ES2919927T3 - Métodos y reactivos para la detección del paludismo por Plasmodium falciparum resistente a la piperaquina - Google Patents

Abstract

Un método para genotipar un plasmodium que comprende: (a) proporcionar una muestra que contiene un plasmodium; y (b) detectar la presencia de un número de copias aumentado del clúster genómico de plasmepsin2-3. Un método para la detección de una infección por Plasmodium en un paciente que comprende: (a) proporcionando una muestra de sangre de un paciente y (b) detectando la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del grupo genómico de plasmepsin2-3 en la muestra de sangre. Kits para genotipar un Plasmodium y/o la detección de una infección por Plasmodium. Métodos para tratar una infección por Plasmodium. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y reactivos para la detección del paludismo por Plasmodium falciparum resistente a la piperaquina

Introducción

La eficacia antipalúdica de las terapias de combinación basadas en artemisinina (las TCA), el tratamiento de primera línea para el paludismo por Plasmodium falciparum sin complicaciones, se basa tanto en derivados de artemisinina (ART) de acción rápida como en fármacos asociados de larga duración. La resistencia a las ART, que actualmente está fijada en el oeste de Camboya y se observa en todo el sudeste asiático, aumenta la proporción de parásitos que sobreviven a un ciclo de 3 días de una TCA. La resistencia al fármaco asociado es un riesgo mayor cuando hay más parásitos que sobreviven a las ART. La eficacia reducida de las ART y de los fármacos asociados se traduce en fracasos tardíos del tratamiento y en un estado de portador del parásito prolongado, aumentando así el potencial de transmisión de infecciones resistentes a fármacos.

En Camboya, se ha elegido a la TCA de artesunato-mefloquina como el fármaco de primera línea en 2001. Para el año 2008, la alta frecuencia de fracasos del tratamiento en las provincias del oeste, el epicentro de resistencia a múltiples fármacos en P. falciparum, condujo a su reemplazo por dihidroartemisinina-piperaquina (DHA-PPQ) en 2008, y más tarde, en 2010, en toda Camboya. En los últimos años, la propagación de P. falciparum resistente a la ART, desde el oeste de Camboya hasta las provincias vecinas,1'5 ha estado seguida por un aumento espectacular en las tasas de fracaso con DHA-PPQ. Actualmente se estima que los fracasos alcanzan el 60 %6'10, lo que indica una expansión notable de la resistencia a la piperaquina (PPQ). Hasta ahora, la detección de resistencia a la PPQ se ha basado en estudios de seguimiento de 42 días logísticamente exigentes de pacientes tratados con DHA-PPQ.11 El ensayo de supervivencia de piperaquina (PSA, forma siglada de Piperaquine Survival Assay)7 in vitro desarrollado recientemente ha demostrado, con parásitos adaptados al cultivo in vitro y aislados de pacientes ex vivo recién recogidos, detectar la resistencia a la PPQ y el fracaso del tratamiento de manera más fiable que los ensayos clásicos de respuesta a la dosis.7 Por lo tanto, el PSA in vitro proporciona una herramienta fiable para identificar firmas moleculares asociadas con la resistencia.

En este caso, los inventores utilizaron información fenotípica basada en el PSA in vitro para comparar secuencias de genoma completo de líneas de P. falciparum camboyanas dicotomizadas como susceptibles o resistentes a PPQ según sus resultados en el PSA in vitro.7 Los exomas de líneas de parásitos resistentes a la ART adaptadas a cultivo (todas portando la mutación K13-C580Y) se compararon en cuanto a polimorfismos de un solo nucleótido (los SNP, forma siglada de single nucleotide polymorphisms) y variaciones en el número de copias (las CNV, forma siglada de copynumber variations). Los inventores observaron una asociación altamente significativa entre un número de copias aumentado de Pfplasmepsina2 (PF3D7_1408000) y Pfplasmepsina3 PF3D7_1408100) (codificados en tándem en el cromosoma 14) y la resistencia a la PPQ in vitro. A continuación, se evaluó el número de copias aumentado del gen Pfplasmepsina2 (PfPM2) como un marcador de resistencia candidato en 134 aislados con tasas de supervivencia por PSA ex vivo conocidas y en 725 muestras de sangre recogidas durante los años 2009-2015 de pacientes camboyanos tratados con DHA-PPQ y seguidos durante hasta 42 días. Estos datos proporcionan una prueba convincente de que la amplificación del locus PfPM2 es un marcador molecular de resistencia a la PPQ, que se puede utilizar para predecir el riesgo de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ en zonas resistentes a la ART. Los inventores también proporcionan información novedosa sobre el posible papel de la vacuola digestiva en la resistencia a la PPQ y el procedimiento de selección escalonado que ha dado como resultado resistencia a múltiples fármacos en parásitos P. falciparum en Camboya.

Sumario

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Se proporcionan métodos para genotipificar un plasmodio. En algunas realizaciones, los métodos comprenden (a) proporcionar una muestra que contiene un plasmodio; y (b) detectar la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. En métodos variantes de la invención, dichos métodos comprenden en una muestra que contiene un plasmodio, detectar la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica obtenida previamente de un paciente. En algunas realizaciones, el plasmodio es Plasmodium falciparum. En algunas realizaciones, la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante secuenciación. En algunas realizaciones, la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante PCR. En una realización preferida, la PCR es una PCR cuantitativa (qPCR). En algunas realizaciones, el método comprende determinar el número de copias de al menos uno del gen Pfplasmepsina2 (PF3D7_1408000) (PfPM2) y el gen Pfplasmepsina3 (PF3D7_1408100) (PfPM3). En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de al menos un ARNm seleccionado de un ARNm de PfPM2 y un ARNm de PfPM3. En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de al menos una proteína seleccionada de una proteína PfPM2 y una proteína PfPM3. En algunas realizaciones, se detectan 2, 3 o 4 copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además detectar la presencia de una proteína o ácido nucleico de propulsora K-13 mutado en la muestra. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la detección de la presencia de no más de una única copia de un ácido nucleico de Pfmdrl en la muestra.

Además, se proporcionan métodos para la detección de una infección por un plasmodio en un paciente. En alguna realización, los métodos comprenden: (a) proporcionar una muestra de sangre de un paciente y (b) detectar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra de sangre. En otra realización, los métodos comprenden: en una muestra de sangre obtenida previamente de un paciente, detectar in vitro la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. En algunas realizaciones, el plasmodio es Plasmodium falciparum. En algunas realizaciones, la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante secuenciación. En algunas realizaciones, la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante PCR. En algunas realizaciones, la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante PCR cuantitativa (qPCR). En algunas realizaciones, el método comprende determinar el número de copias de al menos uno del gen Pfplasmepsina2 (PF3D7_1408000) (PfPM2) y el gen Pfplasmepsina3 (PF3D7_1408100) (PfPM3). En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de al menos un ARNm seleccionado de un ARNm de PfPM2 y un ARNm de PfPM3. En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de al menos una proteína seleccionada de una proteína PfPM2 y una proteína PfPM3. En algunas realizaciones, se detectan 2, 3 o 4 copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además detectar la presencia o ausencia de una proteína o ácido nucleico de propulsora K-13 mutado en la muestra. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la detección de la presencia o ausencia de no más de una única copia de un ácido nucleico de Pfmdr1 en la muestra. En algunas realizaciones, la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 indica que el plasmodio es resistente a la piperaquina. En algunas realizaciones, la presencia de una proteína o ácido nucleico de propulsora K13 mutado indica que el plasmodio también es resistente a los derivados de artemisinina. En algunas realizaciones que no forman parte de la invención los métodos comprenden además administrar a dicho paciente infectado por un plasmodio resistente a la piperaquina un tratamiento a base de derivados de la artemisinina por un tiempo mayor al protocolo habitual, y/u otro fármaco antipalúdico.

Además, se proporcionan kits para la detección de una infección por un plasmodio. En algunas realizaciones, los kits comprenden cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de agrupamiento de plasmepsina2-3 y reactivos para la detección del producto amplificado. En algunas realizaciones, el kit contiene una sonda para detectar un ácido nucleico del agrupamiento de plasmepsina2-3. En algunas realizaciones, la sonda está marcada con un marcador fluorescente, radiactivo o enzimático. En algunas realizaciones el kit detecta un ácido nucleico de PfPM2. En algunas realizaciones el kit detecta un ácido nucleico de PfPM3. En algunas realizaciones, el kit comprende al menos uno de los siguientes cebadores: 5'-TGGTGATGCAGAAGTTGGAG-3' (SEQ ID NO:1); 5'-TGGGACCCATAAATTAGCAGA-3' (SEQ ID NO:2); 5'-GGATTCGAACCAACTTATACTGC-3' (SEQ ID NO:3); y 5'-AATTGGATCTACTGAACCTATTGATAA-3' (SEQ ID NO:4). En algunas realizaciones, el kit comprende al menos una sonda que comprende la secuencia 5'-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATGGA-3' (SEQ ID NO:5). En algunas realizaciones, el kit comprende la siguiente sonda: 5'-FAM-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATGGA-BHQ1-3' (SEQ ID NO:6). En algunas realizaciones, el kit comprende además cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de propulsora K-13 y reactivos para la detección del producto amplificado. En algunas realizaciones, el kit comprende además cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de Pfmdr1 y reactivos para la detección del producto amplificado.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra un diagrama de flujo de pacientes incluidos en estudios clínicos realizados en 2009-2015 en 12 provincias de Camboya para evaluar la eficacia del régimen de DHA-PPQ de 3 días, y aislados utilizados para detectar firmas moleculares asociadas con la resistencia por PSA in vitro y el fracaso clínico de DHA-PPQ. * Se administró DHA-PP supervisado una vez al día durante 3 días (día 0, 24 h, 48 h). La dosificación se basó en el peso corporal, de la siguiente manera: (i) <19 kg= DHA 40 mg-PPQ 320 mg/día; (ii) 19-29 kg= DHA 60 mg-PPQ 480 mg/día; (iii) 30-39 kg= DHA 80 mg-PPQ 640 mg/día; (iv) > 40 kg= DHA 120 mg-PPQ 960 mg/día, Para niños que no pueden tragar comprimidos, DHA-PP se disolvió en 5 ml de agua. Se observó a los pacientes durante 1 h posadministración y se les volvió a administrar una dosis completa o una media si se producían vómitos en un plazo de 30 min o entre 31 y 60 min, respectivamente. Los que vomitaron después de la segunda dosis fueron retirados del estudio y recibieron tratamiento de rescate parenteral (arteméter intramuscular). Los pacientes con temperatura axilar de 37,5 °C se trataron con paracetamol. Los pacientes se observaron diariamente hasta el día 3 y luego semanalmente durante 6 semanas (día 42) para efectuar exploraciones clínicas (temperatura axilar, verificación de síntomas) y frotis de sangre para paludismo. Se realizaron visitas a domicilio si los pacientes no regresaban a sus citas de seguimiento. ** Se excluyeron del análisis, pacientes retirados del estudio, pacientes con los que no fue posible realizar un seguimiento, pacientes que clasifican como reinfectados (basado en los genotipos msp1, msp2 y sorber).

La Fig. 2 muestra un gráfico Manhattan que muestra la significación de las variaciones del número de copias entre secuencias exomas de genoma completo de 23 líneas adaptadas a cultivo resistentes a PPQ y 8 sensibles recogidas en el oeste de Camboya en 2012 y fenotipadas usando el PSA in vitro. Cada punto representa un gen en el conjunto de 31 parásitos adaptados a cultivo, de acuerdo al cromosoma. El eje de abscisas representa la ubicación genómica y el eje de ordenadas representa la transformación logarítmica decimal de los valores de p de la prueba t de Student. Después de la corrección de Bonferroni, solo 2 genes, PF3D7_1408000 (plasmepsina2) y PF3D7_1408100 (plasmepsina3) alcanzaron significación en todo el genoma (> 4,97 = log¹⁰ (4616/0,05.

La Fig. 3 muestra las tasas de supervivencia por PSA ex vivo y PfPM2 de copia única (n=67) y de múltiples copias (n=67) según lo estimado por qPCR en aislados recogidos antes del tratamiento con DHA-PPQ, estratificadas por genotipo de K13. Los pacientes se incluyeron en estudios clínicos realizados en 2014-2015 en las provincias de Mondulkiri, Rattanakiri, Siem Reap y Stung Treng, estratificados por genotipos de K13. Se detectaron polimorfismos de K13 en 65/69 aislados resistentes a la PPQ (64 C580Y, 1 Y493H) y 17/65 aislados sensibles a la PPQ (15 C580Y, 1 C469F y 1 A626E). Se observaron tres líneas de parásitos con datos discordantes: dos líneas resistentes con locus de PfPM2 y PfPM3 no amplificados (6246 y 6395) y una línea sensible con 2 copias de PfPM2 (6369, expansión de ADN tipo 1) (véase la T abla 2).

Las Fig. 4A y 4B muestran la proporción acumulada de pacientes no recrudescentes tratados con un ciclo de 3 días de DHA-PPQ de acuerdo con (A) el número de copias del gen PfPM2 (prueba del orden logarítmico: global p<0,0001; p<0,0001 para única copia frente a 2 copias; p<0,0001 para única copia frente a >3 copias; p=0,017 para 2 copias frente a >3 copias) y (B) número de copias del gen PfPM2 y genotipo de K13 (prueba del orden logarítmico: global p<0,0001; p<0,0001 para K13 de tipo silvestre/PfPM2 con única copia frente a K13 de tipo silvestre/PfPM2 con múltiples copias; p=0,002 para K13 de tipo silvestre/PfPM2 con única copia frente a K13 mutante/PfPM2 con única copia; p<0,0001 para K13 de tipo silvestre/PfPM2 con única copia frente a K13 mutante/PfPM2 con múltiples copias; p=0,001 (RRI=6,9 [IC del 95 %: 0,5-96,6]), para K13 de tipo silvestre/PfPM2 con múltiples copias frente a K13 mutante/PfPM2 con única copia; p=0,07 (^r R|=2,6 [IC del 95 %: 1,3-5,5]), para K13 de tipo silvestre/PfPM2 con múltiples copias frente a K13 mutante/PfPM2 con múltiples copias; p<0,0001 (RRI=17,5 [IC del 95 %: 12,2-25,2]), para K13 mutante/PfPM2 con única copia frente a K13 mutante/PfPM2 con múltiples copias) detectado en aislados recogidos en el momento de la inclusión, antes del tratamiento. En el gráfico: K13 de tipo silvestre/PfPM2 con única copia :1‘ línea desde arriba, K13 de tipo silvestre/PfPM2 con múltiples copias :3‘ línea desde arriba, mutante de K13/PfPM2 con única copia :2‘ línea desde arriba, y K13 mutante/ PfPM2 con múltiples copias :4‘ línea desde arriba.

La Fig. 5 muestra un mapa de Camboya que muestra la ubicación de las zonas de estudio (provincias) donde se realizaron estudios de eficacia clínica de dihidroartemisinina-piperaquina (DHA-PPQ) (seguimiento de 42 días) en 2009-2015.

Las Fig. 6A a 6D muestran la determinación del número de copias de PfPM2y Pfmdr1, con un listado de cebadores, los protocolos y las eficacias de amplificación por PCR.

La Fig. 7 muestra el perfil de expresión de ARNm de PfPM2, con un listado de cebadores, los protocolos y las eficacias de amplificación por RT-qPCR.

La Fig. 8A muestra un gráfico Manhattan que muestra la significación de los polimorfismos de un solo nucleótido (los SNP) entre las secuencias de exomas de genoma completo de 23 líneas adaptadas a cultivo resistentes a la piperaquina y 8 sensibles a la piperaquina fenotipadas utilizando PSA in vitro. Cada punto representa un SNP en un conjunto de 31 parásitos adaptados a cultivo, de acuerdo al cromosoma. El eje de abscisas representa la ubicación genómica y el eje de ordenadas representa la transformación logarítmica decimal de los valores de p de la prueba exacta de Fischer. Después de la corrección de Bonferroni al nivel del 5 %, solo 2 SNP en 2 genes, PF3D7_0420000 (proteína con dedos de zinc, supuesto) (posición 896588) y su vecino PF3D7_0420100 (serina/treonina proteína cinasa RIO2) (posición 908385) lograron una significancia en todo el genoma entre las líneas resistentes y sensibles (p<3,5x10‘7 para ambos SNP, prueba exacta de Fisher) [> 6,38=log10 (120691/0,05)].

Las Fig. 8B.1 a 8B.6 y 8C.1 a 8C.2 muestran un listado de las posiciones con proporciones variables de nucleótidos de tipo silvestre y mutantes de las secuencias de PF3D7_0420000 (que codifica una supuesta proteína con dedos de zinc) (8B.1 a 8B.6) y PF3D7_0420100 (que codifica la serina/treonina proteína cinasa Rio2) (8C.1 a 8C.2) de 23 líneas adaptadas a cultivo resistentes a la piperaquina y 8 sensibles a la piperaquina fenotipadas utilizando PSA in vitro. Listado de las posiciones con proporciones variables de nucleótidos de tipo silvestre y mutantes de las secuencias PF3D7_0420000 (que codifica una supuesta proteína con dedos de zinc) y PF3D7_0420100 (que codifica la serina/treonina proteína cinasa Rio2) de 23 líneas adaptadas a cultivo resistentes a la piperaquina (líneas 6395, 6341, 6280, 6246, 6293, 6391, 6272, 6218, 6302, 6229, 6443, 6430, 6365, 6429, 6394, 6219, 6408, 6224, 6431, 6320, 6261, 6411, 6427) y 8 sensibles a la piperaquina (líneas 3D7, 6273, 6337, 6267, 6403, 6349, 6237, 6410, 6369) fenotipadas utilizando PSA in vitro (programa informático en línea de Multalin, http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). El SNP (posición 896588) en el gen PF3D7_0420000 (que codifica una supuesta proteína con dedos de zinc) (p<3,5x10‘7, prueba exacta de Fisher) y el SNP (posición 908385) en el gen PF3D7_0420100 (que codifica la serina/treonina proteína cinasa Rio2) (p<3,5x10‘7, Prueba exacta de Fisher), detectados como significativos entre las líneas de parásitos resistentes a la piperaquina y sensibles a la piperaquina, se muestran en negrita. Código de nucleótidos (nomenclatura IUPAC): A: Adenina, C: Citosina, G: Guanina, T: Timina, R: A o G, Y: C o T, S: G o C, W: A o T, K: G o T, M: A o C, B: C o G o T, D: A o G o T, H: A o C o T, V: A o C o G, N: cualquier base. Si se observa un indel (> 20 % de la cobertura media de todo el genoma), las letras se muestran en minúsculas.

Las Fig. 9A a 9E muestran perfiles de expansión de ADN en la región de genes que codifican proteínas implicadas en actividades de degradación de hemoglobina asociadas positivamente con resistencia a la piperaquina in vitro y la metodología desarrollada para confirmar los cuatro perfiles de expansión de ADN. (A) muestra cuatro tipos observados de expansión de ADN. (B) muestra la expansión de ADN tipo 1. (C) muestra la expansión de ADN tipo 2. (D) muestra la expansión de ADN tipo 3. (E) muestra la expansión de ADN tipo 4.

La Fig. 10 muestra la distribución de los valores de p de la prueba de Wilcoxon para datos independientes que clasifica la significación de las CNV de los 4.616 genes cribados entre las secuencias de exomas de genoma completo de 23 líneas adaptadas a cultivo resistentes a la piperaquina y 8 sensibles a la piperaquina fenotipadas utilizando PSA in vitro. Cada punto representa una CNV. El eje de abscisas representa los valores de la prueba de Wilcoxon para datos independientes y el eje de ordenadas representa los valores de p (prueba t de Student). PF3D7_1408000 (PfPM2) y PF3D7_1408100 (PfPM3) se clasificaron en la primera y segunda posición (p=5,4xl0-10 y p=1,4x10-10, respectivamente). PF3D7_0523000 (Pfmdrl) se clasificó en la posición 4676a/4678 (p=0,007).

La Fig. 11A muestra los niveles de transcrito de ARNm de PfPM2, en relación con el ARNm de la Pfserina-ARNt ligasa en los primeros estadios de anillo (H0: 0-3 h posinvasión), los estadios de anillo tardíos (H12: 12-15 h posinvasión), los estadios de trofozoíto tempranos (H24: 24-27 h posinvasión) y los trofozoítos maduros (H36: 36­ 39 h posinvasión) de la línea ID_6320 resistente a la piperaquina (tasa de supervivencia por PSA = 62,1 %, 2 copias de PfPM2, alelo C580Y de K13, línea gris continua) y línea ID_6267 sensible a piperaquina (tasa de supervivencia por PSA = 0,5 %, PfPM2 con única copia, alelo C580Y de K13, línea negra continua) adaptadas a cultivo in vitro (véase la tabla 2 para más detalles). El eje de abscisas representa distintos puntos de tiempo posinvasión, y el eje y representa la transformación logarítmica binaria de los valores 2'ññCt (véase la sección de métodos para más detalles). La línea continua horizontal corresponde al nivel de ARNm de PfPM2 de trofozoítos 3D7 (24 h posinvasión), utilizado como control. Las flechas negras indican diferencias significativas en el nivel de ARNm de PfPM2 (* p<0,05-0,011, ** p<0,01-0,0011 y *** p<0,001) entre las 2 cepas en cada momento.

La Fig. 11B muestra la expresión de PfPM2 en el estadio de trofozoíto de Plasmodium falciparum sincronizado de líneas de parásitos resistentes a la piperaquina (6408, tasa de supervivencia por PSA=58,7 %, PfPM2 con múltiples copias) y sensibles a la piperaquina (6267, tasa de supervivencia por PSA=0,5 %, PfPM2 con única copia) detectada por inmunotransferencia de western. La línea de parásitos resistentes a la piperaquina 6408 tiene niveles más altos de proteína PfPM2 que la línea sensible 6267. Los cultivos en estadio de trofozoíto sincronizados (24­ 30 horas posinvasión) se exploraron con anticuerpos anti-PfPM2 (obsequio de Daniel Goldberg) y anti-actina beta (NovusBio). La línea resistente tiene aproximadamente el doble de PfPM2 que la línea sensible.

La Fig. 12 muestra el aumento espacio-temporal de la frecuencia de parásitos con PfPM2 con múltiples copias en el oeste de Camboya (histograma gris) y el este de Camboya (histograma negro) entre 2002 y 2015. En el eje de las abscisas, los tamaños de las muestras se dan por zona y año.

La Fig. 13 muestra la correlación entre la proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias y las tasas de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ registradas en 12 zonas de Camboya entre 2009 y 2015. Los resultados de cada estudio clínico (zona y año) están representados por un punto de color. La posición del punto corresponde a la proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias (eje de abscisas) y la tasa de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ (eje de ordenadas). El código de gradiente de grises se refiere a la proporción de parásitos mutantes para K13 en cada zona por año.

Las Fig. 14A y 14B muestran las proporciones de aislados con acervos genéticos distintos (K13 de tipo silvestre/PfPM2 con única copia, mutante de K13/PfPM2 con única copia, mutante de K13/PfPM2 con múltiples copias y K13 de tipo silvestre/PfPM2 con múltiples copias). (A) Tendencias a lo largo del tiempo de las proporciones de aislados con distintos antecedentes genéticos (K13 de tipo silvestre/PfPM2 con única copia, mutante de K13/PfPM2 con única copia, mutante de K13/PfPM2 con múltiples copias y K13 de tipo silvestre/PfPM2 con múltiples copias) observadas en Camboya entre 2009 y 2015. (B) Escenario propuesto del procedimiento de selección escalonado para el surgimiento de parásitos resistentes a DHA-PPQ en Camboya. El grosor de la flecha es proporcional a la probabilidad del procedimiento de selección.

La Fig. 15A y 15 B muestran una hipótesis que apoya los mecanismos de resistencia de parásitos P. falciparum a la PPQ a través de la amplificación de los genes PfPM2 y PfPM3, y la desamplificación del gen Pfmdr1 en Camboya. (A) Parásito sensible a la PPQ. La PPQ se acumula en la vacuola digestiva de los alimentos a través de sus propiedades de base débil. El transportador PfMDR1 podría ayudar a concentrar PPQ en la vacuola digestiva, explicando la selección contra Pfmdr1 con múltiples copias. La PPQ inhibe la degradación de hemoglobina, lo que conduce a la interrupción de la producción de aminoácidos. Se provoca la muerte del parásito. (B) Parásito resistente a la PPQ. Se propone la amplificación de los genes PfPM2 y PfPM3 y una producción aumentada de las proteasas PfPM2 y PfPM3 para compensar la inhibición de la PPQ del catabolismo de la hemoglobina, restablecer los niveles normales de péptidos derivados de la globina utilizados para la producción de aminoácidos y estimular la supervivencia del parásito. PfCRT podría desempeñar un posible papel en la salida de PPQ de la vacuola digestiva en algunos parásitos resistentes a la PPQ. Hb: hemoglobina; 1: PfPM1; 2: PfPM2; 3: PfPM4; 4: Pffalcipaína; 5: PfPM3; 6: Pffalcilisina.

Descripción detallada

A. Introducción

En el este de Camboya, el epicentro de la resistencia a múltiples fármacos en Plasmodium falciparum, enfrenta actualmente altas tasas de fracasos en el tratamiento con dihidroartemisinina-piperaquina (DHA-PPQ), lo que indica una resistencia tanto a los derivados de artemisinina como a la piperaquina. Se necesitan herramientas genéticas para detectar estos parásitos resistentes a múltiples fármacos. La resistencia a la artemisinina se puede rastrear utilizando el marcador molecular K13, pero no existe ningún marcador para la resistencia a la piperaquina.

Utilizando muestras de sangre de pacientes camboyanos infectados por P. falciparum tratados con DHA-PPQ durante los años 2009-2015 se crearon perfiles de susceptibilidad in vitro y ex vivo para un subconjunto utilizando ensayos de supervivencia de piperaquina (PSA). Las secuencias de genoma completo se determinaron mediante secuenciación de lecturas emparejadas de Illumina, variaciones del número de copias por qPCR, niveles de ARN por qRT-PCR y niveles de proteína por inmunotransferencia.

Las secuencias de exón de genoma completo de 31 líneas de parásitos adaptadas a cultivo asociaron la amplificación del agrupamiento de plasmepsina2-3 (PfPM2, PF3D7_1408000 y PfPM3, PF3D7_1408100) con la resistencia a la piperaquina in vitro. Un número de copias aumentado del gen PfPM2 se correlacionó con los perfiles por PSA ex vivo de 134 aislados. En 725 muestras de sangre recogidas de pacientes antes del tratamiento con DHA-PPQ y seguidas durante 42 días, el PfPM2 con múltiples copias se asoció con una razón de riesgos instantáneos ajustada para los fracasos del tratamiento de 20,4 (IC del 95 %: 9,1-45,5, p<0,0010). PfPM2 con múltiples copias predijo fracasos con DHA-PPQ con una sensibilidad de 0,94 (IC del 95 %: 0,88-0,98) y una especificidad de 0,77 (IC del 95 %: 0,74-0,81). La proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias aumentó constantemente desde 2009 hasta 2015 en el oeste de Camboya y en 2014-2015 para el este de Camboya, correlacionándose con el aumento de las tasas de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ en ambas zonas. La eficacia de DHA-PPQ en el día 42 cayó por debajo del 90 % cuando la proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias superó el 22 %.

Los datos indican que la resistencia a la piperaquina en Camboya está asociada con la amplificación de PfPM2-3, que codifica proteasas de aspártico que digieren hemoglobina. PfPM2 con múltiples copias constituye un marcador molecular indirecto para rastrear la resistencia a la piperaquina. Usado solo o en combinación con K13 y Pfmdr1, PfPM2 proporciona información fundamental para las políticas de tratamiento antipalúdico y las medidas de contención.

Basada en parte en estos datos, la presente invención proporcionó métodos y reactivos para detectar y tratar el paludismo por Plasmodium falciparum resistente a la piperaquina.

B. Métodos para genotipar un plasmodio y/o para detectar una infección por plasmodio

La invención abarca métodos para genotipificar un plasmodio y/o detectar una infección por plasmodio, particularmente por Plasmodium falciparum. En una realización preferida, el método comprende proporcionar una muestra que contiene un plasmodio y detectar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra. La presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 se detecta mediante técnicas rutinarias en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse las técnicas descritas en los ejemplos o en otras partes en el presente documento.

Un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 puede detectarse mediante numerosas técnicas conocidas en la técnica, tales como ensayos de secuenciación, hibridación o amplificación. Los datos en los ejemplos indican que un aumento en el número de copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 da como resultado un aumento del nivel del ARNm de PfPM2. Por lo tanto, puede utilizarse un ensayo que mida el nivel de ARNm de PfPM2 para detectar la presencia o ausencia de un aumento del número de copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. Los datos en los ejemplos indican que un aumento en el número de copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 da como resultado un aumento del nivel de proteína de PfPM2. Por lo tanto, puede utilizarse un ensayo que mida el nivel de proteína de PfPM2 para detectar la presencia o ausencia de un aumento del número de copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. Un experto en la materia apreciará que estos ejemplos no son limitantes.

Dentro del contexto de la presente invención, un "aumento del número de copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3" significa más de una copia del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en cada genoma haploide de un plasmodio. En algunas realizaciones están presentes un total de dos copias. En algunas realizaciones están presentes un total de tres copias. En algunas realizaciones están presentes un total de cuatro copias. En algunas realizaciones están presentes un total de dos a cuatro copias. En algunas realizaciones están presentes más de cuatro copias.

Dentro del contexto de la presente invención, "el agolpamiento genómico de plasmepsina2-3" significa un fragmento de ADN genómico de plasmodio que incluye al menos las secuencias codificantes de PfPM2 y PfPM3 y el ADN genómico intercalado. En algunas realizaciones, el agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 comprende la plasmepsina-4 (PfPM4), la plasmepsina-1 (PfPMI), PfPM2, PfPM3, y secuencias codificantes del factor de transcripción con dominio (o dominios) AP2 (AP2-G2) y el ADN genómico intercalado. En algunas realizaciones, el agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 se selecciona de expansión de ADN tipo 1, expansión de ADN tipo 2, expansión de ADN tipo 3 y expansión de ADN tipo 4, como se muestra en la Figura 9A. En algunas realizaciones, el agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 tiene un tamaño de no más de 10 kb o no más de 5 kb.

En algunas realizaciones, la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante secuenciación. En algunas realizaciones, la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante PCR. En una realización preferida, la PCR es una PCR cuantitativa (qPCR).

En algunas realizaciones, el método comprende determinar el número de copias de al menos uno del gen Pfplasmepsina2 (PF3D7_1408000) (PfPM2) y el gen Pfplasmepsina3 (PF3D7_1408l00) (PfPM3). Como se muestra en los ejemplos, el número de copias del gen PfPM2 puede servir como representante del número de copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3. Los datos en los ejemplos también indican que el número de copias del gen PfPM3 puede servir como representante del número de copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3.

En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de al menos un ARNm seleccionado de un ARNm de PfPM2 y un ARNm de PfPM3. En algunas realizaciones, el método comprende determinar el nivel de al menos una proteína seleccionada de una proteína de PfPM2 y una proteína de PfPM3.

Dentro del contexto de la presente invención, un "ácido nucleico de propulsora K-13 de P. falciparum mutante" significa una secuencia de ácido nucleico que tiene una o más diferencias con la secuencia de tipo silvestre del ácido nucleico de propulsora K-13 de P. falciparum que da como resultado una diferencia de al menos un aminoácido con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína codificada. Dentro del contexto de la presente invención, una "proteína propulsora K-13 de P. falciparum mutante" significa una secuencia de aminoácidos que tiene una o más diferencias con la proteína de propulsora K-13 de P. falciparum de tipo silvestre.

En diversas realizaciones, el método comprende detectar la presencia o ausencia de una proteína propulsora K-13 de tipo silvestre o mutada en la muestra de células. Esto puede realizarse mediante el uso de anticuerpos específicos que discriminan entre las proteínas propulsoras K-13 de tipo silvestre y las mutantes. Estos anticuerpos pueden ponerse en contacto con muestras de pacientes y se puede determinar la presencia o ausencia de proteínas propulsora K-13 de tipo silvestre o mutada detectando la presencia o ausencia de una reacción inmunológica. Preferentemente, el método comprende un ensayo ELISA.

En una realización preferida, el método comprende proporcionar una muestra que contiene un plasmodio y detectar la presencia de una proteína o ácido nucleico de propulsora K-13 mutado en la muestra. Preferentemente, la presencia de un ácido nucleico de propulsora K-13 mutado en la muestra se detecta por secuenciación o por PCR. Por ejemplo, la presencia de un ácido nucleico de propulsora K13 mutado en una muestra se detecta de acuerdo con cualquiera de los métodos divulgados en el documento WO 2015/071759 A1.

En una realización particular el método comprende detectar el número de copias (en particular detectar 2 copias) del gen PfPM2 divulgado en el presente documento, y detectar un alelo C580Y de K13.

Preferentemente, el plasmodio se selecciona de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale curtisi, Plasmodium ovale wallikeri, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Plasmodium brasilianum, Plasmodium cynomolgi, Plasmodium cynomolgi bastianellii, Plasmodium inui, Plasmodium rhodiani, Plasmodium schweitzi, Plasmodium semiovale, Plasmodium simium, Plasmodium berghei, Plasmodium yoelii y Plasmodium chabaudi.

La divulgación abarca métodos para la detección de una infección por un plasmodio y el diagnóstico de la infección en un paciente que se sospecha que está infectado. Los pacientes pueden diagnosticarse proporcionando una muestra de células de un paciente. En una realización preferida, el método comprende proporcionar una muestra de células de un paciente y detectar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra.

La muestra de células puede ser cualquier muestra de células obtenida de un paciente que contenga plasmodio. Preferentemente, la muestra de células se genera extrayendo sangre. La muestra de células es, preferentemente, una muestra de sangre. La muestra de sangre se puede procesar adicionalmente para cultivar el plasmodio en la muestra in vitro. Por ejemplo, se pueden utilizar las técnicas descritas en van Schalkwyk et al. Malaria Journal 2013, 12:320.

En una realización, el método comprende proporcionar una muestra de sangre del paciente; opcionalmente, cultivar el plasmodio de la muestra in vitro, y detectar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra.

En una realización, el método comprende proporcionar una muestra de sangre de un paciente y detectar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del ácido nucleico o proteína de plasmepsina2-3 en la muestra.

Preferentemente, se utiliza PCR (y más preferentemente qPCR), hibridación de ácidos nucleicos o secuenciación de ácidos nucleicos para detectar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en una muestra de células. Puede emplearse cualquier método de secuenciación conocido en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término "secuenciación" se utiliza en un sentido amplio y se refiere a cualquier técnica conocida por el experto en la materia, incluida, pero sin limitación, secuenciación por terminación de didesoxi de Sanger, secuenciación de genoma completo, secuenciación por hibridación, pirosecuenciación, electroforesis capilar, secuenciación por ciclos, secuenciación por extensión de base única, secuenciación en fase sólida, secuenciación de alto rendimiento, secuenciación masiva paralela de firmas (MPSS, forma siglada de massively parallel signature sequencing), secuenciación por terminador de colorante reversible, secuenciación de extremos emparejados, secuenciación a corto plazo, secuenciación por exonucleasa, secuenciación por ligamiento, secuenciación de lectura corta, secuencia de molécula única, secuenciación por síntesis, secuenciación en tiempo real, secuenciación de terminador inverso, secuenciación de nanoporos, secuenciación de 454, secuenciación por analizador de genoma de Solexa, secuenciación por SOLiD(R), secuenciación MS-PET (forma siglada de multiplex sequencing of paired-end tags, secuenciación múltiple de etiquetas de extremos emparejados, espectrometría de masas, y una combinación de los mismos. En realizaciones específicas, el método de la invención está adaptado para ejecutarse en el secuenciador ABI PRISM(R) 377 DNA Sequencer, un analizador ABI PRISM(R) 310, 3100, 3100-Avant, 3730 o 3730x1 Genetic Analyzer, un analizador ABI PRISM(R) 3700 DNA Analyzer o un sistema Applied Biosystems SOLiD(TM) System (todos de Applied Biosystems), un sistema Genome Sequencer 20 System (Roche Applied Science). Puede emplearse cualquier método de hibridación de ácidos nucleicos conocido en la técnica, véase, por ejemplo, Kim, Ji Hun; Kalitsis, Paul; Pertile, Mark D; Magliano, Dianna; Wong, Lee; Choo, Andy; y Hudson, Damien F (agosto de 2012) Nucleic Acids: Hybridisation. En: eLS. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.DOI: 10.1002/9780470015902.a0003148.pub2). En una realización preferida, se utiliza para la hibridación al menos una de las siguientes sondas de hibridación: 5'-caattcaacatttgatggattaaacattga-3' (SEQ ID NO:20) para PfPM2; 5'-tgaagaatcctttaacacgtttcgagtaac-3' (SEQ ID NO:21) para PfPM3. |

En una realización, el método comprende detectar un producto de ácido nucleico amplificado. El ácido nucleico de partida que se amplifica puede ser ADN y/o ARN. Se puede utilizar cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Por ejemplo, el método de amplificación puede ser RCA, MDA, NASBA, TMA, SDA, LCR, ADN b, PCR (todas las formas, incluida la RT-PCR), ^rA ^m , LAMP, ICAN, SPIA, replicasa QB o Invader. Un método de amplificación preferido es la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véanse, por ejemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Iinis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res.

19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (Eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); y las patentes de Estados Unidos N.° 4.683.202, 4.683.195, 4.800.1594.965.188 y 5.333.675. Los métodos de PCR preferido es PCR en tiempo real, PCR-HRM (forma siglada de High-Resolution DNA Melting, fusión de ADN de alta resolución) (véase Andriantsoanirina et al. Journal of Microbiological Methods, 78 : 165 (2009)) y PCR acoplada a reacción de detección de ligasa basada en microesferas fluorescentes (microesferas Luminex®). Este último método permite realizar un ensayo múltiple para detectar varios locus al mismo tiempo.

Otros métodos de amplificación preferidos son la reacción en cadena de la ligasa (LCR), por ejemplo, Wu y Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al., Science 241, 1077 (1988) y Barringer et al. Gene 89:117 (1990)), la amplificación por transcripción (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 86, 1173 (1989) y el documento WO88/10315), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990) y el documento WO90/06995), amplificación selectiva de secuencias de polinucleótidos diana (patente de EE.UU. n.° 6.410.276) y amplificación de secuencia basada en ácidos nucleicos (NABSA) (patentes de EE. UU. n.° 5.130.238, 5.409.818, 5.554.517 y 6.063.603). Otros métodos de amplificación que pueden utilizarse se describen en las patentes de EE.UU. N.° 5.242.794, 5.494.810, 4.988.617 y 6.582.938.

En una realización preferida, se utiliza al menos uno de los siguientes cebadores para la amplificación: 5'-TGGTGATGCAGAAGTTGGAG-3' (SEQ ID NO:1); 5-TGGGACCCATAAATTAGCAGA-3' (SEQ ID NO:2); 5'-GGATTCGAACCAACTTATACTGC-3' (SEQ ID NO:3); y 5'-AATTGGATCTACTGAACCTATTGATAA-3' (SEQ ID NO:4)

En una realización, el ARN se extrae y se transcribe de forma inversa en ADNc. A continuación, se realiza la amplificación o secuenciación del ADNc. Por otra parte, puede realizarse hibridación de northern directamente sobre el Ar N extraído.

Por tanto, el método puede comprender aislar ARN de una muestra de un paciente, transcripción inversa del ARN en ADNc, amplificar o secuenciar el ADNc, o hibridación por Northern del ARN, y determinar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra.

En diversas realizaciones, el método comprende detectar la presencia o ausencia de una cantidad aumentada de una proteína codificada por el agrupamiento de plasmepsina2-3 en la muestra. Como se muestra en los ejemplos, este enfoque puede usarse para detectar un aumento en el número de copias del grupo de plasmepsina2-3. Esto se puede realizar utilizando anticuerpos específicos que detectan las proteínas PfPM2 y/o PfPM3. Estos anticuerpos pueden ponerse en contacto con muestras de pacientes y se puede determinar la presencia o ausencia de una cantidad aumentada de proteínas PfPM2 y/o PfPM3 detectando la presencia o ausencia de una reacción inmunológica. Preferentemente, el método comprende un ensayo ELISA.

Los anticuerpos pueden ser sintéticos, monoclonal o policlonal y puede prepararse mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Dichos anticuerpos se unen específicamente a través de los sitios de unión a antígeno del anticuerpo (a diferencia de la unión no específica). Los polipéptidos, fragmentos, variantes y proteínas de fusión de PfPM2 y/o PfPM3, etc., pueden emplearse como inmunógenos en la producción de anticuerpos inmunorreactivos con los mismos. Más específicamente, los polipéptidos, el fragmento, variantes, proteínas de fusión, etc. contienen determinantes antigénicos o epítopos que suscitan la formación de anticuerpos.

Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos por una única sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos por secciones de aminoácidos de distintas regiones de la cadena polipeptídica que se acercan mucho al plegarse la proteína (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2a ed. 1996)). Debido a que las proteínas plegadas tienen superficies complejas, el número de epítopos disponibles es bastante numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína y los impedimentos estéricos, el número de anticuerpos que realmente se unen a los epítopos es menor que el número de epítopos disponibles (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2a ed. 1996)). Los epítopos pueden identificarse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales pueden prepararse mediante técnicas convencionales.

Los péptidos de PfPM2 y/o PfPM3 basados en la secuencia de aminoácidos de las proteínas y PfPM2 y/o PfPM3 de tipo silvestre pueden utilizarse para preparar anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas PfPM2 y/o PfPM3. El término "anticuerpos" pretende incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos, tales como fragmentos F(ab')2 y Fab, fragmentos variables monocatenarios (los scFv), fragmentos de anticuerpos de un solo dominio (los VHH o Nanocuerpos), fragmentos de anticuerpos bivalentes (diacuerpos), así como cualquier compañero de unión producido de forma recombinante y sintética.

Se define que los anticuerpos se unen específicamente si se unen a su proteína diana con una Ka mayor o igual a aproximadamente 107 Mol. Las afinidades de los compañeros de unión o los anticuerpos pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949).

Los anticuerpos policlonales pueden generarse fácilmente a partir de una diversidad de fuentes, por ejemplo, caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones o ratas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. En general, las proteínas PfPM2 y/o PfPM3 purificadas o un péptido basado en la secuencia de aminoácidos de las proteínas PfPM2 y/o PfPM3 conjugados apropiadamente se administran al animal hospedador normalmente mediante inyección parenteral. La inmunogenicidad de las proteínas PfPM2 y/o PfPM3 se puede potenciar mediante el uso de un adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund. Después de las inmunizaciones de refuerzo, se recogen pequeñas muestras de suero y se analizan en cuanto a su reactividad frente a las proteínas PfPM2 y/o PfPM3. Los ejemplos de diversos ensayos útiles para tal determinación incluyen los descritos en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; así como los procedimientos, tales como la inmunoelectroforesis a contracorriente (IEC), radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos de transferencia por puntos y ensayos de tipo sándwich. Véanse las patentes de Estados Unidos n.° 4.376.110 y 4.486.530.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse fácilmente utilizando procedimientos bien conocidos. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. N.° 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam and Bechtol (eds.), 1980.

Por ejemplo, los animales hospedadores, tales como ratones, pueden inyectarse por vía intraperitoneal al menos una vez y preferiblemente al menos dos veces a intervalos de aproximadamente 3 semanas con proteínas PfPM2 y/o PfPM3 aisladas y purificadas o péptidos de PfPM2 y/o PfPM3 conjugados, opcionalmente en presencia de adyuvante. A continuación, los sueros de ratón se someten a ensayo mediante la técnica de transferencia por puntos convencional o captura de anticuerpos (CAB) para determinar qué animal es el mejor para fusionar. Aproximadamente dos o tres semanas más tarde, los ratones reciben un refuerzo intravenoso de proteína o péptido. Más tarde los ratones se sacrifican y las células del bazo se fusionan con células de mieloma disponibles en el mercado, tales como Ag8.653 (ATCC), siguiendo los protocolos establecidos. Brevemente, las células de mieloma se lavan varias veces en medio y se fusionan con células de bazo de ratón en una relación de aproximadamente tres células de bazo por una célula de mieloma. El agente de fusión puede ser cualquier agente adecuado utilizado en la técnica, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). La fusión se siembra en placas que contienen medio que permiten el crecimiento selectivo de las células fusionadas. A continuación, se puede permitir el cultivo de las células fusionadas durante aproximadamente ocho días. Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes se recogen y se añaden a una placa que se recubre primero con anti-Ig de ratón de cabra. Después de lavar, se añade un marcador a cada pocillo, tal como un polipéptido PfPM2 y/o PfPM3 marcado, seguido de incubación. Los pocillos positivos pueden detectarse posteriormente. Los clones positivos se pueden cultivar en cultivo en masa y los sobrenadantes se purifican posteriormente en una columna de Proteína A (Pharmacia).

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas alternativas, tales como las descritas en Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990). De forma similar, los compañeros de unión pueden construirse utilizando técnicas de ADN recombinante para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo de unión específico. Dicha técnica se describe en Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989).

Los fragmentos de unión a antígeno de tales anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales, también pueden utilizarse para detectar las proteínas PfPM2 y/o PfPM3. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab y F(ab')2. También se proporcionan fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por técnicas de ingeniería genética.

Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Dichos anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o solo el sitio de unión al antígeno del mismo) y una región constante obtenida de un anticuerpo humano. De manera alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) obtenido de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y genomanipulado adicionalmente incluyen los descritos en Riechmann et al. (Naturaleza 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989) y Winter and Harris (TIPS 14:139, mayo de 1993). Los procedimientos para generar anticuerpos de forma transgénica pueden encontrarse en el documento GB 2.272.440, en las patentes de EE.UU. N.° 5.569.825 y 5.545.806.

Pueden utilizarse anticuerpos producidos por métodos de ingeniería genética, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, que pueden fabricarse utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse por ingeniería genética utilizando técnicas convencionales de ADN conocidas en la técnica, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en Robinson et al., publicación internacional N.° WO 87/02671; Akira, et al. Solicitud de patente europea 0184187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 0171496; Morrison et al. Solicitud de patente europea 0173494; Neuberger et al. Publicación internacional PCT N.° WO 86/01533; Cabilly et al., Patente de EE.UU N.° 4.816.567; Cabilly et al., Solicitud de patente europea 0125023; Better et al., Science 240:1041 1043, 1988; Liu et al., PNAS 84:3439 3443, 1987; Liu et al., J. Immunol. 139:3521 3526, 1987; Sun et al. PNAS 84:214 218, 1987; Nishimura et al., Canc. Res. 47:999 1005, 1987; Wood et al., Nature 314:446 449, 1985; y Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553 1559, 1988); Morrison, S. L., Science 229:1202 1207, 1985; Oi et al., BioTechniques 4:214, 1986; Winter, patente de EE.UU. N.° 5.225.539; Jones et al., Nature 321:552 525, 1986; Verhoeyan et al., Science 239:1534, 1988; y Beidler et al., J. Immunol. 141:40534060, 1988.

En relación con los anticuerpos sintéticos y semisintéticos, tales términos pretenden cubrir, pero sin limitación, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos con isotipo cambiado, anticuerpos humanizados (por ejemplo, ratón-ser humano, ser humano-ratón), híbridos, anticuerpos que tienen especificidades plurales y moléculas similares a anticuerpos completamente sintéticas.

En una realización preferida, el método comprende detectar una infección por plasmodio. El método puede comprender además determinar si el plasmodio tiene un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 utilizando cualquier método de la presente divulgación.

Métodos de tratamiento de una infección por plasmodio

La divulgación abarca métodos para tratar una infección por plasmodio. En una realización que no forma parte de la invención, el método comprende determinar si un paciente está infectado por un plasmodio que contiene un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 y ajustar el tratamiento antiparasitario basándose en si el paciente está infectado por un plasmodio que contiene un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3.

En una realización preferida que no forma parte de la invención, si el paciente está infectado por un plasmodio que no tiene un número de copias aumentado del agolpamiento genómico de plasmepsina2-3, el paciente se trata con piperaquina. En una realización más preferida, el paciente se trata con artemisinina o derivados de artemisinina y con piperaquina.

En una realización preferida que no forma parte de la invención, si el paciente está infectado por un plasmodio que tiene un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3, el paciente trata con un tratamiento antiparasitario sin piperaquina.

Por consiguiente, la invención también se refiere al uso de piperaquina para el tratamiento de pacientes que se han sometidos previamente a un método de evaluación in vitro de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 y en donde dicha evaluación no ha revelado tal aumento. La piperaquina puede utilizarse en asociación con artemisinina o derivados de artemisinina.

La divulgación también se refiere al uso de un tratamiento antiparasitario (especialmente antipalúdico) sin piperaquina para el tratamiento de pacientes que se han sometidos previamente a un método de evaluación in vitro de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 y en donde dicha evaluación ha revelado tal aumento.

Kits para el genotipado y/o la detección y/o el tratamiento de una infección por plasmodio

También se divulgan kits para detectar una infección por plasmodio, pero no forman parte de la invención, En algunas realizaciones, los kits comprenden cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de agrupamiento de plasmepsina2-3 y reactivos para la detección del producto amplificado. En algunas realizaciones, el kit comprende una sonda para detectar un ácido nucleico del agrupamiento de plasmepsina2-3. En algunas realizaciones, la sonda está marcada con un marcador fluorescente, radiactivo o enzimático. En algunas realizaciones el kit detecta un ácido nucleico de PfPM2. En algunas realizaciones el kit detecta un ácido nucleico de PfPM3. En algunas realizaciones, el kit comprende al menos uno de los siguientes cebadores: 5'-TGGTGATGCAGAAGTTGGAG-3' (SEQ ID NO:1); 5'-TGGGACCCATAAATTAGCAGA-3' (SEQ ID NO:2); 5'-GGATTCGAACCAACTTATACTGC-3' (SEQ ID NO:3); y 5'-AATTGGATCTACTGAACCTATTGATAA-3' (SEQ ⁱD NO:4). En algunas realizaciones, el kit comprende al menos una sonda que comprende la secuencia 5'-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATGGA-3' (SEQ ID NO:5). En algunas realizaciones, el kit comprende la siguiente sonda: 5'-FAM-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATGGA-BHQ1-3' (SEQ ID NO:6). En algunas realizaciones, el kit comprende además cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de propulsora K-13 y reactivos para la detección del producto amplificado. En algunas realizaciones, el kit comprende además cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de Pfmdrl y reactivos para la detección del producto amplificado.

Preferentemente, el kit comprende una sonda para detectar un ácido nucleico del agrupamiento de plasmepsina2-3. Preferentemente, la sonda está marcada con un marcador fluorescente o enzimático. En una realización preferida, la sonda se marca con una combinación de marcadores FAM y BAQ1.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos

A. Zonas de estudio y pacientes

Se incluyeron pacientes con paludismo por P. falciparum en estudios clínicos realizados en centros de salud ubicados en Camboya durante los años 2009-2015 (Fig. 5). Después de obtener el consentimiento informado por escrito, los pacientes se trataron con DHA-PPQ (Duo-Cotecxin®, dihidroartemisinina 40 mg y piperaquina 320 mg, Zhejiang Holley Nanhu Pharamaceutical Co. Ltd, China) y se siguieron durante 42 días como se describió anteriormente.7810 El criterio de valoración para evaluar la eficacia de DHA-PPQ fue la proporción de infecciones por P. falciparum recrudescentes corregidas por PCR en el día 42.11 Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Ético del Health Research of the Cambodian Ministry of Health. Los ensayos clínicos se registraron en el Registro de ensayos clínicos de Australia y Nueva Zelanda (ACTRN 12615000793516, 12612000184875, 12612000183886, 12612000181808 y 12614000344695).

B. Recogida de muestras

Las muestras de sangre se recogieron en tubos con ácido-citrato-dextrosa (Becton-Dickinson, EE.UU.) antes del tratamiento y se enviaron al Instituto Pasteur en Camboya en un plazo de 24 horas. Se utilizó un subconjunto de muestras recién recogidas para realizar el PSA ex vivo7 Todas las muestras se crioconservaron en glicerolito. Los sedimentos de glóbulos rojos se almacenaron a -20 °C para estudios moleculares. Se prepararon gotas de sangre en el día 0 y, cuando correspondía, el día de la recrudescencia.

C. Investigaciones de laboratorio

Los parásitos crioconservados se adaptaron al cultivo como se describe.12 La susceptibilidad a la PPQ se investigó utilizando el PSA in vitro para parásitos adaptados a cultivo y el PSA ex vivo para aislados recientes. Las tasas de supervivencia se evaluaron microscópicamente y los parásitos con una tasa de supervivencia >10 % se consideraron resistentes a la PPQ.7 Se determinaron los polimorfismos de mspl, msp2 y glurp para distinguir las infecciones recrudescentes de las nuevas.13 Se utilizó secuenciación del dominio propulsor de K13 para el cribado en cuanto a la resistencia a la ART.1 Se realizó secuenciación de genoma completo utilizando secuenciación de lecturas emparejadas de Illumina.1 Los datos se integraron en la base de datos Whole-genome Data Manager (WDM)14 y se compararon los exomas de las líneas resistentes y sensibles a la PPQ después de excluir las posiciones de baja cobertura (es decir, menos del 25 % de la cobertura media de todo el genoma). Los genes de familias multigénicas altamente variables (var, rifin, phist y stevor) se excluyeron.1 Los CNV y los SNP se investigaron utilizando el programa informático PlasmoCNVScan y Phen2gen (véase más abajo).14 El número de copias de PfPM2 y Pfmdr1 se determinó mediante qPCR (véase más abajo). Los niveles de ARNm de PfPM2 en el equilibrio se midieron mediante RT-qPCR (véase a continuación) y la expresión de la proteína PfPM2 mediante inmunotransferencia (véase a continuación).

D. Ensayos de supervivencia de piperaquina (PSA)

La susceptibilidad in vitro a PPQ se investigó utilizando el PSA in vitro o ex vivo, que se basa en la exposición de parásitos en estadio anular muy temprano a PPQ 200 nM durante 48 horas, el lavado del fármaco y la evaluación del crecimiento del parásito después de otras 24 horas de cultivo. Las tasas de supervivencia en el punto de tiempo de 72 horas se evaluaron microscópicamente contando la proporción de parásitos viables en cultivos expuestos y no expuestos que se desarrollaron en anillos de segunda generación o trofozoítos con morfología normal. Los parásitos con una tasa de supervivencia >10 % se consideraron resistentes a la PPQ.5

E. Extracción de ADN, de ARN y de proteínas.

El ADN del parásito se extrajo a partir de gotas de sangre con matriz Instagen (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Francia), y a partir de sangre entera o de parásitos cultivados con QlAamp DNA Blood MiniKit (Qiagen, Valencia, CA). El ARN total se aisló a partir de parásitos cultivados utilizando un protocolo basado en reactivo Trizol (Life Technologies, Courtaboeuf, Francia) y purificó con el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Las muestras se trataron con ADNasa (Life Technologies) para eliminar cualquier ADN genómico contaminante. Las proteínas se extrajeron a partir de parásitos cultivados que se habían lisado con saponina al 0,15 % en PBS. El sedimento de parásitos se lavó cuatro veces con PBS, se resuspendió a 400.000 parásitos por pl de PBS con cóctel inhibidor de proteasas 1 x (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y se liso con un BioRuptor Twin (10 ciclos de 10 segundos cada uno, baja intensidad).

F. Secuenciación de genoma completo

Los análisis de imágenes, la identificación de bases y la estimación de errores utilizaron Illumina Analysis Pipeline versión 1.7. Los archivos de secuencia sin procesar se filtraron utilizando la herramienta Fqquality. Las lecturas recortadas de los archivos Fastq controlados se mapearon en el genoma de 3D7 de P. falciparum de referencia con el alineamiento de Burrows-Wheeler (BWA), lo que generó archivos BAM (archivos binarios de formato SAM delimitado por tabuladores). Se utilizó Samtools para preparar los archivos compilados, que se formatearon utilizando un programa informático interno para integrar los datos en la base de datos Whole-genome Data Manager (WDM).15 Se compararon los exomas de líneas adaptadas a cultivo sensibles y resistentes a PPQ después de excluir las posiciones con una cobertura inferior al 25 % de la media de todo el genoma. Los SNP se exploraron después de excluir genes de familias multigénicas altamente variables (var, rifin, phist y stevor), como se describe.1

Las variaciones del número de copias (CNV) y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) (después de excluir los indeles) se investigaron utilizando los programas informáticos PlasmoCNVScan y Phen2gen, respectivamente. 15

PlasmoCNVScan, un programa informático de C/C++, se utilizó para normalizar la profundidad de lectura a lo largo del genoma y eludir el riesgo de un procedimiento de secuenciación no uniforme (es decir, se presupone que el número de lecturas asignadas a una región sigue una distribución de Poisson y es proporcional al número de copias) y la necesidad de mapear lecturas con un genoma de referencia bien anotado. El concepto subyacente de los métodos basados en la profundidad de lecturas es que la profundidad de cobertura en una región genómica se correlaciona con el número de copias de la región. Primero, los inventores calcularon la frecuencia promedio para cada motivo encontrado en todo el exoma: esta es la cobertura teórica de un motivo. Los inventores definieron la cobertura observada como la cobertura local de un motivo para cada posición (extraído del archivo compilado). A continuación, para cada gen (excepto genes con secuencias de nucleótidos de menos de 500 pb que fueron excluidos), los inventores utilizaron una ventana deslizante y calcularon la relación entre la cobertura observada y la cobertura teórica para cada gen/posición. Esta relación proporcionó la variación estimada del número de copias para esta región. Los inventores CNV consideraron la CNV como una variable continua y utilizaron la prueba t de Student para comparar la CNV en genes de líneas de parásitos resistentes y sensibles a la PPQ. Las CNV también se clasificaron de acuerdo con sus valores Wilcoxon para datos independientes para detectar acontecimientos de amplificación o desamplificación. Para cada análisis, se utilizó un umbral de Bonferroni (0,05/número de genes analizados) para evaluar la significación de todo el genoma.

Phen2gen es un programa desarrollado con los programas informáticos Perl y R. Los inventores realizaron un análisis de SNP y utilizaron la prueba exacta de Fisher para identificar diferencias significativas de los SNP entre líneas de parásitos resistentes y sensibles a la PPQ. Se utilizó un umbral de Bonferroni (0,05/número de SNP analizados) para evaluar la significación de todo el genoma.

G. Inmunotransferencia.

Se mezclaron lisados de parásitos (cultivos sincronizados en el estadio de trofozoíto; 24-30 horas posinvasión) con tampón de Laemmli completo y se hirvieron durante 10 minutos a 95C. Las muestras se corrieron en un gel prefabricado de Tris-Gli-SDS al 10 % (BioRad) a 120 V durante 2 h con un marcador de proteínas Precision Kaleidoscope (Biorad). El contenido del gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (315 mA 90 minutos). Las membranas se bloquearon con leche desnatada en polvo al 2 % y BSA al 1 % en TBS durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se exploraron con anticuerpo diluido en el tampón de bloqueo a 4 °C durante una noche. Las diluciones utilizadas fueron 1:2000 para anti-Plasmepsina2 (obsequio de Dan Goldberg) y 1:5000 para anti-actina beta (NovusBio). Las membranas se lavaron en TBST, a continuación, se exploraron con el anticuerpo secundario apropiado 1:10.000 en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron con TBS, a continuación, se trataron con ECL (Pierce) y se expusieron a una película.

H. Determinación del número de copias de PfPM2 y Pfmdrl

El número de copias de PfPM2 (PF3D7_1408000) y Pfmdrl (PF3D7_0523000) se midió mediante qPCR utilizando una máquina de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Como referencia, los inventores utilizaron el gen tubulina p de única copia (PF3D7_1008700). El listado de los cebadores, los protocolos y las eficacias de amplificación de la PCR se proporcionan a continuación en la tabla.

Tamaño del qPCR ^{Secuencia de}

_Cebador Secuencias Tf (°C) producto (pb) PfPM2 CN F 5'-TGGTGATGCAGAAGTTGGAG-3' (SEQ ID NO:1) 59,8 ₇₉ ^{PfPM2 CN R - 5'-TGGGACCCATAAATTAGCAGA-3' (SEQ ID NO:2) 59,4 PfPM2} Pf p-tubulin CN F 5'-TGATGTGCGCAAGTGATCC-3' (SEQ ID NO:7) 61,9

_{Pf p-tubulina CN R 5'-TCCTTTGTGGACATTCTTCCTC-3' (SEQ ID NO:8) 60,5 79} Pfmdr1 CN F 5'-TGCATCTATAAAACGATCAGACAAA-3' (SEQ ID NO:9) 6,0 ₈₇ ^{Pfmdr1 CN R 5'-TCGTGTGTTCCATGTGACTGT-3' (SEQ ID NO:10) 60,0 Pfmdrl} Pf p-tubulin CN F 5'-TGATGTGCGCAAGTGATCC-3' (SEQ ID NO:11) 61,9

_{Pf p-tubulina CN R 5'-TCCTTTGTGGACATTCTTCCTC-3' (SEQ ID NO:12) 60,5 79}

Número de copias de PfPM2

La PCR cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo en volúmenes de 20 pl en una placa de 96 pocillos que contenía HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix ROX 5X (Solis BioDyne, Estonia), 0,25 pM de cada cebador directo e inverso y 4 pl de ADN molde. Las concentraciones de MgCh finales fueron 2,5 mM y 4 mM para PfPM2 y Pfp-tubulina, respectivamente. Las amplificaciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones: 95 °C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 15 s, 58 °C durante 20 s y 72 °C durante 20 s.

El número de copias de PfPM2 de cada muestra se midió por triplicado en relación con una curva patrón utilizando cinco patrones de fragmentos génicos sintéticos mezclados (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania). Las longitudes de los fragmentos sintéticos para PfPM2 y Pfp-tubulina, incluidas las ubicaciones de los genes, son para PfPM2 (PF3D7_1408000, de la posición 367 a 560, 193 pb): 367-aggtagttcaaatgataatatcgaattagtagatttccaaaatataatgttttatggtgatgcagaagttggagataaccaacaaccatttacatttattcttgatacaggat ctgctaatttatgggtcccaagtgttaaatgtacaactgcaggatgtttaacta aacatctatatgattcatctaaatc-560 (SEQ ID NO:13); y para Pfptubulina (PF3D7_1008700): de las posiciones 1183 a 1391 (208 pb): 1183-tcaacaatacagagccttaactgtgccggagttaacacaacaaatgttcgacgcaaaaaatatgatgtgcgcaagtgatccaagacatggaagatatttaacggcat gtgctatgtttagaggaagaatgtccacaaaggaagttgacgaacaaatgttaaacgttcaaaata aaaactcatcttattttgtcgaatggattcctcac-1391 (SEQ ID NO:14) (mostrado en negrita, la porción amplificada por qPCR).

Los cinco patrones de fragmentos génicos sintéticos mezclados fueron: patrón 1 (relación molar 1:1 de PfPM2 y tubulina p), patrón 2 (relación molar 2:1 de PfPM2 y tubulina p), patrón 3 (relación molar 3:1 de PfPM2 y tubulina p), patrón 4 (relación molar 4:1 de PfPM2 y tubulina p) y patrón 5 (relación molar 5:1 de PfPM2 y tubulina p).

En cada ejecución se incluyó como control la línea 3D7 (África) (una copia de PfPM2). El número de copias de PfPM2 se calculó mediante el método de 2'ACt (ACt = Ct PfPM2 - Ct Pfp-tubulina en que Ct es el ciclo umbral) y se dedujo a partir de la curva patrón. (Fig. 6A.) A PfPM2 el número de copias > 1,6 se definió como una amplificación del gen. Las eficacias de amplificación de los genes PfPM2 y Pfp-tubulina, medidas utilizando diluciones al décimo del ADN de 3D7, fueron similares (99 % y 95 %, respectivamente). (Fig. 6 B.)

Número de copias de Pfmdr1

Las qPCR se llevaron a cabo en volúmenes de 25 |jl en una placa de 96 pocilios que contenía HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix ROX 5x (Solis BioDyne, Estonia), concentraciones de 0,3 jM de cada uno de los cebadores directo e inverso y 4 j l de ADN molde. Las amplificaciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones: 94 °C durante 15 min, seguido de 40 ciclos de 94 °C durante 15 s, 58 °C durante 20 s y 72 °C durante 20 s. Para cada ejecución, el número de copias de Pfmdrl de cada muestra se midió por triplicado en relación con una curva patrón (Fig. 6C) utilizando cuatro patrones de fragmentos génicos sintéticos mezclados (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania). Las longitudes de los fragmentos sintéticos para Pfmdrl (F3D7_0523000), incluida la ubicación del gen son para PfPM2 (PF3D7_1408000), de la posición 3981 a la 4260 (204 pb): 3981-ctattgtagatattaaagataaagctgacaaaactattattactattgcccacagaattgcatctataaaacgatcagacaaaattgtggtatttaataaccctgatcgaa atggaacctttgtacagtcacatggaacacacgatgaattattatcagcacaagatggaatatata aaaaatatgtaaaattagctaaatga-4260 (SEQ ID NO:15) (mostrado en negrita, la porción amplificada por qPCR).

Los cuatro patrones de fragmentos génicos sintéticos mezclados fueron: del patrón 1 (relación molar 1:1 de Pfmdrl y tubulina p) al patrón 4 (relación molar 4:1 de Pfmdr-1 y tubulina p). En cada ejecución se incluyeron como controles la línea 3D7 de África (que tiene una copia de Pfmdrl) y la Dd2line (que tiene tres copias de Pfmdrl).

El número de copias de Pfmdrl se calculó mediante el método de 2'ACt (ACt = Ct Pfmdrl - CtPfp-tubuiina en que Ct es el ciclo umbral) y se dedujo a partir de la curva patrón. A Pfmdrl el número de copias > 1,6 se definió como una amplificación del gen. Las eficacias de amplificación de los genes Pfmdrl y Pfp-tubulina medidas utilizando diluciones al décimo del ADN de 3D7, fueron similares (95 % y 95 %, respectivamente). (Fig. 6D.)

I. Perfil de expresión de ARNm de PfPM2

Las (RT)-qPCR de una etapa se llevaron a cabo utilizando una máquina de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad) en volúmenes de 25 j l en una placa de 96 pocillos que contenía el 2X SuperScript™ III Platinum One step qRT-PCR kit (Life Technologies, Courtaboeuf, Francia), concentraciones de 0,2 jM de cada cebador directo e inverso, concentraciones de 0,1 jM de sondas específicas (FAM-BHQ1) y 3 j l de ARN tratado con ADNasa. El listado de los cebadores, los protocolos y las eficacias de amplificación de la PCR se proporcionan a continuación en la tabla.

Secuencia de Cebador Secuencias Tf (°C) ^{Tamaño del} _{producto (pb)}

PfPM2_RTPCR_F ^{5'-GGATTCGAACCAACTTATACTGC-3' (SEQ ID}

_NO:3) 59,1 PfPM2_RTPCR_R ^{5'-AATTGGATCTACTGAACCTATTGATAA-3' (SEQ ID}

_NO:4) 57,9 90

5'-FAM-RT-PCR

_PfPM2 PfPM2_RTPCR_Probe CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATG GA- 71,3

BHQ1-3' (SEQ ID NO:6)

Pfserine-tRNA ligase

_{RTPCR F} 5'-TGGAACAATGGTAGCTGCAC-3' (SEQ ID NO: 16) 59,7

Pfserine-tRNA ligase

_{RTPCR R} 5'-GGCGCAATTTTTCAGGAACT-3' (SEQ ID NO:17) 61,5 92

Pfserine-tRNA ligase 5'-FAM-TGTCTTCTTGAAAATTATCAAAACGGCGAAG G- 71,6 RTPCR_Probe BHQ1-3' (SEQ ID NO:18)

Las amplificaciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones: 50 °C durante 15 min y 95 °C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y un ciclo final a 35 °C durante 30 s. Los datos de fluorescencia se recogieron durante las etapas de apareamiento-extensión a 60 °C.

Para cada ejecución, la expresión de los ARNm de PfPM2 y Pfserina-ARNt ligasa se midió por triplicado para cada muestra. Se incluyó en cada ejecución como control el ARN tratado con ADNasa de parásitos 3D7 (recogidos en el estadio de trofozoíto, 24 h posinvasión). La expresión del ARNm de PfPM2, normalizada con respecto a la expresión del ARNm de Pfserina-tRNA ligasa, se calculó mediante el método de 2'AACt, utilizando la siguiente fórmula:

AACt -[(Ct PfPM2 - Ct Pfserina-ARNt ligasa) muestra -(Ct PfPM2 - Ct Pfserina-ARNt ligasa) 3D7], en que Ct es el ciclo umbral.

Las eficacias de amplificación por RT-qPCR de Pfplasmepsina2 y Pfserina-ARNt ligasa, medidas utilizando diluciones al décimo del ARN de 3D7 tratado con ADNasa, fueron similares (104 % y 107 %, respectivamente). (Fig. 7.)

J. Análisis estadístico

Los datos se analizaron con MedCalc versión 12 (Mariakerke, Bélgica). Se utilizaron las pruebas de Kruskal-Wallis o Mann-Whitney para las comparaciones no paramétricas y la prueba t de Student o el análisis de la varianza unidireccional para las comparaciones paramétricas. Para las proporciones (expresadas con porcentajes e intervalos de confianza del 95 %), se realizaron las pruebas de la x2 o exacta de Fisher. Los gráficos Manhattan se generaron utilizando el programa informático SNPEVg .15 Los inventores probaron la CNV para la distribución diferencial entre líneas de parásitos sensibles y resistentes a la piperaquina utilizando: 1) una prueba t de Student paramétrica para la diferencia en medias; 2) una prueba de Wilcoxon para datos independientes no paramétrica. Los inventores realizaron un análisis de SNP y utilizaron la prueba exacta de Fisher para identificar diferencias significativas de SNP entre líneas de parásitos resistentes y sensibles a la PPQ. Se utilizó un umbral de Bonferroni (0,05/número de SNP o genes analizados) para evaluar la significación de todo el genoma y ajustar los valores de p cuando las pruebas estadísticas se realizaron simultáneamente en un solo conjunto de datos (véase la sección de métodos para obtener más información). Los riesgos relativos se estimaron mediante la prueba de Mantel-Haenszel. Las relaciones entre un riesgo acumulado de fracaso en el día 42 y las firmas moleculares asociadas con la resistencia a la PPQ se evaluaron mediante análisis de supervivencia. Las curvas se compararon con la prueba del orden logarítmico de Mantel-Haenszel. Se utilizó el modelo de regresión de riesgos instantáneos proporcionales de Cox para evaluar la asociación entre los genotiposde parásitos ( mutaciones de K13, número de copias de PfPM2 y Pfmdrl) y respuestas al tratamiento. Se utilizó un análisis de regresión lineal para evaluar la relación entre la eficacia de DHA-PPQ y la proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias. Los inventores consideraron significativos los valores de p inferiores a 0,05.

Ejemplo 2: Pacientes

Entre 2009 y 2015, se incluyeron 725 pacientes en estudios clínicos para evaluar la eficacia del tratamiento de 3 días con DHA-PPQ. Para el año 2015, la proporción acumulada de recrudescencia de P. falciparum en el día 42 después de la corrección por PCR fue del 16,4 % (119/725), variando del 0 al 62,5 % dependiendo de la zona y el año de estudio (Tabla 1, Figura 1).

Ejemplo 3: Firmas moleculares asociadas con la resistencia a la PPQ

Las secuencias de genoma completo se obtuvieron de 31 líneas de parásitos adaptadas a cultivo resistentes a la ART (K13 C580Y) recogidas en el oeste de Camboya en 2012, incluidas 23 líneas resistentes a la PPQ y 8 líneas sensibles a la PPQ según lo definido por sus tasas de supervivencia por PSA in vitro (Tabla_2). Observamos un total de 120.691 SNP exómicos (secuencia codificante). Después de la corrección de Bonferroni, los análisis de asociación de todo el genoma identificaron diferencias significativas entre líneas resistentes y sensibles en dos genes: uno de ellos es un SNP en el gen PF3D7_0420000 (que codifica una supuesta proteína con dedos de zinc) (p<3,5x10‘7, prueba exacta de Fisher) y el otro es un SNP en el gen PF3D7_0420100 (que codifica una serina/treonina proteína cinasa Rio2) (p<3,5x10‘7, prueba exacta de Fisher). Sin embargo, las secuencias de ambos genes mostraron numerosas posiciones ambiguas con proporciones variables de nucleótidos de tipo silvestre y mutantes, impidiendo la identificación de alelos específicos asociados a la resistencia (Figuras 8A, 8B1-6 y 8C1-2). No estaba claro si esta heterogeneidad reflejaba la selección purificadora que afectaba a estos genes adyacentes o la selección de un locus cercano (que los inventores no pudieron identificar) y si tal selección estaba asociada con la resistencia a la PPQ o la pérdida de resistencia a la mefloquina.

En cambio, se detectaron fuertes señales de amplificación de genes en el grupo resistente a la PPQ en una región ubicada en el cromosoma 14 que codifica proteasas que digieren hemoglobina conocidas como plasmepsinas (las PfPM) (p<10-9, Prueba t de Student con corrección de Bonferroni Figura_2). Todas las secuencias en las líneas resistentes y sensibles a la piperaquina mostraron un polimorfismo de PfPM2 Q442H (a nivel del nucleótido g1326c), mientras que todas las secuencias de PfPM3 eran de tipo silvestre. Cabe señalar que, el polimorfismo Q442H de PfPM2 se observa con frecuencia en líneas de laboratorio de referencia (tales como Dd2, ^g B4 y HB3) o en aislados silvestres (obtenidos de PlasmoDB, http://plasmodb.org/plasmo). La correlación entre las tasas de supervivencia por PSA in vitro y el número de copias de PfPM2/PfPM3 fue altamente significativo (r-0,83 [intervalo de confianza (IC) del 95 % 0,67-0,91], p<0,0001 y r-0,85 [IC del 95 % 0,71-0,93], p<0,0001). Los inventores observaron cuatro perfiles distintos de expansión de ADN (véanse las Figuras 9A-9E).

Los inventores utilizaron el programa informático PlasmoCNVScan para evaluar la variación del número de copias de genes en líneas de parásitos sensibles y resistentes a la piperaquina. Las secuencias de genes que codifican PfPM1-4 son bastante distintas entre sí, pero para confirmar con precisión la amplificación de los genes PfPM2 y PfPM3, los inventores identificaron para cada gen, una secuencia de nucleótidos específica de 30 bases: tgaatcagctgtgaatagctctacatttaa (SEQ ID NO:19) para PfPM1; caattcaacatttgatggattaaacattga (SEQ ID NO:20) para PfPM2; tgaagaatcctttaacacgtttcgagtaac (SEQ ID NO:21) para PfPM3 y tgcttcagcatttgatcgattgaaattagg (SEQ ID NO:22) para PfPM4. Luego recontaron el número de apariciones de estas secuencias en las 31 secuencias de genoma completo y uniformaron el número de apariciones de cada secuencia de PfPM específica normalizando frente a la media de secuencias específicas de Pfptubulina (tgatgtgcgcaagtgatcc (SEQ ID NO:7) y tcctttgtggacattcttcctc (SEQ ID NO:8)). Los inventores confirmaron la especificidad de las amplificaciones observadas con PlasmoCNVScan y los cuatro tipos de expansión de ADN. Cada tipo de expansión de ADN presenta una firma específica en el paquete WDM (véase más abajo). Basándose en su conjunto de datos, los inventores no son capaces de diferenciar entre múltiples acontecimientos de surgimiento que dieron lugar a los cuatro tipos de expansión de ADN y un solo acontecimiento correspondiente al tipo 4, que fue seguido por distintas pérdidas de amplificaciones de genes en los otros tipos de expansión.

La firma específica de cada tipo de expansión de ADN observada con el paquete WDM se muestra en las Figuras 9B-9E. (el eje de abscisas representa la posición del gen y el eje de ordenadas representa la relación entre la cobertura observada y la cobertura teórica para cada gen/posición, lo que da una variación estimada del número de copias para cada región). La expansión de ADN tipo 1 (segmento amplificado de aproximadamente 10 kb de longitud) fue la más frecuente (13/22) e incluyó a los genes PfPM2 y PfPM3. La firma específica de la línea parasitaria ID 6224 se da como ejemplo (véase la Tabla 2 para más detalles). (Fig. 9B.) La expansión de ADN tipo 2 (6/22), de aproximadamente 18 kb de largo, incluido el PfPM4 secuencia arriba y los genes AP2-G2 secuencia abajo. La firma específica de la línea parasitaria ID 6224 se da como ejemplo (véase la Tabla 2 para más detalles). (Fig. 9C.) La expansión de ADN tipo 3 (observada una vez), de 26 kb de longitud, incluía un gen secuencia abajo adicional. La firma específica de la línea parasitaria ID 6293 se da como ejemplo (véase la Tabla 2 para más detalles). (Fig. 9D.) La expansión de ADN tipo 4 (observada en dos muestras) abarcó 72 kb desde PfPM-4 y extendiéndose secuencia abajo hasta una proteína que contiene repetición de WD. La firma específica de la línea parasitaria ID 6280 se da como ejemplo (véase la Tabla 2 para más detalles). (Fig. 9E.)

Las tasas de supervivencia por PSA in vitro fueron significativamente más altas en parásitos que portaban la expansión de ADN tipo 2 (N=6, Valor medio del PSA=64,9 %, DT=7,7 %) en comparación con los que portaban la expansión de ADN tipo 1 (N=13, Valor medio del PSA=44,8 %, DT=16,1 %, p=0,0103) o el tipo 4 (N=2, Valor medio del PSA=16,2 %, DT=16,2 %, p=0,0206, pruebas de la t de dos muestras con varianzas iguales). Solo una secuencia tenía la expansión de ADN tipo 3 (valor medio del PSA=39,3 %).

Utilizando la prueba bilateral de Wilcoxon para datos independientes, se confirmó que el número de copias de PfPM2/PfPM3 aumentó significativamente en las líneas resistentes (p<10-5). Por el contrario, un agrupamiento de 5 genes en el cromosoma 5 (PF3D7_0531700, PF3D7_0522900, PF3D7_0523000, PF3D7_0523100, PF3D7_0523200), que incluía a Pfmdrl, presentó un número de copias aumentado en las líneas sensibles. Pfmdrl se amplificó en 5 de 8 líneas sensibles a la PPQ, pero en 0 de 23 líneas resistentes a la PPQ (p=0,007) (Figura 10).

Ejemplo 4: CNV de PfPM2 y susceptibilidad a PPQ ex vivo

Para examinar las asociaciones entre la CNV de PfPM y la tasa de supervivencia por PSA ex vivo, los inventores se enfocaron en PfPM2, utilizado como indicador de amplicón. En primer lugar, los inventores optimizaron un método qPCR para evaluar el número de copias del gen PfPM2 (véanse las Figuras 6A-6D).

El número de copias de PfPM2 detectado por qPCR fue un 100 % concordante con las estimaciones de secuenciación de genoma completo para los 31 parásitos adaptados a cultivo (p<0,0001, prueba de Fisher). De un conjunto de 134 aislados con perfiles del PSA ex vivo conocidos, PfPM2 se amplificó en 67 de 69 parásitos resistentes a la PPQ (50, 15 y 2 aislados con 2, 3 o 4 copias de PfPM2, respectivamente), y 0 de 65 parásitos susceptibles a la PPQ (Figura_3). La mediana de la tasa de supervivencia por PSA ex vivo fue significativamente más alta en los aislados con >2 copias de PfPM2 en comparación con las que no tienen amplificación (única copia) de PfPM2 (51,7 % [IIC 29,7-75,1 %] frente a 0,004 % [IIC 0,003-0,39 %], p< 0,0001, prueba de Mann-Whitney). Un número de copias de PfPM2 aumentado predijo la resistencia a la PPQ ex vivo con una sensibilidad de 0,97 (IC del 95 % 0,90-0,99 y especificidad de 1,0 (IC del 95 % 0,65-1). Se detectaron polimorfismos de K13 en 65 aislados resistentes a la PPQ y 17 aislados sensibles a la PPQ (Figura_3). Solo 4 de 69 aislados resistentes a la PPQ portaban una secuencia de K13 de tipo silvestre. En un análisis de regresión múltiple, el número de copias de PfPM2 aumentado se asoció más fuertemente que las mutaciones de K13 con la resistencia a la PPQ in vitro (rparcial= 0,94, p<0,0001 y rparcial= 0,25, p=0,004, respectivamente).

Ejemplo 5: Niveles de ARNm y proteína en parásitos con PfPM2 con copia única o con múltiples copias

Los niveles de transcritos de PfPM2 fueron 4,1-5,3 veces más altos en la línea resistente a la PPQ (ID_6320) en comparación con la línea sensible a la PPQ (ID_6267) en todos los puntos de tiempo del ciclo intraeritrocitario investigado. Los niveles de proteína PfPM2 fueron al menos dos veces más altos en los parásitos resistentes a la PPQ (ID_6408) en comparación con la línea sensible (ID_6267) (Figura 11). Sin embargo, se precisa trabajo adicional para expandir este análisis a otras líneas.

Ejemplo 6: CNV de PfPM2 y resultado del tratamiento con DHA-PPQ

A continuación, los inventores exploraron la relación entre la CNV de PfPM2 y el resultado del tratamiento con DHA-PPQ en los aislados de 725 pacientes recogidos antes del tratamiento con DHA-PPQ, de los cuales 119 experimentaron una recrudescencia entre el día 12 y el día 42 (Figura_1). PfPM2 no estaba amplificado, tenía 2 copias o >3 copias en 476/725 (65,7 %), 153/725 (21,1 %) o 96/725 (13,2 %) aislados, respectivamente. Solo 7 de 476 pacientes (1,5 %) con parásitos con PfPM2 no amplificado tuvieron recrudescencia el día 42 en comparación con 112/249 (45,0 %) pacientes infectados con parásitos con PfPM2 con múltiples copias (RR=22,8 [IC 95 %: 10,7-48,6]; p<0,0001). La recrudescencia fue más frecuente para los aislados con >3 en comparación con 2 copias de PfPM2 (52/96, 54,2 % frente a 60/153, 39,2 %, p=0,02). La incidencia acumulada de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ aumentó con el aumento de copias del gen PfPM2: sin amplificar frente a 2 copias (RRI=32,2 [IC del 95 %: 17,9-58,0], p<0,0001), sin amplificar frente a 3 copias (RRI=49,0 [IC del 95 %: 23,0-104,2], p<0,0001), o 2 copias frente a >3 copias (RRI=1,53 [IC del 95 %: 1,04-2,25], p=0,02) (Figura_4A). El tiempo medio hasta la recrudescencia disminuyó con el aumento del número de copias de PfPM2: 41,9 días (iC del 95 %: 41,8-42,0) para pacientes con PfPM2 no amplificado, 36,0 días (IC del 95 %: 34,6-37,4) para aquellos con 2 copias, o 34,0 días (IC del 95 %: 32,1-35,9) para aquellos con >3 copias. Un número de copias de PfPM2 aumentado predijo los fracasos del tratamiento con DHA-PpQ con una sensibilidad de 0,94 (IC del 95 %: 0,88-0,98) y una especificidad de 0,77 (IC del 95 %: 0,74-0,81). El ABC (área bajo la curva de rendimiento diagnóstico) fue de 0,86 (IC del 95 %: 0,83-0,88), significativamente distinto de 0,5 (p<0,0001).

Ejemplo 7: Polimorfismo de propulsora K13 y amplificación del gen Pfmdrl

Entre los 725 pacientes tratados con DHA-PPQ, se detectaron mutantes de K13 en 443/725 (61,1 %) aislados del día 0 (Figura_4B). De estos, 116/443 (26,2 %) eran de pacientes que fracasaron en el tratamiento con DHA-PPQ el día 42 en comparación con 3 de 282 (1,1 %) de pacientes que portaban parásitos con K13 de tipo silvestre (RR=24,6 [IC del 95 %: 7,9-76,7], p<0,0001). Se detectó una única copia del gen Pfmdrl en 610/725 (84,1 %) aislados del día 0. Se observaron fracasos con DHA-PPQ en 112/610 pacientes (18,4 %) infectados con parásitos que portaban una única copia de Pfmdrl y 7/115 (6,1 %) de pacientes infectados con parásitos con Pfmdrl con múltiples copias (RR=3,0 [IC 95 %: 1,4-6,3]; p=0,003). Los inventores observaron que la incidencia acumulada de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ no aumentó con el aumento de la edad (estratificados en 3 clases: 0-15, 16-30 y > 30 años, p=0,1809, prueba del orden logarítmico) o con parasitemia creciente medida en aislados recogidos antes del tratamiento con DHA-PPQ (estratificados en 4 clases: <5000, 5001-20000, 20001-50000 y > 50000 parásitos por pl, p=0,4612, prueba del orden logarítmico).

Después de controlar por los genotipos de K13 y Pfmdrl en un modelo de regresión de riesgos instantáneos proporcionales de Cox, el número de copias de PfPM2 (cualquier aumento en comparación con la no amplificación) fue la firma molecular más significativa asociada con el fracaso del tratamiento con DHA-PPQ (RRA=20,4 [IC del 95 %: 9,1-45,5], p<0,0010) seguido de la mutación de K13 (RRA=5,5 [IC del 95 %: 1,7-18,3], p=0,005) y Pfmdrl con única copia (RRA=2,05 [ ⁱC 95 %: 0,95-4,42], p=0,06). La incidencia acumulada de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ entre pacientes que portaban parásitos resistentes a la ART (mutante de K13) aumentó significativamente con el número de copia de PfPM2: sin amplificar (3,3 %, 7/208) frente a >2 copias (46,4 % 109/235; RRI=17,5 [IC del 95 %: 12,2-25,2]).

Ejemplo 8: Tendencias espacio-temporales en la eficacia de DHA-PPQ en Camboya

Se investigaron las CNV de PfPM2 en muestras recogidas en las provincias del oeste (N=405) y el este (N=324) entre 2002 y 2015 (es decir, antes y después de la introducción de DHA-PPQ). La proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias aumentó del 27,9 % (19/68) en 2008-2009 al 91,2 % (52/57) en 2014-2015 en las provincias del oeste. En las provincias del este, los parásitos con PfPM2 con múltiples copias fueron poco frecuentes hasta 2012-13 (3,2 %, 1/31) pero aumentaron al 45,5 % (40/88) en 2014-2015 (Figura 12).

La asociación entre la proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias y las tasas de fracaso del tratamiento con DHA-PPQ se exploraron en las 12 zonas en que se realizaron estudios de eficacia de DHA-PPQ en 2009-2015. La proporción de aislados con PfPM2 con múltiples copias se correlacionó negativamente con las tasas de curación del día 42 (r=0,89 [IC del 95 %: 0,77-0,95]; p<0,0001) (Figura 13). Un modelo de regresión lineal demostró que la eficacia clínica de DHA-PPQ en el día 42 cayó por debajo del 90 % cuando la proporción de parásitos con PfPM2 con múltiples copias con acervo genético de mutante de K13 aumentaba por encima del 22 %.

Ejemplo 9: Análisis

Tras los informes sobre el fracaso cada vez mayor del artesunato-mefloquina en el oeste de Camboya, en 2008 se adoptó DHA-PPQ. La resistencia a esta combinación se ha acelerado recientemente a niveles que la vuelven ampliamente ineficaz.1 La escasez de alternativas crea una situación peligrosa en la que estas infecciones resistentes a múltiples fármacos pueden volverse intratables y propagarse a otras regiones donde el paludismo es endémico.

La estrategia utilizada por los inventores para buscar asociaciones genéticas con la resistencia a PPQ se basó en comparaciones de secuencias de todo el genoma de líneas de parásitos resistentes a la ART que presentaban tasas de supervivencia por PSA in vitro indicativas de resistencia o susceptibilidad a la PPQ. Los resultados identificaron la amplificación del agrupamiento de PfPM2-3 como el acontecimiento molecular más significativo asociado con la resistencia a la PPQ. Para confirmar esta asociación, los inventores se centraron en PfPM2, ubicado en el centro del amplicón y que presenta la mayor asociación estadística (Figuras 9 y 10). La amplificación PfPM2 se correlacionó fuertemente con las tasas de supervivencia por PSA ex vivo independientemente de la susceptibilidad a la ART y fue altamente predictiva de los fracasos con DHA-PPQ. La amplificación de PfPM2 representa así el primer marcador informativo sólido para la resistencia a la PPQ.

La fuerte asociación entre los polimorfismos de K13 y la amplificación de PfPM2 en los parásitos camboyanos estudiados en el presente documento probablemente refleja la historia de la selección de fármacos en Camboya. La proporción de aislados con distintas combinaciones de K13-PfPM2 (Figura 14) es concordante con una selección escalonada para resistencia a la ART seguida de resistencia a la PPQ. Esto está en consonancia con la aparición retrasada de parásitos con PfPM2 con múltiples copias en las provincias del este donde el surgimiento de resistencia a la ART se retrasó en comparación con las provincias del oeste. La mayoría (94,1 %, 112/119) de los fracasos con DHA-PPQ tenían una única copia del gen Pfmdrl, confirmando informes anteriores de casos de fracasos con DHA-PPQ.6-9 La presencia de una única copia de Pfmdrl es concordante con los datos informados para parásitos Dd2 resistentes a la PPQ seleccionados in vitro 16 y el análisis de muestras de campo de Camboya, lo que sugiere mecanismos de resistencia opuestos frente a estas moléculas.17 Los inventores no observaron la Mutación C101F de Pfcrt observada en una línea de parásitos presionada mediante PPQ seleccionada in vitro. Por tanto, los datos actuales muestran que, aunque el marcador informativo para la resistencia a PPQ es el número de copias de PfPM2, la mutación de K13 junto con una única copia del gen Pfmdrl contribuye al fenotipo de fracaso con DHA-PPQ.

La amplificación de genes seleccionada por fármacos es un fenómeno bien conocido en los parásitos del paludismo.18-21 El tamaño de los amplicones en el cromosoma 14 varió dependiendo del aislado, como se informó para Pfmdrl.22 La amplificación de genes, que en parásitos P. falciparum 22 es más frecuente que la mutación puntual, es concordante con el aumento y la propagación notablemente rápidos de la resistencia a la PPQ en Camboya. Por el contrario, en los últimos años se produjo en Camboya una desamplificación de Pfmdr1, concordante con la susceptibilidad recuperada a la mefloquina, 6823 y, como se muestra en este caso, está asociada con el surgimiento de cepas resistentes a la PPQ.

Las plasmepsinas se expresan durante el ciclo de estadios sanguíneos asexuales intraeritrocitarios, así como en gametocitos del estadio sexual que pueden transmitirse al mosquito vector. Las cuatro plasmepsinas (PfPM1-4) se encuentran en la vacuola digestiva de las formas intraeritrocitarias del desarrollo donde participan en distintas etapas de la degradación de la hemoglobina. Estudios de parásitos con genes PfPM alterados apuntaban a la redundancia de la maquinaria de degradación de la hemoglobina.24 Según el conocimiento de los inventores, no hay estudios informados sobre las consecuencias de la sobreexpresión de estas proteasas. Los inventores muestran en este caso que la amplificación de PfPM2 se asocia con un aumento notable de los niveles de proteína y ARNm en el equilibrio en dos aislados adaptados a cultivo. Esta observación debe confirmarse con aislados adicionales. Una hipótesis razonable es que la amplificación de las plasmepsinas supera el efecto inhibidor de la PPQ sobre la degradación de hemoglobina y la desintoxicación del hemo, posiblemente mediante la reducción de los niveles de especies del hemo reactivas que son sustratos preferidos para la unión a PPQ. Se ha demostrado que los trofozoítos tratados con PPQ poseen grandes vacuolas digestivas que contienen paquetes de hemoglobina no digerida unidos a la membrana.25 La observación de que los parásitos resistentes a la PPQ tienen una única copia de Pfmdr1 es concordante con este escenario, ya que el mantenimiento de una única copia de Pfmdr1 (o la inversión a una única copia) podría evitar la importación de cantidades excesivas de PPQ a la vacuola digestiva (Figura 15).2627

Los inventores señalan que la asociación de la resistencia a PPQ con la amplificación del agrupamiento de PfPM2-3 en el cromosoma 14 no es prueba de causalidad. La población altamente estructurada de parásitos P. falciparum en Camboya 28 podría confundir la solidez de la asociación y locus adicionales también podrían contribuir a la resistencia a la PPQ. Los presentes hallazgos deben complementarse con investigaciones de laboratorio de las consecuencias celulares de esta amplificación en la respuesta del parásito a la PPQ y en la aptitud y transmisibilidad del parásito. No obstante, los datos actuales son oportunos para proporcionar una herramienta molecular que predice la aparición de resistencia a la PPQ en contextos endémicos.

La PPQ es un fármaco asociado bien tolerado que actualmente se utiliza en combinación con derivados de la ART o el compuesto de ozónido arterolano (OZ277).29 El mecanismo de resistencia a la PPQ en el contexto específico de Camboya, donde la resistencia a la ART está casi fijada y la presión del fármaco es alta, no puede extrapolarse a zonas donde aún no se ha documentado la resistencia a la ART. Aún así, los inventores proponen extender la evaluación del número de copias del gen PfPM2 a zonas donde se usa la PPQ en las TCA a una muy gran escala, y combinar este ensayo con la secuenciación de K13 para localizar zonas de resistencia del parásito a ambos componentes. En Camboya, donde el rápido fracaso de las TCA de primera línea está poniendo en peligro los esfuerzos de eliminación y acelerando el surgimiento y la propagación de la resistencia, la susceptibilidad opuesta entre la mefloquina y la PPQ podría utilizarse para implementar nuevas estrategias basadas en la rotación de fármacos de la TCA, la administración secuencial o combinaciones triples que incluyan ambos fármacos asociados de la ACT. Aunque es difícil de implementar, estas estrategias alternativas ayudarán a garantizar una eficacia a largo plazo de los antipalúdicos para alcanzar el objetivo de la eliminación.

Cabe señalar que los inventores participaron en tres estudios que se han publicado recientemente303132 en donde se han utilizado protocolos idénticos o similares a los divulgados en el presente documento para identificar la firma molecular asociada con la resistencia de Plasmodium falciparum a tratamientos que incluyen piperaquina, y que dichos estudios confirmaron los resultados proporcionados en el presente documento. Los resultados de esos estudios confirman los presentes.

TABLA 1

Tabla 1. Proporción de recrudescencias de P. falciparum corregidas por PCR observadas el día 42 en 2009-2015 en 12 provincias de Camboya, en pacientes tratados con un ciclo de 3 días de régimen de DHA-PPQ. Se proporciona la ubicación de la zona y los años de recogida para aislados con perfiles del PSA in vitro y ex vivo (el mapa de i i n l z n i r n n l A n i 1.

TABLA 2

continuación

Tabla 2. Detalles de 31 mutantes K13-C580Y (y la línea de referencia 3D7), Análisis de parásitos adaptados a cultivo sensibles y resistentes a la PPQ mediante secuenciación de genoma completo. La última columna enumera los tipos de expansión de ADN observados en la región del cromosoma 14 que codifica las plasmepsinas 1-4 hemoglobinasas. * Umbral utilizado para definir la susceptibilidad in vitro a la PPQ: sensible si las tasas de supervivencia eran <10 % y resistente si las tasas de supervivencia eran >10 %.

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para el genotipado in vitro de un plasmodio que comprende:

en una muestra que contiene un plasmodio detectar la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3, en particular en donde el plasmodio es Plasmodium falciparum.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante secuenciación y/o se detecta mediante PCR, en particular mediante PCR cuantitativa (qPCR) o se detecta mediante hibridación de ácidos nucleicos.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el método comprende determinar el número de copias de al menos uno del gen Pfplasmepsina2 (PF3D7_1408000) (PfPM2) y el gen de Pfplasmepsina3 (PF3D7_1408100) (PfPM3) o comprende determinar el nivel de al menos un ARNm seleccionado de un ARNm de PfPM2 y un ARNm de PfPM3 o comprende determinar el nivel de al menos una proteína seleccionada de una proteína PfPM2 y una proteína PfPM3.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde se detectan 2, 3 o 4 copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además detectar la presencia de una proteína o ácido nucleico de propulsora K-13 mutado en la muestra y/o que comprende además detectar la presencia de no más de una única copia de un ácido nucleico de Pfmdr1 en la muestra.

6. Un método para la detección in vitro de una infección por plasmodio en un paciente que comprende:

en una muestra de sangre obtenida previamente de un paciente detectar la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra de sangre, en particular en donde el plasmodio es Plasmodium falciparum.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la presencia o ausencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 en la muestra se detecta mediante secuenciación o se detecta mediante PCR, en particular mediante PCR cuantitativa (qPCR) o se detecta mediante hibridación de ácidos nucleicos.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en donde el método comprende determinar el número de copias de al menos uno del gen Pfplasmepsina2 (PF3D7_1408000) (PfPM2) y el gen Pfplasmepsina3 (PF3D7_1408100) (PfPM3) o el método comprende determinar el nivel de al menos un ARNm seleccionado de un ARNm de PfPM2 y un ARNm de PfPM3 o comprende determinar el nivel de al menos una proteína seleccionada de una proteína PfPM2 y una proteína PfPM3.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde se detectan 2, 3 o 4 copias del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, que comprende además detectar la presencia o ausencia de una proteína o ácido nucleico de propulsora K-13 mutado en la muestra y/o que comprende además detectar la presencia o ausencia de no más de una única copia de un ácido nucleico de Pfmdr1 en la muestra.

11. Uso de al menos uno de los siguientes cebadores:

5'-TGGTGATGCAGAAGTTGGAG-3' (SEQ ID NO:1);

5'-TGGGACCCATAAATTAGCAGA-3' (SEQ ID NO:2);

5'-GGATTCGAACCAACTTATACTGC-3' (SEQ ID NO:3); y

5'-AATTGGATCTACTGAACCTATTGATAA-3' (SEQ ID NO:4) y opcionalmente de al menos una sonda que comprende la secuencia 5'-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTt Ta Gg ATGGA-3' (SEQ ID NO:5), en particular la siguiente sonda: 5'-FAM-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATGGA-BHQ1 -3' (SEQ ID NO:6) para el genotipado o para la detección de una infección por plasmodio mediante la amplificación de un ácido nucleico de agrupamiento de plasmepsina2-3.

12. El uso de la reivindicación 11 para detectar una infección por plasmodio mediante la amplificación de un ácido nucleico de agrupamiento de plasmepsina2-3 en donde la sonda es al menos una sonda que comprende la secuencia 5'-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATGGA-3' (SEQ ID NO:5), en particular la sonda 5'-FAM-CAACATTTGATGGTATCCTTGGTTTAGGATGGA-BHQ1-3' (SEQ ID NO:6) o es al menos una sonda 5'-CAATTCAACATTTGATGGATTAAACATTGA-3' (SEQ ID NO:20) para PfPM2.

13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, que comprende además cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de propulsora K-13 y reactivos para la detección del producto amplificado y/o que comprende además cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de Pfmdr1 y reactivos para la detección del producto amplificado.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la presencia de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 indica que el plasmodio es resistente a la piperaquina.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la presencia de una proteína o ácido nucleico de propulsora K13 mutado indica que el plasmodio también es resistente a los derivados de artemisinina.

16. Piperaquina para su uso en el tratamiento de pacientes que se han sometido previamente a un método de evaluación in vitro de un número de copias aumentado del agrupamiento genómico de plasmepsina2-3 y en donde dicha evaluación no ha revelado tal aumento.