KR20010041371A - 핵산의 비특이적 증폭방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RNA 풀로부터 다수의 RNA 사본을 비특이적인 방법으로 생성하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 특정 조건 하에서 소정의 세포 타입 또는 세포 내에서 발현상의 차이를 선별하는 기법에서 특히 중요하다. 본 발명은 비선택성 폴리 A mRNA 표지 및 증폭 방법을 제공하는데, 이 방법은 cDNA 합성 단계를 포함하지 않는다. 본 발명은 폴리 A 꼬리를 포함하는 mRNA 풀의 각각의 mRNA를 포함하는 출발물질을 포함하는 핵산으로부터 출발하여 비특이적인 방법으로 다수의 RNA 사본을 생성하므로써 RNA를 증폭시키는 방법에 관한 것인데, 여기서 상기 출발물질은 올리고-dT 서열, RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열 및 올리고-dT 서열과 상기 프로모터 서열 사이에 위치하는 전사 개시 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 동시에 접촉시키고, 또한 역전사효소 활성을 보유하는 효소, RNase H 활성을 보유하는 효소 및 RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소 및 필요한 뉴클레오티드와 접촉시키고, 생성되는 반응 혼합물은 효소 반응이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지시킨다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 생성된 RNA 사본은 DNA 리가제, RNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있는 이본쇄 DNA 프로모터 서열을 포함함으로써 복합체의 한 쇄가 상기 DNA 쇄중 한 쇄의 5' 단부에 부착된 RNA의 신장부를 보유하는 이본쇄 핵산 복합체 및 필요한 뉴클레오티드와 접촉시킨다. 생성된 반응 혼합물은 증폭이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지시킨다.

Description

핵산의 비특이적 증폭 방법{METHOD FOR THE NON-SPECIFIC AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID}
단지 소수의 세포로부터 유도된 mRNA 함량을 분석하기 위해서는 조사중에 있는 세포(들) 내에 존재하는 mRNA를 증폭시키는 방법이 필요하다. 이미 어떤 세포의 mRNA 군집을 조사하기 위한 방법을 개발하기 위해 많은 노력이 있어 왔다. 이는 여러가지 조건하에서 차별적으로 발현되는 유전자의 확인을 목적으로 하는, 세포의 mRNA 군집으로부터 출발하는 핵산 물질을 표지하는 기법들의 개발로 이어졌다.
유전자 발현의 차이를 선별하기 위한 한가지 방법은 차별 현시(Differential Display)라 알려진 방법이다[참조: Liang 및 Pardee, Science, Vol 257, 967-971 (1992); 1993년 11월 16일 발행된 미국 특허 5,262,311]. 상기한 Liang 및 Pardee의 방법에 따르면, mRNA는 먼저 cDNA로 전사되고, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 증폭된다. 한 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되는데, 첫째 프라이머는 mRNA의 하부 세트의 폴리아데닐화 꼬리에 부착되어 있으며, 다른 프라이머는 짧고, 서열이 무작위여서 첫째 프라이머와는 상이한 위치에 어닐링된다. 이 방법은 조사중인 세포로부터 가능한한 많은 mRNA의 증폭을 목표로하는 변경가능한 상이한 쌍의 서열과 함께 사용된다. 생성된 PCR 생성물은 미량의 표지된 (방사성) 뉴클레오티드를 이용하여 표지된다.
Liang 및 Pardee의 차별 현시법을 개선한 방법은 미국 특허 5,589,726에 게시되어 있다. 미국 특허 5,589,726에 기술된 방법은 더 긴 프라이머(Liang 및 Pardee에 의해 최초로 기술된 9 내지 14 염기쌍과 비교하여 22 내지 30 뉴클레오티드)를 사용하는 점에서 Liang 및 Pardee의 방법과는 다르다.
Liang 및 Pardee에 의해 최초로 게시된 차별 현시법에 대한 다른 개선법은 WO 97/37045에 기술되어 있다. 이 출원에서, PCR에 기초한 방법에 다시 게시되며; 이 방법은 부착된 프라이머가 아니라 올리고-dT 프라이머를 사용한다. 따라서, 역전사 단계후, 모든 가능한 mRNA 서열을 포괄하는 단지 하나의 cDNA 군집이 생성된다. 따라서, 얻어진 cDNA는 cDNA의 감소 농도에서 수회의 PCR 반응을 수행함으로써 PCR 과정으로 적정한다. 이는 상기 방법을 보정하여 허위 음성에 대해 상기 방법을 보호하는데 기여한다. PCR 반응은 부착된 프라이머를 이용하여 재차 수행할 수 있다.
mRNA의 "발현 프로파일링(Expression Profiling)"을 위한 다른 방법은 미국 특허 5,514,545에 게시되어 있다. 이 방법에 따르면, 단일 세포내의 mRNA는 세포내에서 mRNA로부터 cDNA의 제1 쇄를 합성하기 위한 올리고-dT 및 박테리오파지 프로모터, 예를 들어 T7, T3 또는 SP6의 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 역전사효소 및 뉴클레오티드를 세포내로 미세주입함으로써 특정화할 수 있다. cDNA의 제1 쇄로부터 이본쇄 cDNA가 합성된다. 상기 이본쇄 cDNA는 작용 프로모터를 포함하기 때문에, aRNA(안티센스 RNA)는 RNA 폴리머라제를 이용하여 이로부터 합성할 수 있다. 상기 aRNA는 역전사효소와 함께 무작위 헥사뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 재증폭되어 제1 쇄 cDNA를 합성한다.
상기 모든 기법에 따르면, cDNA는 주형으로서 RNA를 이용하여 프라이머로부터 제조할 수 있다. 그러나, 이 반응에 사용된 효소(역전사효소)는 mRNA 내의 구조에 의해 cDNA 합성에서 방해된다. 결과적으로, 종래의 방법들은 구조가 없거나 거의 없는 mRNA에 특이적이다. 이 효과는 합성된 cDNA가 예를 들어 PCR에 의해 추가로 증폭되는 경우 더 증강된다. 상기한 이유로인해, 이러한 형태의 발현 프로파일링 분석에서 다량의 샘플을 이용하는 것이 통례이다. 따라서, 이 기술적인 한계로 인해 세포 분류기 상에서 분리된 단지 소수의 세포 또는 현미경 확인 및 선택후 유리 슬라이드로부터 미세 절단에 의해 분리된 소수의 세포의 분석은 불가능하다.
본 발명은 RNA의 풀로부터 다수의 RNA 사본을 비특이적으로 생성하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 특정 조건하에서 소정의 세포 타입 또는 세포 내에서발현의 차이를 선별하기 위한 기법에 특히 중요하다.
고등 유기체의 세포 내에서는 존재하는 유전자의 약 15%만이 발현된다(각 세포는 약 100,000 유전자를 보유한다). 유전자 발현은 상이한 세포 타입 및 소정의 세포의 상이한 발생 단계에 따라 다르며, 모든 생물학적 과정, 예를 들어 노화, 세포 분화 및 감염 또는 기타 질병 상태에 결정적이다. 따라서, 세포내 상이한 환경에서 차별적으로 발현되는 유전자의 확인은 세포 생물학에서 최대의 관심사이다.
이러한 문제에 대한 해답은 비선택적인 폴리 A mRNA 표지화 및 증폭 방법을 이용하는 것인데, 이 방법은 cDNA 합성 단계를 포함하지 않는다.
본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 본 발명은 폴리-A 꼬리를 포함하는 mRNA 풀의 각각의 mRNA를 포함하는 출발 물질을 함유하는 핵산으로부터 출발하여 다수의 RNA 사본을 비특이적인 방법으로 생성함으로써 RNA를 증폭하는 방법에 관한 것인데, 여기서 상기 출발 물질은 올리고-dT 서열, RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열 및 상기 올리고-dT 서열과 상기 프로모터 서열의 사이에 위치하는 전사 개시 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 동시에 접촉시키고, 추가로 역전사효소 활성을 보유하는 효소, RNase H 활성을 보유하는 효소 및 RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소 및 필요한 뉴클레오티드와 접촉시키고, 생성되는 반응 혼합물은 효소 반응이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건하에서 유지시킨다.
이는 반응 혼합물내에 존재하는 mRNA의 다수의 안티센스 RNA 사본의 형성을 유도할 것이다. 본 발명의 방법은 cDNA 중간체의 생성은 포함하지 않으며; RNA는 조사중인 물질 내에 존재하는 mRNA로부터 직접 복제된다. 본 발명의 방법은 RNA의 증폭을 위한 기초로서 cDNA를 필요로하지 않는다. RNA는 RNA 폴리머라제에 의해 mRNA 주형으로부터 직접 합성된다. 상기 RNA 폴리머라제 활성은 mRNA 내에 존재하는 임의의 2차 구조와는 무관하며, 따라서 상이한 mRNA가 mRNA 내의 구조에 따라 증폭되는, 방식상의 차이는 없다. 만들어진 사본은 출발 물질 내에 존재하는 최초 mRNA 군집을 나타낸다.
본 발명의 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 3' 단부에서 폴리아데닐화 꼬리에 하이브리드화될 올리고-dT 서열을 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열 및 상기 올리고-dT 서열과 상기 프로모터 서열의 사이에 위치하는 전사 개시 영역을 추가로 포함한다. RNA 폴리머라제의 예는 E. coli 및 박테리오파지 T7, T3 및 SP6으로부터 취한 폴리머라제이다. 바람직한 RNA 폴리머라제는 박테리오파지-유도된 RNA 폴리머라제, 특히 T7 폴리머라제이다.
상기 올리고뉴클레오티드는 그의 3' 단부에서 차단될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드가 그의 3' 단부에서 차단되지 않는 경우, 올리고뉴클레오티드는 역전사효소에 의해 신장될 수 있다. 그러나, 생성되는 cDNA는 증폭 기작의 일부분이 아닐 것이다(종래의 방법과 동일함). 이는 기타 효소 반응과 충돌한다. 올리고뉴클레오티드의 신장은 매우 제한된 수의 뉴클레오티드인데, 그 이유는 상기 프로모터가 이본쇄로 제조되는 경우, RNA 폴리머라제에 의한 mRNA 주형 상에서의 전사는 즉시 개시될 것이기 때문이다. 이 전사는 RNA 주형으로부터의 RT를 "추진"할 것이며, 올리고뉴클레오티드의 신장(즉, cDNA 합성)은 더 이상 발생하지 않을 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 그의 3' 단부에서 차단되어 그로부터 RNA 주형을 따라 역전사효소에 의한 임의의 신장을 방지하며; 역전사효소는 올리고뉴클레오티드의 3' 단부의 신장을 개시시킬 수 없을 것이며, cDNA는 합성되지 않는다. 역전사효소는 주형 내에 존재하는 프로모터 서열의 상보적인 쇄를 합성한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 용도는 도 1에 모식적으로 도시하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화시, mRNA의 폴리-A 서열은 RNase H 활성을 보유하는 효소에 의해 절단된다. 이 활성은 역전사 효소의 RNase H 활성 또는 별도의 효소, 예를 들어 E. coli RNase H의 RNase H 활성, 또는 둘 다 일 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 방법과 함께 사용된 바람직한 전사효소는 RNase H 활성을 보유하는 효소, 예를 들어 AMV-RT 또는 MMLV-RT 이다. 상기 RNA의 새롭게 생성된 3' 단부는 올리고뉴클레오티드 주형 상에서 신장되어 이본쇄 프로모터 서열을 생성한다. RNA 폴리머라제를 적용함으로써 최초 RNA의 새로운 RNA 사본이 만들어 진다. 이 전사 단계중, 라벨이 혼입될 수 있으며, 전형적으로 각각의 RNA 100-1000 사본이 만들어 진다. 만들어진 사본은 안티센스 RNA이며, 따라서 5' 단부에 폴리-T 신장부를 포함한다.
RNA 폴리머라제는 보통 전사를 위해 이본쇄 주형을 사용하기 때문에, 이 효소는 mRNA 내의 구조에 의해 방해되지 않을 것 같다. 게다가, 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제의 가공성은 매우 높은데, DNA 주형 상에서 1초당 보통 250개 이상의 뉴클레오티드이다. 이는 증폭률이 단위시간에 1개의 프로모터당 개시 이벤트의 수에 의해 결정됨을 의미한다. 상기 프로모터는 각각의 mRNA에 대해 동일하기 때문에, 증폭에서 선택성이 없다.
상기 반응이 수행되어야 하는 조건은 정상 조건, 즉 사용되는 효소 혼합물에 대해 최적인 것으로 알려진 완충용액 구성 및 온도이다.
단지 소수의 세포의 발현 프로필을 제조하는 것이 목적인 경우, 상기한 증폭은 예를 들어 사본이 표지되는 경우 신호를 생성하기 위한 RNA의 충분한 사본을 산출할 수 없을 수 있다. 특별한 경우에서, RNA는 추가로 선택성을 도입함이 없이 증폭될 필요가 있을 수 있으며, 따라서 cDNA 합성을 피할 수 있다. 이 문제를 해결하기 위한 다수의 해결책이 있으며, 모두 전사에 기초한 것들이다. 좋은 해결책은 도 2에 도시하였다. 새롭게 합성된 RNA는 다음과 같은 방법으로 추가로 증폭될 수 있다. 모든 RNA 분자의 3' 단부에 RNA 리가제를 이용하여 이본쇄 프로모터 서열을 연결한다. 모든 3' 단부는 화학적으로 동일하기때문에, 선택성은 없다. 연결된 프로모터를 이용하여 더 많은 (표지된)RNA를 생성하는 두번째 전사 라운드를 개시시킨다. 이는 도 2에 나타냈다.
따라서, 본 발명의 바람직한 방법에서, 상기한 바와 같이 만들어진 생성된 RNA 사본은 RNA 리가제, RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있는 이본쇄 DNA 프로모터 서열을 포함함으로써 복합체의 한 쇄가 상기 DNA 쇄중 한 쇄의 5' 단부에 부착된 RNA의 신장부를 보유하는 이본쇄 핵산 복합체, RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소 및 필요한 뉴클레오티드와 접촉시킨다. 생성되는 반응 혼합물은 증폭이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건하에서 유지시킨다.
또한, 사용된 하나 이상의 뉴클레오티드는 표지할 수 있다.
RNA 폴리머라제 프로모터 서열의 배향으로 인해, RNA 주형을 이용하여 새로은 센스 스트랜드 RNA 분자를 생성한다. 전형적으로 각각의 RNA의 100 내지 1000 사본이 RNA 폴리머라제에 의한 전사 반응에 의해 만들어 진다.
상기 DNA 쇄중 한 쇄의 5' 단부에 부착된 RNA의 신장부는 5' 단부에서 인산화된다. 인산화는 5' 단부의 연결을 가능하게 한다.
프로모터는 예를 들어, 상기 과정의 첫 부분에서 사용한 것과 동일한 프로모터일 수 있으며, T7-프로모터 서열을 사용할 수 있으며, RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제이다.
흥미롭게도, 두번째 전사 라운드에서 만들어진 센스 RNA는 다시 3' 단부에 폴리 A 신장부를 함유하며, 도 1에 예시한 방법 및 도 2에 예시한 바와 같이 리가제를 이용하는 방법을 반복하여 수행함으로써 다수의 증폭 사이클을 수행할 수 있다.
리가제가 사용되는 과정은 별개의 반응으로 수행할 수 있다. 즉, RNA 사본이 도 1에 도시한 과정과 유사한 과정으로 생성된 후, RNA 사본은 다른 반응 배지 내에 이전할 수 있으며, 제 2 반응을 수행할 수 있다.
모든 효소 및 올리고뉴클레오티드와 프로모터 구성물이 초기 반응 혼합물과 연합되는 경우, 연속 공정으로 수행할 수 있다. 비편향된 mRNA 증폭 방법의 증폭 인자를 더 증강시키기 위한 다른 좋은 방법은 새롭게 합성된 RNA의 3' 단부에 폴리 A 뉴클레오티드 신장부를 첨가하는 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드 신장부는 효소인 폴리 A 폴리머라제에 의해 첨가된다. 상기 첨가된 폴리 A 서열에 올리고 T 신장부 및 T7 프로모터를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 다시 하이브리드화할 수 있으며, 이미 기술한 과정을 반복하여 수행할 수 있다. 결과적으로, RNA는 전사 과정에 의해 제조될 것이며, 새롭게 합성된 RNA는 전체 반응이 우선적으로 개시되는 최초 mRNA와 동일할(대부분) 것이다. 당업자는 올리고 dT 신장부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 T7 프로모터가 재차 이 RNA에 하이브리드화할 수 있으며, 전사, 올리고뉴클레오티드 어닐링 및 이본쇄 프로모터 합성에 의한 RNA 합성의 연속 과정에 편입된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 방법에서, 상기한 바와 같이 기본적인 방법으로 만들어진 생성된 RNA 사본은 폴리 A 폴리머라제, 올리고 T 신장부와 T7 프로모터를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 역전사효소, RNase H, RNA 폴리머라제 및 필요한 뉴클레오티드와 접촉시킨다. 생성되는 반응 혼합물은 증폭이 일어날 충분한 시간동안 적합한 조건하에 유지시킨다. 이 혼합물에서, 사용된 하나 이상의 뉴크레오티드는 표지할 수 있다. 새롭게 첨가된 폴리 A 신장부(RNA 분자의 3' 단부)의 위치때문에, RNA 폴리머라제는 반대 극성의 RNA를 생성할 것이다. 올리고 T 신장부 및 T7 프로모터를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 상기 과정의 첫째 부분에서 사용한 것과 동일한 것일 수 있다. 폴리 A 폴리머라제가 첨가되는 과정은 별개의 반응으로 수행할 수 있다. 즉, RNA 사본은 도 1에 도시한 것과 같은 과정으로 제조된 후, 상기 RNA 사본은 다른 반응 배지 내로 이전할 수 있으며, 폴리 A 폴리머라제를 이용하여 반응을 수행할 수 있다. 연속 증폭 과정을 개시한다. 폴리 A 폴리머라제가 초기 반응 혼합물에 첨가되는 경우, 연속 증폭 과정은 최초 mRNA 주형으로부터 즉시 개시할 수 있다.
도면의 간단한 설명
제1도는 전사에 기초한 비특이적인 폴리 A mRNA 증폭의 모식도이다. 상기 RNA를 절단하는데 필요한 RNase H 활성은 AMV-RT와 관련될 수 있다.
제2도는 상기한 비특이적인 증폭 모식도(예를 들어, 도 1에 기술한 방법)에 의해 생성된 RNA 생성물의 비특이적인 증폭의 두번째 라운드를 나타내는 모식도이다.
제3도는 주형으로서 실시예 1에 설명한 RNA 형태의 상이한 희석율을 이용하여 티라스(Tyras) 반응의 실버 염색된 클린겔 분석을 나타내는 도면이다.
1) 50배 희석
2) 100배 희석
3) 500배 희석
4) 1000배 희석
5) 주형없음
M) 100-400 nt 마커
i) 주입물
제4도는 방사능 표지된 티라스 증폭 생성물을 나타내는 클린겔의 방사능 사진이다. 레인 1, 폴리 A+RNA 주입; 레인 2, 5분 표지화; 레인 3, 10분 표지화; 레인 4, 20분 표지화; 레인 5, 주형없는 반응; 레인 M, 비표지된 마커.
제5도는 실시예 3의 티라스 반응 혼합물로 탐침한 표 1에 기재한 프로브 어레이 필터의 방사능사진이다.
제6도는 아틀라스 인간 cDNA 발현 어레이의 "이 쿼드란트(E quadrant)"를 이용한 필터의 방사능사진이다. 볼 수 있는 점들은 분명히 티라스에 의해 표지된 폴리 A + RNA의 하이브리드화를 나타낸다. 화살표는 실시예 4에서 양성인 G3PDH 프로브 OT1446의 대조용 점을 가리킨다(참조: 도 5).
제7도는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 T 신장부의 하이브리드화를 위한 표적으로서 폴리 A 꼬리를 첨가한 폴리 A 폴리머라제를 이용하는 티라스 반응의 실버염색된 클린겔 분석 결과를 나타내는 도면이다.
레인 1, 주입물로서 반응물 A 5 ㎕를 이용하는 티라스 반응; 레인 2, 주입물로서 반응물 B 5 ㎕를 이용하는 티라스 반응; 레인 3 및 레인 4, 음성 대조용 레인; M은 마커 레인. 화살표는 특이적 증폭 생성물의 위치를 나타낸다.
개요
본 실시예에 사용된 방법은 본 발명의 방법의 한 구체예이며, 본 실시예에서 "티라스(Tyras)"라 칭한다. 티라스라 칭하는 방법은 mRNA의 폴리 A 꼬리에 대한 올리고 T 신장부를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화에 이은 올리고뉴클레오티드에 대한 RNase H 분해 및 역전사효소에 의한 mRNA의 새롭게 형성된 3' 단부의 신장을 포함한다. 이 방법에서, 올리고 T 신장부를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 일부분인 T7 RNA 폴리머라제 인식 서열(즉, T7 프로모터)는 이본쇄로 제조된다. 상기 프로모터에 대한 T7 RNA 폴리머라제의 결합시, 최초 mRNA 분자는 반대 극성의 다수의 RNA 사본으로 전사된다(참조: 도 1).
재료
대부분의 효소, 방사능표지된 뉴클레오티드, 아크릴아미드 클린겔 및 올리고뉴클레오티드는 네덜란드, 4077 AT 루센달, 베르크란트 230의 아메르샴 파마시아에서 시판된다. AMV-역전사효소는 미국, 메릴랜드 120248, 록빌에 소재하는 세이가가쿠에서 시판된다. 인간 폴리 A+ RNA는 네덜란드, 3830 AE 레이덴, PO BOX 214, 웨스트버그에 소재하는 클론테크에서 시판된다.
실시예 1
B형 간염 비루스(HBV) 게놈 서열[뉴클레오티드 수 1662-1914, 참조: Lai, M.E 등 (1991)]을 함유하는 플라스미드 pG3O. T7 프로모터뒤의 EcoRI 위치내에 클로닝된 사르디니아에서 분리된 ayw 아형의 새로운 돌연변이주의 B형 간염 비루스 게놈[참조: Nucleic Acids Res. 19 (18), 5078]의 서열 분석을 이용하여 HBV 서열(핵산 수 1662-1914)에 인접한 폴리 A 신장부(25 nts)를 함유하는 시험관 내에서 전사된 RNA를 생성하였다. 상기 플라스미드 pG3O는 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 제한 효소 Hind III로 분해하였다. 선형화된 플라스미드는 37℃에서 3시간 동안 시험관내 전사 반응(조성: 40mM 트리스-HCl, pH=7.5, 6 mM MgCl2, 2 mM 스페르미딘, 10mM NaCl, 10mM DTT, 각각 0.5mM rNTPs, RNA 가드 20 유니트 및 T7 RNA 폴리머라제 46.5 유니트)으로 표준 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 전사시켰다. 시험관 내에서 전사된 RNA의 길이는 306개의 뉴클레오티드였다. 시험관 내에서 전사된 RNA는 DNase I(1 ㎕, 10 유니트)으로 37℃에서 30분 동안 처리하였다. DNase I으로 처리한 후, 시험관 내에서 전사된 RNA는 당업계에 공지된 방법으로 페놀/클로로포름 정제하고, 에탄올 침전시켰다. 펠릿화된 시험관 내에서 전사된 RNA는 물 20 ㎕에 용해시키고, 물에 희석시킨 희석물은 후속 실험을 위해 사용하였다.
실시예 2
실시예 1에서 생성된 시험관 내에서 전사된 RNA(약 1 ㎍/㎕)를 주형으로 사용하여 티라스 반응에서 새로운 RNA를 생성하였다. 상기 실시예 1의 시험관 내에서 전사된 RNA는 별도로 물에 50배, 100배, 500배 및 1000배 희석시켰다. 티라스 용액은 물 2 ㎕, 5x NN 완충용액(200mM 트리스-HCl, pH 8.5, 60mM MgCl2, 350mM KCl, 25mM DTT, 각각 5mM dNTPs, 10mM rATP, 10mM rUTP, 10mM rCTP, 7.5mM rGTP, 2.5mM ITP) 4 ㎕, 프라이머 혼합물(100% DMSO 76.9 ㎕, 올리고뉴클레오티드 PH26 11.6 ㎕[42.9μM, 서열 5'AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AGA AGG ATA CCA CTA GCT AGC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 3'-비오틴]과 물 11.5 ㎕로 전체 부피 100 ㎕) 및 실시예 1에서 시험관 내에서 전사된 RNA의 적합한 희석물 5 ㎕를 포함한다. 반응은 65℃에서 5분 동안 항온처리하고, 이어서 41℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 효소 혼합물(1.5M 소르비톨, BSA 2.1 ㎍, RNase H 0.08 유니트, T7 RNA 폴리머라제 32 유니트 및 AMV-역전사효소 25.3 유니트) 5 ㎕ 이상을 상기 반응물에 첨가하고, 튜브를 두드려 부드럽게 혼합하였다. 41℃에서 5분 동안 짧게 항온처리한 후, 간단히 원심분리하여 모든 소적들을 튜브의 바닥에 수집하였다. 반응물은 41℃에서 90분 동안 항온처리하였다. 상기 반응후, 튜브는 -20℃에서 저장하였다. 상기 반응물은 10% 아크릴아미드 클린겔 상에서 분석하였으며, 티라스 반응물 0.5 ㎕는 포름아미드 로딩 염료(미국 텍사스 78744-1832 오스틴 우드워드 스트리트 #200 2130에 소재하는 암비온) 7.5 ㎕와 혼합하고, 제조자의 프로토콜에 따라 클린겔상에서 분석하였다. 결과는 도 1에 나타냈다.
실시예 3
본 실시예에서는 티라스 반응물을 이용하여 인간 태반 폴리 A + RNA 주형으로부터32P 방사능표지된 RNA를 생성하였다. 상기 티라스 반응물은 5x NN*완충용액(200mM 트리스-HCl, pH 8.5, 60mM MgCl2, 350mM KCl, 25mM DTT, 각각 5mM dNTPs, 10mM rGTP, 10mM rUTP, 10mM rCTP) 4 ㎕, 프라이머 혼합물 PH26(실시예 2 참조) 4 ㎕, α-32P-ATP 6.5 ㎕ 및 인간 폴리 A+ RNA(1 ㎍/㎕, 클론테크 로트 NR. 7050106, Cat.6518-1) 0.5 ㎕를 함유하였다. 튜브를 두드려 상기 성분들을 혼합하고, 65℃에서 5분, 이어서 41℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 효소 혼합물(1.5M 소르비톨, BSA 2.1 ㎍, RNase H 0.08 유니트, T7 RNA 폴리머라제 32 유니트 및 AMV-역전사효소 25.3 유니트) 5 ㎕ 이상을 상기 반응물에 첨가하고, 튜브를 두드려 부드럽게 혼합하였다. 41℃에서 5분 동안 짧게 항온처리한 후, 간단히 원심분리하여 모든 소적들을 튜브의 바닥에 수집하였다. A, B, 및 C로 표시한 3개의 튜브에는 각각 41℃에서 0분, 5분 및 15분 동안 항온처리한후, rATP(100mM) 0.4 ㎕를 첨가하였다. rATP를 첨가한 후, 상기 반응물은 41℃에서 90분 동안 항온처리하였다. 상기 반응후, 튜브는 -20℃에서 저장하였다. 반응물은 10% 아크릴아미드 클린겔 상에서 분석하고, 티라스 반응물 0.5 ㎕와 포름아미드 로딩 염료(암비온) 7.5 ㎕를 혼합하고, 제조자 프로토콜에 따라 클린겔 상에서 분석하였다. 결과는 도 2에 나타냈다.
실시예 4
실시예 3의 티라스 반응물을 수집하고, 필터 프로브 어레이를 탐침하는데 이용하였다. 프로브 어레이의 조성은 하기 표 1에 나타냈으며, 올리고뉴클레오티드는 제타-브로브 막(미국 캘리포니아 94547 허큘리스 알프레드 노벨 드라이브 2000에 소재하는 바이오라드 래보러토리즈) 상에 스포팅하였다. 실시예 3으로부터 수집된 티라스 반응물 총 58.5 ㎕를 하이브리드화 혼합물(5x SSC[20x SSC는 3M NaCl, 0.3M Na-시트레이트임], 7% SDS, 20mM NaPi, 10x 덴하르트[100x 덴하르트는 2% 폴리비닐피롤리돈, 2% BSA 및 2% 피콜임]) 25 ㎖에 첨가하였다. 상기 필터는 프로브 어레이와 함께 하이브리드화 혼합물 내에서, 42℃의 진탕 항온처리기 내에서 16 시간(O/N) 동안 항온처리하였다.
실시예 3의 표지된 티라스 반응물로 탐침된 올리고뉴클레오티드 프로브 어레이의 조성물
감마-액틴(+)프로브:OT8583.0＾13 분자 감마-액틴(+)프로브:OT8586.0＾11 분자 감마-액틴(+)프로브:OT8593.0＾13 분자 감마-액틴(+)프로브:OT8596.0＾11 분자
감마-액틴(+)프로브:OT8603.0＾13 분자 감마-액틴(+)프로브:OT8606.0＾11 분자 G3PDHP2:OT14463.0＾13 분자 G3PDHP2:OT14466.0＾11 분자
G3PDHP2:OT14473.0＾13 분자 G3PDHP2:OT14476.0＾11 분자 G3PDHP2:OT14483.0＾13 분자 G3PDHP2:OT14486.0＾11 분자
V 인자P1:OT19153.0＾13 분자 V 인자P1:OT19156.0＾11 분자
상기 프로브 어레이 필터는 실온에서 7분 동안 3x SSC/1% SDS에서 2회 세척하였다. 세척후, 습윤 필터를 호일로 감싸고, -70℃에서 하룻밤동안 X-선 필름에 노출시켰다. 노출 결과는 도 3에 나타냈다. 방사능사진은 어레이에서 G3PDH 프로브 OT1446의 위치에서 양성 신호를 분명하게 나타내고 있다.
실시예 5
본 실시예에서, 티라스 반응물을 이용하여 인간 폴리 A+ RNA 주형으로부터32P 방사능표지된 RNA를 생성하였다. 상기 티라스 반응물은 5x NN*완충용액(200mM 트리스-HCl, pH 8.5, 60mM MgCl2, 350mM KCl, 25mM DTT, 각각 5mM dNTPs, 10mM rGTP, 10mM rUTP, 10mM rCTP) 4 ㎕, 프라이머 혼합물 PH26(실시예 2 참조) 4 ㎕, α-32P-ATP(반응물 A 및 반응물 B) 6.5 ㎕ 또는 α-32P-ATP(반응물 D, E 및 C) 5.5 ㎕ 및 인간 폴리 A+ RNA(1 ㎍/㎕, 클론테크 로트 NR. 7050106, Cat.6518-1)을 함유하였으며, 반응물 C에는 단지 물만 첨가되었는데 그 이유는 이 반응물이 음성 대조용이기 때문이다. 상기 성분들은 상하로 5회 피펫팅함으로써 혼합하고, 65℃에서 5분 동안, 이어서 41℃에서 5분 동안 항온처리하였다. 효소 혼합물(1.5M 소르비톨, BSA 2.1 ㎍, RNase H 0.08 유니트, T7 RNA 폴리머라제 32 유니트 및 AMV-역전사효소 25.3 유니트) 5 ㎕ 이상을 상기 반응물에 첨가하고, 튜브를 두드려 부드럽게 혼합하였다. 반응물 C, D 및 E에 T7 혼합물(T7 RNA 폴리머라제 31 유니트 및 RNase H 0.6 유니트) 1 ㎕를 첨가하고, 튜브를 두드려 부드럽게 혼합하였다. 41℃에서 짧게 5분 동안 항온처리한 후, 상기 튜브를 간단히 원심분리하여 상기 튜브 바닥에 모든 소적을 수집하였다. 모든 튜브에 rATP(100mM) 0.4 ㎕를 첨가하였다. rATP 첨가후, 반응물 A와 반응물 B는 41℃에서 90분 동안 항온처리하고, 반응물 C, 반응물 D 및 반응물 E는 41℃에서 150분 동안 항온처리하였다. 반응후 상기 튜브는 -20℃에서 저장하였다. 반응물 A, B 및 D를 수집하고, 아틀라스 인간 cDNA 발현 어레이(미국 캘리포니아 94303-4230 팔로알토 이스트 메도우 서클 1020, 클론테크 래보레토리즈, 로트 번호 7090625)의 "이 쿼드란트"를 탐침하였다. 상기 필터는 아틀라스 인간 cDNA 발현 어레이의 "이 쿼드란트"와 함께 50℃에서 15분 동안 하이브리드화 혼합물(실시예 4 참조) 내에서 항온처리하였다. 수집된 반응물 A, B 및 D를 상기 필터위의 하이브리드화 혼합물에 첨가하고, 추가로 16 시간(O/N) 동안 항온처리하였다. 하이브리드화후, 아틀라스 인간 cDNA 발현 어레이의 "이 쿼드란트"를 갖는 필터는 실온에서 3x SSC/1% SDS를 이용하여 4회 세척하였다. 습윤 필터를 호일로 싸고, -70℃에서 65 시간 동안 X-선 필름에 노출시켰다. 결과는 도 4의 하부에 나타냈으며, 티라스 방법을 이용하는 폴리 A+ RNA의 양호한 표지화를 나타내는 어레이 상의 양성 점들을 분명하게 나타내고 있다.
실시예 6
본 실시예에서 폴리 A 폴리머라제를 첨가하는 것이 티라스 반응의 증폭을 증강시키는가를 조사하였다. 상기 반응물은 폴리 A 꼬리를 함유하거나 함유하지 않는 모델 RNA ±1 ㎍, 1mM ATP, 50mM 트리스, pH=7.9, 250mM NaCl, 10mM MgCl2, BSA 2.5 mg/ml 및 폴리 A 폴리머라제(지브코 비알엘, 카탈로그 번호 18032-011) 1.3 유니트를 총 부피 30 ㎕로 함유하였다. 반응물은 37℃에서 20분(반응물 A) 또는 60분(반응물 B) 동안 항온처리하였다. 후속적으로 3' 단부에 새롭게 첨가된 폴리 A 신장부를 보유하는 반응 생성물은 실시예 2에 기술한 티라스 반응에 사용하였다. 41℃에서 90분 항온처리후, 티라스 반응 생성물은 10% 아크릴아미드 클린겔 상에서 분석하였다. 겔에 로딩하기 위해, 티라스 반응물 0.5 ㎕와 포름아미드 로딩 염료(미국 텍사스 78744-1832 오스틴 우드워드 스트리트 #200 2130, 암비온) 7.5 ㎕를 혼합하고, 제조자 프로토콜에 따라 클린겔 상에서 분석하였다. 결과는 도 5에 나타냈다. 상기 겔 상에서 볼수있는 다수의 밴드는 화살표의 위치에서 반응물의 성분의 결과를 나타냄에도 불구하고(참조 레인 3 및 4), 특정 밴드는 레인 1과 2에서 관찰될 수 있다. 이 결과로부터 명백히 확인할 수 있는 바와 같이, RNA에 폴리 A 신장부를 첨가하고, 이어서 티라스 증폭을 개시할 때 새롭게 첨가된 폴리 A 신장부를 이용할 수 있다.

Claims (15)

  1. 폴리 A 꼬리를 포함하는 mRNA 풀의 각각의 mRNA를 포함하는 출발 물질을 함유하는 핵산으로부터 출발하여 비특이적인 방법으로 다수의 RNA 사본을 생성하는 방법으로서,
    상기 물질을 동시에
    - 올리고-dT 서열, RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 서열 및 상기 올리고-dT 서열 및 상기 프로모터 서열 사이에 위치하는 전사 개시 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드
    - 역전사효소 활성을 보유하는 효소
    - RNase H 활성을 보유하는 효소 및
    - RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소
    - 필요한 뉴클레오티드
    와 접촉시키고, 생성되는 반응 혼합물은 효소 반응이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건 하에서 유지시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 그의 3' 단부에서 차단되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로모터 서열이 T7-프로모터 서열이고, 상기 RNA 폴리머라제가 T7 RNA 폴리머라제인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 역전사 효소 활성을 보유하는 효소가 AMV-RT 또는 MMLV-RT인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNase H 활성을 보유하는 효소(들중 하나)가 E. coli RNase H인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 RNase H 활성을 보유하는 효소가 역전사효소인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RNase H 활성을 보유하는 효소가 AMV-RT 또는 MMLV-RT인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드가 라벨을 구비하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성된 RNA가 추가 증폭을 위한 주입 물질로 사용되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제1항에 기재된 방법으로 만들어진 생성된 RNA 사본과
    - RNA 리가제
    - RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있는 이본쇄 DNA 프로모터 서열을 포함함으로써 복합체의 한 쇄가 상기 DNA 쇄들중 한 쇄의 5' 단부에 부착된 RNA의 신장부를 보유하는 이본쇄 핵산 복합체
    - RNA 폴리머라제 활성을 보유하는 효소
    - 필요한 뉴클레오티드
    와 접촉시키고, 생성되는 반응 혼합물은 효소 반응 증폭이 일어나기에 충분한 시간 동안 적합한 조건하에서 유지시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 DNA 쇄의 한 쇄의 5' 단부에 부착된 RNA의 신장부는 5' 단부에서 인산화되는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 프로모터 서열은 T7-프로모터 서열이고, 상기 RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오티드가 라벨을 구비하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 RNA 리가제 및 RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있는 이본쇄 DNA 프로모터 서열을 포함함으로써 상기 DNA 쇄중 한 쇄의 5' 단부에 부착된 RNA의 신장부를 보유하는 이본쇄 핵산 복합체를 더 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 제1항의 방법으로 만들어진 생성된 RNA 사본을 폴리 A 폴리머라제와 접촉시키는 방법.
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