CN109504791A - 用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关k13基因突变的试剂盒 - Google Patents

用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关k13基因突变的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒，属于检测生物技术领域，试剂盒包括3对引物和6个非标记探针，第一对引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，第二对引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示，第三对引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示；第一非标记探针的序列如SEQ ID NO.7所示，第二非标记探针的序列如SEQ ID NO.8所示，第三非标记探针的序列如SEQ ID NO.9所示，第四非标记探针的序列如SEQ ID NO.10所示，第五非标记探针的序列如SEQ ID NO.11所示，第六非标记探针的序列如SEQ ID NO.12所示，非标记探针的3’端被封闭。本发明试剂盒能快速、大量检测K13基因，适合临床样本的快速诊断。

Description

用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒
技术领域
本发明属于检测生物技术领域，尤其涉及用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒。
背景技术
疟疾(Malaria)是一种由疟原虫造成的，并以按蚊为主要媒介传播的全球性急性寄生虫传染病。它主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。目前全球仍有90多个国家和地区的20多亿人居住在疟疾流行区，其中以非洲的撒哈拉以南地区感染疟疾的疫情最严重[1]。根据世界卫生组织《2017年世界疟疾报告》：2016年全球约有2.16亿疟疾病例，死亡44.5万人，其中约90％为非洲地区的儿童[2]。青蒿素(artemisinin)是我国科学家从青蒿(黄花蒿，Artemisia annua)中发现的新型抗疟药物。自问世以来，青蒿素及其衍生物被广泛用于疟疾临床治疗，疗效确切而且显著，尤其对氯喹耐药的恶性疟疾及致命性脑型疟有效，成为疟疾治疗的一线药物[2]。近年来，恶性疟原虫出现了青蒿素抵抗的现象，即在进行单方剂的青蒿素或ACT药物治疗之后，患者体内的原虫清除的时间延长了[2-4]。这个现象一出现就得到全世界的关注。因此，目前WHO推荐以青蒿素为基础的联合疗法(ACT)作为治疗抗药性疟疾的首选疗法，同时还制定一个全球检测系统以监控耐药虫株的出现。
尽管目前对于青蒿素耐药的分子标志物并没有完全确定，然而耐药虫种的体内和体外研究发现青蒿素抗性表现与恶性疟原虫kelch螺旋体基因(PF3D7_1343700kelchpropeller domain(K-13propeller)突变有关[5,6]。目前的研究表明K13基因编码N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H和C580Y氨基酸替换能够影响原虫体外存活率和体内清除率[5]。特别是在东南亚地区，C580Y被认为是一个主要和富有潜力的衡量青蒿素抵抗的分子标志[5]。根据2018年世界卫生组织的关于疟疾的ACT药物抵抗报告[7]，K13基因的F446I、N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H、C580Y这七个突变已经证实与青蒿素和其衍生物的抵抗有关，其可以作为我们监控ACT药物抵抗的分子标记。因此，为了有效的监控和消灭青蒿素耐药的恶性疟原虫，这需要去发展一种快速、便捷的方法以检测出kelch13基因的突变。
尽管通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对kelch13基因进行扩增，然后再采用Sanger测序是检测点突变的金标准[5]。这种方法目前已经在各个地区的科学研究中得到广泛的应用[5,8-10]。然而，由于其需要高价值的测序仪，比较严格标准的实验环境和较为昂贵的费用，这注定它不能用于高疟区临床样本的快速诊断。目前也有研究人员将PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)应用到恶性疟原虫青蒿素耐药相关基因突变的检测中来[11]，但这种方法需要引入额外的酶切位点，并用Alu I,Apo I等几种不同的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，最后在紫外分析仪下分析产物：根据酶切产物片段的大小，最后确定是否有kelch13突变的存在。PCR-RFLP的操作繁琐，耗时长，价格高，而且大批量开盖操作容易造成实验室污染。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和纳米孔测序是新近兴起的两种技术，也有人将此两者结合起来，用LAMP对kelch13突变所在的区域进行扩增，再用纳米孔测序仪MinION对C580Y位点进行分析[12]。但是，纳米孔测序仪MinION目前尚因存在测序错误率高等缺点而未得到广泛的应用。还有人将突变扩增系统(amplificationrefractory mutation system，ARMS)与实时荧光定量PCR结合起来，用于分析kelch13基因的突变[13]，但是检测位点较少，成本较高。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒，该试剂盒能快速、大量检测K13基因，适合临床样本的快速诊断。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于检测恶性疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的引物对和非标记探针组，其包括3对引物和6个非标记探针，第一对引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，第二对引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示，第三对引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示；第一非标记探针的序列如SEQ ID NO.7所示，第二非标记探针的序列如SEQ ID NO.8所示，第三非标记探针的序列如SEQ ID NO.9所示，第四非标记探针的序列如SEQ ID NO.10所示，第五非标记探针的序列如SEQ ID NO.11所示，第六非标记探针的序列如SEQ ID NO.12所示，所述非标记探针的3’端被封闭。
另外，本发明还提供所述的引物对和非标记探针组在制备用于检测K13基因突变的试剂盒中的应用，每20μL反应体系具有以下浓度的组分：样品2μL、10μmol/L上游引物0.2μL、10μmol/L下游引物1μL、PCR预混液10μL、10μmol/L非标记探针0.5μL、荧光染料2μL，余量为无菌蒸馏水；所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示、如SEQ ID NO.3所示或如SEQ IDNO.5所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示、如SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID NO.6所示，所述样品为全血或血斑。
另外，本发明还提供一种用于检测恶性疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒，其包括所述的引物对和非标记探针组。
作为上述技术方案的改进，试剂盒还包括荧光染料、PCR预混液和无菌蒸馏水。
作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光染料为LC Green、SYTO 9或EvaGreen，所述PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂和稳定剂。
作为上述技术方案的改进，试剂盒还包括对照品，所述对照品为含有K13野生型基因的质粒，所述质粒的浓度为103copy/mL。
本发明有益效果：本发明提供用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒，本发明试剂盒及检测方法具有以下优点：
1)基于高分辨率熔解曲线法的非标记探针基因(Unlabeled probe)分型技术，建立起针对青蒿素耐药相关的突变(F446I、N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H、C580Y)的PCR-HRM检测方法；
2)经过优化和改良，本试剂盒使用即用型PCR预混液，PCR预混液含有专用于血样扩增DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂和稳定剂，可直接用于全血或者血斑纸片的扩增而无需进行DNA的提取；相较于其他分子诊断方法，此方法检测灵敏度高，操作简便快速，成本低，反应通量大，结果准确可以满足临床样本的检测，并且实现了真正的闭管操作，减少实验室污染的机会。
附图说明
图1为PF3D7_1343700kelch protein K13的序列；
图2为引物、非标记探针及SNP的示意图；其中，非标记探针从左至右依次是P1、P2、P3、P4、P5、P6，SNP从左至右依次是N458Y、F466I、Y493H、R539T、I543T、R561H、C580Y；
图3显示F446I的检测结果；其中，3a为Temperature--d(Fluorescence)/dT图；3b为Temperature-Normalized Fluorescence图，3c为Temperature-Normalized-d(Fluorescence)/dT图；
图4显示N458Y的检测结果；其中，4a为Temperature--d(Fluorescence)/dT图；4b为Temperature-Normalized Fluorescence图，4c为Temperature-Normalized-d(Fluorescence)/dT图；
图5显示Y493H的检测结果；其中，5a为Temperature--d(Fluorescence)/dT图；5b为Temperature-Normalized Fluorescence图，5c为Temperature-Normalized-d(Fluorescence)/dT图；
图6显示R539T和I543T的检测结果；其中，6a为Temperature--d(Fluorescence)/dT图；6b为Temperature-Normalized Fluorescence图，6c为Temperature-Normalized-d(Fluorescence)/dT图；
图7显示R561H的检测结果；其中，7a为Temperature--d(Fluorescence)/dT图；7b为Temperature-Normalized Fluorescence图，7c为Temperature-Normalized-d(Fluorescence)/dT图；
图8显示C580Y的检测结果；其中，8a为Temperature--d(Fluorescence)/dT图；8b为Temperature-Normalized Fluorescence图，8c为Temperature-Normalized-d(Fluorescence)/dT图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
标本留取
使用Whatman-新华903滤纸制备恶性疟患者的干血班，干燥后密封保存；采用EDTA-K2抗凝真空管采集患者外周血3mL，然后放置4℃冰箱备用。
标准质粒构建
采用人工合成的办法由华大公司合成含有青蒿素耐药相关突变(C580Y、Y493H、R539T、I543T、N458Y、R561H、F446I)和野生型的pUC57-amp质粒，共8种，编号K01～K08，其中K01～K07为突变型，K08为野生型，序列及位置如下：K01：K02：K03：K04：K05：K06：K07：(参考于Genomic Sequence：PF3D7_1343700kelch protein K13，序列来源于http://plasmodb.org，如图1所示)。
PCR扩增目的基因片段
采用全血或干血斑直接扩增，在相同检测条件下，每个被检标本采用6个反应管分别用于扩增F446I、N458Y、Y493H、R539T、I543T、R561H和C580Y基因序列。采用不对称PCR体系，体系的非标记探针组及引物对的信息见表1及图2。反应体系为20μL，试剂配制及用量如下：2μL全血(或1mm×1mm干血斑或103copy/mL质粒)、0.2μL 10μmol/L上游引物、1μL 10μmol/L下游引物、10μL 2×Hemo HiFi PCR MIX(海基生物科技有限公司)、0.5μL 10μmol/L非标记探针(3’端采用C3spacer或磷酸化封闭)、2.μL饱和荧光染料LC Green，最后加无菌蒸馏水至20μL。
表1与青蒿素耐药相关的K13基因SNP的非标记探针、引物的序列信息
PCR扩增
采用96孔板或0.2μL薄壁管PCR按表2程序进行扩增。
表2
PCR产物分析
PCR反应结束后，用LightScanner96(Idaho Technology Inc.,USA)、LightCycler480II(Roche BIOTECON Diagnostics)或其他带有HRM功能的仪器对扩增产物进行HRM(高分辨率溶解曲线)分析，温度范围设置55～80℃，温度变化速率为0.1℃/s，用软件对采集后荧光曲线进行分析。实验所分析的是非标记探针与目标DNA分子形成的双链溶解曲线。最后通过与标准质粒的曲线自动归类比对，确定样本的突变类型。
实施例
本实施例提供一种用于检测恶性疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒，其包括3对引物和6个非标记探针、荧光染料、PCR预混液、无菌蒸馏水和对照品；
第一对引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，第二对引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示，第三对引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示；第一非标记探针的序列如SEQ ID NO.7所示，第二非标记探针的序列如SEQ ID NO.8所示，第三非标记探针的序列如SEQ ID NO.9所示，第四非标记探针的序列如SEQ ID NO.10所示，第五非标记探针的序列如SEQ ID NO.11所示，第六非标记探针的序列如SEQ ID NO.12所示，非标记探针的3’端被封闭；
荧光染料为LC Green、SYTO 9或Eva Green，PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂和稳定剂，对照品包含浓度为103copy/mL的质粒。
K13基因突变的检测
1)使用实施例的试剂盒对样品的K13基因进行检测，结果如图3所示，样本为突变型：F466I；
2)使用实施例的试剂盒对样品的K13基因进行检测，结果如图4所示，样本为突变型：N458Y；
3)使用实施例的试剂盒对样品的K13基因进行检测，结果如图5所示，样本为突变型：Y493H；
4)使用实施例的试剂盒对样品的K13基因进行检测，结果如图6所示，样本为突变型：R539T和I543T；
5)使用实施例的试剂盒对样品的K13基因进行检测，结果如图7所示，样本为突变型：R561H；
6)使用实施例的试剂盒对样品的K13基因进行检测，结果如图8所示，样本为突变型：C580Y。
由上述检测结果及图2～图8，可以看出本发明试剂盒能准确性检测K13基因突变，且线条重复性好，检测方法比较稳定；另外，从图6中，使用同一对引物和同一个非标记探针可以同时检测R539T和I543T。
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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<120> 用于检测疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒
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Claims (6)

1.用于检测恶性疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的引物对和非标记探针组，其特征在于，包括3对引物和6个非标记探针，第一对引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，第二对引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示，第三对引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示；第一非标记探针的序列如SEQ ID NO.7所示，第二非标记探针的序列如SEQ ID NO.8所示，第三非标记探针的序列如SEQ ID NO.9所示，第四非标记探针的序列如SEQ ID NO.10所示，第五非标记探针的序列如SEQ ID NO.11所示，第六非标记探针的序列如SEQ ID NO.12所示，所述非标记探针的3’端被封闭。
2.如权利要求1所述的引物对和非标记探针组在制备用于检测K13基因突变的试剂盒中的应用，其特征在于，每20μL反应体系具有以下浓度的组分：样品2μL、10μmol/L上游引物0.2μL、10μmol/L下游引物1μL、PCR预混液10μL、10μmol/L非标记探针0.5μL、荧光染料2μL，余量为无菌蒸馏水；所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示、如SEQ ID NO.3所示或如SEQID NO.5所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示、如SEQ ID NO.4所示或如SEQ IDNO.6所示，所述样品为全血或血斑。
3.一种用于检测恶性疟原虫青蒿素耐药性相关K13基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对和非标记探针组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料、PCR预混液和无菌蒸馏水。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为LC Green、SYTO 9或EvaGreen，所述PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂和稳定剂。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对照品，所述对照品为含有K13野生型基因的质粒，所述质粒的浓度为103copy/mL。
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