JP4385072B2 - 選択的な制限断片増幅:一般的なdnaフィンガプリント法 - Google Patents
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Description
DNAフィンガプリントまたはDNA分類、並びに他の遺伝子型分類や特性化やDNA同定の方法は個人、変種もしくは種族または品種の遺伝子構成もしくはゲノムにおける類似性または1つ以上の区別的な特徴を特性化することを意味する。一般的規則は遺伝子関係が近縁であるほど同一性が大となり或いはゲノムの類似性が一層充分となり、その結果ゲノムにおける区別的な特徴がより稀となる。これらの類似した或いは区別的な特徴は、DNAを制限エンドヌクレアーゼで切断した後に生物のDNAを分析して示すことができる。制限エンドヌクレアーゼは、短いヌクレオチド配列(一般に長さ4〜8塩基)を認識すると共に2個のDNA鎖を切断して別個の長さを有するDNA断片を生成させる酵素である。制限エンドヌクレアーゼは、その高度の配列特異性により、DNA分子を極めて特異的に切断する。その結果、再現しうるDNA断片群が生成される。DNA断片は、その長さに応じ多孔質マトリックスもしくはゲルで分画して典型的なバンドパターンを生じ、生物の遺伝子構成におけるDNAフィンガプリントを構成することができる。
極めて近縁の品種、変種もしくは種族のフィンガプリントを比較すると、DNAフィンガプリントは同一であるか或いは極めて類似する。同一のDNAフィンガプリントにも拘らず相違点が観察される場合、これら相違点はDNA多形性と呼ばれる。これらは、フィンガプリントに出現する新たなDNA断片である。DNAはその位置にて多形性であると言われ、この新規なDNA断片はDNAマーカーとして使用することができる。制限酵素切断により得られるDNAフィンガプリントで検出されるDNA多形性は、制限エンドヌクレアーゼ標的部位を破壊する突然変異、新規な標的部位を形成する突然変異、挿入、欠失または2つの制限部位の間の逆位のようなDNA配列における変化から生じうる。
ウィルスを除く殆ど全ての生存する生物につき、これら生物の全ゲノムDNAの制限消化物は、個々のバンドを評価することができないほど多くのバンドをもたらす。したがって、全てのDNAフィンガプリント法は、小割合のDNA断片のみを可視化させてDNAフィンガプリントを構成する単純なバンドパターンを得ると言う原理に基づいている。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術は、インビトロにて特定DNA断片を合成するための方法である。この方法は、DNA分子上の独特の配列に結合する特定のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性のDNAポリメラーゼを使用することに基づく。オリゴヌクレオチドは、DNAの対向鎖にアニールしてそれぞれ新たなDNA鎖の合成を指令するようDNA合成反応でプライマとして作用するように設計される。したがって、1ラウンドの合成においてはプライマー間でDNA分子の完全コピーが作成され、プライマー間のDNAが複製される。各ラウンドのDNA合成の結果、二倍量のDNAが生じて2個のプライマー間で構成されるDNAの増幅をもたらす。その結果、PCR技術は少量の「基質DNA」を用いて正確なDNAセグメントを合成することを可能にする。
(1)PCR技術により増幅すべき1個もしくはそれ以上の制限断片のサブセットをランダムに選択することによるゲノムのDNAフィンガプリント法。さらに本発明は、上記方法に用いるための合成オリゴヌクレオチドをも包含し、さらにこれら方法は法医学的型分類、微生物同定、変種同定、血統分析、および遺伝子形質に関連したDNAマーカーのスクリーニング等に使用とすることができる。
(2)多形性でありうる1種もしくはそれ以上の予備選択されたDNA断片をPCR増幅により同定するための方法。さらに本発明は、前記方法に使用するための特定の合成オリゴヌクレオチドをも包含し、さらにこれら方法はヒトの遺伝病のスクリーニング、植物および動物の育種における耕種学的形質の遺伝の監視、および病気における感染物質の検出等に使用することができる。
以下の説明および実施例においては多くの用語を使用する。これら用語に与えるべき範囲を含め本明細書および請求の範囲を明瞭かつ一貫して理解するため、次の定義を設ける。
−制限エンドヌクレアーゼ:制限エンドヌクレアーゼもしくは制限酵素は二本鎖DNA分子における特定塩基配列(標的部位)を認識する酵素であって、各標的部位にてDNA分子の両ストランドを切断する。
−制限断片:制限エンドヌクレアーゼによる切断により産生されるDNA分子を制限断片と称する。任意所定のゲノムは特定の制限エンドヌクレアーゼにより個々の制限断片群に消化される。制限エンドヌクレアーゼ切断によって生ずるDNA断片を分離して、ゲル電気泳動により検出する。
−制限断片長さ多形性(RFLP):たとえば2種の近縁生物のゲノムDNAは、多くの部位でそのヌクレオチド配列組成の相違点を示す。これらの相違点が制限エンドヌクレアーゼに関する標的部位に存在すれば、改変された標的部位はその箇所で切断されないだろう。同様に、ヌクレオチド配列変化は他の生物には存在しない新たな標的部位を導入し、その箇所で制限酵素によるDNAの切断を引き起こす。或いは、1種の生物で生ずる、制限エンドヌクレアーゼ用の2つの標的部位の間でのヌクレオチドの挿入もしくは欠失は、これら標的部位の間の間隔を改変する。このために、2種の生物DNAの消化により異なる長さを有する制限断片が生成する。2種の生物のDNAの消化によって生ずる制限断片の長さに多形性が生ずる。
2.好適実施態様の説明
本発明はより詳細には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を長さ多形性(length polymorphisms)を含む制限断片多形性(RFP)の検出に用いうる方法および手段に関する。本発明はRFPを検出する方法、本発明の方法に使用するための合成オリゴヌクレオチド、RFPを検出するための手段を含むキット、並びに植物および動物の育種、遺伝病の診断、生物の同定、および法医学的型分類などへの本発明の方法および手法の使用を包含する。
A)DNAの単離及び修飾
全トマトDNA(Lycopersicon esculentum c.v.Moneymaker)をBernatzski及びTanksley(Theor.Appl.Genet.72,314−321)に記載の如く幼葉から単離した。典型的な収量は、新鮮な葉物質1グラム当たりDNA 50−100μgであった。DNAをPstI(Pharmacia)で制限し、二重鎖(ds)PstIアダプターを以下に記載の方法に従って制限フラグメントに連結した。これらのアダプターは以下の構造:
5- CTCGTAGACTGCGTACATGCA -3
3- CATCTGACGCATGT -5
を有していた。これらのアダプター内の3’TGCA−の突出端をPstIにより作った付着端にアニールする。5’C−残基がAに置き換わっているので、PstI認識配列CTGCAGは、このアダプターの連結により修復されない。連結反応は、得られる末端が殆どDNAフラグメント−アダプター分子であるような方法で設計されていた。これは、
1.アダプター−アダプターの連結を排除する非ホスホリル化アダプターを使用する、
2.同時に連結及び制限反応を実施する
ことにより実施した。後者の方法により、任意のフラグメント−フラグメントの連結産物が制限でき、これによりこれらの産物を殆ど完全に除去できた。PstI認識配列はこれらの産物中で修復されないので、アダプター−フラグメント連結産物は制限酵素により制限され得ない。アダプター連結に使用する反応条件は以下の通りであった。
0.2μg アダプター
20単位 PstI
1単位 T4 DNA−リガーゼ
10mM Tris.HAc pH 7.5,10mM MgAc,50mM KAc,
2mM ジチオトレイトール,0.5mM ATP
連結反応を反応容積20μl中37℃で3時間実施した。アダプター連結後、非連結アダプターを選択的に沈殿させることにより除去した。この目的のため、反応混合物を100μlに増やし、NH4Acを終濃度2.5Mで添加した。−20℃のエタノール(100μl)を添加し、混合物を室温で5分間インキュベートした。4℃に冷却したエッペンドルフ遠心分離機中、14000rpmで10分間遠心分離してDNAを集めた。DNAペレットを室温で70%エタノール0.5mlで1回洗浄し、T0.1E(10mM Tris.HCl pH 8.0,0.1mM EDTA)40μlに溶解させた。DNAを−20℃で貯蔵した。本明細書中に記載する選択的沈殿法により、反応混合物から非連結アダプターを効率良く除去したが、小さなDNAフラグメント(<200bp)も失ってしまった。
上記方法で製造したDNAをPstIフラグメントを増幅するための鋳型として使用した。PCRの反応混合物は、
1ng 鋳型DNA
150ng プライマー
1単位 Taq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)
200μM 全4dNTP
10mM Tris.HCl pH 8.5,1.5mM MgCl2,50mM KCl
H2O (全容量が50μlになるまで)
を含んでいた。増幅反応中の蒸発を防ぐために、反応混合物を軽質鉱油(light mineral oil)20μlで被覆した。以下のサイクルプロフィール:94℃で1分、60℃で1分、60℃から72℃に温度を1℃/5秒の速度で上昇及び72℃で2.5分を使用してPerkin Elmer DNA Thermal Cycler上でPCRを実施した。全部で33サイクル実施した。反応後、クロロホルム20μl及び充填染料10μl、この場合染料Orange G(Merck)0.1% w/vと一緒に50%蔗糖を添加した。次いでこれを反応混合物と十分に混合し、充填染料を補った反応混合物から有機相(鉱油及びクロロホルム)を分離するために軽く遠心分離した。この反応混合物20μlを1.0%アガロースゲル上で分析した。
PstIで制限し、次いでPstIアダプターをつけたトマトDNAを上記条件を使用して増幅した。以下の配列:
1. 5-CTCGTAGACTGCGTACA-3
2. 5-GACTGCGTACAtgcagA-3
3. 5-GACTGCGTACAtgcagAC-3
4. 5-GACTGCGTACAtgcagACC-3
をもつ4つのプライマーを選択した。プライマー1はDNAを修飾するのに使用するアダプターのトップストランドの一部なので、全PstIフラグメントを増幅しなければならない。プライマー2はアダプター配列の一部、PstI認識配列(小文字)及び1個の選択的ヌクレオチド(大文字)を含むので、理論的には全PstIフラグメントの約1/16部分を増幅しなければならない。プライマー3及び4はプライマー2に似ているが、選択的ヌクレオチドをそれぞれ2つ及び3つ含んでいるので、PstIフラグメントの約1/256及び1/4096を増幅すると予想される。反応混合物の一部を1.0%アガロースゲル上で分析し、結果を図11に示す。この図面のレーン1及び6はDNAマーカーを含んでおり、そのサイズを左側に示す。レーン2、3、4及び5は各々プライマー1、2、3及び4で得られたPCRを含んでいる。この結果は、3つの選択的ヌクレオチドを使用したプライマーの場合にのみ、はっきりしたバンドパターンの増幅フラグメント数が得られることを示している。他の3つのプライマーはアガロースゲル上に溶解できなかったバンドパターンを与えたが、これは多くのPCR産物が生成したためである。これらの多くのPCR産物内でも、常に幾つかのフラグメントが目立っており、他のPCR産物の不鮮明なバックグラウンド上でもバンドとして検出される。恐らくこれらの強い産物は、トマト遺伝子上に高コピー数で存在するか、または他の産物よりもずっと効率的に増幅するのだろう。トマト遺伝子DNAのPstIフラグメントの総数(20,000〜100,000)により、3つの選択的ヌクレオチドをもつプライマーが使用されてアガロースゲル上で鮮明なバンドパターンを作ったに違いないと予想された。
増幅フラグメントが同一サイズの真正制限フラグメントに対応することを立証するために、これらの増幅フラグメントをサザンブロット上で試験した。この目的のために、プライマー4で得られた4つの個々のフラグメントをアガロースゲルから切り出した。これらのゲル切片からDNAをガラスビーズ(Gene Clean,製造業者Bio 101)に吸着させることにより精製し、精製DNAの一部を再増幅して4つのDNAフラグメントを各々約1μg得た。続いて再増幅反応を1.0%分取アガロースゲル上で電気泳動させ、所望のDNAフラグメントを精製した。各フラグメント200ngを、製造業者(Boehringer Mannheim)により推奨された方法に従ってランダムヘキサマー標識キットを使用して(α−32P)dATPで標識した。全トマトDNAをPstIで制限し、1.0%アガロースゲル上で電気泳動にかけた。制限DNAを約3μg含む4つのはっきりと分離したレーンを使用した。次に、アガロースゲルを、製造業者(New England Nuclear)により示された遺伝子スクリーン+ハイブリダイゼーション膜にブロットした。ブロット後、ゲルをPstIで制限したトマトDNAを1レーン含む4つの切片に切断した。これらの4つの切片をKlein−Lankhorstら(Theor.Apll.Genet.81,661−667)に記載の方法に従って4つのDNAプローブの一つに各々ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたブロットをKodak XAR5フィルムを使用してオートラジオグラフに40時間かけた。得られた結果は、4つのDNAプローブにより識別された全てのゲノムDNAフラグメントはこれらのプローブと同一の長さを持つことを示した。これは、プローブとして使用した増幅フラグメントはブロット上で検出されたフラグメント由来であることを示していた。
プライマーの3セットをトマト遺伝子DNA由来の3つの対応するランダムPstI−フラグメント用にデザインしたが、その中でもPstI−認識配列に隣接する配列が公知であった。5つの選択的ヌクレオチドを持つプライマーのセットを以下に示すように製造した。
配列1:
5-ctgcagCAGTACCAGC----CCGGCACCTGctgcag-3
5-TGCGTAACATtgcagCAGTA-3 3-TGGACgacgtACATGCGT-5
プライマー1.1 プライマー1.2
配列2:
5-ctgcagCCGAATCTCT-----AGTGAGTTAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagCCGAA-3 3-CAATCgacgtACATGCGT-5
プライマー2.1 プライマー2.2
配列1:
5-ctgcagAATACCAAGA-----GCAAGCACAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagTTATG-3 3-GTGTCgacgtACATGCGT-5
プライマー3.1 プライマー3.2
先のセクションにおいて、選択的制限フラグメント増幅法を使用すれば、配列情報が入手可能な場合、ランダムまたは特定のフラグメントのいずれかにおいて制限フラグメントを増幅し得ることが明示された。従って、同一種の2つの個体間で制限部位多型現象に関して調査可能である。非常に近縁であるが系の一方にはネコブセンチュウ耐性遺伝子、Miが存在するという点が異なる2つのトマト系に関してこのことを以下に記載する。このMi−遺伝子はLycopersicon peruvianum、食用トマトL.esculentumの遠縁種に由来する。これを、交雑、次いでL.esculentum親に12回戻し交雑し、さらにMi−遺伝子の存在に関して子孫を選択することによりL.esculentum系に導入した。従って、2つのトマト系は、その遺伝子物質の小さな部分だけ、即ちMi−遺伝子及び周囲領域が異なる。古典的遺伝学方法を使用して、Mi−領域がこの系のゲノムの<1%を構築すると計算した。
実施例1では、選択的制限フラグメント増幅(SRDA)の原理は、トマトDNA及び制限酵素PstIを用いて例証されている。本実施例では、2つの制限酵素、PstI及びMseIを使用してSRFAを説明する。
全トマトDNAを実施例1に記載の如く、幼葉から単離した。所謂、同一遺伝子系の2対、GemR及びGemS、各々GCR26及びGCR151[これらの系は、以下の文献に記載されている:Denby及びWilliams,(1962),Can.J.Plant Sci.42,681−685,Smith及びRitchie,(1983),Plant Mol.Biol.Rep.1,41−45]をDNA源として使用した。同一遺伝子の各対の2つの個体は遺伝子的に非常に似ているが、真菌病原体Verticillium albo−atratumに対する耐性を与える特徴の存在が異なる。
2.5μg DNA
12.5単位 PstI(Pharmacia,10単位/μl)
12.5単位 MseI(N.E.Biolabs,4単位/μl)
5μl 10×RL−緩衝液
50μlになるまでの量のH2O
インキュベーションを37℃で1時間実施した。
MseIアダプター: 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
3-TACTCAGGACTCAT-5
16マー、5-GACGATGAGTCCTGAG-3 8μg(1430 pMoles)を全容量H2O 28.6μl中の14マー、5-TACTCAGGACTCAT-3 7μg(1430 pMoles)と混合した。
PstIアダプター:5-ビオ-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
制限DNAに、以下のもの:
1μl PstI ビオ−アダプター(=5 pMol)
1μl MseI アダプター(=50 pMol)
1.2μl 10mM ATP
1μl 10×RL−緩衝液
1単位 T4 DNAリガーゼ(Pharmacia,5単位/μl)
10μlになるまでの量のH2O
を含む混合物10μlを添加した。
2つの制限酵素を使用するSRFA用の鋳型−DNAの製造は、通常、単一酵素を用いるSRFAを使用する際には使用しない追加の段階を含んでいた。この段階において、ビオチニル化アダプターに連結するDNAフラグメントを他のすべてのフラグメントから分離した。
上記の如く製造した鋳型DNAは、記載のトマト系からの全PstI−MseIフラグメント、さらに全く内部MseI−フラグメントを含まない少量のPstI−PstI−フラグメントを含まなければならない。この実験において、これらの多くのPstI−MseIフラグメントが、実施例1に記載の如く本質的に増幅により可視化された。この実施例に記載の方法により得られたフラグメントの種類は実施例1に記載のフラグメントよりもずっと小さかったので、増幅産生物のゲル分析は変性アクリルアミドゲル(Maxam及びGilvert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74,560−564)上で実施した。さらにこの種のゲルはレーン1つあたり100個以上のバンドに分離できた。これは、実施例1に記載のアガロースゲルの約10倍以上であった。フラグメントは、(γ−32P)ATP及びポリヌクレオチドキナーゼで5’末端でPCRプライマーの一つを標識することにより可視化できた。
標識用に選択したプライマーは、MseIプライマー1と名付けられた19マー、5−GATGAGTCCTGAGTAAgaa−3であり、選択的ヌクレオチドは小文字で表されている。標識は、以下の方法により実施した。
5.0μl (γ−32P)ATP(10μCi/μl=50μCiの溶液から)
3.0μl 250mM Tris.HCl/100mM MgCl2/50mM DTT,pH 7.5
0.5μl T4−キナーゼ(Pharmacia 10単位/μl)
18.5μl H2O
PstIプライマー2:5-GACTGCGTACATGCAGgt-3
PstIプライマー3:5-GACTGCGTACATGCAGgg-3
PstIプライマー4:5-GACTGCGTACATGCAGag-3
PstIプライマー5:5-GACTGCGTACATGCAGat-3
PstIプライマー6:5-GACTGCGTACATGCAGct-3
PstIプライマー7:5-GACTGCGTACATGCAGta-3
全PSRプライマーは、濃度50ng/μlでH2Oに溶解した。
PCR混合物は、以下のものを含んでいた。
2.0μl 鋳型DNA
1.0μl 5’標識MseIプライマー(5ng)
0.5μl 未標識MseIプライマー(25ng)
0.6μl PstIプライマー(30ng)
2.0μl 100mM Tris.HCl/15mM MgCl2/500mM KCl,pH 8.5
0.8μl 5mM dNTP
0.1μl Taq ポリメラーゼ(Cetus Perkin Elmer,5単位/μl)13.0μl H2O
全ての反応成分を添加し、十分に混合し、PCRの重要成分、通常酵素を最後に添加した。続いて反応をできるだけ迅速に開始した。
1サイクル:変性: 94℃で30秒
アニーリング: 65℃で30秒
伸長: 72℃で60秒
11サイクル:変性: 94℃で30秒
アニーリング温度を各サイクルごとに0.7℃ずつ下げて行く。64.3℃,63.6℃,62.9℃,62.2℃,61.5℃,60.8℃,60.1℃,59.4℃,58.7℃,58.0℃,57.3℃.各温度で30秒ずつインキュベートする。
23サイクル:変性: 94℃で30秒
アニーリング: 56℃で30秒
伸長: 72℃で60秒
反応産物を4.5%変性ポリアクリルアミドゲル上で実施した。50×38cmゲルを使用し、これらのゲルを製造するためにゲルカセットをBioradから入手した。4.5% w/v アクリルアミド/0.225% w/v ビスアクリルアミド/7.5M 尿素/50mM Tris/50mM ホウ酸/1mM EDTA,pH 8.3を含むゲル溶液100mlを使用した。ゲルにキャストする直前に、100mlゲル溶液を500μl 10% 過硫酸アンモニウム及び100μl TEMEDと混合した。Tris/ホウ酸/EDTA−緩衝液を電気泳動緩衝液として使用した。これらは100mM Tris/100mM ホウ酸/2mM EDTA,pH 8.3を含んでいた。反応混合物を98% ホルムアミド/10mM EDTA/0.01% w/vブロモフェノールブルー/0.01% w/vキシレンシアノールの等量(20μl)と混合した。得られた混合物を95℃で3分間加熱し、次いですぐに氷冷した。各サンプル2μlをゲル上に載せた。電気泳動時、ゲルに一定の電圧110ワットをかけると、一定の発熱(thermal development)があった。これらの条件下のゲルの磁場強度は、40〜50ボルト/cmに相当した。
2種の制限酵素を用いた種々のLACTUCA種のDNAの選択的制限フラグメント増幅
実施例2ではトマトDNAにおいて、2種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント(SRFA)増幅の原理を例証した。この実施例においては、同じ2種の制限酵素PstI及びMseIを使用して種々のLactuca種のDNAについても同様の結果が得られることを示す。
種々のLactuca種の幼葉材料を使用し、実施例1に記載のごとくDNAを単離した。下記に示すように、かかる植物には市販用レタス品種(L.sativa)と、2種の野生Lactuca種L.saligna及びL.virosaとが含まれていた。植物は下記のごとき恣意的番号で示す。
1.L.saligna,nr.21,植物1
2.L.saligna,nr.21,植物2
3.L.saligna,nr.22,植物1
4.L.saligna,nr.22,植物2
5.L.virosa, nr.01,植物1
6.L.virosa, nr.01,植物2
7.L.virosa, nr.02
8.L.virosa, nr.03,植物1
9.L.virosa, nr.03,植物2
10.L.sativa,市販用バターヘッド(butterhead)品種
上述のごとく調製したDNAをSRFA反応の鋳型として使用した。1つのMseIプライマーと2つの異なるPstIプライマーとを用い、2種のプライマーの組合せを使用した。かかるプライマーは下記の通りである(選択的ヌクレオチドは小文字で示した):
MseIプライマー :5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3
PstIプライマー1:5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
PstIプライマー2:5-GACTGCGTACATGCAGca-3
実施例2及び3ではそれぞれトマトDNA及びレタス(Lactuca種)DNAを使用し、2種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント(SRFA)増幅の原理を例証した。この実施例においては、トウモロコシ(Zeaトウモロコシ)系においても同様の結果が得られることを示す。更に、種々の制限酵素の組合せを使用し、この場合にはトウモロコシ系のDNAフィンガープリントが得られることも示す。
番号1及び2を付した2種のトウモロコシ同系交配系を使用した。かかるトウモロコシ系源は、本発明者らの経験によれば選択した任意の系がSRFAを使用して優れたDNAフィンガープリントを与えるので、重要でない。Saghai−Mahoof et al.,(1984),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,8014−8018に記載のごとく、幼葉材料からかかる系のDNAを単離した。以下の制限酵素の組合せ(EKs)を使用して鋳型DNAを作製した:PstI/TaqI、EcoRI/TaqI、AseI/TaqI、Sse8387−I/TaqI。全ての酵素はPharmaciaから購入したが、但しAseIはNew England Biolabsから購入し、Sse8387IはAmershamから購入した。鋳型DNAは実質的に実施例2及び3に記載のごとく調製したが、但し下記の点が異なる。
TaqIアダプター:5-GACGATGAGTCCTGAC-3
3-TACTCAGGACTGGC-5
PatI及びSse8387Iアダプター:
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
AseIアダプター:5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGAT-5
EcoRIアダプター:5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGTTAA-5
実施例2に記載のごとく制限フラグメントを増幅した。増幅産物を標識するために選択したプライマーは、(小文字で示した)3つの選択的ヌクレオチドを有する下記のTaqIプライマーであった:
TaqIプライマー 1.5-TGAGTCCTGACCGAacc-3
(5’標識) 2.5-TGAGTCCTGACCGAaca-3
3.5-TGAGTCCTGACCGAcaa-3
4.5-TGAGTCCTGACCGAcac-3
EcoRIプライマー:1.5-CTGCGTTACCAATTCcaa-3
2.5-CTGCGTTACCAATTCaca-3
3.5-CTGCGTTACCAATTCaac-3
4.5-CTGCGTTACCAATTCcag-3
AseIプライマー: 1.5-GACTGCGTACCTAATaac-3
2.5-GACTGCGTACCTAATaag-3
3.5-GACTGCGTACCTAATacc-3
4.5-GACTGCGTACCTAATgaa-3
PstIプライマー: 1.5-GACTGCGTACATGCAGac-3
2.5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
3.5-GACTGCGTACATGCAGca-3
4.5-GACTGCGTACATGCAGcc-3
Sse8387Iプライマー:1.5-GACTGCGTACATGCAGGa-3
2.5-GACTGCGTACATGCAGGg-3
3.5-GACTGCGTACATGCAGGc-3
4.5-GACTGCGTACATGCAGGt-3
実施例2、3及び4においてはそれぞれトマト、レタス(Lactuca種)及びトウモロコシのDNAにおいて、2種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント(SRFA)増幅の原理を例証した。この実施例においては、この方法を使用して細菌DNAを特性分析し得ることを示す。細菌における本発明方法の有用性を示すため、ベルギーのGentにあるthe Laboratory of Microbiologyから多数のXanthomonas campestris株を入手した。
全てのDNAは、種々の資源、ほとんどは感染植物から単離したXanthomonas campestris株から調製した。番号1〜26を付したこれらの株を下記に列挙する。これらの株はベルギーのGhentにあるthe Laboratory of Microbiologyから入手し得る。
1. albilineans 494
2. fragariae 708
3. oryzae oryzae 5047
4. oryzae populi 5743
5. maltophilia 958
6. campestris campestris 568
7. campestris alfalfae 497
8. campestris coracanae 686
9. campestris citri 8655
10. campestris citri 9658
11. campestris citri 9181
12. campestris citri 8657
13. campestris citri 8654
14. campestris citri 8650
15. campestris citri 682
16. campestris citri 681
17. campestris citri 9325
18. campestris citri 9321
19. campestris citri 9176
20. campestris citri 9671
21. campestris citri 9665
22. campestris citri 9182
23. campestris citri 568
24. campestris citri 9167
25. campestris citri 9175
26. campestris citri 9160
TaqIアダプター:5-GACGATGAGTCCTGAC-3
3-TACTCAGGACTGGC-5
ApaIアダプター:5-bio-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3
3-CATCTGACGCATGT-5
実施例2に記載のごとく制限フラグメントを増幅した。SRFAに選択したプライマーは、TaqIプライマー 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3(小文字で示した1つの選択的ヌクレオチドを有する)と、ApaIプライマー 5-GACTGCGTACAGGCCCg-3(小文字で示した1つの選択的ヌクレオチドを有する)であった。実施例2に記載のごとく増幅フラグメントを検出するために、ApaIプライマーの5’末端を標識した。
2種の制限酵素を用いた種々の動物のDNAの選択的制限フラグメント増幅
先の実施例では種々の資源の植物DNAにおいて、選択的制限フラグメント増幅(SRFA)を例証した。ここでは、種々の家畜から得られるランダムなDNA試料を使用し、本発明方法の有効性を説明する。試験した動物種は:Gallus domesticus(ニワトリ);Susscrofa domestica L.(ブタ);Bos taurus(ウシ);Equus caballus(ウマ)であった。使用した制限酵素はSse8387I及びMseIであった。
Maniatisら(1989)によって記載された方法に従い、血液試料からDNAを単離した。DNA試料1〜3(ニワトリ)、4〜7(ブタ)、8〜11(ウシ)及び12〜15(ウマ)を制限酵素Sse8387I及びMseIによって消化した。実施例2に記載のごとく、DNAフラグメントをアダプターに連結した。制限酵素Sse8387I及びPstIは互換性のある3’突出部を生成するので、本発明者らは実施例2に記載のごときPstI及びMseIアダプターを使用し得た。
上記のごとく番号を与え、実施例2に記載のごとく調製した鋳型DNAはSRFA反応における鋳型として作用した。使用したプライマーの組合せは、1つのMseIプライマーと異なるSseIプライマーからなった:
MseIプライマー: 5-GATGAGTCCTGAGTAAtac-3
Sse8387Iプライマー1:5-GACTGCGTACATGCAGGaa-3
Sse8387Iプライマー2:5-GACTGCGTACATGCAGGag-3
(a)前記出発DNAを前記特定の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、それを、それぞれ5’末端及び3’末端を含む対応する一連の制限フラグメントに断片化し、
(b)後述する5’及び3’アダプターがまだ独立した形態になっていないならば、前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ1つの部位をそのヌクレオチド配列内に含む所定の二重鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、前記特定のエンドヌクレアーゼを用いて消化し、それぞれかかる5’及び3’アダプターに切断し、
(c)出発DNAから得られた制限フラグメントを、それらの5’及び3’末端で、それぞれ前記3’及び5’アダプターに連結し、それによって、タグをそれぞれ5’及び3’末端に有する、出発DNAのタグ付き制限フラグメント〔そのタグのヌクレオチド配列は、前記特定の制限部位内に含まれるヌクレオチドを含む3’及び5’アダプター配列を含有する〕を生成し、
(d)プライマーに適した鋳型を与えるのに適当であれば、先の連結に先立って前記5’及び3’アダプターが、所定の一定配列のオリゴヌクレオチドセグメントをそれぞれ5’及び3’末端に付加することにより伸長されていない場合、同じ目的で適当であれば、前記タグ付き制限フラグメントの対応末端を前記オリゴヌクレオチドを用いて伸長させ、それによって、前記一定配列によって両末端が伸長されたタグ付き制限フラグメントを得、
(e)前記タグ付きまたは適当であれば伸長された制限フラグメントをハイブリダイジング条件下で2種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、
(f)前記プライマーが、前記タグ付きまたは適当であれば伸長された制限フラグメントの5’及び3’末端の鎖〔それ自体は前記プライマーの鋳型として作用する鎖と相補的である〕の末端部分と同じヌクレオチド配列を有する配列を含む場合、前記プライマーはそれぞれ、鋳型鎖の前記所定の特定の制限エンドヌクレアーゼに対する部位の形成に関与するものと相補的なヌクレオチドを含んでおり、
(g)前記プライマーにハイブリダイズした伸長制限フラグメントを、要求されるヌクレオチド及びポリメラーゼの存在下にPCRまたは同様の方法により増幅し、ハイブリダイズしたプライマーを、該プライマーが最初にハイブリダイズした出発DNAの制限フラグメントに沿ってそれらの全長にわたって伸長させ、
(h)前記最後に述べた制限フラグメントを同定または回収する
ことからなる。
(i)アダプターとして使用される所定のDNA配列と相補的な、10塩基以上且つ30塩基以下のヌクレオチド配列(一定配列)、この直ぐ後に、
(ii)ヌクレオチド配列またはその一部が(ii)に含まれない限り、ステップ(a)で使用された特定の制限エンドヌクレアーゼのターゲット部位と相補的なヌクレオチド配列、この直ぐ後に、
(iii)選択された1以上且つ10未満、例えば長さ1〜5のヌクレオチド配列。
−前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ1つの部位をそのヌクレオチド配列内に含み、それによって、それぞれ対応する5’及び3’アダプターに切断される二重鎖DNAオリゴヌクレオチドリンカーであって、あとでこのキットのPCRプライマー用鋳型を与え得る5’及び3’部分を与えるに十分なサイズを有する二重鎖DNAオリゴヌクレオチドリンカー;
−一方では、あとで該プライマーの鋳型として作用する鎖と相補的な5’及び3’アダプターの鎖と同じ配列をそれぞれ有するPCRプライマーであって、更に、鋳型鎖内の前記所定の特定の制限部位に対する部位の形成に関与するものと相補的なヌクレオチドを含むプライマー;
−前記リンカーを前記特定の制限エンドヌクレアーゼによって消化してそれぞれ前記5’及び3’アダプターを作製する前に、前記5’アダプターの5’末端もしくは前記3’アダプターの3’末端または両方を伸長するために、或いは、前記5’及び3’アダプターを出発DNAのフラグメントの末端に連結してその後得られたタグ付きフラグメントの伸長のため、前記プライマーを用いたハイブリダイゼーションに十分な長さの部位を生成するための所定(一定)配列のオリゴヌクレオチドセグメント(適当な場合);
−前記特定のエンドヌクレアーゼを用いて消化することにより得られる、断片化試験を実施する所定のDNAに対応するフラグメント化標準DNA(必要による)。
Claims (13)
- 標的DNAから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのプライマーセットであって、該プライマーセットは少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該オリゴヌクレオチドプライマーが前記アダプター配列に相補的な配列、制限エンドヌクレアーゼで消化した後に残る制限部位の部分に相補的な配列、および標的配列の3’末端に直ぐ隣接した、制限フラグメントのサブセットの選択的増幅を可能にする1〜10個の選択性ヌクレオチドから成り、下記:
・PstIアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー:
- 標的DNAから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのアダプターおよびプライマーのセットであって、該アダプターおよびプライマーのセットは制限フラグメントに連結する少なくとも1つのアダプター並びに10〜50ヌクレオチドを有する少なくとも1つのプライマーを含み、該プライマーはアダプター配列に相補的な配列を含み、ここで該アダプターおよびプライマーは、下記の群(i)〜(vii):
(i)PstI−アダプター
- 標的DNAから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのキットであって、該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該キットは請求項1に記載の少なくとも1つのプライマーセットを含むことを特徴とする前記キット。
- 請求項1に記載のプライマーセットを含む請求項3に記載のキット。
- 更に、1種または複数種の制限エンドヌクレアーゼを含む請求項4に記載のキット。
- 更に、DNAポリメラーゼおよび/またはdNTP、および/または緩衝液溶液を含む請求項5に記載のキット。
- DNAポリメラーゼがTaqポリメラーゼである請求項6に記載のキット。
- 遺伝子分析のための請求項3〜7に記載の診断用キット。
- ヒトの法医学的分類のための請求項8に記載のキット。
- 動物または植物の形質の遺伝を検出するための請求項8に記載のキット。
- 増幅された制限フラグメントのセットであって、
(a) 出発DNAを少なくとも1種の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、制限フラグメントに断片化し、
(b) 得られた制限フラグメントを、該制限フラグメントの一端または両端に連結するのに適合した一端を有する少なくとも1種の2本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターに連結し、それによって標識付き制限フラグメントを生成し、
(c) 前記標識付き制限フラグメントを、ハイブリダイゼーション条件下に、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、ここで前記プライマーおよびアダプターは、請求項1に記載のものの中から選択され、
(d) 前記1種または複数種のプライマーにハイブリダイズした前記標識付き制限フラグメントを必要なヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼの存在下に増幅するか、またはハイブリダイズしたプライマーを前記標識付き制限フラグメントに沿って伸長させ、
(e) ステップ(d)で作製した増幅または伸長したDNAフラグメントを同定または回収する、
ことを含む方法により得られる、増幅された制限フラグメントのセット。 - ゲル、膜またはフィルム上に存在する請求項11に記載の増幅された制限フラグメントのセット。
- 少なくとも1種の制限エンドヌクレアーゼを用いて標的DNAから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該オリゴヌクレオチドプライマーは制限エンドヌクレアーゼで消化した後に残る制限部位の配列を有するアダプターと組合せて使用されることを特徴とし、ここで該オリゴヌクレオチドプライマーが、下記:
・PstIで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー:
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