く の、より情報型子型性部位を発生する方法の提案に関するものである。

クローン疾患遺伝子の胎児期診断 およそ１２の疾患遺伝子が、ヘモグロビンや凝固因子のような既知の遺伝子生産 物を基にクローン化された。

他の１２の遺伝子が、位置クローニングにより分離された。初期の胎児期診断は 、疾患遺伝子領域における情報型多型の分離を基に行われる。はとんどそれぞれ 場合での診断を確実にする十分に情Ｎｕの多型性を同定する標準ＲＦＬＰ分析は 多少なりとも労働集約型である（　Ｒ，Ｖ。

Ｌｅｂｏ、ｅｔ　ａｌ　Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ４７　：　５８３−５９ ０（１９９０））。

限定した数の遺伝子突然変異が、ある与えられた遺伝子座に、原因となる配列変 化の大部分を結果的に起し、そのため、それぞれの突然変異についての特殊な検 査で病気対立遺伝子の重要な部分を説明する時に、異常なハブロタイブの多形性 分析が唯一利用できる選択方法かも知れない。現在、これは、突然変異を起した 対立遺伝子が多く報告されている嚢脆性繊維症の場合のことである。

しかしながら、現在の方法よりも、スクリーニング、されるより多くの情報提供 型多望部位を与える方法を用いれば、胎児分析の履行能力が促進されるだろう未 知の疾患遺伝子の“逆向き遺伝学”また“位置クローニング″は、候補の遺伝子 が親及び正常な物に分離され配列されるまで、まれにしか組み換えられない多形 性マーカーを近接配置することにより遺伝病遺伝子座の方へ近づく方法に関する ものである。すべての突然変異の対立遺伝子が、病原変質をもつことを示しつる とき（ｃ、　ｆ、　Ｓ、　Ｈ。

０ｒｋｉｎ、ｅｔ　ａｌ　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｉ　８　：　Ｉ 　３１−１７１（１９８４））、そしてすべての正常な対立遺伝子が正常な配列 をもつことが示される時に、遺伝子が同定されてきた。検索の最初の部分は、ゲ ノム全域にわたり、多くの多型性マーカーを通して、多型が、２より大きなＬＯ Ｄ　（公算のｌｏｇ　）評点を与えるのが見出されるまで、変更する。

次に、多くのマーカーが、ＬＯＤ評点３か得られるまで試験され、連鎖が立証さ れたと考えられる。これは、多型性部位が遺伝子に連鎖される可能性が、９９９ ／１０００　（ＩＯｇ＋ｏ　１０００＝３；１０３＝１０００）より大きいこと を意味する。Ｒａｙ　Ｗｈｉｔｅの実験室で、期待した通り、試験で評点が３． ０より大きい、１ｏｏｏ個の中の１個の予測連鎖か、連鎖されていないことを見 出している。

ゲノムの全体は、２２対の常染色体と１対の性決定染色体に関しおよそ３０００ センチモルガン（１センチモルガン＝１％組換え）を含むと推定される。理想的 には、ゲノム全域で１０センチモルガンの間隔で、およそ３００の均等にひろが った多型性部位を利用することができ、その結果、疾患遺伝子への連鎖に関する ゲノムのそれぞれの検索によって、情報型多量マーカーと疾患表現型との間の連 鎖が明らかにされることである。不幸にして、はんのわずかの染色体しか、多型 性マーカーによくマツプされなかった。これらのマーカーは、染色体上に均等に 配置されていない。従って、連鎖した多型マーカーに関する現在のゲノム検査で は、ヒトゲノム全域のおよそ８５％を試験する約１２００の多型プローブを主と して含んでいる。染色体部位の情報が増加する程、より有用になる。

ヒトゲノム計画の一つの目標は、最も少ない数のマーにマツプされるような均等 に位置決定された多型部位を開発することである。組織特異性ライブラリーから 分離し、マツピングしたｃＤＮＡは、遺伝病用候補遺伝子と同様、追加の、独自 にマツプされた染色体部位を与えるだろう（Ｍ、　Ｄ、　ＡｄａｍｓｅｔａｌＳ ｃｉ、２５２　：　１６５！　−１６５６（１９９１））。いったん、位置決定 すれば、疾患遺伝子表現型及びまたは他の多望部位間の分離分析により遺伝子座 を遺伝（連鎖）地図に加えることが出来るように、あるいは候補遺伝子として部 位を試験できるように、その染色体部位における情報型多量マーカーに関する検 索が必要である。

他の動向としては、雄の減数分裂の中期の始めにおけるキアズマ（組換え）測定 に基づくセンチモルガンの予測数が、全体的に調べられた染色体でのセンチモル ガンの数を過小評価したことである。例えば、染色体１個は、２００から３００ センチモルガンであると推定されたが、しかし、遺伝子距離は、現在、試験され た最も遠位の多型部位まで、およそ４６４センチモルガンであることが示されて いる。従って、多型プローブの数は、以前に未知の遺伝病表現型のために、ゲノ ム全域をスクリーンにかけて推定した数よりも大きくしなければならないだろう 。

位置クローニング計画を開始する前に必要とされる病気に冒された患者とその家 族の数は、遺伝様式に依存する。他の要因は、検査に関係する多型マーカーか交 配の部分で、単に情報を提供しうる確率である。常染色体性劣性遺伝病の研究に 適用な患者集団は、病気に冒された２人の子供をもつ２０組の家族である。これ によって、研究者は、すべての情報提供患者と最初の病気の子供における遺伝病 表現型と冬型遺伝子座の相を決定し、２番目の子供の組換えの割合を比較するこ とが可能になる。

常染色体性優性遺伝病の場合は、単一の大きな家系がｌＯの情報提供型の減数分 裂をもてば、このような２系統の家系か試験として十分である。本件のこの数は 、３０％のすくない対立遺伝子頻度（２つの対立遺伝子系の主要な対立遺伝子頻 度は従って７０％）をもつ情報供与型多型マーカーとして、２．０と３．０の間 のＬＯＤ評点を与えることを期待することができる。２．０よりも大きなＬＯＤ 評点を与えるすべての多型部位について、この染色体領域における連鎖は、もっ と多くの多型プローブで検査される。−２，０（連鎖の機会は１／１００＝１０ −２以下である）より少ないＬＯＤ評点をもつすべてのプローブについて、連鎖 は排除されると考えられる。

遺伝病が、ＬＯＤ評点３をもつ独自の染色体領域にマツプされる時、その染色体 領域での他の多型マーカーが試験され、その結果は、Ｊｕｒｇ　ｏｔｔによって 開発されたＬ　Ｉ　ＰＥＤのようなコンピュータープログラムを用いた多点連鎖 分析により比較される。多点分析は、ＬＯＤ評点の上昇（多分連鎖の可能性が９ ，９９９／１０．０００である４、０に）により連鎖が訂正される可能性を増加 し、あるじ）は、ＬＯＤ評点を著るしく下げる、より小さな染色体領域での二重 組換えを示すことにより、しばしば急速にこの染色体領域を排除する。

位置クローニング計画は、それぞれの家族メンバーの病状が確実に決定されない 限り、開始されるべきではないことに注意すべきである。このルールについての 例外は、“うつ病”の遺伝子座がアミッシュの中の染色体１１（染色体１ｉｐ） のショートアームで分離されることが報告された際に生じた。この例で染色体１ １ｐ多型性によるＬＯＤ評点が６より大きくなる（連鎖の可能性は大きくそして １，０００．０００／１，０００，００１）と報告された後：程なく、２人の患 者の重いうつ病が急速に改善された際、連鎖研究の基礎になる表現分析が間違っ ていることが発見された。これら２つの表現壓を正しく設定し、これを基にＬＯ Ｄ評点が計算された時、相互開気の診断を、より容易にするのに必要であること よりも、集団遺伝学者をさらに懐疑的にしたがしかし、連鎖研究の基礎となるそ れぞれの家族メンバーに対する正しい病状診断の重要性が強調される。

疾患遺伝子が、連鎖した多型プローブにマツプされた時、次の段階は、同じ染色 体領域にある多くの他の多型マーカーの対立遺伝子を分離し、試験することであ る。

存在するマーカーの獲得は、同じ染色体領域のこれまでの研究からの利用可能な りローンおよびライブラリーあるいは、この染色体領域にあらかじめマツプされ た利用可能なｃ　Ｄ　Ｎ　Ａまたは他の多型プローブに依存している。

新しいプローブを発生するための最適計画は、協同した研究所の資源と専門的知 識に依存している。

例えば、疾患遺伝子がマツプされたすべてのヒト染色体を運ぶ謹歯類−ヒトハイ ブリド体細胞は照射することができる。そこで、連鎖した多型プローブにより染 色体領域だけを運ぶ細胞株を分離することができる。組換えライブラリーは、ヒ トクローンを同定するためのヒトａｌｕ反復配列によりスクリーニングされる。

ａｉｕ配列は、ヒトゲノムを通じておよそ３００．０００回繰返されるので、こ の方法で多くのヒトクローンが同定される。これらのクローンから、ＤＮＡ多型 部位が同定され、さらに、−放向で連鎖分析が行われる。

第２の方法は、疾患遺伝子領域内の染色体部分を分裂し、わずかに集められた染 色体の休館をａｌｕプライマーで増幅し、また、増幅したフラグメントをクロー ン化することである。これらのフラグメントは、次いで、疾患遺伝子領域内にお ける多型性を見出すのに用いられる。

これら多型部位の分離物は、さらに、疾患遺伝子領域を定めるために、影響を受 けたすべての系統で試験される。

分裂片のライブラリーは、およそ１２の既知の遺伝病遺伝子座内で作られた。

同時に、推定上の疾患遺伝子領域にマツプされた他のクローン遺伝子は、影響を 受けた系統内で試験されたこれらの遺伝子の多型性と分離について試験すること ができる。

この点で、Ｒ，Ｖ、　Ｌｅｂｏ、　ｅｔ　ａｌ　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｎｇ、　Ｇ ｅｎｅｔ。

４７：５８３−５９０　（１９９０）に指適されたように、９５％の信頼性があ り、事例の少なくとも７５％に情報を与える、臨床的な胎児期遺伝試験が提案さ れるかも知れない。遺伝病の頻度によっては、患者集団は、単に、疾患遺伝子の 位置のマツピングと、近接して連鎖した遺伝子マーカーの発見にのみ限定される かも知れない。遺伝子の変質を識別することは別として、記述された４、　００ ０以上の遺伝病の中、多分２．０００の場合がそうであるかも知れない（Ｍｃｋ ｕｓｉｃｋ、　Ｍｅｎｃｆｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｉｎ　Ｍａｎ　 ）。

位置クローニングの次の目標は、ＤＮＡの１メガベース（Ｍｇ）またはｔ、ｏｏ ｏ、ｏｏｏ塩基対以下に過ぎないフランキングマーカーの間の未知の遺伝病遺伝 子座の輪郭を抽くことである。領域外で試験されたクローンの数を最小にする一 方、このような小さな染色体領域内でのクローン化ＤＮＡ断片のたくさんの数を 継続してスクリーングする方法が最も生産的である。たとえば、照射された染色 体■７ハイブリツドから分離されたコスミドクローン及びハイブリダイゼーショ ンにより、その染色体領域のみをもって、ロングアームにハイブリッドする同定 クローンは、神経繊維腫症−１遺伝子座の飽和に用いられた。それから再び、嚢 胞性繊維症染色体領域からのフラグメントのライブラリーが、すべてのハイブリ ッド細胞株に保有された近傍の選択型遺伝子を運ぶ細胞系から作られた。

デュシエン筋ジストロフィー（Ａ、　Ｐ、　Ｍｏｎａｃｏ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ３２３　：　６４６−６５０　（１９８６））及び、Ｘ染色体の慢 性肉芽腫症（Ｂ、　Ｒｏｙｅｒ　−Ｐｏｋｏｒａ、　ｅｔ　ａｌＩ　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐ、　ＨａｒｂｏｒＳＹｍｐ、　Ｌ　Ｉ　：　Ｉ　６　９−１　７６（夏９８ ６）　）、染色体７の嚢胞性繊維症（Ｊ、　＆１．　Ｒｏｍｍｅｎｓ、　ｅｔ　 ａｌ　Ｓｃｉ。

２４５　：１０５９−１０６５　（１９８９）　；　Ｊ、Ｒ。

Ｒｌｏｒｄａｎ、ｅｔａｌ　Ｓｃｉ、２４５　：　Ｉ　０６６−１０７３（１９ ８９）　；Ｂ、　Ｓ、　Ｋｅｒｅｍ、　ｅｔａｌ　Ｓｃｉ、２４５　＋１０７３ −１０８０　（１９８９）及び染色体Ｉ７の神経繊維腫症−１（Ｍ、　Ｒ，Ｗａ ｌｌａｃｅ、　ｅｔ　ａｌ　Ｓｃｉ、２４９　：１８１−１８６　（１９９０） ）を含むおよそ１２の疾患遺伝子が位置クローニングにより同定された。染色体 １７のＸ染色体遺伝子及び神経繊維腫症−１遺伝子座は、染色体組換えが疾患遺 伝子領域を限定したので、もっと容易に迅速に同定された。メガベース領域の嚢 胞性繊維症、常染色体性劣性遺伝病を、連鎖分析と不平衡によって、フランキン グマーカーで境界を定める一層の努力が要求される。次いで、酵母人工染色体（ ＹＡＣ）ライブラリーによる染色体ホビングが、ＹＡＣ“ホビング及び“リンキ ングライブラリーによる異常遺伝子の同定に先立って、残存するＤＮＡ部分を分 離するために用いられた（Ｊ、　Ｍ、　Ｒｏｍｍｅｎｓ、　ｅｔ　ａｔ　Ｓｃｉ 、２４５　：　ｌ　０５９”−１０６５（１９８９）。

次に、推定疾患遺伝子領域における転写遺伝子が、制限エンドヌクレアーゼ切断 部位によりＣＰＧ島を探る種間の保護配列の検索により、また最近開発されたエ クソントラッピング計画により、同定されるかも知れない。

ＹＡＣクローンは、ニスミド中で一部消化され、サブクローン化される。次にコ スミドは、標識され、反復配列ヘハイブリダイズするために、すべての非標識ヒ トＤＮＡにアニーリングされ、次いで、犬、マウス、猫及び牝牛から得たＤＮＡ ヘサザン法によりハイブリダイズされる（動物プロット参照）。

それぞれに、ハイブリダイズする配列を運ぶＹＡＣクローンは、保護遺伝子を運 ぶと考えられる。これらのコスミドは、それで、組織特異性のｃＤＮＡライブラ リをスクリーンするのに用いられる。相同ｃＤＮＡクローンを認知するこれらの コスミドは、そこで、推定遺伝子が冒された組織中に発現するか否かを決定する ために、異なる組織中にノザン法によってハイブリダイズされる。

このような組織は、ヒトの死体か、実験室のラットからめることか出来る。

遺伝子を同定する第２の方法は、ＣＰＧ島５を認識し、切断して多くの遺伝子に する、Ｂｓｓ　ＨＩｌ、　Ｅａｇ　ｒまた５ａｃｌｒのような酵素でＹＡＣクロ ーンを切断することである（Ｃ，Ａ、　Ｓａｒｇｅｎｔ　ｅｔ　ａｔ　ＥＭＢＯ ８：　２３０５−２３１２　（１９８９））。分離したＹ　Ａ、　Ｃクローンは 消化させることができ、また挿入ＹＡＣが切断されたか否かを知るために、パル スフィールドゲル電気泳動を用いて分離することができる。

次に切断片の末端は、丁度Ｎｏｔ　Ｉ　ＹＡＣ連鎖ライブラリが構成されるよう に、プラスミドベクターに連結し、ベクターを切断しない制限酵素で消化し、増 殖のためプラスミドを要求するバクテリアを形質転換することによって分離する ことができる。増殖するプラスミドは、保護配列のための動物プロット、組織抽 出のサザンプロットまたｃＤＮＡライブラリのスクリーンに用いられる。

第３の方法、エクソントラッピングは、遺伝子領域の特性を明らかにするために 、レトロウィルス性ベクターを用いたＤｒ、　Ｇｅｏｆｆｒｅｙ　Ｄｕｙｋによ って開発された。

ＹＡＣまたは、コスミドクローン化配列は、消化され、レトロウィルス性ベクタ ーｐＥＴＶ−８Ｄにクローン化されたショットガンがエクソントラップカセット に運ばれる。このエクソントラップベクターは、クローン化ゲノムＤＮＡ断片に 暗号化された機能的なスプライス受容部位を同定する。大部分の遺伝子は、ＲＮ Ａスプライシングを受けるので、このような部位は、大部分の遺伝子のための同 定用として機能する。このショットガンクローニングからのプールされたプラス ミドＤＮＡは、エコトロピックなレトロウィルス性包括細胞系に形質転換される 。この細胞系は、レトロウィルスとしてのベクター増殖のために必要な蛋白質を 供給する。レトロウィルス性ＤＮＡは、ｉｎ　ｖｉｖｏで転写され、機能スプラ イス部位による転写体は、カセット内の標識介在配列のロスでスプライシングを 受けるかも知れない。スプライスされまたスプライスされないウィルス性ＲＮＡ は、ウィルス粒子にパッケージされ、この培地から収穫され、ＣＯ８細胞を感染 させるために用いられる。この第２の複製は、スプライシングの頻度を増加させ る。この第２培地から分離したウィルスは、本質的にＳＶ４０抗原を生産するＣ Ｏ８細胞を感染させるのに用いられる。このようにして、シャトルベクターは、 逆転写され、ＳＶ４０起源または、ベクター中の複製の循環ＤＮＡエピソームと して増幅される。β−ガラクトシダーゼ指示遺伝子は、スプライシングによって 切り出され、スプライスされないコロニーは通常青色であるのに反して白色コロ ニーを生ずる。スプライシング現象は、スプライス供与エクソン内部で、そこか ら感作されたＤＮＡ配列決定により白色コロニー内で立証される。これらの候補 エクソンは、動物プロット、ｃＤＮＡライブラリー、あるいは遺伝子同定の可能 性のあるノザンプロットのスクリーンに利用される。

先行技術の記述 Ｍａｒｘ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７　：　１５４０−１５４２（１，９９０） は、自己免疫疾患、高血圧、肥満症、癌また、アルツハイマー疾患、繰うつ病お よび精神分裂病を含む精神病のような多原因疾患の構成要素を理解するため遺伝 学者が直面している問題点を報告している。

０１ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２４５　：　１４３４−１４３５（ １９８９）は、ゲノムマツピング用に普通の言語を与えるため、配列標識部位を 用いた物理的地図方式に関する示唆を報告している。

三つの論文シリーズ（Ｒｏｍｍｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｊｅｎｃｅ２４５　 ：　１０５９−１０６５　（１９８９）、　Ｒｉｏｒｄａｎｅｔａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４５　：１０６６−１０７２　（１９８９）及びＫｅｒｅｍ 　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ２４　５　：　１　０　７　３−　１　０　７　 ９（１９８９））は、ＣＦ遺伝子の位置、ＣＦ遺伝子の配列及び遺伝子内の欠陥 、そしてまた疾患集団内のパーセンテージをそれぞれ識別するために用いた“ジ ャンピングと名づけだ新しい遺伝子分析法について報告している。

Ｄｉ　Ｌｅｌｉａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　ｉ　：４９７−４９ ９（１９８８）は、化ヨーロッパ系統のコーカサスにおけるフェニルケトン尿症 の原因である２種類の主な対立遺伝子検出のためのスクリーニング法について記 載している。エクソン１２のおよそ中心部また介在配列１２とエクソン１２の結 合点に位置する突然変異は、エクソン１２とフランキング介在配列の２４５ｂｐ 領域のＰＣＲ増幅によって検出される。増幅配列は、両方の突然変異を取りかこ み、それぞれの対立遺伝子に特有のプローブを用いて分析される（予備の電気泳 動分離なしに）。

Ｄｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７　：　８３０− ８３７（１６ｓ　９）及びＭａｒｄｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ７　：８４０−８５０　（１９８９）は、ＤＮＡ配列、特にＰＣＲ−発 生配列の自動化技術について報告している。

Ｃ１ａｒｋ、　Ｍｉｏｌ　Ｂｉｏｌ、　Ｅｖｏｌ、、７　（２）　：　１１１− １２２（１９９０）は、ＰＣＲ−発生対立遺伝子決定からのハブロタイブの推定 あるいは、近接連鎖した制限部多形性のハブロタイブ頻度の推定のために、ある 場合に用いられる特定の演算方式について記述している。

５ｔｅｐｈｅｎｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、 　４６　：１１４９−１１５５　（１９９０）は、増殖した異型接合個体のハブ ロタイブの決定法について述べている。その方法は、“単分子稀釈”または“Ｓ ＤＭ”と呼ばれ、それぞれの稀釈サンプル中にただ１分子のＤＮＡだけが含まれ るよう十分に稀釈することによって、単鎖ＤＮＡ分子を推計学的に分離するもの である。単ｉ１！ＤＮＡの収穫に関し、分子のハブロタイブ分析のためにＰＣＲ 技術が用いられる。

ハブロタイブを直接識別する他の方法は、Ｂｏｅｈｎｋｅ　ｅｔａｌ、Ａｍ、Ｊ 、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、４５　：２１−３２　（１９８９）によって述べら れている。その方法は、ハブロイド細胞、特に精子細胞を用いて行われる。

Ｃａｖａｌｌｉ　−５ｆｏｒｚａ、　Ａｍ、　Ｊ、　ＨＬｌ［Ｉｌ、　Ｇｅｎｅ ｔ、　４６　：　６４９−６５１　（１９９０）は、ゲノム中に存在する個体変 異の程度に関する情報を得るため、色々な遺伝位置における多くの個体のゲノム の統計的サンプリングが、ゲノムマツピング計画の一部としてなされるべきであ ると提案している。

上記の文献はそれぞれ、文献としてすべてここに編入されている。

発明の要約 本マツピング方法は、個体のゲノムＤＮＡの分析を通してハブロタイブの直接決 定に役立たせるものである。

本マツピング方法は、興味ある遺伝領域に関連した多くの多型性に関する情報を 得、そして遺伝領域で異なる対立遺伝子とハブロタイブをもつ個体を識別する方 法を提供するものである。さらに、本法は、興味ある遺伝子、特に、与えられた 遺伝子座からの疾患遺伝子の距離と方向に関する情報を提供するものである。こ の方法は、染色体組換えに関係しない疾患遺伝子の位置の決定に特に有効である 。

本法はまた、特に、興味ある遺伝子座におけるゲノムを通して多型性マーカーを 急速に発生させる方法を提供するものである。マーカーは、古典的なＲＦＬＰ部 位より、もっと容易に同定され、スクリーンされるばかりでなく、マーカーは、 与えられた位置に存在しても、しなくても、古典的ＲＦＬＰ部位よりもはるかに 多くの情報を提供する。

本発明は、非暗号化領域配列、特にイントロン配列が、染色体上に近接してまた 離れて連鎖した遺伝子座の対立遺伝子に特徴的な遺伝変異を含むことを見出した ことに基づいている。特に、十分な数のイントロン配列ヌクレオチドを含む、プ ライマー限定の増幅ＤＮＡ配列は、興味ある遺伝領域に関係した対立遺伝子とハ ブロタイブの特徴的なパターンを生産するために用いることができる。

そのパターンは、増幅したＤＮＡ配列の中に、ゲル電気泳動の長さの違いで生産 され、あるいはまた、１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼによる増幅ＤＮ Ａ配列の消化によって、ＲＦＬＰ断片パターンが生産される。

どちらか一方、−たび十分な配列情報が得られたならば、対立遺伝子／ハブロタ イブ特異的−増幅を、選別された対立遺伝子／ハブロタイブの存在を検出するの に用いることができる。

マツピング方法は、多くの個体のＤＮＡの分析により、遺伝子座として作られた 多くの対立遺伝子及びサブ一対立遺伝子（ハブロタイブ）のパターンを決定する ことにより、遺伝子座の多望の程度に関する情報を与える。この方法はまた、興 味ある遺伝子座に関係する個体変異を探査するだめの個体スクリーンに用いるこ とができる。

本法はまた、疾病の集団遺伝、特に−遺伝子病の研究に用いられる疾病関連の遺 伝子座に関する情報を提供する。

発明の詳細な説明 本発明は、非暗号領域配列変異パターン、特に、イントロン配列変異パターンの 分析を通して、個体のハブロタイブを同定する能力に基づいた改良マツピング方 法に関する。マツピング方法は、２つの局面をもっている。

第一は、興味のある特別な領域について、本法は、その領域に関係する多型性の 程度についての情報を提供し、また、異なる対立遺伝子とサブ対立遺伝子（ハブ ロタイブ型）をもつこれらの個体を識別し、集団を通しての個体変化の特性記述 を可能にしている。興味のある特別領域について、このような特性記述は、同一 の遺伝配列による個体の複性配列を回避させつる。

興味ある領域に関係するハブロタイブ制限を分析することにより、興味ある遺伝 子の方向、最終的には位置を決めることができる。さらに、直接的なハブロイド 細胞により、家族研究を基にした連鎖分析に頼ることなく、疾病に関係した興味 ある遺伝子の位置決定を容易にしている。正常な、また疾病に冒されたハブロタ イブの直接分析は、疾病に関係した遺伝子座を同定するために役立たせることが できる。

第２に、この方法は、ゲノムを通して、多型性マーカーを発生し、スクリーンす るだめの迅速な方法を提供している。特に、およそ２００から５００ｎｔの配列 情報、特に遺伝子座の情報があるどの領域の非暗号配列も、急速に増幅し、分析 することができ；これによって、経済的にスクリーンされるマーカーを提供しつ る。さらに、マーカーは、与えられた位置に存在してもしなくても、古典的なＲ ＦＬＰ部位より、はるかに多くの情報をもっている。すべての遺伝子座について 、１個または少ないイントロン配列マーカーの分析により、遺伝子座に関係した 対立遺伝子／ハブロタイブを同定することができる。

遺伝子間配列について、領域に関係した多型性の程度は、より高くなっている。

本発明は、十分な数の非暗号配列ヌクレオチド、特にイントロン配列ヌクレオチ ドを含むプライマー−限定のＤＮＡ配列の増幅によって、興味ある遺伝領域に関 係した対立遺伝子とハブロタイブに特徴的なパターンを生産することに用いられ るという発見に基づいている。本法は、単一の固体有機体が試験される時、ハブ ロタイブを、ＤＮＡタイピング分析の直接の産物として読みとる。本法は、ここ では、ヒトゲノムのマツピング項目として記述されている。しかしながら、この 方法は一般的にすべての真核生物に応用できる。この方法は、植物や動物種のゲ ノムＤＮＡのマップングとしても有効に用いられる。

定義 ここで使用する“対立遺伝子”という用語は、暗号領域に関係した遺伝的変異を 意味する。すなわち、遺伝子のもう一方の形態である。このような変異は、暗号 化蛋白質内におけるアミノ酸の置換に影響しない“サイレント”変異を含む。

ここで用いられる“連鎖“という用語は、ゲノムのＤＮＡの領域が、−緒に遺伝 される程度に関係する。異なった染色体における領域は、連鎖を示さず、期間の ５０％が一緒に遺伝される。常に一緒に相続される隣接した遺伝子は１００％の 連鎖を示す。

ここで用いられる”連鎖不平衡”という用語は、連鎖した遺伝子座における２つ の対立遺伝子の共発現に関係し、このような場での対立遺伝子の共発現頻度は、 それぞれの対立遺伝子が別々に発現することから期待される頻度より大きい。分 離した頻度から期待される頻度で共発現した対立遺伝子は、“連鎖不平衡”であ ると呼ばれる。

ここで云う“ハブロタイブは、組換えにより結合した染色体上のゲノムＤＮＡの 領域であり、ハブロタイブ領域内での遺伝子座は、通常ユニットとして遺伝子さ れる。しかしながら、時として、遺伝的転位がハブロタイブ内で起こるかも知れ ない。このような場合、ハブロタイブという言葉は、連鎖した遺伝子座の染色体 上での発現に関係する操作上の用語である。

ここで用いられる“イントロン”という用語は、エクソン間で翻訳されないＤＮ Ａ配列に関係する。プロモータを含む５′フランキング領域と、遺伝子に関係す る３′フランキング領域は、遺伝子座として関係する。

“遺伝早開配列”という用語は、暗号領域に関係しない遺伝子座間の間隔を置い た配列に関連して用いられ、日常会話的には、“ジャンク”と呼ばれる。

ここで用いられる、“増幅したＤＮＡ配列”という用語は、ＤＮＡ配列とその相 補的塩基配列の一部のコピーであるＤＮＡ配列に関係し、そのコピーは、ヌクレ オチド配列内で、元のＤＮＡ配列とその相補的配列に相当する。

ここで用いられる“相補“という用語は、特定のＤＮＡに相補的であるＤＮＡ配 列に関係する。

ここで用いる“プライマー部位“という用語は、プライマーがハイブリダイズす る標的ＤＮ’Ａの面積に関係している。

ここで用いる“プライマーペア”という用語は、プライマーのセットを意味し、 増幅されるべきＤＮＡ配列の５′末端とハイブリダイズする５′上流プライマー 及び増幅されるべき配列の３′末端の補体とハイブリダイズする３′下流のプラ イマーを含んでいる。

ここで用いる“エクソン限定プライマー″という用語は、イントロンの保護部分 にあるエクソンの内部または丁度外側に位置したプライマーを含むプライマーベ アを意味しており、このプライマーは、エクソンまたその一部を含むＤＮＡ配列 を増幅し、隣接したイントロンの小さなパラ−エフソニック領域よりも大きくな い。

ここで用いる“イントロンースパンニングプライマー”という用語は、少なくと も一つのイントロンの一部を増幅するプライマーペアを意味し、増幅したイント ロン領域は、保護されない配列を含んでいる。イントロンースパンニングプライ マーは、イントロンの保護領域内または、隣接した上流及び／または下流エクソ ン配列内に位置することができる。

ここで用いる“遺伝床“という用語は、上流または下流に転写された非暗号領域 及び関係した調整領域を含む蛋白質を暗号化した遺伝子を含むゲノムＤＮＡの領 域を意味する。従って、ＨＬＡ遺伝子座は、ＨＬＡ遺伝子産物を暗号化する遺伝 子を含むゲノムＤＮＡの領域である。

ここで用いる“隣接遺伝子座”という用語は、（１）ＤＮＡ配列が位置する遺伝 子座あるいは（２）遺伝床に関係しないイントロンＤＮＡ配列として最も近い上 流または上流の遺伝床に関する。ここで用いる“遠位遺伝子座”という用語は、 （１）ＤＮＡ配列が位置している遺伝子座から上流または下流にある遺伝子座あ るいは、（２）遺伝床に関係しないイントロン配列として、イントロン配列に最 も近い上流または下流の遺伝床からの上流また下流の遺伝子座に関する。

ここで用いる“遺伝子座−特異的プライマー”という用語は、一定の遺伝子座の 一部またはその相補的績と特異的にハイブリダイズし、そして増幅法に用いられ る条件下で他のＤＮＡ配列とはハイブリダイズしないプライマーを意味する。遺 伝子座−特異的プライマーベアは、遺伝床の大部分の対立遺伝子にまたは、遺伝 子座のすへての対立遺伝子に存在する増幅ＤＮＡ配列を限定する。

遺伝子座−特異的プライマーベアは一つの遺伝子座−特異的プライマーを含む。

ベアの他のプライマーは、様々な遺伝床に共通であることができ、あるいはまた 、遺伝子座−特異的プライマーであることができる。

ここで用いる“配列−特異的プライマー”　（Ｓ　Ｓ　Ｐ）という用語は、遺伝 床の１つまたはそれ以上の対立遺伝子中にあるいはそれらの相補的績に存在する が、遺伝子座のすべての対立遺伝子には存在しない配列多望と特異的にハイブリ ダイズするプライマーを意味する。ＳＳＰは、増幅法に用いられる条件下で、配 列多望を含まない遺伝床の対立遺伝子とはハイブリダイズしない。配列−特異的 プライマーベアは、遺伝床の多くの対立遺伝子中には存在するが、遺伝子座のす べての対立遺伝子中には存在しない増幅されたＤＮＡ配列を限定する。配列−特 異的プライマーペアは、１つの配列−特異的プライマーを含む。ベアの他のプラ イマーは、遺伝座として、様々なプライマーペアに共通であることができるし、 あるい′はまた、配列−特異的プライマーとして対立遺伝子の同じ群に対して特 異的であることができる。

ここに用いる“対立遺伝子−特異的プライマー“に、あるいはその相補的鎖に存 在し、遺伝子座の他の対立遺伝子には存在しない配列多型と特異的にハイブリダ イズするプライマーを意味する。ＡＳＰは、増幅法に用いられる条件下で、遺伝 座の他の対立遺伝子とはハイブリダイズしない。対立遺伝子−特異的プライマー ペアは、遺伝座の１つの対立遺伝子中に存在し、遺伝子座の他の対立遺伝子中に 存在しない増幅されたＤＮＡ配列を限定する。対立遺伝子−特異的プライマーペ アは、少なくとも１つの対立遺伝子−特異的プライマーを含む。他のプライマー は、多数の対立遺伝子に共通であることができる。

ここに用いる“ハブロタイブ−特異的プライマー”（Ｈ３Ｐ）という用語は、遺 伝座及び１つまたはそれ以上の隣接した遺伝子座に関係する１つのハブロタイブ 中に、あるいはその相補的鎖に存在するが、遺伝子座に関係する他のハブロタイ ブ中には存在しない配列多型と特異的にハイブリダイズするプライマーを意味す る。

Ｈ３Ｐは、増幅法に用いられる条件下で、遺伝座の他のハブロタイブとはハイブ リダイズしない。ハブロタイブ−特異的プライマーペアは、遺伝座に関係する１ つのハブロタイブ中に存在し、遺伝子座に関係する他のノ１プロタイプ中に存在 しない増幅されたＤＮＡ配列を限定する。

ハブロタイブ−特異的プライマーペアは、少なくとも、１つのハブロタイブ−特 異的プライマーを含む。他のプライマーは、遺伝座及びその隣接した遺伝子座に 関係する多数のハブロタイブに共通であることがてき、あるいはまた、ハブロタ タイプー特異的プライマーであることができる。

ここに用いられる“エンドヌクレアーゼ”及び“制限エンドヌクレアーゼ”とい う用語は、特別なヌクレオチド配列をもつ二重鎖ＤＮＡを切断する酵素に関係す る。

多くのエンドヌクレアーゼの特異性はよく知られ、色々な出版物にみることがき る、たとえば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｂｙ　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ。

Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２．その マニュアルは、文献として、そのすべてをここに編入しである。

ここで用いられる“制限酵素切断片長冬型（またはＲＦＬＰ）という用語は、＃ ＩＦ！！エンドヌクエアーゼで分割される時、異なった長さの切断片を生産する ＤＮＡヌクレオチド配列における違いに関係する。

ここで用いられる“ＨＬＡ　ＤＮＡ”という用語は、ＨＬＡ抗原を暗号化する遺 伝子を含むＤＮＡを意味する。

ＨＬＡ　ＤＮＡは、すへての存核ヒト細胞中に見出される。

非暗号配列変異の分析 ＨＡＬ遺伝子コンプレックスの遺伝子座における非暗号配列変異の研究から、多 型変異のステラ−配列は、このコンプレックスの遺伝子座の進化を見分け、また 、近接して連鎖した遺伝病遺伝子座と独得のＨＬＡハブロタイブの間の連鎖不平 衡を調べるために用いることができることが明らかになった。大部分の遺伝子座 は、多型変異が最大であるＨＬＡコンプレックスのそれよりも、もっと保護的で ある。これは、はとんどの遺伝子座の保護が生存のために必要であるからである 。そこで、ＨＬＡ領域は、各遺伝子座内の対立遺伝子変異の分析の手がかりとし て、ゲノムを通じて多型現象の模範例として利用できる。連鎖不平衡は、多くの 世代を通して、近接染色体領域の相互分離を反映している。連鎖不平衡は、異な った染色体上の、あるいは離れた染色体領域の遺伝子のランダムな分離を反映し ている連鎖平衡の逆の極端である。各遺伝子座でのかなりの対立遺伝子変異は、 ！またはそれ以上のメガベースを超えた連鎖領域での遺伝子座の対立遺伝子間の 重要な連鎖不平衡を検出することにより高解像力をもった連鎖地図を作成する上 で、近接遺伝子座における多型現象の分離の評価に用いることができる。

先行技術は、背景の項目て述へたように、ヒトの家系における他の連鎖した冬型 遺伝子座または、遺伝子の相互分離の頻度を調べるのに、冬型遺伝子座か用いら れる多くの事例を述へている。多型現象か用いられるすべての事例で、本発明の 非暗号配列変異の分析を適用することができる。高率で変異しうる対立遺伝子を もつＨＬＡ領域での適応性は、他の非暗号遺伝子配列が、情報供与型になり、そ して各遺伝子座における情報供与交配の数の増加に比例してそれぞれの分析方法 の力が増加するようになることで実証されている。

例えば、制限酵素によって同定される３以上の対立遺伝子をもつＲＦＬＰはわず かである。６以上の対立遺伝子をもつＲＦＬＰは、はとんどすべての交配におい て情報を供与し、これらの遺伝子座は、染色体全体にわたって他の制限酵素に対 し、アンカーポイントとして役立つようになる。それぞれのアンカーポイントは 、フランキング多型対立遺伝子から得た情報を増加させる。何故ならば、これら の情報の少ない位置は、アンカーポイントのようにひんばんにお互いに比較出来 ないからである。

本発明のマーカ一部位は、努力しないで、より迅速に試験することかできる多く のアンカーポイントを与えるだろう。

アンカーポイントは、定義上、介在配列によってつなぎ合されたエクソンを意味 する。染色体に偏在したｃＤＮＡクローンから極めて容易に引き出すことができ る。プライマーは、ｃＤＮＡの異なった領域で合成することができて、異なった イントロン内の対立遺伝子変異を試験するため非暗号配列の増幅に用いられる。

２ｋｂより小さなイントロンは、もっとも容易に増幅される。

復帰遺伝計画が動物プロット、ｃＤＮＡのライブラリーのスクリーニングにより 、あるいは、クローニング制限部位によって、推定遺伝子を分離するとき、遺伝 子配列は、拳法を用いて多型現象について分析し、試験することができる。

同様のあるいはもっと大きいレベルの変異は、遺伝子開領域で発見させる。これ は、これらの領域では、活性遺伝子の場合よりも、選択的圧力が維持されにくい ためである。従って、これらの配列はまた、本発明のマーカーの位置決定のため に用いることができる。

より特異的なこととして、本発明の方法と試薬を用いて、遺伝座及び遺伝早開配 列に関係した非暗号配列変異の２種類の型が発見された。第１は、対立遺伝子関 連の変異である。すなわち、非暗号配列変異のパターンは、近接遺伝子座におけ る対立遺伝子型に関連する。第２の変異の望は、離れた連鎖遺伝子座（ハブロタ イブ）に関連したサブ対立遺伝子変異である。すなわち、配列変異は、同じ対立 遺伝子をもった個体のサブ集団に存在する。

このサブ対立遺伝子変異は、離れた遺伝子座（ハロタイプ）における対立遺伝子 と関係がある。このようなハブロタイブの相違は、同じハロタイプをもつように 特徴づけられた配列間に生ずると思われる。このような個体限定的または個体特 異的変異は共通的なものではない。

さらに、十分な非暗号配列、好ましくは、イントロン配列を含む増幅ＤＮＡ配列 は、サンプルのＤＮＡ中に存在する、対立遺伝子／ハブロタイブに関連した配列 に依存して変化するだろう。すなわち、非暗号配列、特にイントロンは、近接し たあるいは離れた遺伝子座における対立遺伝子に関連した遺伝子変異（たとえば ；制限部位の数または位置の変化または挿入に起因するゲル電気泳動の長さの多 型現象、電気泳動移動度に影響する欠失及びまたは配列置換を含んでいる。

これらの非暗号配列変異パターンは、配列情報がおよそ２００から５００ｂｐで ある所ならばどこでも発生させることができる。特に、ｃＤＮＡ遺伝子配列内、 ＳＴＳ部位内及び既知の古典的ＲＦＬＰ部位内であれば発生させることができる 。これらの位置の中で、最も望ましいのは、遺伝子内のイントロン変異部位の発 生である。クローン遺伝子の数は１９８９年に９４５を示しており、従って多く の遺伝子座を用いることができる。さらにゲノムの領域が特別に興味のあるもの であれば、領域内の追加遺伝子を同定する技術がある。たとえば、遺伝病遺伝子 座が、３またはそれ以上のＬＯＤ評点（およそ２０遺伝子を含むＤＮＡのおよそ １メガベースの領域）をもつ独得の染色体領域にマツプされた場合には、先行技 術のどれでも：たとえば、エクソントラッピング及び動物プロット分析を領域内 の追加遺伝子の同定に用いることかできる。領域内での追加の遺伝座かいったん 同定されれば、新たに同定される遺伝座の他のイントロン変異マーカーは、後で 述べるように開発することができる。

前に述べたように、これらの多型変異パターンは、どの遺伝座についても容易に 同定することができる。さらに、そのパターンは容易に生産され、迅速なスクリ ーニングのために分析される。加えて、そのパターンは、高度の情報供与型であ るので、スクリーニングによって、古典的なＲＦＬＰ部位よりもはるかに多くの 情報が与えられる。この組合わせは、疾病に関係した遺伝子座の迅速なマツピン グのためには、イントロン変異パターンを理想的なマーカーとしている。

特に、ゲノムマツピング計画の目標の１つは、ゲノム全域に、厚い、均等にひろ がったマーカーを生産することである。先に述べたように、マーカーの有効性は 、直接、マーカーの多型現象の程度に関係している。

拳法によって発生したイントロン変異パターンは、このプロセスを容易にするた めに用いることができる。特に、増幅したイントロン配列は、ゲノム探索上、情 報の少ないマーカーを用いる先行技術よりも、さらに濃厚で情報の豊富な物理的 遺伝的地図を発生させることができる。本発明による、独自の遺伝領域からのイ ントロンを含む増幅ＤＮＡ配列は、遺伝子座に関する対立遺伝子とハロタイプ情 報を直接与えるような、容易にスクリーニングされ、しかも極めて情報供与型の マーカーを提供する。容易にスクリーニングされかつ高度に情報的であることに 加えて、イントロン変異パターンは、古典的なＲＦＬＰのパターンよりも早く発 生し、得点し、費用か安い。最も多くの情報を最も短い時間で、最少の費用で提 供しつるのは特別価値のあることである。ゲノムが現在の推定よりは大きくなる 可能性、また、莫大な費用とゲノム計画の限られた資金を考えると、より多くの 情報を短時間に提供する拳法の利用は特に有益である。これに加えて、遺伝子は 、経験に基づいて決定されたＲＦＬＰ部位よりは、もっと均一に、染色体の長さ に沿って分布しているものと予想される。

ヒトゲノム全体には、５０．０００遺伝子があるだろうと推定されている。遺伝 子配列のマツピングや研究の初期の活動を集約してみると、遺伝早開配列よりは むしろ、はるかに多くの疾患遺伝子候補が、遺伝病分野に台頭してきたようにみ える。

遺伝子は、ゲノムのおよそ２％に相当すると推定され一部として遺伝子を同定す るのは有効な初期のアプローチである。本発明の多室性マーカ一部位は、既知の どの遺伝的座にも作ることができる。

遺伝子中の配列多望性パターンを同定することに加えて、少なくとも２００、望 ましくは少なくとも５００ｂｐの配列情報のある、どんな他の領域もまた、領域 に関係した対立遺伝子／ハブロタイブを同定するパターンを作る増幅ＤＮＡ配列 を生産するためのマーカ一部位として利用することができる。先に述べた通り、 多望性パターン部位の位置決定の際に、遺伝座、ＳＴＳ、あるいはＲＦＬＰ部位 のどれでもマーカーを与えるのに使用することができる。本発明の非暗号多室性 変異パターンは、古典的なＲＦＬＰ分析に比較して、限定された費用とスクリー ニングに要する時間の見地から、ＳＴＳ部位でのゲノム全域に繰返されるＣＡ及 びＧＡのためのスクリーニングと少なくとも同じように有効である。さらに加え て、本発明の多型変異パターンは、分離されたｃ　ＤＮＡが同じ染色体領域にマ ツプされたそのマツピング技術で、ＲＦＬＰ部位を置換することかできる。先行 技術のマツピングや連鎖分析方法を使用し、より多くの情報をもつ多望性マーカ ーが提供されることに加えて、領域に関するハブロタイブパターンは、以下に述 べるように、ハブロコンティグ地図の作成に使用することができる。

領域についてのハブロタイブが一度決定されると、最初の遺伝子座から離れた領 域（およそ０．Ｏｌから２ミリオン塩基対（Ｍｂｐ　）のへだたり）のハブロタ イブは、同じ方法で分析される。

分析されるべき次の領域は、以前の遺伝子座に共有されるＰＤＬＰあるいはＲＦ ＬＰパターンによって特徴づけられたいくつかのハブロタイブパターンを与える ために、十分に近接していることが望ましい。すなわち、隣接する遺伝子座にお いて、いくつかの同じハブロタイブのパターンがあるだろう。与えられた位置で のハブロタイブパターンの分析によって、遺伝座とハブロタイブの位置が同定さ れる。この同定は、連鎖遺伝子座とハブロタイブの領域の境界を位置決定するこ とができる。この方法で、接触し重なり合ったハブロタイブの領域（ハブロコン ティグ）は地図が作れるように分析される。

特別な個体群のためのイントロン変異のパターンの分析は、群のメンバーに存在 する遺伝子座において、対立遺伝子とサブタイプのあるいはサブ対立遺伝子群（ ハブロタイブ）の両方を同定することかできる。ヒトでは民族の差異を、動植物 では種属の違いを最大限に代表する個体群を分析することによって、遺伝子座の 最も共通した対立遺伝子／ハブロタイブの特徴をもったパターンを識別すること ができる。対立遺伝子とハブロタイブのパターンの追加分は、より大きな集団の スクリーニングによって同定することができる。このようにして、興味ある遺伝 子座に関係した対立遺伝子／ハブロタイブでの多型現象の程度が、多くの個体の 反復配列を行うことなく決定することができる。

地図の作成よりもむしろ、ハブロタイブパターンは、興味ある遺伝子の方向を同 定するために用いることかできる。このような遺伝子には、疾病関係遺伝子、ま た動植物では、商業的に望ましい特性をもつ遺伝子座か含まれる。たとえば、疾 病、特に−遺伝子病をもった患者のハブロタイブのパターンの分析は、すべての 遺伝子座で、このような患者の対立遺伝子／ハブロタイブの特徴をもったパター ンを生ずる。そこで、遺伝子座からの遺伝子に関係ある病気の方向を決定するこ とかできる。特に、与えられた遺伝子座における特別な特性に関係した多型現象 の程度を分析することによって、特性に関係した遺伝子座（遺伝子座−指向型ハ ブロタイピング）の位置の末端小粒あるいは動原体の方向を同定することができ る。

すなわち、特性をもつ個体の遺伝子座に関係した多型現象（ハブロタイブの数） の程度か減少すれば、遺伝子座は興味のある遺伝子に、より近接している。特性 に関係した遺伝子座は、最高程度のハブロタイブ異種制限を示すだろう。逆に、 特性に関係した遺伝子座から１つが動けば、特性をもつこれらのハブロタイブの 数は、特性をもつ遺伝子が、特性を持たない遺伝子と同じハブロタイブを持つで あろうその遺伝子座から、特性に関係した遺伝子が離れるまで増加する。

ある場合には、次に分析した遺伝子座が、最初に試験した遺伝子座とパターンを 共有しないことがある。次の遺伝子座におけるハブロタイブのパターンか、前の 遺伝子座パターンと両立しない時、組換えによって、組換えの位置の両側の対立 遺伝子を含む新しいハロタイプが結果的に発生するか、あるいはまた、ハブロタ イブの領域の境界が交差した。すなわち、第２の遺伝子座は組換えの位置の他の 一方の側にある。この現象は、組換えホットスポットの周辺で最もひんばんにみ られる。このような遺伝子座は、試験した２つの遺伝子座の間の中間にある別の ハブロタイブの領域の存在により分離されるかも知れない。評価された遺伝子座 の間の中間にあるＤＮＡ配列は、そこで、ハブロタイブの領域の境界を決定する ために、あるいは、ハブロタイブに関係した遺伝座の各各の位置決定のために分 析することができる。

ハブロタイブの領域の位置が−たび設定されれば、各境界内の遺伝座また望まし くは、１つの中心遺伝子座を評価することができ、これにより、各遺伝子座及び 隣接遺伝子座における対立遺伝子の数を決定することができる。この評価で、ハ ブロタイブ領域の各遺伝子座の共通対立遺伝子により生産される遺伝的変異パタ ーンを決定することができる。

同じ方法で、染色体の隣接領域を評価することにより、マツピング方法は、染色 体の選択された領域での重なり合ったハブロタイブの領域（ハブロコンティグ） を決定し、またゲノム全域にわたりハブロタイブの領域を設定することができる 。

別の観点で、マツピング法は、興味のあるゲノム領域に関係した多型現象の程度 に関する情報を提供する。多くの個体からのＤＮＡの分析によって、興味ある領 域に関係した多くの対立遺伝子とハブロタイブを決定することができる。分析に よって生じたＰＤＬＰ及びＰＦＬＰパターンは、もっと数か多く、古典的方法で 位置決定されたＲＦＬＰ部位よりももっと遺伝座に近く連鎖される。

これは、本性が、増幅ＤＮＡ配列中のすべてのＲＦＬＰ部位を有効に利用するこ とができるからである。対立遺伝子／ハロタイブー特異的増幅は、遺伝子座を迅 速にスクリーンするには最も好ましい分析法である。しかしながら、この方法は 、その実施に先立って、ＰＤＬＰまたはＲＦＬＰ技術よりももつと多くの配列情 報が必要である。

遺伝的に全く異質の個人間の配列比較が、最小配列を可能にする。この方法で、 非相同領域を同定することができ、制限分析あるいはＡＳＰ　ＨＳＰ増幅のため の合理的な位置の選定が可能である。それから、集団における特別な変異のパタ ーンに関係した追加個人が配列に先立って同定される。この分析法は同しハブロ タイブにより、個体の重複配列を除く。興味ある遺伝座の配列に先立って、遺伝 子座に関連した対立遺伝子とザブ対立遺伝子ハブロタイブのパターンか決定され る。特別なサブ一対立遺伝子ハブロタイブのパターンをもつ１個体のみが配列さ れる必要がある。しかしながら、選択した配列が、個体の変異を代表するよりは むしろ、ハブロタイブの代表であることを確認するため、２個または３個の個体 の配列か望ましい。この方法て、特徴的なサブ一対立遺伝子（ハブロタイブの） 群と共に、ハブロタイブの領域におけるすべての共通の対立遺伝子を同定し、配 列することができる。さらに、まれな遺伝病に関係した個体のような、比較的ま れなハブロタイブをもつ個体は、病気をもつ個体のハブロタイブのパターンを直 接評価することによって認識することができる。

特に、病気に関係した対立遺伝子とハブロタイブは、特別な病気をもった患者の 対立遺伝子／ハブロタイブ異種の制限によって明らかにされる。すなわち、特別 な病気をもつ患者は、一般集団に存在する対立遺伝子／ハブロタイブはほんのわ ずかしか持たないだろう。たとえば、ＤＲＢ／ＤＱＡ／ＤＱＢ遺伝子座の対立遺 伝子から成る１００ＨＬＡハブロタイブより大きなもののうち、ハブロタイブの およそ３０のみが糖尿病に関係している。これら３０のハブロタイブの中、わず か５または６のハロタイプのみか、中国人及びコーカサス人の初期発病に関係し ている。

すべての遺伝的座に対する個体変異の分析は一遺伝子疾患に関係した、これまで 認知されなかった遺伝子座を同定することができる。遺伝子座は、病気に関係し た遺伝子に非常に強く連鎖されると思われるので、遺伝子座と病気に関係した遺 伝子間の組換えはみられないだろう。

さらに、病気に関係したハブロタイブは制限されるだろう。すなわち、正常な集 団内に存在する限られた数のハロタイプのみはまた、病気をもつこれらの患者の 中に存在しうる。

多重遺伝子疾患に関係した遺伝子の同定と分析は、同じ方法で行われる。特徴と して病気に関係するハブロタイブはまた、病気をもつ患者の中で、病気に関係す るそれぞれの遺伝子座で制限されるだろう。

増幅ＤＮＡ配列の位置決定 イントロン配列に相当するおよそ２００から５００ｎｔを含む増幅ＤＮＡ配列は 、特に、若し介在配列が遺伝子座の変異性のエクソンに隣接している場合には、 その介在配列に関係する対立遺伝子を特徴づけることに用いることができる。さ らに、およそ２００から２０００ｎｔ。

好ましくは４００から５００ｎｔを含む増幅ＤＮＡ配列、これは遺伝座に関係す る非暗号配列に相当し、好ましくは、遺伝早開配列に相当するか、ハブロタイブ の特徴である対立遺伝子のサブタイプのパターンを反映している。

従って、遺伝子に関係する非暗号配列、好ましくはイントロンに相当する増幅Ｄ ＮＡ配列は、隣接した遺伝子座と離れた遺伝子座の対立遺伝子を分析するために 生産される。

増幅ＤＮＡ配列は、プライマー部位を選別するために十分な配列情報がある領域 に位置決定される必要かあるだろう。病気に関係する遺伝子として、しばしば病 気に相互に関連するＲＦＬＰ部位をとりまく領域の配列が知られている。それと は別に、興味ある遺伝子は、別の遺伝的座の近くに位置決定されることを知るべ きであろう。

さらに、もしそれ以上の情報が利用できなければ、ゲノムマツピング計画のため に特徴づけられるＳＴＳ部位か、およそ、４００から５００ヌクレオチドの配列 情報を含んでいるので利用することかできる。

ゲノムＤＮＡ配列が利用される時、プライマーは、遺伝早開配列に相当する増幅 ＤＮＡ配列を生産するよう位置決定される。もしも、遺伝子座として、変異性エ クソンの配置が知られているならば、増幅ＤＮＡ配列は、変異性エクソンに隣接 したイントロンに位置決定されることが望ましい。さらに望ましくは、増幅ＤＮ Ａ配列が、変異性エクソンに及び、その一部を含め、望ましくはその大部分を、 最も望ましくは、隣接したイントロンの両方すべてを含むことであろう。

ｃＤＮＡ配列だけが利用でき、配列内のイントロンの位置が確認されない時、プ ライマーが、およそ２００ｎｔの間隙で選別され、ゲノムＤＮＡの増幅に使用さ れる。

もし、増幅した配列がおよそ２００ＪＩｔを含むならば、最初のプライマーの位 置は、およそ２００ｎｔはと第２プライマーの一方の位置に動かされ、（１）期 待より大きな増幅ＤＮＡ配列が生産されるまで、あるいは（２）増幅ＤＮＡ配列 が生産されず、増幅法としては大きすぎる遺伝子面配列の存在が示されるまで増 幅が繰返される。どちらの場合でも、イントロン配列の位置は決定された。

プライマーがイントロンに及び、増幅ＤＮＡを生ずる時、プライマーは、多くの 個体のＤＮＡについて分析操作を開始するために使用することができる。増幅Ｄ ＮＡ配列が生産されない時、プライマーによって限定されるイントロン配列は大 きすぎるかも知れない。別のインドロン配列を位置づけることができるか、前に 述べたように、あるいは、イントロンの一部分に相当する配列を生産するために 、アンカーの、一方向だけの増幅を行うことができる。これらのＤＮＡ配列、あ るいはその一部は、分析用として増幅ＤＮＡ配列を限定するために、イントロン 配列内で第２プライマー部位を位置決定するために配列させることができる。

増幅されるべき領域内でイントロンとエクソンの配列（またはエクソン配列とエ クソン−イントロン接続点の位置）が知られている時、増幅ＤＮＡ配列は、エク ソン配列よりはむしろ、はとんどのイントロンを含むように限定される（プライ マー部位の位置の選択により）。プライマー選択と作成方法は、ＤＮＡ増幅法と 同様によく知られており、詳細をここに述べる。

イントロン配列を含む増幅ＤＮＡ配列が一度生産されると、多くの個体から、相 当する増幅ＤＮＡ配列を作るためにプライマーが用いられる。遺伝子座に関係す る対立遺伝子とサブ対立遺伝子の遺伝的相違を実証する分析法を選択するために 、いくつかの制限エンドヌクレアーゼを用いて、配列の大きさと断片のパターン を調べることができる。エンドヌクレアーゼと生産物の選択及びＲＦＬＰパター ンの分析はよく知られており、詳細をこドヌクレアーゼ結合が選択されると、お よそ１００個体のＤＮＡが増幅され、配列（断片）の長さが決定されるだろう。

配列の長さは、その増幅配列のための個体の対立遺伝子／ハロタイプに関係した パターンになるだろう。

各染色体領域につき、領域に関係する各対立遺伝子／ハロタイプを決定するため 、領域に沿った色々な点で、増幅した配列が作られるだろう。ヒトゲノムの１つ のハロタイプの領域に見出される対立遺伝子／ハロタイプの典型的な識別は、Ｄ ＲＢ／ＤＱＡ／ＤＱＢ遺伝子座の既知のＨＬＡハロタイプの３５の確認である。

その分析は、例として詳細に述べられている。例からすぐに分るように、まれな ハブロタイブに関係する新しいパターンあるいは、他の集団群に関係するハロタ イプは、分析を行うことで容易に同定することができる。

遺伝病に関係する遺伝子の探索で、遺伝子を含むＤＮＡ領域に関係する３０から ４０のへロタイブが認められる。病気によるこれらの配列変異は、病気個体群の 相当なパーセンテージ（約７０％）を数える病気に関係したハブロタイブの、か なり小さな数（３から８）に制限されるだろう。これらのハブロタイブは、増幅 と分析の上で、異なったパターンを生成する。病気をもった２０から１００の比 較的小さな数の個体からのＤＮＡは迅速に増幅し、消化しそして分析することが できる。パターンは、遺伝子座の対立遺伝子の変異数に依存し、３から８群にな るだろう。それぞれの対立遺伝子群からのＤＮＡのただ１つの代表サンプルだけ が配列のために必要である。そのサンプルが代表的なものであることを確認する ため、２つまたは３つのサンプルが配列されることが望ましい。この方法で、配 列前に、異なったハブロタイブ関連の対立遺伝子をもつこれらの個体を決定する ことができ、最も普及している反復配列を避けることができる。

たとえば、嚢脆性繊維症（ＣＦ）は、常染色体性劣性遺伝病で、各染色体上に突 然変異遺伝子の存在が必要である。ＣＦは、コーカサス人では最も普通の遺伝病 で、２０００人の出生に１人か発生する。４０人のコーカサス人の中の１人はこ の病気の保菌者と推定されている。

最近、予測した１４８０アミノ酸ポリペプチドの位置５０８におけるフェニルア ラニン残基を不全に導く推測ＣＦ遺伝子の読み取り枠で３個の連続した塩基対の 特定の欠失が報告された（Ｋｅｒｅｍ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２４５　 ：１０７３−１０８０　（１９８９））。ハブロタイブ分析に基づき、この欠失 は、北ヨーロッパ人にある（約６８％）大部分のＣＦ突然変異にその原因が帰せ られるよってある。第２の突然変異は、伝えられる所ではある南ヨーロッパ人に ゆきわたっている。追加データでは、いくつかの他の突然変異もこの病気の原因 になっているかも知れないことが示されている。

ＣＦ患者（必然的に１人は正常、１人は病気に関係したハブロタイブ）の両親の ハブロタイブの研究では、ＣＦ遺伝子座に関係する、すくなくとも１７８ノ＼プ ロタイプがあることが示された。これらのハブロタイブの中、９０だけが病気に 関係し；７８だけが正常人に見出され；そして１０は、病気と正常の両方に関係 している（Ｋｅｒｅｍ　ｅｔ　ａｌ、　５ｕｐｒａ）　ａ病気は明らかに、イ＜ ツかの異なる突然変異が原因であり、あるものはヒトには極めて頻度か低い。ハ ブロタイブ情報で実証されたように、病気の原因になるのは、突然変異の対立遺 伝子であるよりは、遺伝子座に関係するハブロタイブである方が多い。

本法は、遺伝子座に関係するハブロタイブを決定し、病気−関連遺伝座に関係す ると現在認められている１７８のハブロタイブの中のハブロタイブを検出するこ とができる。病気に関係する追加のハブロタイブは、本発明の方法により、多く のＣＦ患者のＤＮＡを迅速に分析して容易に決定される。

さらに、非暗号調節領域に関係すると思われる突然変異もまた、本法で検呂する ことができ、スクリーニング操作で確認されるだろう。

病気の原因になる暗号領域でのそれぞれの欠失を決定しようと試みるよりもむし ろ、本法は、遺伝子座に関係するイントロン配列を増幅して、対立遺伝子及びサ ブ対立遺伝子のパターンを識別する。イントロン配列によって生じた新しいＰＤ ＬＰ及びＲＦＬＰパターンは、これまで認められなかったハブロタイブの存在を 示している。

プライマーの選択、増幅方法及びＤＮＡ配列の分析は以下に示す。これらの技術 は、最初に、遺伝子座に関係する通常の対立遺伝子／ハブロタイブによって作ら れるパターンを決定するのに使用される。いったん通常のパターンが設定されれ ば、そのパターンは、遺伝子座に関係する追加のハブロタイブを見分けられるよ うに精製される。この追加された特性によって、新しいハブロタイブが容易に識 別されるようになる。この完全な特性は、遺伝病に関係した遺伝子座にとって、 また、ＨＬＡ遺伝子座のような、その他の医学的に重要な遺伝子座にとって特に 価値あるものである。しかしながら、ある遺伝子座については、数百の個体の分 析で、遺伝子座に関係するわずか１つか２つのハブロタイブしかないことが実証 されるだろう。このような小さな数は、領域に関係するハブロタイブの数が限ら れていることを示している。他の１００個体の分析で、さらに１つか２つのハブ ロタイブを追加されるだろう。多くの他の個体からのＤＮＡは、低頻度のハブロ タイブの検出のために分析される必要がある。それ以上の特性は、すべてのこの ような遺伝子座にとって望まれないだろう。

増幅されたＤＮＡ領域内には、検出することが出来る３つの主な遺伝子変異の型 があって、対立遺伝子とサブ対立遺伝子群を同定するために用いられる。これら の変異は、検出の楽な順から云えば、（１）配列の長さの変化、（２）すくなく とも１つの制限部位の存在または位置の変化、そして（３）制限部位に変化をも たらさない１個または２．３個のヌクレオタイドの置換である。増幅されたＤＮ Ａ配列内での他の変異も、また、検出可能である。あるいは、遺伝子座について の十分な配列情報が、−たび展開されれば、対立遺伝子／ハブロタイブ−特異的 増幅が、当の遺伝子座に関する多くの追加個体のＤＮＡの解析を行うことができ る。対立遺伝子／ハブロタイブ特異的増幅は、対立遺伝子／ハブロタイブの特性 であるプライマー部位の選択に基づいている。

変異の検出には４つの型の技術が用いられる。第１は、増幅されたＤＮＡ配列の シーフェンシングである。シーフェンシングは、最も時間を消費し、また、増幅 された配列中のどの型の遺伝子変異も検出するので、最も分析法が明らかにされ る。第２の分析法は、対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドまたは、配列−特 異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯまたはＢＳＯプローブ）である。プロ ーブは、変異部位の正確な配列が知られる限り、遺伝変異のどの型でも、その結 果上ずるシングルヌクレオチドの変化を検出することができる。第３の分析方法 の型は、異なった長さの配列（すなわち、ヌクレオチドの挿入／欠失による、移 動度を変えるヌクレオチドの置換によるあるいは、制限部位の位置の変化による ）そしてまたあるいは、配列の異なった数（制限部位の獲得または欠失による） を検出する方法である。好ましい、長さの差異検出法は、ゲルまたはキャピラリ ー電気泳動法である。制限部位の変化に伴う断片の長さまたは数の変化を検出す るため、増幅された配列は、断片の長さのパターンの分析の前に、適当な制限エ ンドヌクレアーゼで消化されなければならない。

第４のそして最も望ましい型の分析法は、選択された対立遺伝子／ハブロタイブ の存在を検出するため、対立遺伝子／ハブロタイブ−特異的増幅に基づくもので ある。

第４の方法で、遺伝子座−特異的増幅ＤＮＡ配列は、選択された対立遺伝子／ハ ブロタイブにとって特異的な一組のプライマーベアて増幅される。プライマーベ アにより、増幅されたＤＮＡ配列の生産物は、対立遺伝子／ノ１プロタイプの存 在を示す。本性のより好ましい具体例として、それぞれの組合わされた増幅は、 増幅されたＤＮＡ配列の存在か対立遺伝子／ノ＼プロタイプの存在を示すように 、分離した増幅反応混合器の中で行われる。

各プライマーベアは、異なった長さの増幅されたＤＮＡ配列を生産し、こうして 出来た増幅ＤＮＡ配列の長さは、対立遺伝子／ハブロタイブの存在を確認するた めに決定されることが望ましい。

分析技術は、増幅されたＤＮＡ配列の中の、対立遺伝子に関係した遺伝変異を確 認するために用いられるけれども、プローブまたは増幅されたＤＮＡ配列のシー フェンシングの利用を含めることができる。これらの方法は、病気に関係した対 立遺伝子の識別のような、特別の利用法に限定する方が望ましい。はとんどの場 合、初期分析は、増幅されたＤＮＡ配列の使用をベースとし、また、その後の分 析は、（１）増幅されたＤＮＡ配列と、対立遺伝子／ハブロタイブの相互関係、 （２）対立遺伝子／ハブロタイブに相関するＲＦＬＰパターンの生産あるいは（ ３）増幅されたＤＮＡ配列の生産物が、選択された対立遺伝子／ハブロタイブの 存在を示すような配列−特異的増幅、のいづれかに基づいて行われる。しかしな がら、シーフェンシングまたはプローブの使用は、いくつかの遺伝領域で好まし い分析方法であると云えよう。

本発明の方法は、ゲノムＤＮＡの選択されたイントロン領域の増幅に基づいてい る。その方法論は、興味ある遺伝的座についての、その他の遺伝的座は関係なく 、複数の対立遺伝子に関係するゲノムＤＮＡを選択的に、独自の保護領域にハイ ブリダイズすることをプライマーの使用によって促進することにある。

このようにして、プライマーがハイブリダイズする部位は、マツプされるべき範 囲内で、保護領域に選択される。保護領域は、すくなくとも２個体からの配列に 基づいて決定される。もし、それ以上の配列情報が利用できなければ、制限部位 、クローン配列ＳＴＳ部位を作る保護領域、あるいは、領域を画くのに用いられ る他のマーカーを用いることかできる。

ゲノムＤＮＡが利用できる時、プライマーは、イントロン内の保護領域に位置す ることが望ましい。利用しうる配列がｃＤＮＡ配列だけである時、プライマーは 、工クソン内の保護領域に位置決定される。もし、ｃＤＮＡ配列内のイントロン とエクソン配列の接続点が知られているならば、プライマー部位は、これらの接 続点の近くに位置することが望ましい。

遺伝子座−特異的プライマーベアは、増幅されたＤＮＡ配列の５′末端を、増幅 されるべき標的配列の５′末端にハイブリダイズするように定められた５′上流 プライマーと、また、増幅されたＤＮＡ配列の３′末端を、増幅されるべきＤＮ Ａ配列の３′末端の補体でハイブリダイズするように定められた３′下流プライ マーを含んでいる。プライマーペア内のプライマーは、本発明で用いられる條件 下で、他の遺伝座のＤＮＡとハイブリダイズは行わない。

遺伝子座−特異的プライマーベアの各プライマーについて、プライマーは、増幅 されるべきＤＮＡ遺伝子座の複数の対立遺伝子に、あるいはその補体にハイブリ ダイズする。プライマーベアはハブロタイブが関係するにもかかわらず、遺伝子 座のすべての対立遺伝子を増幅するほうが望ましい。しかしながら、特別な集団 群に存在する最も共通の対立遺伝子とあるいは共通の配列を分は合う対立遺伝子 群と特異的に結合するプライマーベアまたはその結合体もまた考えられる。

プライマーによって定められる増幅されたＤＮＡ配列は、十分な数の非暗号領域 のヌクレオチド、望ましくはイントロン配列ヌクレオチドを含み、隣接した遺伝 子座の対立遺伝子間を区別し、そしてなるべ（なら、遺伝子座のすべての対立遺 伝子として、試料中に存在する遺伝子の対立遺伝子、あるいは選択した配列を含 む遺伝子群のすべての遺伝子を同定する。最も望ましい具体例で、プライマーが 限定した増幅されたＤＮＡ配列は、隣接した遺伝子座と１つまたはそれ以上の離 れた遺伝子座に関係したハブロタイブ間を区別するために十分な数のイントロン 配列ヌクレオチドを含んでいる。

配列の長さ 遺伝子座のすべての対立遺伝子／ハブロタイブ間の区別ができるように十分な遺 伝変異を含むことが要求される増幅された配列の長さは、遺伝子座（対立遺伝子 の数）の多室性の範囲と直接的な関係を生ずる。すなわち、試験される遺伝子座 に関係する対立遺伝子とハブロタイブの数が増加するに従って、各対立遺伝子／ ハブロタイブを見分けるための十分な遺伝変異を含む増幅された配列の大きさも 増加する。しかしながら、多くの対立遺伝子とハブロタイブをもつＨＬ　Ａ遺伝 子座においてさえ、２．０００ｎｔの増幅されたＤＮＡ領域で十分である。一般 的に、変異しうるエクソンに隣接したイントロンから、イントロン配列ヌクレオ チドの４００から５００ｎｔに相当する、増幅されたＤＮＡ配列は、遺伝子座に 関係するすべてのハブロタイブを見分けるに十分である。

増幅されたＤＮＡ配列の末端は、増幅に用いられるプライマーベアによって限定 される。便宜上、プライマーベアは、遺伝子座のすへての対立遺伝子／ノ１プロ タイプのＤＮＡ配列とハイブリダイズするだろう。従って、各プライマー配列は 、ゲノムＤＮＡ配列の保護領域に相当しなければならない。そこで、増幅された 配列の位置は、成る範囲内で、保護領域内にプライマーを位置決定する必要性に よって指令されるだろう。保護されたイントロン領域を決定するための十分なイ ントロン配列情報か利用されない時、プライマーはエクソンの保護された部分に 位置決定され、これらのエクソン間のイントロン配列を増幅するのに用いられる 。

適切に位置決定された、保護配列が遺伝的塵に唯一のものでない時、最初のプラ イマーベアによって作られた増幅配列内に位置決定された第２のプライマーベア を、遺伝的塵に特異的な増幅ＤＮＡ配列を与えるために用いることかできる。

すくなくとも、第２プライマーベアのプライマーの１つは、最初のプライマーベ アによって定められた増幅ＤＮＡ配列の保護領域に配置される。第２プライマー ベアは、第１プライマーベアによる増幅をフォローし、遺伝子座特有の増幅ＤＮ Ａ配列を生産するために第１プライマーペアによって作られた増幅されたＤＮＡ 配列の一部を増幅するために用いられる。

遺伝変異に関する考察 増幅されたＤＮＡ配列に見出される遺伝変異の型はまた、配列の配置と大きさに 影響を与える。前に述べたように、分析は、むしろ、対立遺伝子／ハブロタイブ 特異的増幅あるいは、増幅されたＤＮＡ配列の長さに変化をもたらし、または、 すくなくとも１つの制限部位−の存在または配置に変化をもたらす遺伝変異を基 にしている。

対立遺伝子／ハブロタイブ−特異的増幅について、２つの考え方がある。第１は 、ネステドプライマーの少なくとも１つについてのプライマー部位は、対立遺伝 子／ハブロタイブに特有である。これらの考察は、ネステドプライマー特性の考 察の中に述べられている。第２の考察は、それぞれの対立遺伝子／ハブロタイブ についての増幅されたＤＮＡ配列は、むしろ、長さが異なるということである。

プライマーが定めた増幅ＤＮＡ配列の長さに相違をもたらす遺伝変異は、プライ マー限定による長さの多量現象（ＰＤＬＰ）として、ここに記載したが、遺伝子 座の対立遺伝子／サブ対立遺伝子群間の区別に用いることができる。ＰＤＬＰは 、プライマーベアによって定められたイントロン配列の一部分にあるＤＮＡのか なり大きな長さく増幅したＤＮＡ配列の全長に比較して）の挿入または欠失の結 果として生ずる。ＰＤＬＰの検出のため、増幅されたＤＮＡ配列が、選んだ方法 で検出できる大きさの挿入または欠失を含んだ領域に配置される。

別に、長さの変異は、増幅されたＤＮＡ配列内の１個またはそれ以上のヌクレオ チドの置換により、電気泳動の移動度に変化を生じたと理解される長さの変異で ある場合がある。この明瞭な長さの変異は、プライマー限定の移動度変異（ＰＤ ＭＰ）に関係があり、そしてまた、ここでいうＰＤＬＰの型としても関係がある だろう。このような移動度の相違は配列に存在するヌクレオチドの特別な結合に よる増幅されたＤＮＡ配列のねじれまたは折りたたみに帰せられる。このような ヌクレオチドの結合とその結果の移動度の相違はよく知られている。たとえば、 ＡＴ配列における豊かな領域は、ねじれの傾向がある。

増幅されたＤＮＡ配列は、長さの違いについて、最善の解決がなされたような長 さを持つべきである。電気泳動として、長さについて、約３００から５００塩基 のＤＮＡ配列が長さの相違についての最適の解決を与える。

しかしながら、８００から１．０００ｎｔの長さの配列はまた、容易に識別しつ る。適当な條件の下で、ゲル電気泳動も、キャピラリー電気泳動も、配列の長さ で３ｎｔ程の少ない相違も検出することができる。対立遺伝子間で、長さの相違 は、好ましいのは少なくとも１０、さらに好ましくは２０、最も望ましいのは５ ０ｎｔまたはそれ以上である。従って、増幅されたＤＮＡ配列は、３００から１ 、．０００ｎｔの間で、長さの差異は、少くとも３、望ましくはＩＯ１最も望ま しくは５０ｎｔまたはそれ以上を含むことが望ましい。

ＰＤＬＰは２種類の普通の方法で生産することができる。第１には、プライマー 部位はサンプルＤＮＡ配列の中の固定した位置に置かれ、プライマー部位間の配 列は、遺伝子座の対立遺伝子またはハブロタイブに依存して変化する。別の具体 例で、プライマー部位は対立遺伝子／ハブロタイブ−特定増幅について述べたよ うに、遺伝子座の各対立遺伝子／ハブロタイブの異なった長さをもつ増幅ＤＮＡ 配列を生産するために、位置を変えて選択される。

検出されるべき変異が制限部位での変化である時は、増幅されたＤＮＡ配列は、 少なくとも１つの制限部位、（１）は１つの対立遺伝子に存在し、他に存在しな い、（２）は少なくとも２つの対立遺伝子または（３）その結合体の配列内の異 なった位置に明らかに配置されるような制限部位を含むことが必要である。増幅 された配列は、制限エンドヌクレアーゼ分割によって、はぼ同じ長さの２つまた はそれ以上の断片よりはむしろ、検出可能な異なった長さの断片を生産するよう に位置決定されることが望ましいだろう。

ここに述べた方法について、１個以上の増幅されたＤＮＡ配列の使用及びまたは 、増幅されたＤＮＡ配列当り１分析法以上の使用が、高度な多量性遺伝子座の場 合；　（対立遺伝子が、その対立遺伝子に特存ではないシングルヌクレオチド置 換によって異なるような遺伝子座）、あるいは離れた遺伝子座の対立遺伝子（ハ ブロタイブ）に関する情報が望まれる場合に必要になるだろうということが考え られる。さらに特別には、異なった位置に配置される２つまたはそれ以上の増幅 ＤＮＡ配列を使用するために、また予備の集合増幅によって生産された増幅ＤＮ Ａ配列についての多重集合増幅を行うために、あるいは１つの増幅ＤＮＡ配列を 多数のエンドヌクレアーゼで消化して遺伝子座の対立遺伝子とサブ対立遺伝子の パターンを区別できるようにするために、ＰＤＬＰ分析どＲＦＬＰ分析を結合す ることが必要であるかも知れない。これらの結合は、本発明の範囲内に含まれる と考それぞれの遺伝子座−特異的プライマーは、ハイブリダイゼーションに用い られる條件下で、増幅されるべき遺伝子座の対立遺伝子とハイブリダイズするに は十分な、また他の遺伝子座の対立遺伝子とのハイブリダイゼーションは行わな い多くのヌクレオチドを含む。プライマーの特性は、同じ緊縮性を与える條件下 で、その配列の中のヌクレオチドの数によって増加する。従って、より長いプラ イマーが望まれる。１５ヌクレオチドより少ない数の配列は、特別な遺伝子座に 対し特異的になる確実性は少ない。すなわち、１５ヌクレオチドより少ない数を もつ配列は、ヌクレオチド配列の長さに反比例して、他の遺伝子座、特に他の共 通の起源または進化的に起源に近い遺伝子座に関係したＤＮＡの部分に存在する ことも大いにありうる。それぞれのプライマーは、少なくともおよそ１５のヌク レオチドを含むことが望ましく、少なくともおよそ２０のヌクレオチドをもつこ とがさらに望ましい。プライマーは、およそ３０ヌクレオチドを超えないことが 望ましく、およそ２５ヌクレオチドを超えないことがさらに望ましい。最も望ま しいのは、プライマーが、およそ２０と２５ヌクレオチドの間の数をもつことで ある。

プライマーペアの２セツトが、配列的に用いられて、第２プライマーペアによっ て、第１プライマーベアの生産物を増幅する時、プライマーは、最初の増幅に用 いられたものと同じ大きさであることかできる。しかしながら、より小さなプラ イマーを第２の増幅に用いることができ、必要な特性を与えることができる。第 ２プライマーベアのプライマーは、１５またはそれより少ないヌクレオチドを持 つことができる。プライマーペアの２セツトが、２つの増幅配列を生産するため に用いられる時。

第２の増幅ＤＮＡ配列が遺伝子変異のその後の分析に用いられ、増幅ＤＮＡ配列 について先に考察した要求に適合しなければならない。

プライマーは、増幅されるべきＤＮＡ配列またはその補体の部分に一致したヌク レオチド配列をもつことが望ましい。しかしながら標的ＤＮＡ配列またはその補 体と異なるプライマーの３′末端の最初の５ヌクレオチドの２つを持っているプ ライマーはまた、使用することができる。配列またはその補体に一致しないヌク レオチドはどれも、プライマーの３′ヌクレオチドではない。プライマーの３′ 末端は、プライマーが結合する配列に相補的であるヌクレオチドの少なくとも２ つ、好ましくは３つまたはそれ以上を持つことが望ましい。増幅されるべき配列 またはその補体に一致しない３′末端におけるどのヌクレオチドも、プライマー 配列に隣接しないことが望ましい。さらに望ましくは、プライマー配列における 非相補的ヌクレオチドは、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのヌ クレオチドを分離すべきであろう。プライマーは、およそ５５から７５°Ｃの融 解温度（Ｔｍ）を持つべきである。緊縮増幅條件を助長するために望ましいＴｍ は、およそ６０°Ｃから６５°Ｃである。

特別のハイブリダイゼーションを確実にするプライマー選択のための相同、長さ 、Ｔｍその他の考察の程度は、よく知られており、本発明の構成部分ではない。

プライマーは多くの方法、たとえば、ホスホトリエステルとホスホジエステル法 あるいは、その自動化方法を用いて作ることかできる。ホスホジエステルとホス ホエステル法は、Ｃｒｕｔｈｅｒｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　２８１− ２　８　５　（１９８５）　；　Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙ ｍｏｌ、。

６８：１０９　（１９７９）；及びＮｒａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、６８　：　９０　（１９７９）　、　に記載されている。

１つの自動化方法として、Ｂｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎｌｅｔｔｅｒｓ、２２　：１８５９−１９６２　（１９８１）により述べら れているように合成することができるジエチルホスホラミシティが出発物質とし て用いられる。修飾した固体サポート上のブライマーオリゴヌクレオチド配列の 合成方法は、Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔ、　Ｎｏ、４．４５８．０６６４：記述されて いる。上記文献はそれぞれ、文献としてその全体がここに編入されている。

増幅 −たびプライマーベアが選択されると、増幅ＤＮＡ配列を作るために、ゲノムＤ ＮＡが増幅される。ＤＮＡ増幅のための條件と試薬は、よく知られている。望ま しい増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。

ＰＣＲ増幅方法は、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４．６８３．　ｌ　９５　（ ｔ。

Ｍｕｌｌｉｓｅｔａｌ、　１ｓｓｕｅｄＪｕｌｙ　２８．　１９８７）　；Ｕ、 Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４．６　８３．１　９　４　（ｔｏ　５ａｉｋｉ　ｅｔ　 ａｌ、１ｓｓｕｅｄＪｕｌｙ２８．　１９８７）　；５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２３０　；１３５０−１３５４　（１９８５）　；　５ｃｈａ ｒｆ　ｅｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、３２４　：１６３−１６６　（１９８６）　；Ｋｏｇａｎｅｔ 　ａｌ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３　１　７　：　９　８　５　−　９ 　９　０（１９８７）　ａｎｄ　５ａｉｋｉ、　Ｇｙｆｌｅｎｓｔｅｎ　ａｎｄ 　Ｅｒ１ｉｃｈ、　ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏ ｎ　ｉｎ　Ｇｅｎｏｒｎｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　：　ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ ｐｐｒｏａｃｈ、　ｅｄ、　Ｄａｖｉｓ　ｐｐ、１４１−１５２（１９８８）　 ｒ、Ｒ，Ｌ、　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、に述ぺられている。

上記文献はそれぞれ、文献として、すべてここに編入されている。残りの記述は 、ＰＣＲ増幅法の使用を基礎にしているけれども、ＮＡＳＢＡ法（Ｃｏｍｐｔｏ ｎ　Ｎａｔｕｒｅ３５０．９１　（１９９１））のような他のＤＮＡ増幅法もま た使用できる。本分析法への他のＤＮＡ増幅方法の適用は、技術の熟練度の範囲 内である。

増幅に先立って、ゲノムＤＮＡのサンプルか得られる。

すべての有核細胞はゲノムＤＮＡを含み、それ故に必要なりＮＡの潜在的入手源 である。高等動物では、一般的に、組織サンプルよりはむしろ、末梢血液細胞が 使用される。０．Ｏｌから（Ｌ　０５　ＣＣのわずかな末梢血液が増幅のための 十分なりＮＡを提供する。髪の毛、精液そして組織もまたサンプルとして使用で きる。ゲノムＤＮＡライブラリーが利用できるそしてよく知られた方法で容易に 作られる。

有核細胞からのＤＮＡ分離は；　Ｋａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、２９７　：　１０８０−１０８４　（１９７７）　；Ｋａｎｅｔ ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５］　：　３９２−３９２　（１９７４）　；ａｎｄ Ｋａｎｅｔａｌ、　ＰＮＡＳ　７５　：　５６３１−５６３５（１９７８）、に 述べられている。上記文献はいづれも文献としてそのすべてがここに編入されて いる。血液、精液、上置、粘膜上皮及びゲノムＤＮＡのその他の入手源はよく知 られている。植物細胞の場合は、セルラーゼによる細胞の消化でＤＮＡを放出す る。その後、ＤＮＡは、以下に述べるように精製される。

抽出されたＤＮＡは、増幅の前にポリヌクレオチドを精製するため、透析、クロ マトグラフィーあるいは他の既知の方法で精製することができる。一般的には、 ＤＮＡは増幅の前に精製されない。

増幅ＤＮＡ配列は、ＤＮＡの一部と、鋳型としてプライマーペアが結合したその 補体を用いて生産される。この方法の最初の段階で、ＤＮ、１１は、−重鎖ＤＮ Ａに分離される。この鎖分離は、物理的化学的な多くの方法で行うことができる 。望ましい方法は、ＤＮＡが十分に（およそ９３％）変性するまで加熱して鎖を 分離する物理的な方法である。熱変性の温度範囲は約８０°から１０５℃、時間 の範囲は約１５から３０秒である。一般的には、温度９０°から９３°Ｃで、お よそ３０秒から１分間、ＤＮＡを加熱すれば十分である。

生産されるブライマーエクステンション生成物は、プライマー限定したＤＮＡ領 域に相補的であり、ハイブリダイズして同じ長さの鎖の二重体を形成する。エク ステンション生成物とそれらの鋳型の二重体はそれから一重鎖ＤＮＡに分離され る。二重体の相補鎖が分離すると、鎖は追加ＤＮＡ鎖の合成の次のサイクルの鋳 型として容易に用いられる。

各合成段階は、ＤＮＡ増幅に適した條件を用いて行うことができる。一般に、増 幅手段は、緩衝水溶液中で、望ましくはｐＨはおよそ７から９、さらに望ましく はｐＨ８で行われる。適当な増幅緩衝液は、緩衝剤として、およそ１０から１０ ０ｍ１Ｊのトリス塩酸を含む。緩衝液はまた、望ましくは、少なくとも約１０ｍ Ｍで約６０ｍＭ以下の一価塩を含む。望ましい一価塩は、ＫＣＩ、　ＮａＣ１及 び（ＮＨｔ）ｔＳ０４である。緩衝液はまた、約５から５０ｍＭのＭｇＣ１，を 含む。へベスあるいはグリシン−ＮａＯＨそしてまた燐酸カリウム緩衝剤のよう な他の緩衝剤系も用いることができる。一般的に、増幅反応混合液の全容量は、 およそ５０から１００μｍである。

ゲノムＤＮＡとして、望ましくは、およそ１０＠　＋１プライマー：プライマー ペアの鋳型の過剰モルが、分離されたＤＮＡ鋳型鎖を含む緩衝液に加えられる。

プライマーの大過剰モルは増幅工程の効率を改良する。一般的に、各プライマー のおよそ１００から１５０ｎｇが加えられる。

デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰもまた、増幅ＤＮＡ配列を生産するのに十分な 量で増幅混合液に加えられる。

望ましくは、ｄＮＴＰはおよそ０．７５から４．　ＯｍＭｌｊ度で、さらに望ま しくは、およそ２．０　ｍＭで存在する。この溶液は、約９０°から９３°Ｃで 、およそ３０秒から１分間、ＤＮＡ鎖を分離するために加熱される。この加熱時 間後、溶液は増幅温度まで冷却される。

ＤＮＡ鎖の分離につづいて、プライマーは鎖をアニーリングさせる。アニーリン グ温度は、プライマーの長さとＧＣ含量で変化する。これらの変動は、各プライ マーのＴｍに反映される。エクステンション反応段階は、プライマーのアニーリ ングに続いて、ゲノムＤＮＡについて行われる。

ブライマーエクステンション反応を誘導または触媒する適当な剤が、鎖分離（変 性）手段の前か後に、変性條件下の剤の安定度に依存して、増幅混合液に添加さ れる。

ＤＮＡ合成反応は、技術的によく知られた條件下で、行わせる。この合成反応（ ブライマーエクステンション）は、室温から、ポリメラーゼがもはや有効に機能 しない以上の温度でおこすことかできる。増幅温度を上げると、反応の緊縮度が 強められる。前に述べたように、ヌクレオチドの置換が増幅配列内で、制限部位 あるいはプローブ結合部位を変えることができるので、増幅配列とＤＮＡ鋳型配 列が同じヌクレオチド配列を含むことを確実にするために、緊縮な條件が必要で ある。

誘導剤は、ブライマーエクステンション生成物の合成を促進する如何なる化合物 または系でもよく、望ましくは酵素である。この目的に適した酵素は、ＤＮＡポ リメラーゼ（たとえば、ε、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ、　ｃｏｌ ｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメント、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ） 、逆転写酵素及びその他の酵素（熱安定ポリメラーゼを含む）を含み、これらは ブライマーエクステンション生成物を形成するための適切な手段の中でヌクレオ チドの結合を促進する。最も望ましいのは、Ｔａｑポリメラーゼまたはその他の 熱安定性ポリメラーゼで、高温（約６０°から９０°Ｃ）でＤＮＡ合成を促進す る。Ｔａｑポリメラーゼは、たとえばＣ１ｅｎ　ｅｔ　ａｔ。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、！　２７　：　１５５０−１５５７　（１９７６） に述べられている。その論文は、文献としてそのすべてかここに編入されている 。エックステンション工程が約７２°Ｃておよそ１分間行われる時、増幅される べき標的ＤＮＡの１．０００塩基か必要になる。

増幅配列の合成は、各プライマーの３′末端で開始され、合成が終了するまで、 鋳型ＤＮＡ鎖に沿って鋳型の５′末端の方に進み、異なった長さのＤＮＡ配列を 生産する。新しく合成された鎖とその相補的鎖は、二重鎖分子を生成し、それが その後に続く工程に用いられる。次の工程で、二重鎖分子の鎖は、前に述べたよ うに、分離され（変性される）−重鎖分子を供給する。

新しいＤＮＡは、−重鎖鋳型分子上に合成される。上記條件下で反応を進める必 要があれば、追加のポリメラーゼ、ヌクレオチドそしてプライマーが加えられる 。この段階の後、エクステンション生成物の半分は、２つのプライマーによって 結合された増幅配列から成り立っている。鎖分離とエクステンション生成物の合 成の工程は、増幅ＤＮＡ配列の望まれる量を生産するに必要な多くの回数が繰返 される。生産される増幅配列の量は指数関数的に蓄積される。一般的には、分析 上、増幅ＤＮＡ配列の適当量を生産するには約２５から３０サイクルで十分であ る。

増幅方法は、各段階後に新しい試薬を加える段階方式でも、あるいは、初期段階 ですべての試薬を加える連続方式でも、あるいは、きめられた数段階後に新らし い試薬を加える一部段階一部連続方式でも行うことができる。

増幅反応混合液は、サンプルのゲノムＤＮＡに加えて、４つのヌクレオチド、モ ル過剰のプライマーベア、及びＴａｇポリメラーゼのような誘導材を含むことが できる。

各工程の段階は、すべての試薬か最初に存在しているにもかかわらず逐次的に起 こる。付加物質は必要に応じて加えてよい。一般的には、熱安定性ポリメラーゼ が用いられる時、ポリメラーゼは補充されない。増幅配列の望みの量が適当な回 転数で生産された後、酵素を不活性化し、あるいは反応成分を分離し、あるいは 熱循環を止めることによって反応は停止される。

この方法の望ましい具体例として、増幅は、最初の増幅につづく第２の増幅を行 うために第２プライマーペアの使用を含む。第２プライマーペアは、最初の増幅 配列の一部であるＤＮＡ配列を限定する。すなわち、少なくとも第２プライマー ペアの１つは、最初の増幅配列の末端以内にある第２増幅配列の１つの末端を限 定する。この方法で、第２プライマーペアの使用は、第２増幅反応で生産される どの増幅配列も、試験される遺伝子座に特異的であることを確実にするよう助長 する。すなわち遺伝子座−特異的ペアによりコピーされるかも知れない非標的配 列は、最初の増幅配列内に位置決定する第２遺伝子座−特異的プライマーベアと ハイブリダイズする配列を含むことはないように思われる。

増幅ＤＮＡ配列の分析 前に考察したように、サンプルＤＮＡに存在する対立遺伝子の特性を明らかにす るため増幅ＤＮＡ配列を分析することに用いられる方法は、配列中の遺伝変異に 依存する。対立遺伝子間の差異が、プライマー限定の長さの多型を含む時、増幅 配列は長さに基づいて望ましくは、ゲルまたはキャピラリー電気泳動を用いて分 離される。

分析がＲＦＬＰ断片のパターンに基づく時、増幅配列は、１個またはそれ以上の 制限エンドヌクレアーゼによって消化し、その結果の断片は長さをベースに、望 ましくはゲルまたはキャピラリー電気泳動によって分離される。

最も望ましい方法は、増幅−特異的方法であり、集合した増幅ＤＮＡ配列が選択 された対立遺伝子またはハブロタイブの存在を示す。

種々の分析方法のそれぞれの工程は、たとえばＤＮＡ増幅、エンドヌクレアーゼ 消化法そしてゲル電気泳動のような良く知られた方法を用いており、以下に記載 する。

対立遺伝子−または〜ハブロタイブー特異的増幅分析法 対立遺伝子−または−ハブロタイブ−特定増幅は好ましい分析方法であり、最も 異なった民族グループの１５から２０個体について、領域に関する４００から５ ００ｂｐの配列情報が−たび利用できれば行うことができる。

分析方法の最初の段階として、ネステの配列−特異的プライマーペア、対立遺伝 子−特異的プライマーペアあるいはハブロタイブ−特異的プライマーペアにより 増幅される標的ＤＮＡ配列として用いられる遺伝子座−特異的増幅ＤＮＡ配列が 作られる。標的ＤＮＡ配列は、変異性エクソンまたは変異性エクソンの下流のエ クソン及び隣接するイントロン配列ヌクレオチドを含む遺伝塵の部分に相当する ことが望ましい。この方法は、選択された配列が標的配列の中に存在する時にだ け、ペアのプライマーのすくなくとも１つか、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズ するようなプライマーペアを用いて標的ＤＮＡ配列を増幅することを基にしてい る。前に述べたように、配列多型は、一つの対立遺伝子または遺伝塵の対立遺伝 子群に特徴的であることができる。別に、配列多型は、遺伝塵及び１個またはそ れ以上の隣接遺伝子座に関係したハブロタイブに特徴的なサブ一対立遺伝子変異 であることができる。この方法で、増幅ＤＮＡ配列の生産物は、選択された配列 冬型性そして選択されたサブ一対立遺伝変異、対立遺伝子または対立遺伝子群が 標的ＤＮＡに存在することを示す。１つの具体例として、最初の増幅は、サンプ ルに存在する対立遺伝子またはハブロタイブに関係なく標的ＤＮＡ配列を生産す る遺伝子座−特異的プライマーペアを使用する。他の具体例として、共通の配列 多型をもつ対立遺伝子の選択群がサンプルに存在する時にだけ、遺伝子座−特異 的プライマーペアが標的ＤＮＡ配列を生産する。標的配列の次の増幅は、群内の 対立遺伝子を用いて行われる。

第２の増幅は、サンプル中の対立遺伝子／ハブロタイブを決定するための十分な 配列多型として、プライマーペアを含むことが望ましい。一つの具体例で、それ ぞれの増幅反応混合液が、シングルプライマーペアを含んで多数の増幅が行われ る。反応混合液中の増幅の存在の検出には、プライマーペアが特異的である対立 遺伝子がサンプル中に存在することを測定して行う。他の具体例で、多重ＤＮＡ 増幅が、プライマーペアを用いて単一反応混合液中で行われる。ここでは、反応 混合液中のそれぞれのプライマーペアによって、それぞれ、長さの違いが区別で きる増幅されたＤＮＡ配列が生産される。結果として生じた増幅ＤＮＡの長さの 測定は、標的ＤＮＡ中に存在する配列多型を同定する。望ましい事例として、プ ライマーペアの十分なコンビネーションが用いられその結果生じた増幅ＤＮＡ配 列は、サンプル中に存在する遺伝塵の両方の対立遺伝子を測定する。

ネストのプライマーペア この方法は、ネストのプライマーペアを用いた、標的ＤＮＡ配列の増幅に基いて いる。ここでネストのプライマーペアによる増幅の存在が、特別な配列多型がサ ンプル中に存在することを示している。配列多型は、一つの対立遺伝子、遺伝塵 の対立遺伝子群の特性であることができ、あるいは、１個またはそれ以上の個体 のサブ対立遺伝子変異特性であり、あるいは、遺伝塵及び１個またはそれ以上の 隣接遺伝子座に関係するハブロタイブの特性であることができる。一つの望まし い事例として、標的ＤＮＡ配列は、サンプル中の対立遺伝子またはハブロタイブ の存在にかかわりなく、サンプルのゲノムＤＮＡを増幅する遺伝子座−特異的プ ライマーペアにより生産される増幅ＤＮＡ配列である。他の望ましい事例におい て、標的ＤＮＡ配列は、遺伝子座の対立遺伝子群を包みこむがすべての対立遺伝 子は包みこまない。

対立遺伝子−特異的またはハブロタイブ−特異的増幅に影響するため、各ネスト のプライマーペアにおける少なくとも１つのプライマーは選択されて、選択され た配列多型が存在する時だけ、そめプライマーがＤＮＡ配列にハイブリダイズす る。このようにして、増幅ＤＮＡ配列の存在は配列多型がそのサンプルに存在す ることを示す。これは、プライマーか保護領域に結合し、結果として生じた増幅 ＤＮＡ配列が通常はオリゴプローブを用いて、増幅配列内の多型の存在を分析す る先行技術とは最も対照的である。

各プライマーペアの少なくとも１つのプライマーは、選択的に配列多型とハイブ リダイズし、（１）遺伝塵の多数の対立遺伝子に特異的であるが、すべての対立 遺伝子には存在しない（配列−特異的プライマーまたは５ＳＰ）、（２）遺伝病 の１つの対立遺伝子（対立遺伝子−特異的プライマーまたはＡＳＰ、（３）遺伝 塵及び１個またはそれ以上の隣接遺伝塵に関係した１つのハブロタイブ（ハブロ タイブ−特異的プライマーまたはＨ３Ｐ）あるいは（４）特別な個体または個体 グループ（個体−特異的プライマーまたはｌ５Ｐ）に特異的である。プライマー ペアのその他のプライマーは、前に考察したようにあまり特異的ではない。

ネストの増幅ＤＮＡ配列の各々は、標的ＤＮＡ配列に位置決定される。標的ＤＮ Ａ内の各々のネストの増幅ＤＮＡ配列の位置は、増幅ＤＮＡ配列の１方または両 方の末端が、望ましい特性の多型配列を含むように選択される。すなわち、増幅 ＤＮＡ配列の３′末端または５′末端または両末端のどれかが、配列−特異的、 対立遺伝子−特異的、ハブロタイブ−特異的または個体−特異的のいづれかのプ ライマーがハイブリダイズするような多型配列を含んでいる。

プライマーはまた、反応混合液内の各プライマー対が異なった長さの増幅ＤＮＡ 配列を限定するように位置されることが望ましい。遺伝座に関係する各ネストの プライマーベアが異なった長さの増幅ＤＮＡ配列を限定するようにプライマーが 位置されれば、さらに望ましい。

ネストのプライマーにより生産される増幅ＤＮＡ配列は、その長さがおよそ５０ から７００ｂｐまで変化しうるが、５０から３００ｂｐが望ましく、５０から１ ００ｂｐか最も望ましい。それぞれのネストの増幅ＤＮＡ配列はまた、反応混合 液内でお互し２にネストの増幅ＤＮＡ配列か異なることが望ましく、遺伝子座の それぞれのネストの増幅ＤＮＡ配列が少なくとも十分な数のヌクレオチドにより 、ゲル電気泳動で増幅ＤＮＡ配列が容易に区別することか出来ることが望ましい 。

長さの相違は、配列（プライマーが限定した長さの多源またはＰＤＬＰ）内のヌ クレオチドの数に帰せられあるいは、ゲル（プライマー限定の移動度の多源また はＰＤＭＰ）における配列の移動度の相違に帰因する明瞭な長さの相違であり得 る。ＰＤＬＰまたはＰＤＭＰのゲル電気泳動の説明は、ここに詳細に述べられて いる。

第２増幅についてのネストのプライマーの特別なハイブリダイゼーションについ ての考え方は遺伝子座−特異的増幅で必要な條件とはいくらか異なっている。す なわち、プライマーは、選択されたＤＮＡ配列、最初の増幅で生成された標的配 列を増幅する目的に十分に特異的であることのみが必要である。ネストのプライ マーに対する考え方の相違は良く知られている。ネストのプライマーについて、 それぞれのプライマーは長さがおよそ１０から３０まで変化するが、望ましい長 さは１５から２゜ｎｔｆｉも望ましい長さは約１８ｎｔである。プライマーベア （ＳＳＰ、ＡＳＰ、Ｈ３Ｐ、　またｌ；！ｌ５Ｐ）（７）中の各特別なプライマ ーについて、プライマーの３′末端は、配列対立遺伝子、ハブロタイブあるいは 検出されるべき個体変異について特徴的な標的配列の独特の領域に選択的にハイ ブリダイズする。

３′末端における１つの独自のヌクレオチドは、増幅反応に適当な緊縮度を与え る條件下で、十分特殊性を保証している。プライマー部位の３′末端に２または ３個の独自なヌクレオチドをもつ位置を可能な時に用いることができる。プライ マーとプライマー部位はプライマーの３′ヌクレオチドについて少なくとも相補 的でなければならない。３′ヌクレオチドに加えて、隣接４個のヌクレオチドの 少なくとも２個が望ましく、プライマーの３′末端における５個のヌクレオチド かまた、プライマー部位配列に相補的であることか最も望ましい。プライマーの ５′末端における、望ましくは少なくとも３個のヌクレオチド、さらに望ましく は５個のヌクレオチドもまたプライマー部位配列に相補的である。プライマーの 中心に近い非相補的領域、望ましくは、非相補的ヌクレオチドが隣接しなければ 特別な増幅について十分相同性前に述べたように、分析法は、標的ＤＮＡ配列を 生産するため、遺伝子座−特異的プライマーによる最初の増幅を含む。標的ＤＮ Ａ配列は、配列、対立遺伝子、ハブロタイブあるいは検出されるべき個体変異に ついて特徴的な標的配列の一部分に特異的なネストのプライマーペアによって増 幅される。方法はいくつかの異なったやり方で行うことができ、ネストのプライ マーベアにより生産された増幅ＤＮＡ配列は、ペアが特異的であるような配列が サンプル中に存在することを示して、特徴的である。

ＤＮＡ増幅に用いられる試薬と條件は、遺伝子座−特異的増幅のそれらと異なら ない。次の方法の説明は、目的を明確にするため、遺伝子座の対立遺伝子検出の 項に書かれている。同じ考え方か、サブ一対立遺伝子の変異の検出に含まれてい る。

最初の増幅 分析法の最初の工程は、遺伝子座−特異的増幅ＤＮＡ配列を生産するため、遺伝 子座−特異的プライマーによるゲノムＤＮＡの増幅である。前に述べたように、 遺伝子座−特異的プライマーは、共通配列多型をもつ遺伝子座の対立遺伝子検出 の増幅ＤＮＡ配列を生産する。最初の増幅は２つの方法の中の１つで行われる。

１つの具体例として、遺伝子座−特異的プライマーベアは、サンプルのゲノムＤ ＮＡ中に存在する対立遺伝子にかかわりな（、増幅ＤＮＡ配列を生産する。結果 として生じた遺伝子座−特異的増幅ＤＮＡ配列はその後の工程の標的ＤＮＡとし て使用される。

より好ましい具体例として、遺伝子座特異的ブライ・マーペアは遺伝子座の多数 の対立遺伝子を増幅するが遺伝子座のすべての対立遺伝子は増幅しない。この具 体例での使用は、遺伝子座−特異的プライマーペアは、遺伝子座のすべての対立 遺伝子を増幅するよう要求されていることを意味する。しかしながら、第２の増 幅は、標的ＤＮＡ配列を生産する遺伝子座−特異的プライマーベアの配列多型を もつ対立遺伝子群に対する特異性のみを必要とする。この方法は、特殊な試料を 分析することが要求されるので全ＤＮＡ増幅の数は小さくなる。

それぞれの遺伝子座−特異的プライマーベアは分離した増幅反応混合液中に存在 することができる。その場合、増幅ＤＮＡ配列の存在は試料中の対立遺伝子の群 を示す。

また別に、２個またはそれ以上の遺伝子座−特異的プライマーペアは、単一増幅 反応混合液に存在することができる。その場合、結果として生じたそれぞれの増 幅ＤＮＡ配列は区別しうる長さをもち、試料中に存在する対立遺伝子群を決定す るため電気泳動にかけられる。単一反応混合液中の多数のプライマーペアの結合 技術は、マルチブレシングとして文献を参照のこと、マチルブレシングに関係す る考察は、第２増幅で詳細が述べられる。

第２増幅 標的ＤＮＡ配列内のＤＮＡ配列を増幅する第２増幅は、プライマーペアを用いて 行われる。第２増幅において、増幅に責任をもつプライマーペアが指示的に増幅 ＤＮＡ配列を生産する。すなわち、プライマーペアの少なくとも１プライマーは 、対立遺伝子または遺伝子座の対立遺伝子群について特徴的なりＮＡ配列にハイ ブリダイズする。特別なプライマーペアまたはプライマーの群による増幅ＤＮＡ 配列の生産は、対立遺伝子が試料中に存在することを示している。

標的配列か遺伝子座のすへての対立遺伝子を包み込む時各対立遺伝子の増幅が行 われる。一つの具体例で、分離反応混合液は、遺伝子座の各対立遺伝子へのプラ イマーペアの特質のために作られる。増幅ＤＮＡ配列を生産する１つまたは２つ の反応混合液の測定で試料中に存在する対立遺伝子が識別される。好ましい具体 例で、各増幅ＤＮＡ配列は、長さが異なり、増幅ＤＮＡ配列は、試料中の対立遺 伝子の存在を確認するために測定される。

一方、第２反応混合液の少な（とも一つは、２個またはそれ以上のプライマーペ アを含むことができる。反応混合液中のあらゆる他のプライマーペアによって生 産される増幅ＤＮＡ配列から、それぞれのプライマーペアか区別できる、長さを もつ増幅ＤＮＡ配列を生産できるように、反応混合液におけるプライマーペアの 結合を選択することによって、増幅ＤＮＡ配列の生産に責任のあるプライマーペ アは、増幅ＤＮＡ配列の長さを測定することによって容易に識別することができ る。かくして、標的ＤＮＡ中の配列多型の存在が、増幅ＤＮＡ配列の長さの測定 によって容易に識別することができる。

単一反応混合液中で多くのプライマーペアが用いられる時、反応混合液中に存在 する他のプライマーペアによって生産されるすべての他の増幅ＤＮＡ配列の長さ から、増幅ＤＮＡ配列の長さを区別出来るように各ペアのプライマーが選択され る。それぞれのペアのプライマーは、選択される対立遺伝子に特異的であること ができる。一方、反応混合液中の２個またはそれ以上のプライマーペアは、共通 のプライマーを分は合うことができる。反応混合液中の１つのプライマーペアか 共通のプライマーを利用する時、便宜的に、反応混合液中のすべてのプライマー ペアが共通のプライマーを利用する。その場合、それぞれのプライマーペアの対 立遺伝子−特異的プライマーは、ゲル電気泳動によって区別されるように、他の 対立遺伝子−特異的プライマーから十分に離れた位置に選択されるだろう。

好ましい具体例で、ただ１つの増幅ＤＮＡ配列が、各対立遺伝子用に生産される 。すなわち、遺伝子座の各対立遺伝子用に１つの対立遺伝子−特異的プライマー ペアがあることが望ましい。たとえば、いくつかの対立遺伝子−特異的プライマ ーペアが用いられる時、各ペアごとのプライマーが選択され、その結果、対立遺 伝子が標的ＤＮＡに存在する時、ただ１つの増幅ＤＮＡ配列が生産される。しか しながら、対立遺伝子に特徴的な配列−特異的増幅ＤＮＡ配列のパターンが、− 諸に起ると、また考えさせられる。

他の具体例で、第２反応混合液中で、１個またはそれ以上のネストのプライマー ペアが配列−特異的プライマーであり、遺伝子座の対立遺伝子群を増幅する。第 ２増幅により生産された増幅ＤＮＡ配列を増幅するためにネストのプライマーを 用いる追加増幅が、第２増幅ＤＮＡ配列内の対立遺伝子を測定するために用いら れる。

遺伝子座の対立遺伝子のための上記の分析法は、サブ対立遺伝子多望、特殊なハ ブロタイブ多望、あるいは、対立遺伝子／ハブロタイブを特徴づける配列−特異 的プライマー群の使用あるいは、対立遺伝子／ハブロタイブを測定するためネス トのプライマーによる増幅のような分析技術で普通の腕をもった人ならば容易に 適用することかできる。

ＲＦＬＰ断片パターンの生産 制限エンドヌクレアーゼ 制限エンドヌクレアーゼは、制限部位と呼ばれる特別なヌクレオチド配列でＤＮ Ａを加水分解的に分裂または切断する酵素である。粘着性の末端断片（鎖の加水 分解位置は少量のヌクレオチドで互いに分離される）を生ずるエンドヌクレアー ゼと同様プラント末端ＤＮＡ断片（両方のＤＮＡ鎖に結合するホスホジエステル の加水分解が同じ位置で起る）を生ずるエンドヌクレアーゼを用いることができ る。

制限酵素はＳｉｇｍａ　Ｐｈａｒａ＋ａｃｅｕｔｉｃａ１．Ｂｅｔｈｅｓｄａ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｓ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ　ａｎｄ 　Ｐｈａｒｃｎａｃｉａを含む多くの入手先から商業的に利用することができる 。前述のように、本発明に用いられる制限エンドヌクレアーゼは、本。

発明の増幅ＤＮＡ配列を分裂して、区別できる断片長をもった一連の断片から成 る消化物を生産する。特に、遺伝子座の１つの対立遺伝子／ハブロタイブの断片 は、他の遺伝子座の他の対立遺伝子／ハブロタイブの断片と大きさが異なる。多 くの消化物の断片の分離と視覚化により生じたパターンは、遺伝子座の対立遺伝 子とサブ対立遺伝子のパターンを十分に区別できる。さらに特徴的には、増幅配 列の１個またはそれ以上の消化物を用いて、遺伝子座の対立遺伝子が区別できる ように、エンドヌクレアーゼを選択できる。

エンドヌクレアーゼの選択で、考慮すべき重要なことは、遺伝子座の色々な対立 遺伝子をもつ増幅配列から生ずる断片の数である。さらに特別な事として、対立 遺伝子とハブロタイブ間を見分けるために十分な数の断片が作られなければなら ない。しかしながら多くの断片が、特別な検出方法によっても、他のハブロタイ ブのパターンと区別できない程、その大きさが大きすぎても、あるいは同じであ ってもいけない。この選択については、異なるエンドヌクレアーゼと増幅ＤＮＡ 配列を実験的に組合わせてその結果のパターンを評価するよりは、むしろ、代表 的な配列を分析し、配列にとって有用な制限エンドヌクレアーゼを決定する方が 望ましい。

普通の熟練者ならば、エンドヌクレアーゼが、区別できる断片長をもったＲＦＬ Ｐ断片を作るか否かを容易に決定することができる。

この決定は、それぞれの対立遺伝子をもった増幅配列と、本発明法で指定したエ ンドヌクレアーゼで分裂することによって実験的に行うことができる。断片のパ ターンは、それから分析される。配列か分析され、遺伝子座をもつ配列の中にあ って、対立遺伝子／ハロタイプの特徴をもつ断片を生産するエンドヌクレアーゼ の制限位置を選定することが望ましい。対立遺伝子のパターン間の相違を検出す るのに、２個またはそれ以上の消化物のパターンを比較すれば十分かどうかを決 めることにより、パターンは容易にその違いを区別できる。このような比較は、 断片を生産し、ゲルによって断片を分離することによって行うことができる。一 方、エンドヌクレアーゼによって作られる断片は、既知の配列を解析することに よって、その長さを決定することができる。

ＲＦＬＰ断片の生産 増幅の後、増幅ＤＮＡ配列は、エンドヌクレアーゼと結合させて、特別な制限部 位で、加水分解的に分裂または切断される。エンドヌクレアーゼと増幅ＤＮＡ配 列の結合物は、区別できる長さの一連の断片を含んだ消化物を生産する。Ｕ、　 Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４．５８２．７８８　（ｔ。

Ｅｒ１ｉｃｈ　１ｓｓｕｅｄ　Ａｐｒｉｌ　１５．　１９８６）は、制限酵素断 片長多型（ＲＦＬＰ）に基づいたＨＬＡ型方法について述べている。この特許は 文献として、すべてここに編集されている。

好ましい具体例として、分割試料当り、略等量のＤＮＡを含む２個またはそれ以 上の増幅反応混合液の分割試料を用意する。便宜上１００μ１反応混合液中のお よそ５から１０μｍが各分割試料として用いられる。各分割試料は、異なったエ ンドヌクレアーゼと結合させて多数の消化物が作られる。この方法で、特別な増 幅ＤＮＡ配列に対し、多くのエンドヌクレアーゼを使用して、特別な遺伝子座の 多数の対立遺伝子を区別する遺伝子座−特異的結合物が容易に決定される。消化 物の作成に続いて、それぞれの消化物は、ＲＦＬＰパターンの形成に使用される 。パターン形成の前に、２個またはそれ以上の消化物をプールすることか望まし い。

一方、２個またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼか、単一消化物の生産に用 いられる。消化物は、それぞれ酵素が別々に用いられて異なっており、結果的に 生じた断片については、一つの酵素によって生ずる断片は消化物の他の酵素によ って認識される１個またはそれ以上の制限部位を含んでいるかも知れないので、 プールされる。２個またはそれ以上の酵素によって同時に消化されて生じたパタ ーンは、これらの酵素で別々に消化された生じた生成物をプールしたものよりは 、より多くの断片を含むだろうし、また分析ももっと複雑になるだろう。

増幅ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼによる消化は、エンドヌクレアーゼの活性 上、より好適な條件である水溶液中で行うことができる。一般に、溶液はｐＨ約 ６．５から８．０の緩衝液である。望ましい温度は約２０°Ｃから４５°Ｃ１よ り望ましい生理的温度（２５°Ｃから４０°Ｃ）が適用される。制限エンドヌク レアーゼは通常マグネシウムイオンを要求し、ある場合は、補因子（ＡＴＰ及び Ｓ−アデノシルメチオニン）または他の薬剤を、活性のために要求する。従って 、これらのイオン源、例えば、無機マグネシウム塩、またその他の薬剤は、必要 ならば、消化混合液中に加えられる。適当な條件は、エンドヌクレアーゼの製造 業者か述べており、一般には、エンドヌクレアーゼがその最適活性條件として、 高い、中間の、または低い塩を必要とするか否かによって変ってくる。

消化混合液中のＤＮＡの量は、一般的には、１％から２０％重量の範囲にある。

大抵の場合、完了までに消化される５から２０μｇの全ＤＮＡから適当量がＲＦ ＬＰ断片の生産のために提供される。過剰なヌクレアーゼ、望ましくは、１から ５単位／μｇＤＮＡが使用される。

消化物中の断片のセットは、望ましくは、ＲＦＬＰパターンの生産のための工程 へ進められ、分析される。望まれるならば、消化物は、Ｋａｎ　ｅｔ　ａｌ、　 ＰＮＡＳ　７５　：５６３１−５６３５　（１９７８）によって述べられている ように、次の工程の前に、沈澱と再懸濁により精製することができる。この論文 は文献として、すべてがここに編集されている。

断片は、いったん生成されれば、既知の方法で分析される。断片は、電気泳動で 分析されることが望ましい。

ゲル電気泳動法は詳細がここに述べられている。キャピラリー電気泳動法は、自 動化することができ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ｆｏｓｔｅ ｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡにより、型２０７八分析キャピラリー電気泳動系の使用に よって）　、Ｃｈｉｎ　ｅｔａｌ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｎｅｗｓ　Ｅｄｉｔｉｏｎ。

Ｄｅｃｅｍｂｅｒ、１９８９に記載されている。

ＤＮＡ断片の電気泳動分離 電気泳動は、電場の影響下で大きさと荷電により、支持培地に含まれるＤＮＡ配 列フラグメントを分離する。

ゲル板または平板、たとえば、アガローズ、アガローズ−アクリルアミドまたは ポリアクリルアミド、が普通、ヌクレオチド配列の分析に用いられる。電気泳動 の條件は、断片の分離の程度に影響する。１０ヌクレオチド以下の大きさの違い で断片が分離される程度で普通は十分である。

３から５ヌクレオチドの断片の違いを解決するゲル能力が望ましい。しかしなが ら、ある目的で、少なくとも１００ｎｔの配列上の差異の区別が分析としては十 分であろう。

分析ゲルの製造と染色はよく知られている。たとえば、エチジウムプロミドを用 いて染色する３％ＮｕシーブＩ％アガロースがＢｏｅｒｗｉｎｋｌｅ　ｅｔ　ａ ｌ、　ＰＮＡＳ、８６　：　２１２−２１６（１９８９）に記載されている。シ ルバー染色を用いるポリアクリルアミドゲルによるＤＮＡの検出がＧｏｌｄｍａ ｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、３　：　２４−２６（１ ９８２）　；　ＩＪａｒｓｈａｌｌ、　Ｅｔｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　；　 ４　：　２６９−２７２　（１９８３）　、；　Ｔｅｇｅｌｓｔｒｏｍ、　Ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ。

７：　２２６−２２９　（１９８７）；及びＡ１．Ｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ。

ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７　：　７３６−７４４　（１９８９）に述べら れている。Ａ１１ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、により述べられている、シルバーにより染 色される大孔サイズ超薄層の再水和性ポリアクリルアミドゲルが好ましい。これ らの論文は文献としてすべてここに編集されている。

本発明は、以下の特徴的なしかし限定されない例によってさらに説明される。特 に記載のない限り、温度は、摂氏度で、濃度は、重量パーセントで与えられる。

解釈上、実用性に乏しい方法は、現在の時制で述べ、また、実験室で行われた方 法は、過去の時制で説明されている。

例　Ｉ ＨＬＡ　ＤＱＡ　遺伝子座の分析 ＨＬＡ　ＤＱＡＩ遺伝子座のハブロタイブは、下記のように分析された。ＤＱＡ Ｉ遺伝子座のよく知られたハブロタイブの個体からのＤＮＡが評価された。およ そ１μｇの試料ＤＮＡが、プライマーペア（各プライマー１μｇ）　、ｄＮＴＰ Ｓ　（各２．５１１Ｉｇ）及び増幅緩衝液（５０ｍＭ塩化カリウム；ＩＯｍＭ） リス−塩酸、ＰＨ８，Ｏ；　２゜５Ｂ塩化マグネシウム、ｉｏｏμｇ／ｍｌゲラ チン）中のＴａｑポリメラーゼ２．５単位を含む１００μｌの全容量中で結合し 、増幅反応混合液が作られた。

プライマーの配列は： ＳＧＤ　００１−５’　ＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＧＡ　３’　：及 びＳＧＤ　００３−５’　ＧＡＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧ　３’　、で あった。これらのプライマーは、第２エクソンの５′末端から上流およそ５００ ｂｐの配列へ、また、第２エクソンから下流５０ｂｐにハイブリダイズし、７０ ０から８００ｂｐ範囲の増幅ＤＮＡ配列を生成する。各プライマーはＡｐｐｌｉ ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ　ｍｏｄｅｌ　３０８　Ａ　ＤＮＡシンセサイザーを用 いて合成された。増幅方法は９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２° Ｃで６０秒間の３０サイクルで行った。増幅後、増幅ＤＮＡ配列は、ＰＤＬＰ型 を決定するために、４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけられた。この 場合、８対立遺伝子の増幅ＤＮＡ配列は、５つの異なる長さのＰＤＬＰ配列を生 成した（少なくとも、５ハブロタイブの存在を示す）。ＲＦＬＰパターンを生成 するために用いられるその後の酵素消化は、追加の対立遺伝子とサブ一対立遺伝 子（ハブロタイブ型）パターンを識別した。

増幅ＤＮＡ配列は分割され、制限酵素Ａｌｕｌ。

ＤｃｆｅＩ及びＭ　ｂ　ｏ　ＩＩ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈしａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、別々に消化された。消化は、５単位（１μｌ ）の酵素と、ｌＯμｌの増幅ＤＮＡ配列（およそ０．５及び１μｇのＤＮＡ）を 、製造業者の指示により製造業者から提供された酵素緩衝液中で混合して、消化 物を生成させた。消化物は、次に３７°Ｃて２時間培養されて、酵素消化を完結 させた。消化反応生成物は、およそ０．１μｇの“ラダー”ヌクレオチド配列（ 始めの長さ１２３ｂｐで１２３ｂｐに増加し、最終サイズがおよそ５、　ＯＯＯ ｂｐになるヌクレオチド対照配列；　ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ＭＤから購入可能）と混合し、ま た、４％水平超薄ポリアクリルアミドゲル（Ｅ　−ＣＡｐｐａｒａｔｕｓ、　Ｃ ｌｅａｒｗａｔｅｒ　Ｆ　Ｌ　Ａ　）を用いて電気泳動を行った。ゲルのバンド は、シルバー染色技術（Ａｌｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ７　：　７３６−７４４（１９８９）　）を用いて視覚化（染色化）された。

３つのエンドヌクレアーゼの各々による、ＤＱＡ　ｌハブロタイブの各々とのＰ ＤＬＰ群及び断片のパターンは表１に説明されている。

浄書（内容に変更なし） 要　約　書 本発明は、ゲノム全域にわたり、高度に情報を供与する多室性部位を発生するこ とができる改良されたゲノム地図作成の方法に関するものである。高度に冬型性 である上に、その座位は、領域に関係した対立遺伝子及びサブ対立遺伝子（ハブ ロタイブ）を同定するパターンの発生に用いることができる。

手続補正書（酸） 平成４年５月２２日　１弊

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ゲノム地図作成のため、高度に情報を供与する多型性マーカーを同定する ａ．染色体上の遺伝子座を同定する； ｂ．遺伝子座内の少なくとも１イントロン配列を同定する；そして ｃ．ゲノム地図作成のため、マーカーとしてイントロン配列に相当する増幅ＤＮ Ａ配列を使用することからなる同定方法。
2. ２．遺伝子座が、染色体の領域に以前に地図作成された請求項第１項記載の同定 方法。
3. ３．ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、遺伝子座の地図が 染色体に作成される請求項第１項記載の同定方法。
4. ４．ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡを配列することにより、イントロン配列の位置が決 定される請求項第１項記載の同定方法。
5. ５．対応する増幅ｃＤＮＡ配列よりも大きい長さをもつ、増幅されたゲノムＤＮ Ａ配列を生産することによって、イントロン配列の位置が決定される請求項第１ 項記載の同定方法。
6. ６．およそ１メガベースの興味ある領域のゲノム地図を作成するため、高度に情 報を提供する多型性マーカーを同定する ａ．興味ある領域からのｃＤＮＡ配列を同定する；ｂ．同定されたｃＤＮＡ配列 の地図を興味ある領域内の位置に作成する；そして ｃ．ｃＤＮＡ配列に関係する遺伝子座内の、少なくとも１つのイントロン配列の 位置を同定する。 ことからなる同定方法。
7. ７．エクソントラッピング方法により、ｃＤＮＡ配列が同定される請求項第６項 記載の同定方法。
8. ８．動物プロット分析方法により、ｃＤＮＡ配列が同定される請求項第６項記載 の同定方法。
9. ９．ＹＡＣ分析方法の使用により、ｃＤＮＡ配列が同定される請求項第６項記載 の同定方法。
10. １０．遺伝子座及び１つまたはそれ以上の隣接遺伝子座の対立遺伝子及びサプ対 立遺伝子を同定する、高度に多型性のマーカーの分析によりゲノム地図を作成す る：ａ．少なくとも２つの対立遺伝子または当該遺伝子座のハプロタイプ間の差 異を区別する遺伝変異を含むように、十分な数の非暗号配列ヌクレオチドを含む 増幅したＤＮＡ配列を生産する当該遺伝子座内のゲノムＤＮＡを増幅する；そし て ｂ．当該対立遺伝子またはハプロタイプに特異的である当該増幅したＤＮＡ配列 中における変異を同定する ことからなるゲノム地図作成方法。
11. １１．増幅したＤＮＡ配列がＳＴＳ部位に位置する請求項第１０項記載の方法。
12. １２．増幅したＤＮＡ配列がＲＦＬＰ部位の側面領域に位置する請求項第１０項 記載の方法。
13. １３．増輻したＤＮＡ配列が遺伝子座に位置する請求項第１０項記載の方法。
14. １４．増輻したＤＮＡ配列がイントロンに位置する請求項第１３項に記載の方法 。
15. １５．対立遺伝子またはハプロタイプ特異的なプライマーとして当該増輻したＤ ＮＡ配列内の当該変異がプライマー座位である請求項第１０項記載の方法。
16. １６．増幅したＤＮＡ配列の長さにおいて、当該増幅したＤＮＡ配列内の当該変 異が相違している請求項第１０項記載の方法。
17. １７．少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼによる消化後増幅したＤＮＡ配 列から生産された断片のパターンにおいて、当該増幅したＤＮＡ配列内の当該変 異が相違している請求項第１０項記載の方法。
18. １８．断片における相違が断片の数の変化である請求項第１７項記載の方法。
19. １９．断片における相違が、少なくとも１断片の長さの変化である請求項第１７ 項記載の方法。
20. ２０．当該増幅ＤＮＡ配列が少なくとも約５００の非暗号配列ヌクレオチドを含 む請求項第１０項記載の方法。