RU1788970C

RU1788970C - Способ получени полинуклеотида дл использовани в генетических исследовани х

Info

Publication number: RU1788970C
Application number: SU874203449A
Authority: RU
Inventors: Джон Джеффрис Алек
Original assignee: Империал Кемикал Индастриз ПЛС
Priority date: 1986-03-19
Filing date: 1987-10-06
Publication date: 1993-01-15
Also published as: AU7738887A; IE59859B1; YU47887A; NZ219685A; JPH0630636B2; EP0238329A3; CN87102927A; PT84502B; GB8706401D0; GB2188323B; FI871189A0; FI871189A; AU7070187A; DK140287D0; EP0238329A2; KR870009024A; DE3789679D1; NO871122L; GB8606719D0; DK140287A

Abstract

Использование: спор об отцовстве, судебна медицина, диагностика и лечение генетических расстройств, а также предрас- положенностей. Сущность изобретени : способ заключаетс в том, что осуществл ют гибридизационный анализ геномной ДНК путем скрининга библиотеки ДНК в фаге путем гибридизации с последовательностью 33,6 или 33,15 и отбор позитивных клонов с последующим выделением всей или части выставки. 1 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение может быть использовано дл получени полинуклеотидов и зондов, которые могут найти применение в спорах при установлении отцовства или в судебной медицине, или с целью предотвращени , диагностики и лечени генетических расстройств или предрасположен ностей.

Описаны различные ДНК-последовательности , которые могут быть использованы в качестве зондов дл полиморфизма человеческого и животного гономов.

Насто щее изобретение основано на обнаружении того, что могут быть получены полинуклеотиды и полинуклеотидные зонды , каждый из которых вл етс специфиче- ским дл одного единственного информативного генетического участка.

До насто щего времени было известно весьма ограниченное число ГиПёрвариа- бельных областей в человеческой ДНК, к ним относ тс минисателлиты: 5 ген инсулина , 3-ген с-На- ZasL, ген коллагена типа II и между генами глобина и 1, а также

участок D 14 S 1, определенный безым нным клоном ДНК, полученным из теломер- ной области длинного плеча хромосомы 14. Это минисателлиты существенно отличаютс друг от друга своей вариабельностью, котора заключена в одном случае только в 6 различных аллел х, обнаруженных в ги- первариабельной области коллагена, а в других их число превышает 80, как, например , в случае области D 14 S 1. Общее число гипервариабельных областей в человеческом геноме пока не известно, но веро тнее всего, оно большое. В действительности, человеческий геном может содержа т ь по крайней мере 1500 гипервариабельных. областей.

Установлено, что можно клонировать ДНК-фрагмент, идентифицированный при помощи гибридизации фрагментов геномной ДНК с полинуклеотидным зондом, способным дифференцировать ДНК при помощи сравнени с более чем одной полиморфной минисателлитной областью ИЛУ

Ё

VI

00

о VI о

со

гипервариабельным участком, например, с использованием зондов 33,6 и 33,15, которые были предложены и описаны в ветше- упом ну то и за (ev и получить из. него полинуклеотид или зонд, способный к гиб- ридизации с ДНК-фрагментом, который содержит минисателлит, кото рый вл ётс специфичным относительно определенной области или участка на геноме; вышеупом нута область или участок и представл ет собой информативный генетический участок . В насто щем изобретенйи:исдользован информативный генетический частЬк как участок, в котором можно вы вить по крайней мере 3 различных аллел в любой пробе из 100 случайно выбранных индиви; дов. Этот факт заключаетс в том что участок (область) имеет аллельную вариацию не менее 3. Существенным здесь вл етс то, что проба из 100,500 или 1000 индивидов действительно, подбираетс случайно, так как обычно вполне во-Зможно идёйтифйци- ровать 100, 500 или 1000 индивидов , кото- рые имеют менее 3 аллелей -в данной информативной генетической области при помощи просеивани достаточно большого количества членов общей попул ции;

Уем выше этот полиморфизм в данной информативной генетической области, тем более эффективным и информативным бу- дет специфический зонд дл этой области при идентификации индивида с целью установлени отцовства или судебной эксперти- ,зы.

Относительно применений к человеку насто щего изобретени выражение информативный генетический участок, как оно здесь используетс , может быть опрёделено как область, в которой можно разлйчить по крайней мере 3 аллел в ДНК| экстрагированной .из любых 20 линий кле- ток из списка, приведённого ниже. Эти ли- нии- клеток сданы на хранение в Американское собрание типов культур (АТСС): .,.,.,.,.-.,: s/ , -::..

.

-... . :..-,

003)

НОМЕР КУЛЬТУРЫ В ATGC- CCL2 CCL 30 GCL54 :-- CCL 65 v CCL 66 CCL 72 -- CCL 75 ; : CCL 76 :1 - CCL 85 CCL 83 CCL 87 .- CCL95

5 10 3 15 0 5

0

5 : 0 5

, 1

6

5

Detroit 55,1.:

RPMI6666.:

RPMI7666 .

CCRF-CEM

CCRF-SB

HT-1080

HG-261

CHP3(M.W.)

LL47 (MaDo)

HEL299

M-24

HFUf ; ч

Wi-ТбоЗ

MRC-5 IMR-90 LS 174T TL86(LeSa) LL 97A (AIMy) HLF-a CCD-13Lu CCD-8LU CCD-11lu CCD-14Br CCD-16Lu CCD-18Lu CCD-19Lu

CQL 1 ГО rv

:,. VCCL Tt

CCL 114 /,::

cct ffg 7

CCL 120 CCL 121 CCL 122 . CCL 132 CCL 135 CCL 137 CCL 151

5 CCL 153 CCL 154 CCL. 171 CCL 186 CCL 188 CCL 190 CCL 191 CCL 199 CCL200 CCL 201 CCL 202 CCL 203 - CCL 204 . CCL 205 ; CCL210

Приведенные выше линии клеток можно получить из АТСС, 12301 Паклаун Драйв, Роквилл , Мерилэнд 20852-1776, США, а их список имеетс в каталоге АТСС линий клеток и гибридов. Все вышеупом нутые линии клеток сданы на хранение в АТСС по 1985 г.

Таким образом, насто щее изобретение использует минисателлит, который вл етс специфическим относительно определённой области или участка в геноме, имеет аллельную вариацию, равную не менее 3. Изобретение включает клонирование фрагмента ДНК, идентифицированного при помощи гибридизации фрагментов геном- ной ДНК с полинуклеотидным зондом, который способен дифференцировать ДНК по более чем одной полиморфной минисател- литнрй о бласти или гипервариабельному участку; и получение, из него полинуклео- тида,. способного к гибридизации с фраг- ментом , который содержит минирате ллит, специфический относи- тельно определенной области или участка в геноме; и, имеет аллельную вариацию, равную не менее 3 (100). ;,.,,......

Прлинуклеотидный зонд содержит на- р ду с меченQи.компонентой или компонентой-маркёром полинуклеотид, содержащий по крайней мере три тандемных поетбра (при пб крайней, мере 70% гомологии) по- следовательностей, которые гомологйчйьт 1 минисателлитной области генома в такой

степени, котора позвол ет осуществить гибридизацию зонда с соответствующим фрагментом ДНК, полученным при помощи расщеплени пробы ДНКэндонуклеазой рестрикции .

Каждый повтор содержит дро, которое имеет по крайней мере 70% гомологичность с минисателлитной ДНК из различных ге- номных участков, дро имеет длину от 6 до 16 нуклеотидов, общее число нуклеотйдов внутри повтор ющего блока, которые не участвуют в формировании дра, не превышает 15.

В предпочтительном варианте вышеупом нутый ДНК-фрагмент содержит мини- сателлит из минисателлитной области или гипервариабельного участка, который может быть обнаружен при помощи полинук- леотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности , комплементарной последовательности: .

(A) AGGG CT GG A GG . .(1) (в которой Т вл етс Т или U, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности, комплементарной последовательности:

AGAGGTGGGCAGGTGG (2) (в которой Т вл етс Т или U).

Рассматриваетс также нуклеотидна последовательность с ДНК-фрагментом, полученным в результате расщеплени ге- номной ДНК эндонуклеазрй рестрикции, причем вышеупом нутый фрагмент ДН К содержит минисателлит из вышеупом нутой минисателлитной области или гипервариабельного участка.

отличающийс тем, что:

1) вышеупом нута область или участок имеют аллельную вариацию (как она была определена выше), равную по крайней мере 3(100), и

2) вышеупом нута область или участок могут быть обнаружены при помощи пол- инуклеотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности (включа также комплементарные последовательности):

(A)AGGGG CTGGAGG(1) (где Т обозначает Т или U, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности (включа комплементарные последовательности):

AGAGGTGGGCAGGTGG (2), где Т - Т или U. ---В изобретении используютс следующие термины.

Гипервариабельность.

Область человеческой, животной или растительной ДНК называетс гипервариабельной , если она может находитьс в многочисленных формах, например, в том, что касаетс длины или пор дка. Минисателлит.

Область человеческой, животной или растительной ДНК, котора составлена из тандемных повторов короткой ДНК-последовательности . Все повтор ющиес блоки не об зательно должны обладать совершенной идентичностью. Полиморфизм.

Если ген или любой фрагмент ДНК обладает изменчивостью от одного индивида к другому или между данными спаренными

хромосомами индивидов, то говор т, что он полиморфный.

Тандемна последовательность. Это полинуклеотидна последовательность , котора точно или с некоторыми изменени ми повторена в р д. В общем случае, последовательность называетс состо щей из тандемных повторов, если такой повтор содержитс по крайней мере три раза .

% гомологичности,

При сравнении двух повтор ющихс или тандемных повтор ющихс последовательностей А и В гомологичность в процентах выражаетс числом пар оснований в А,

которое меньше числа вставок, замещений или удалений пар оснований в В, которое необходимо было бы осуществить дл того, чтобы получить А, выраженное в процентах. Таким образом, гомологичность в процентах между двум последовательност ми ATGC и AGC равна 75%.

Согласованное дро (последовательность ).

Последовательность, котора может

быть идентифицирована как ближайша пара среди нескольких повтор ющихс последовательностей; в общей случае среди повтор ющихс блоков двух или более различных минисателлитов.

Полинуклеотиды, относ щиес к насто щему изобретению, могут быть идентифицированы при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего любую одну последовательность , выбранную из следующих последовательностей: .

AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCCAGG

GAGPGGC 3

GTGGAYAGG 4

TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5

GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6 GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG

AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC8

TGTGTGTAATGGGTATAGGCAGGGCCCCGGC

AAGGGGGTCTGGYX 9

(в которых Y вл етс С, Т или U, X вл етс G или С, R вл етс А или G, а Т вл етс Т или U) или-их тандемных повторов или Ш- следовательностей, комплементарных к

ним. .

В общем случае, полинуклеотиды и зоны специфичны, относительно определенного участка при очень строгих услови х гибридизации. В этом отношении выражение специфичный относительно определенного участка используетс в св зи с полинуклеотидом или зондом с тем, чтобы показать, что гюлинуклеотид или зонд можно использовать при услови х гибридизации , которые гарантируют, что полинуклеотид или зонд гибридйзируетс только с одним единственным специфичным участком. .;,.,,:

Однако, необходимо иметь в виду, что зонды, специфичные относительно определенного участка, если их иело льзуют п рй менее строгих услови гибридизаций, способны дифференцировать ДНК при помощи сравнени с более чем одной полиморфной минисателлитной областью или гипервари- абельным участком и, таким образом, их можно использовать дл идентификации других информативных генетических участков ,.. -: ;- ;

;.-Повторы, которые не вл ютс точными , именуютс в соответствующих местах как несовершенные повторы. Такие повторы , тем не менее, могут быть узнаны как точные повторы. В общем случае, это будет означать, имеетс в среднем по крайней мере 70% гомологичность между всеми повтор ющимис блоками. В предпочтительном варианте существует по крайней мере 80%, в более предпочтительном варианте по крайней мере 85%, особенно предпочтительном - 90 %:гомологичность м ёжду всеми повтор ющимис 1 блока ми. Необходимо иметь в виду, однако, что неуклеотидна последовательность или повтор ющийс блок не об зательно повтор етс целиком, если это необходимо. .

Число повтор ющихс блоков в предпочтительном варианте должно быть не менее 5, в еще более предпочтительном варианте не менее 10. В общем случае, измен етс в области от 10 до 40, но, в прйнципе , может быть произвольном чй сл ом, даже в области 1-10000.

В предпочтительном варианте полинуклеотиды и полй нУклёЬтидныё зонды содержат любую последовательность, выбранную из формул с 3 по 9, приведенных выше.

Изобретение позвол ет идентифицировать информативную генетическую область в человеческом гёнЬ мё и прй этом позвол ет

получить зонды, специфические относи тельно определённых областей, причем

каждый .зонд, специфичны, относительно

определённой информативной, геномной

области. Была осуществлена, в частности, идентификаци шести различных .информа- тив нШ генетических участков, причем эти участки обладаю т очень высокой гетерози- ТотнОстью в испытываемой попул ции (не

мейее ЭО) и бнй1 наход тс среди наиболее полиморфных из изолированных до сих пор. За витель получил специфический относительно определенной области зонд дл каждой области, эти зонды были обозначены рЯдХ,Я1у13 1.,ЯМ$8,ЯМ$31,ЯМ532 и Я MS 43 (они соответствуют определенным выше зондам).. ,-..,.,....... .--..

Степё йь индивидуальности генотипов, Определенных при.помощи,специфичности

Ьтн ОЙ и тел ьно области зондов, может быть

о Ценёйа из гёт еррзиготности (Н) в каждой области. Средн аллельна частота q в не: котором участке задаетс при помощи (1-Н). а веро тность того, что два случайно вы5 бранных индивида включают один и тот же генотип, равна q (2-q). Эта веро тность не- обОСйованного св зывани двух индивидов измен етс от 0,02 дл Я MS 8 до 0,0002 дл ЯМЗ 31, причем эта оценка вл етс консер0 вативной в том смысле, что неоднородность по q снижает эти веро тности. Веро тность необрснованного св зывани дл всех шести мийисателлитных зондов равна приблизительно 10 , что сравнимо с

5 веро тностью того, что два случайно выбранных фингепринта ДНК, обнаруженных при помощи одного зонда, специфичного относительно нескольких областей, идентичны (см. патент Великобритании №

0 2166445). Напротив, веро тность того, что две области идентичны дл данного гипер- варйабельного участка, задаетс формулой 1/4(1 + q) . Веро тность идентичности дл всех шести зондов равна 0,0004 по.

5 сравнению, с примерно 10-7 дл фингепринта ДНК с использованием одного зонда, специфичного относительно, нескольких областей.;. ....;,. Эти структуры обеспечивают.высокую

0 степень индивидуальной специфичности,

и хот она не столь высока по сравнению с

той/которую можно получить при исполь

зб вании зондов относительно нескольких

областей или при использовании последо5 . вателйной гибридизации с зондами, специфичными относительно о.пределе.нной области (см, выше). Оба типа зондов, объединенные зонды или отдельные зонды, специфичные относительно определенной

; , 1 N - Ч - - -:. - , .-... ...

области, могут оказатьс особенно эффективными при изучении клеточных химер.

В приводимых ниже примерах используемые зонды 33,6 и 33,15 описаны в патентной публикации Великобритании №2166445. Они содержат повтор ющуюс последовательность:

(A)AGGGCTGGAGGn

AGAGGTGGGCAGGTGG соответственно.

П р и м е р 1. ДНК выдел ют из белых кров ных клеток и из трансформированной вирусом Энстейна-Барра линии клеток лим- фобластов. Осуществл ют переваривание рестриктазами. Фрагменты двунитевой ДНК зондов изолируют при помощи электрофореза на бумаге ДЕ81, а затем снабжают 32Р-меткой при помощи любой олигонуклеотидной затравки. Однонитевой минисателлитный зонд 33,15 получают в соответствии с описанием, данным Джеффри- сом и др. (1985), Nature, 314, стр. 67-73.

Клонирующий гипервариабельный фрагмент.

600 мкг ДНК линии клеток лимфобла- стов, обработаной ферментом Sau ЗА, фракционируют при помощи электрофореза в 0,5%-ном агарозном геле и фракции соответствующих размеров собирают с исполь- зованием электроэлюировани на мембрану дл диализа. После двух циклов препаративного гелевого электрофореза фрагмент g подвергают 1000-кратной очистке (выход 150 нг ДНК) 20 нгэтой очищенной фракции подвергают лигированию с 60 нг ДНК Ah 47.1, выделенной после расщеплени ферментом Bam HI, упаковывают в лабораторных услови х и помещают на пластинки с культурой E.coli Wh 95/803, sup Е, sup F, Lsd Rk, hsd Mk+, ton A, trpR, met Д лизогенные дл P2 с тем, чтобы отобрать рекомбинанты. Полученную в результате библиотеку рекомбинатного фага 1500 просеивают при помощи гибридизации на пластинке с минисателлитным зондом 33,15. Четыре положительные пластинки снова распредел ют по пластинкам и отбирают на культуре E.coli ЕД8910(803, sup Е, sup F, rec В21, res C22, RSdS) и ДНК рекомбинантного фага выдел ют. Sau ЗА-вставку рекомбинантного фага дЗ субклонируют по сайту Ват HI в плазмиду pU C13 и культивируют в res А-производной культуре E.coli J M83, J M83, Д (res A-srlP)306:Tn10.

Анализ ДНК-последовательности.

ДНК- рАд 3 обрабатывают ультразвуком , отбирают по размеру и клонируют в сайт Sma 1 ДНК М13 тр 19. Чтобы определить ДНК-последовательности области из тандемных повторов в рАд 3, анализируют последовательность у 12 случайных клонов при помощи процедуры анализа концов

ДНК. 8 из этих клонов получают из миниса- теллитной области тандемных повторов в рАд 3 и используют дл определени согласованной повтор ющейс последовательности . Клоны М13, содержащие области с 5 и З -концами, обнаруживают при помощи гибридизации с Р-мечеными зондами А и В (см. черт.1, описанный ниже) и анализируют последовательность с тем, чтобы определить последовательность боковых областей,

а также начальные и концевые пункты мини- сателлита.

Результаты.

Изол ци специфичного минисателли- та..

Индивид III 9 из родословной Гуджара- ти, описанный Джеффрисом и др. (1986) Am. J. Hum. Genet. 39. стр. 11-24) подвергают анализу на (СНПГП) сохранение наследственных признаков гемоглобина плода и ее

фингепринт ДНК, обнаруженный после обработки Sau ЗА при помощи минисателлит- ного зонда 33,15, содержит полиморфный фрагмент в 8,2 т.п.о. (тыс ч пар оснований) (фрагмент черт.1а), который имеет тенденцию образовывать сочетани с СНПГП у других членов этого рода. Этот ДНК-фрагмент подвергают очистке от других ми ниса- теллитных фрагментов с использованием двух циклов препаративного гелевого электрофореза . ДНК из индивида III 9 переваривают ферментом Sau ЗА, а фрагменты длиной 6-9т.п.о. собирают при помощи препаративного электрофореза. Эти фрагменты снова подвергают электрофрезу.

Отдельные порции ДНК III 9 обрабатывают ферментом Sau ЗА, каждую фракцию подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном геле и провод т дотгибридизацию с минисателлитным зондом 33,15. Фрагмент

g (8,2 т.п.о.), который гибридизуетс с СНППГ, подвергают примерно 1000-кратной очистке во фракцию 3.

Фрагмент g, обнаруженный в продукте обработки ферментом Sau ЗА и подвергнутый очистке приблизительно в lt)00 раз, клонируют в A L 47.1 и затем перенос т на Р2-лизогенную гее + культуру E.coli с тем. чтобы отобрать рекомбинатный фаг. Полученную в результате библиотеку просеивают при помощи гибридизации с зондом 33,15. При этом получают четыре положительных бл шки. Их снова помещают на пластины (0-8 pfu (бл шку) {С гее В, гее С культурой E.coli} с тем, чтобы получить

бл шки нормального размера (1 мм в диаметре ). Далее два клона Ад 1 и Яд 3 анализируют и обнаруживают, что они содержат Sau ЗА-вставки размерами 7,7 и 7,8 т.п.о. соответственно . Оба эти клона получают из полосы q, но они короче полосы g на 0,5 и 0,4, т.п.о. соответственно. Так как не было какой-либо неоднородности в размерах Sau ЗА-вставки как в клоне Яд 1,таки клоне Ад 3, выращенных на res В, res С культуре E.coli (эти данные здесь не приведены), отсюда следует, что часть вставки была утер на в каждом клоне в процессе их первоначального переноса на гее + культуру E.coli.

Выходы ДНК Яд 1 и Яд 3 были очень низкими (1 % от выхода рекомбинатной ДНКЯ1 47.1), что указывает на необычные свойства роста таких минисателлитных клонов. Поэтому Sau ЗА-вставкусубклонируют в PU C13 и перенос т в гее А-производную культуры E.coli J M83. Полученный в результате субклон , р Я g 3 содержит Sau ЗА-вставку в 7,1 т.п.о., что на 6,7 т.п.о. короче, по сравнению с вставкой в дЗ.

Организаци минисателлитного фрагмента д, .

Структуру минисателлитного фрагмента в рЯдЗ определ ют при помощи рестрикции и анализа ДНК-последовательности.

Карта дл Sau ЗА-вставки в р Я g 3 построена при помощи эндонуклеазы сечени I (A), Dde I (I), Hae III (H), Mb II (М), Pst I (Р) и Sau ЗА (S). Сайты сечени дл Hint I или RS al отсутствуют. Вставка в 7,14 т.п.о. содержит 171 тендемный повтор последовательности в 37 п.о. (пар оснований) плюс 747 п.о. боковых дл ДНК.

ДНК- последовательность гипервариа- бельного фрагмента g содержит область с 5 и,3 конец и минисателлит вместе с повтор ющимис последовательност ми трех случайных областей (а-с) из этого миниса- теллита, начало обращенного Alu-фрагмен- та, несколько простых областей последовательности в 5 -области, согласованную последовательность (соп) минисателлитного повтор ющегос блока в 37 п.о. второй повтор ющийс блок в области с содержит сайт рестрикции Hae III, и эта область образует внутренний сайт Hae III в минисателлите.

Клон р Я g 3 содержит минисателлит в 6,3 т.п.о., лишенный сайтов рестрикции, за исключением единственного внутреннего сайта Hae III. Этот минисателлит составлен из 171 повтора блока в 37 п.о ., который содержит последовательность G Т G G G С А G G . Эта последовательность в точности соответствует наиболее инвариантной части последовательности дра в 11-16 п.о., котора ранее была идентифицирована как сочетающа с с несколькими различными человеческими минисателлйтами. Повтор ющиес блоки не вл ютс полностью одно- родными. Анализ последовательности нескольких случайно выбранных областей внутри этого минисателлита вы вл ет ограниченное количестбо измёнений повтор ющейс последовательности. Большинство вариантов, включающих делецию в 4 п.о., который продуцирует под множество повтор ющихс блоков в 33 п.о., распространены по более чем одному повтор ющемус блоку . Один вариант (трансверси А - С в области С) создает единственный внутренний сайт Hae III и он вл етс единственным, обнаруженным в одном повтор ющемс блоке. Начальные и концевые повтор ющиес блоки минисателлита больше отличают- с последовательност ми, чем внутренние повторы.

Минисателлит в р Я g 3 содержит боковую не повтор ющуюс ДНК с нормальной

плотностью сайтов рестрикции. Начало 5 - области состоит из головной части обращенного Alu-элемента. Оставшиес 5- и 3- области, определенные с использованием зондов гибридизации а и Ь, вл ютс уникальной последовательностью ДНК и гибридизаци осуществл етс только на этом участке ДНК (эти данные не приведены). 5 - область содержит значительное количество ДНК с простой последовательностью (полипурин и (АСС)п).

Минисателлитный фрагмент g обнаруживает единственный полиморфный участок .

Дл того, чтобы определить, можно ли

использовать полный клонированный мини- сателлитный фрагмент в качестве зонда гиб- ридизации дл специфического обнаружени соответствующего участка в человеческой ДНК Sau ЗА-вставку из р Я g 3

подвергают гибридизации в присутствии конкурентной ДНК человека, обработанной ферментом Hinf I.

При помощи рЯд 3 обнаружено Менде- лево наследование полиморфных ДНК- фрагментов. 8 мкг человеческой ДНК обрабатывают ферментом Hint I, подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном геле , гибридизуют с Sau ЗА-вставкой из р Яд 3 в 1 х SSC при температуре 65°С в присутствии 6%-ного раствора полиэтиленгликол

и 50 мкг/мл конкурентной ДНК плаценты

человека после гидродинамического фрагментировани с использованием щелочи, и

промывают в 0,2 х SSC при температуре

65°С. При помощи р A g 3 обнаруживают единственный участок, который вл етс гетерозиготным во всех указанных индивидах . Наследование аллелей вл етс менделевым.

При весьма строгих услови х (0,2 х SSC, 65°С) обнаруживают либо один, либо два прогибридизировавшихс фрагмента во всех проверенных индивидах. При помощи р A g 3 обнаруживают фрагмент g в 8,2 т.п.о. в ранее обследованных родственных ин- Д и видах III 8, что подтверждает клониро- вание полосы д. При менее строгих услови х (1 х SSC, 65°С) обнаруживают дополнительный , слабо гибридизующийс , полиморфный ДНК-фрагмент, ДНК-фрагменты , обнаруженные при помощи р Яд 3 при очень строгих услови х, классифицированы как аллели одной области. Этот участок не св зан с полом и, как было установлено, не вл етс существенным, но половые св зи в двух больших родословных были исследованы не полностью (исследовали 61 потомка, Z 0,18 при в 0,43; эти данные не приведены). Он ведет себ как аутосомна область и расположен на 7 хромосоме .

Полиморфное изменение в минисател- литном участке.

Продукты обработки ферментом Hinf I ДНК из 79 случайно выбранных британцев кавказского происхождени отбирают при помощи вставки из р A g 3, сначала отдельно , а затем в группах по 14 человек (1 мкг ДНК от индивида), подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле длиной 35 см с тем, чтобы получить максимум аллель- ного разрешени . Длину минисателлита в самом коротком типичном аллеле определ ют при помощи геномной карты этого фрагмента в томозигйте, использу боковые зонды а и b одной копии.

Количество повторов на аллель очень приблизительное и зависит от пропорции в минисателлите повтор ющихс блоков в 37-38 п.о. За исключением короткого типичного аллел , оставшиес аллели попадают в выборку либо однажды (42 аллел ), либо дважды (12 аллелей), либо три раза (12 аллелей ), либо четыре раза (5 аллелей). Такое распределение не очень сильно отличаетс от ожидаемого, если все эти аллели встречаютс редко (g 0,0081, 2 (4 ф.р.) 4,0) и оно, следователь но, согласуетс с простой моделью одного типичного короткого аллел (д 0,165), причем в этой попул ции одинаково редко присутствуют Т03 аллел (д 0,0081 на аллель).

По крайней мере 77 различных аллелей могут быть разрешены вэтойпопул цион- ной пробе, причем количества повторов измен ютс в области от 14 до примерно 525

на аллель. Гомозиготы в этой попул цион- ной пробе все гомозиготны с самым коротким аллелем. Приведенные оценки дл числа аллелей и средней частоты дл редких аллелей ограничиваютс разрешением гелевого электрофореза и реальные числа дл аллелей различной длины в этой пробе могут быть больше.

Распределение длин аллелей не совсем произвольно, а содержит триWacca аллелей с коротких (14-16 повторов), средних (41-68 повторов) и длинных (107-424 повтора ). Бимодальное распределение длин аллелей было ранее отмеченО дл кавказцев в гипервариабельной области, расположенной от 5 до гена человеческого инсулина (Nature, 1982, 295, стр. 31-35), хот така бимодальность не очевидна дл негрев.

Изол ци фрагмента g подтверждает, что большие и высокополиморфные ДНК- фрагменты в фингепринте ДНК могут быть клонированы с тем, чтобы получить специфичные относительно Определенной области зонды, пригодные дл изучени отдельных гипервариабельных областей.

Несмотр на то, что фрагмент g можно кло- нировать в бактериофаг А, полученные в результате клоны про вл ют необычные свойства роста на гес+ культуре E.coli. Это может приводить к изъ тию минисателлитных клонов из известных амплифицирован- ных человеческих библиотек в фаге. Клонированный минисателлит не стабилен как относительно внешних, так и внутренних возмущений при субклонировании в pU

С13 в гее А культуре E.coli. Рекомбинантный рАд 3 тер ет примерно 30 повтор ющихс блоков по сравнению с фрагментом р А д 3. следовательно, не полностью отражает организацию фрагмента д.

Клонированный ДНК-фрагмент имеет ожидавшуюс структуру дл минисателлита , что подтверждает тот факт, что фрагмент g не был получен из ДНК с более длинным сателлитом. Несмотр на присутствие как

последовательности дра в каждом повтор ющемс блоке, так и части Alu - последовательности в 5 -области, клонированный фрагмент g в присутствии конкуретной человеческой ДНК действует как специфичный

относительно определенной области зонд. Неудача при использовании рАд 3 с целью эффективного обнаружени других, содержащих дро, минисателлитов, объ сн етс

присутствием дополнительной не дерной ДНК в каждом повтор ющемс блоке.

Клонированный минисателлит про вл ет полиморфизм по длине, что веро тно объ- сн етс аллельной вариацией как в количестве повтор ющихс блоков, так и в отношении повтор ющихс типов с длиной 37 и 33 п.о. в каждом аллеле. В каждой случайной попул ционной пробе из 158 хромосом можно обнаружить один распростра- ненный и по крайней мере 76 редких аллелей. Этот участок вл етс гораздо более полиморфным, чем больша часть, или даже все клонированные человеческие ги- первариабельные области, которые охарактеризованы до насто щего времени, включа селекцию относительно коротких клонированных минисателлитов.

Гетерозиготность в этом участке составл ет не менее 96,8%, причем больша часть гомозигот рождаетс из короткого распространенного аллел , Новые аллели на этом участке возникают либо в результате изменени количества повторов, либо за счет сдвига рамки в процессе репликации ДНК, либо за счет неравного обмена. Предположив наличие случайного дрейфа мутации, вычисл ют параметр 4 NeV ( в), где Ne - эффективный размер попул ции, а V - скорость мутации на одну гамету, исход из количества различных аллелей, отмеченных в попул ционной пробе. За витель рассчитывает, что он содержитс в диапазоне 60-90 дл этого участка, в зависимости оттого, включал или не включал распространенный короткий аллель . Так как Ne дл человека равен примерно 10 , скорость мутации V в аллели новой длины в этом участке равна приблизительно 0,002 на одну гамету. Это значение дл V занижено, так как количество обнаруженных аллелей лимитируетс разрешением ге- лев ого электрофореза и так как не существует бесконечного числа потенциальных разрешаемых аллелей. Средн длина ДНК минисателлита на этом участке составл ет 5 т.п.о. и, следовательно, скорость мутации (рекомбинации) на 1 т.п.о. минисателлита составл ет 4 х 10 по сравнению с на 1 т.п.о., установленную дл других, содержащих более короткое дро , минисателлитов и средней скоростью мейотической рекомбинации 10 на 1 т.п.о. дл человеческой ДНК (Nature, 1985, 314, стр.67-73), Таким образом, скорость образовани новых аллелей в этом участке мини- сателлита гораздо более высока . По-видимому, скорость мутации дл коротких аллелей вл етс относительно небольшой , что может служить объ снением того,

как самый короткий аллель мог дрейфовать, чтобы обеспечить значительную частоту в попул ции, не подверга сь разрушению в результате неравных обменов в течение этого процесса.

Способ фингепринта ДНК представл ет собой эффективное средство дл индивидуальной идентификации и дл установлени семейного родства, например, в спорах об

0 отцовстве и иммиграции, Точность этого способа определ етс низкой средней веро тностью того, что некотора полоса имеетс у двух случайно выбранных индивидов. Дл британцев кавказского происхождени

5 величина X была оценена как 0,2 дл Hine l-фрагментов фингепринта ДНК, с длиной более 4 т.п.о. В тех случа х, когда полоса встречаетс у нескольких индивидов (то есть, когда полоса одного индивида соче0 таетс у второго индивида с полосой той же подвижности и авторадиограммой интенсивности ), то не сно, представл ют ли сочетающиес полосы идентичные аллели одного и того же минисателлитного участ5 ка.

Использу зонды 33,6 и 33,15 фингепринта ДНК, можно заметить расщепление до 34 диспергированных аутосомных участков у больших групп людей, состо щих из

0 братьев и сестер. Дл большей части проанализированных участков только один из двух аллелей был отмечен во всей совокупности разрешенных фрагментов фингепринта ДНК значительных размеров ( 4

5 т.п.о.), что наводит на мысль, что существуют большие различи по размерам между минисателлитными аллел ми, причем много аллелей расположено в плохо разрешаемой ( 4 т.п.о.) области фингепринта ДНК. Это

0 также можно заметить дл клонированного минисателлита; Hinf l-аллели на этом участке варьируютс по длине от 1,7 до 20,4 т.п.о., а распределение частот аллелей показывает , что оба аллел из этого участка могут

5 быть разрешены в фингепринте ДНК только дл 40% индивидов в то врем , как ни один из аллелей не обнаружен у 14% человек.

При помощи минисателлитных зондов 33,6 и 33,15 обнаружены примерно 60 ги0 первариабельных участков.

В приводимом ниже примере 2. используют следующие материалы и приемы.

а) Клонирование селекции больших минисателлитов .

5Собирали 5 мг ДНК крови от каждого из 40 случайно выбранных индивидов, гид- ролизуют ферментом Sau ЗА, а фрагменты в 5-15 т.п.о. изолируют при помощи пре- паративного электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле с последующим электроэлюированием на мембрану дл диализа. Очищенную фракцию подвергают электрофорезу во втором препаратйвнрм геле, с тем, чтобы удалить все сЛеды загр зн ющих небольших Sau ЗА-фрагмёнтов. 50/нг фракции в 5-15 т.п.о. лигируютс ТООнгД.47.1 -ДНК, полученной после расще плени ферментов Bam HI (Gene, 1980, 20, стр.249-259), упаковывают в лабораторных услови х, создают библиотеку и отбирают с использованием человеческих минисателлитных зондов 33,6 и 33,15. Положительные бл шки изолируют в соответствии е описанием, приведенным в примере 1, с тем, чтобы получить МС-се- рии рекомбинантного фага.

b) Изол ци минисателлитных зондов гибридизации.

ДНК рекомбинатного фага переваривают ферментом Sau ЗА и большой фрагмент дл вставки отдел ют от малых фрагментов векторов при помощи электрофореза в агаре с низкой температурой гелеобразовани . Гелевый срез, содержащий вставку, раствор ют в 3 объемах воды при температуре 65°С, а порции, содержащие 10 нг ДНК вставки, снабжают меткой с использованием 32Р при помощи олигонуклеотидной затравки .

c) Гибридизации по Саузерну.

Пробы геномной ДНК обрабатывают ре- стриктазами и подвергают электрофорезу. ДНК перенос т на фильтры, фиксируют при помощи ультрафиолетового облучени и провод т предварительную гибридизацию при 65°С в течение 5 мин в 0,5 М фосфате натри , 7% ДСН (додецил сульфата натри ), 1 ММ ЭДТА (рН 7,2). Затем фильтры гибри- дизуют в течение ночи с 0,5 мг/мл Р-мече- ной ДНК зонда (удельна активность примерно 109 имп/мин/мкг ДНК) в присутствии 25 мкг/мл разрезанной однонитевой конкурентной ДНК плаценты человека. После гибридизации фильтры промывают при температуре 65°С в 40 мм раствора фосфата натри , 1% ДСН (рН 7,2), затем промывают при температуре 65°С в 0,1 х SSC (15 мм NaCI, 1,5 мм тринатрий цитрата, рН 7,0), 0,1% ДСН, Фильтры оставл ют на авторадиографию в течение от 3 часов до 1 недели при температуре - 80°С в присутствии интенсифицирующего экрана.

d) Определение тандемной повтор ющейс последовательности МС-рекомби- нантов..-.--

Каждую МС-рекомбинантную ДНК подвергают обработке ультраз в уком, отбирают фрагменты размером 0,3-0,6 т.п.о. и клонируют в сайт Sma 1 М 13 mp 19. Рекомбинан- тный фаг отбирают при помощи гибридизации бл шек с Р-меченой МСвставкой ДНК. 10 строго.положительных од- нонитевых ДНК фага из данных рекомби- нантов сравнивают парами при помощи С-теста. Больша часть ДНК разбиваетс на

две группы в соответствии с С-тестом и поэтому весьма правдоподобно, что они получены из длинной тандемно повтор ющейс области Я MS-вставки, Два М13-рекомби- нанта каждой из двух комплементарных

групп анализируют на состав последовательности при помощи метода концевого лечени леотидных цепей (Сангер, Никлен и Кулсон (1977), Proc. Natl. Acad) с тем, чтобы определить повтор ющуюс после довательность каждого МС-рекомбинанта на обеих нит х. :

П р и м е р 2. а) Выделение гипервариа- бельных зондов ДНК . Sau ЗА-фрагменты после селекции по

размеру в области 6-15 т.п.о. из ДНК, собранной у 40 случайно выбранных индивидов , клонируют в векторе с замещённым сайтом Bam HIAL47.1. Так как человеческие минисателлиты могут обладать существенной аллельной вариацией по длине, применение объединенных человеческих ДНК с целью клонировани больших Sau ЗА-фраг- ментов, должно увеличить количество клонируемых гипервариабельных участков .

которые содержат большие Sau ЗА-аллели. Из библиотеки, состо щей из 2000 рёком- бинантов, изолируют 5 фагов при помощи гибридизации с человеческим минис ател- литным зондом 33,15, а дополнительные 5

фагов обнаруживают при помощи зонда 33,6 с тем, чтобы получить МС-серии реком- бинантов.

Дл того, чтобы определить, может ли каждый Я MS-рекомбинант действовать как

специфический относительно определен- ной области зонд дл гипервариабельного минисателлита, Sau ЗА-вставку каждого ре- комбинанта подвергают гибридизации в присутствии человеческой конкурирующей

ДНК, гидролизованной рестриктазой Hinf 1 оттрех случайно выбранных индивидов, при гидролизе рестриктазой Alu 1 дл Я MS 32, минисателлитные тандемные повтор ющиес блоки которого содержат сайт Hinf 1.8

из 10 рекомбинантов гибридизуют с одним или двум большими вариабельными ДНК- фрагментами в каждой из испытуемых человеческих ДНК. Четыре рекомбинанта, обнаруженных при помощи зонда 33,6 (Я MS

8, 40, 41 и 47) гибридизуютс в ту же структуру вариабельных ДНК-фрагментов и, следовательно , они получены из того же гипервариабельного участка. 2 мкг пробы ДНК от трех, не св занных между собой

19

20

индивидов переваривают ферментом Hint 1, подвергали электрофорезу в 0,8%-ном агарозном геле, гибридизуют по Саузерну с 32Р-мечеными Sau ЗА-вставками из р Яд 3 (пример 1),ЯМ58 и Я MS 40, как это описано в пункте материалы и методы. Фильтры промывают в 0,1 х SSC при температуре 65°С, а затем получают авторадиограмму в присутствии интенсифицирующего экрана в течение 1 дн или 1 недели. Я MS 8 и Я MS 40 обнаруживают один и тот же-гипервариа- бельный участок и дополнительные вариа- бельные ДНК-фрагменты.

Оставшиес рекомбинанты Я MS 1, 31, 32 и 43 получают из других участков, которые не включают ранее охарактеризованный р Я g 3-участок (см. пример 1). Хот ни один из этих Я MS-рекомбинантов не дает фингепринтов ДНК сложных вариабельных фрагментов, большинствоЯ MS-зондов еженедельно подвергают кроссгибридизации в дополнительные полиморфные ДНК-фрагменты , если авторадиограмму снимают более длительное врем .

ДваЯМЗ-рекомбинанта, обнаруженные при помощи зонда 33,15, Я MS 3 и Я MS 30, не имеют специфичного участка в человеческой ДНК, гидролизованной Hinf 1 или Sau ЗА как в присутствии человеческой конкурирующей ДНК, так и без нее.

Таким образом, несмотр на известные ранее трудности при клонировании больших и нестабильных человеческих миниса- теллитов, за витель смог показать; что по крайней мере некоторые из самых больших и наиболее вариабельных ДНК-фрагментов, обнаруженных в фингепринте ДНК, поддаютс клонированию в бактериофаге Я при условии, что эти вставки стабилизированы при помощи переноса фага в культуру-хоз ина гее ВС E.coli.

b) Определение блоков повтор ющейс последовательности клонированных мини- сателлитов.

Случайные сегменты ДНК-вставки из каждого Я MS-рекомбинанта анализируют на состав последовательности с тем, чтобы определить, каждый ли клонированный ги- первариабельный участок состоит из тан- демно повтор ющегос минисателлита. Показано, что все Я MS-клоны состо т главным образом изтандемных повтор ющихс блоков, длина которых измен етс в области от 9 п.о. дл Я MS 1 до 45 п.о. дл Я MS 43.

Случайные сегменты каждого клонированного минисателлита анализируют дл того, чтобы определить согласованный повтор ющийс блок. Переменные позиции в каждом типе согласованности указаны следующими символами: R, г А или G; Y , Y С или Т; N, n любое основание. Минисател- лит в MS 8 состоит из двух перемежающихс между собой повтор ющихс блоков длиной

29 и 30 пар оснований.

Ни в одном минисателлите нет повтор ющихс блоков, полностью однородных. Минисателлит Я MS 3 состоит из перемешанных множеств в двух очень похожих, но

различных повтор ющихс блоков длиной

29 и 30 п.о. Концы минисателлитов в Я MS

рекомбинантах до сих пор не определены.

Таким образом изолированы п ть новых

гипервариабельных участков, каждый из которых состоит главным образом из тандем- но повтор ющегос минисателлита. Повтор ющиес тандемом блоки из рЯд 3, Я MS 1, Я MS 31 и Я MS 32 содержат последовательность дра. Однако, копии

последовательности дра вл ютс несовершенными и простые сравнени повтор ющихс блоков этих минисателлитов очевидно не дают возможности определить новую последовательность дра, котора

. чаще всего св зана с этими большими и сильно вариабельными участками. Напротив , представл етс весьма правдоподобным , что с большими минисателлитами может быть св зан широкий спектр производных дра, Минисатёллиты Я MS 8 и Я MS 43 содержат в высшей степени нестандартные версии последовательности дра. При помощи простых сравнений Я MS 8, Я MS 43 и 33,6 нельз четко представить новую специфичную последовательность, котора св зана главным образом с этими трем участками .

с) Менделево наследование и вариабельность участков1.

П ть новых минисателлитов Я MS 1, 8, 31,32 и 43 содержат (каждый) единственный большой и вариабельный участок. Менделево наследование всех участков подтверждают при помощи анализа сегрегации в

больших горизонтальных родословных с использованием СЕРН-программы, Пробы ДНК по 1 мкг из СЕРН-семейства 1423 обрабатывают ферментом Alu 1, гибридизуют по Саузерну с Р-меченой Sau ЗА-вставкой

из ЯМ531.

Степень аллельной вариабельности дл каждого зонда оценивают при помощи анализа частоты сочетани аллелей между случайно выбранными англичанами. Пробы по

Claims

1 мкг ДНК гидролизуют ферментом Hinf 1, гибридизуют по Саузерну с Я MS 43. Все индивиды вл ютс гетерозиготными, что указывает на то, что степень гетерозиготно- сти в этом гипервариабельном участке достаточно высока (Н 0,86, р 0,95). Более точна оценка гётёрозиготностй может быть сделана при помощи сравнени аллелей в каждом индивиде с аллел ми у шести ближайших соседей на авторадиогрэммё с тем, чтобы оценить степень сочетани аллелей между отдельными индивидами. У всех обследованных индивидов S 0,11, откуда средн частота аллел Q может быть оценена как g 1 - (1-8) 0,056, а гетерозигот- ность как (1-д) 94%. Она представл ет собой минимальную оценку гетёрозиготно- сти в услови х ограниченного разрешени гелевого электрофореза.

Все участки оказались высоковариа- бельными с гётерозиготностью, измен ющейс в области от 90% дл Я MS 8 до 99% дл Я MS 31 (см. таблицу 1). Степень вариации длины аллелей в дальнейшем анализируют при помощи сравнени спектра аллелей, обнаруженных в объединенных из 15 и 150 индивидов. Пробы ДНК от одного индивида (а), из объединенной пробы 15 индивидов (Ь) и из объединенной пробы 150 человек (с) гидролизуют ферментами Alu 1 (дл ЯМЗ 32)или Hinf 1 (дл всех оставшихс зондов), провод т гибридизацию по Саузер- ну с гипервариабельными зондами. Все индивиды были случайно выбранными жител ми Северной Европы. Индивиды а включают в объединенные Ь, а всех индивидов объединени Ь включают в объединение с. Можно заметить, что Я MS 43 обнаруживает вторую вариабельную область/представленную короткими Hinf 1-ал- лел ми, отмеченными символом 0; в дальнейшем эту область более детально не изучали.

Дл слабо вариабельного участка Я MS 8 имеетс два преобладающих аллел длиной 5,3 и 7,2 т.п.о. плюс 7 аллелей с меньшей частотой, обнаруженных в группе из 15 человек . Тот факт, что эти два преобладающих аллел не вл ютс результатом ошибки

Большинство аллелей. изЯ MS 31 распредел- но довольно равномерно на относительно узкой области размером от 5,5 до 9,3 т,п.о., в то врем , как аллели из Я MS 1 варьируют по размеру от 2 до..20. т.п.о. В некоторых случа х имеетс очевидна неравномерность распределени аллелей по длине, в частности, в Я MS 43 .про вл ютс два преобладающих класса размеров аллелей 5-6 т.п.о. и 8-14 т.п.о., а в р Яд 3 про вл ютс три класса размеров 1,6-1,7, 2,8-3,6 и 5-15 т.п.о. Обнаруженные участки вл ютс в высшей степени вариабельными, а в действительности , он и вл ютс самыми вариабельными среди большей части полиморфных участков, выделенных До сих пор из ДНК человека. .. .....

П р им е р 3. Чувствительность миниса- теллитных зондов.,

Авторадиографический сигнал гибридизации по Саузерну, полученный после гибридизации в течение ночи, достё тбчно насыщен при концентрации ДНК зонда 0,1 нг/мл, причем также сигналы могут быть легко получены от 60 кг и даже меньшего количества человеческой геномной ДНК. Аналогично, в зависимости от генотипа испытываемых индивидов, с использованием этих зондов можно обнаружить-2% и меньше ДНК одного .индивида. ,.: .-..

Проведен анализ чувствител ь ност и спе: цифичных относительно определённой области зондов и их применени с целью проведени судебной экспертизы в двой- 35 ном преступлениИ Изнасило ваниеУубийст во. Подозреваемый ( был .обвинен...в. убийстве Y, но судебное расследование вр всей очевидностью показало, ,е жерт.тч вы X и Y были убиты одним и тем же челове.-, ком. Выдел ли и анализировали ДНК из следующих судебных образцов: а - волосы жертвы X, вз тые через два Дн после убийства , Ь - смесь спермы и влагалищной жидкости, извлеченна из лобковых волос

10

15

20

25

30

40

при вз тии пробы у этих 15 индивидов, под- 45 жертвы X: с -свежэ кровь пЪдозреваемотверждаетс таким же преобладанием их в группе из 150 индивидов. Аналогично, Я MS 43 (гетёрозиготность 94%) обнаруживает. 7 основных аллелей, которые согласуютс в группах из 15 и 150 индивидов. Напротив, наиболее вариабельные участки Я MS 1, 31 и 32, и р Я g 3, гетерозиготность которых измен етс .в области 97-99%, не обнаруживают аллелей с значительной частотой, попул ции, которые сочетаютс с равной интенсивностью у обоих групп индивидов. Разброс длин аллелей у кавказцев также измен етс между такими гипервариабельными участками (см. таблицу 1).

roL, d -кровь из сердца, вз та ЈГ через день после убийства у жертвы Y е - влагалищный мазок у жертвы У, содержащий сперму, кровь и влагалищную жид кость Т..- .п тно

50 на юбке жертвы Y, содержащё 0 сперму и кровь. Пробы а и Ь хранили в сухом виде при температуре 4°С в течение:3 лет, пробы d и е хранили при температуре 40°С в течение 2 мес цев, а пробу f хранили в

55 сухом виде п;Јй температуре 4°С в течение 2 мес цев. ДНК извлекали, гидролизовали Hinf 1 и подвергали гибридизации по Саузерну с меченой 32Р- Я MS 1-вставкой. ДНК анализировали в каждой пробе, за исключеБольшинство аллелей. изЯ MS 31 распредел- но довольно равномерно на относительно узкой области размером от 5,5 до 9,3 т,п.о., в то врем , как аллели из Я MS 1 варьируют по размеру от 2 до..20. т.п.о. В некоторых случа х имеетс очевидна неравномерность распределени аллелей по длине, в частности, в Я MS 43 .про вл ютс два преобладающих класса размеров аллелей 5-6 т.п.о. и 8-14 т.п.о., а в р Яд 3 про вл ютс три класса размеров 1,6-1,7, 2,8-3,6 и 5-15 т.п.о. Обнаруженные участки вл ютс в высшей степени вариабельными, а в действительности , он и вл ютс самыми вариабельными среди большей части полиморфных участков, выделенных До сих пор из ДНК человека. .. .....

Проведен анализ чувствител ь ност и спе: цифичных относительно определённой области зондов и их применени с целью проведени судебной экспертизы в двой- 5 ном преступлениИ Изнасило ваниеУубийст во. Подозреваемый ( был .обвинен...в. убийстве Y, но судебное расследование вр всей очевидностью показало, ,е жерт.тч вы X и Y были убиты одним и тем же челове.-, ком. Выдел ли и анализировали ДНК из следующих судебных образцов: а - волосы жертвы X, вз тые через два Дн после убийства , Ь - смесь спермы и влагалищной жидкости, извлеченна из лобковых волос

0

5

0

5

0

на юбке жертвы Y, содержащё 0 сперму и кровь. Пробы а и Ь хранили в сухом виде при температуре 4°С в течение:3 лет, пробы d и е хранили при температуре 40°С в течение 2 мес цев, а пробу f хранили в

сухом виде п;Јй температуре 4°С в течение 2 мес цев. ДНК извлекали, гидролизовали Hinf 1 и подвергали гибридизации по Саузерну с меченой 32Р- Я MS 1-вставкой. ДНК анализировали в каждой пробе, за исключением проб е и Г. Авторадиограмму получали в течение одной недели в присутствии интенсифицирующего экрана. П тна спермы Ь, е и Г содержат два гибридйзиру- ющихс фрагмента ДНК, которые не могут принадлежать жертве. Кроме того, проба Ь содержала аллели жертвы, полученные из влагалищной ДНК. Аллели спермы Ь, е и Г неразличимы, что наводит на на мысль, что жертвы X и Y были на самом деле изнасилованы одним и тем же мужчиной. Аллели подозреваемого L не сочетались с аллел ми п тен спермы.

Эти результаты подтверждали при по10

У троих отец/мать/ребенок все фрагменты потомства можно проследить. Каждый потомок содержит 3,4+0,5 ДНК-фрагментов, которые нос т специфичное отцовское происхождение и равное количество специфичных дл матери ДНК-фрагментов (испытано 10 троек отец/мать/ребенок).

Ф о р м у ла изобретени 1. Способ получени полинуклеотида дл использовани в генетических исследовани х , предусматривающий гибридизаци- онный анализ геномной ДНК, который включает бкрининг библиотеки ДНК в фаге

мощи гибридизации сЯМЗ 31 и при помощи 15 путем гибридизации с пробой, и отбор позианализа фигнепринтов ДНК более значительных количеств судебных материалов. В свете этих данных, обвинени ; выдвинутые против подозреваемого, были сн ты прокурором .

П р и м е р 4.

Объединённые минисателлитные зонды . ... ..

Чувствительность минисателлитов в процессах гибридизации по Саузерну позвол ет объединить зонды с тем, чтобы их использовать с целью обнаружени вариа- бельных фрагментов из нескольких участков одновременно, как это было сделано дл объединени из 5 зондов (р A g 3, Я MS 1, Я MS 8, A MS 31 и Я MS 43). Теоретически количество фрагментов ДНК, которое можно обнаружить при помощи 5 зондов, 5 .. .. 5) (1+ Hi), где Hi .- гетерозиготность 1-го

зонда. Дл этих 5 зондов в среднем может быть обнаружено 9,78 фрагментов на один индивид. На практике может быть разрешено 8,4 + 1,2 (ст. отклонение) полос 2 т.п.о. (испытано 40 случайно выбранных индивидов ). Така потер разрешаемых полос частично объ сн етс исключением малых (1,6 т.п.о.) и относительно-распространен- . ных р Я g 3 аллелей {пример 1, средн потер на одного индивида 0,33 полосы), но в основном это результат совместной миграции при электрофорезе различных ми- нисателлитных аллелей.

Структуры п тен дот-гибридизации с несколькими участками дают высокую индивидуальную специфичность только с 18% (ср. отклонение + 11 %) ДНК-фрагментов, которые сочетаютс у пар, случайно выбранных жителей Северной Европы (испытано 40 пар.). ...,. , .,. . .-:-,....-;,,..

20

25

30

35

40

50

55

тивных клонов с последующим выделением всей или части вставки, отличающийс тем, что, с целью повышени специфичности полинуклеотида, в качестве пробы используют последовательность 33,6 или 33,15, содержащую по меньшей мере 3 тандемных повтора, включа комплементарные последовательности: (А) AGGGCTGGAGG, где Т представл ет собой Т или U, А может присутствовать или отсутствовать , или AGA GGTGGGCAGGTGG, где Т представл ет собой Т или U, причем она в среднем имеет по меньшей мере 70% гомологии между всеми тандемно повтор ющимис последовательност ми и вы вл ют полинуклеотид, способный гибридизиро- ватьс с ДНК-фрагментом, содержащим ми- нисателлит, специфический к конкретному участку или локусу генома, при этом указанный участок имеет аллельную вариацию по меньшей мере 3 (100).

2. Способ по п.1,отличающийс тем, что минисателлит содержит любую одну последовательность, выбранную из:

(3) AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGG GCCAGGGAGPGGC

(4) GTGGAYAGG

(5) TGGQAGGTGGRYAGTGTCTG

(6) GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGA СТСА

(7) GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGG TGTTGG

(8) AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGA GTAC

(9) TGTGTGTAATGGGTATAGGCAGGGC CCCGGGAAGGGGGTCTGGYX (где Y обозначает С, Т или U, X обозначает G или С, R обозначает А или G и Т обозначает Т или U), или ее тандемную дупликацию (дупликации) или последовательность, комплементарную ей.

0

путем гибридизации с пробой, и отбор пози

0

5

0

5

0