CN1678753A

CN1678753A - 监测引物延伸和多态性检测反应的方法和组合物

Info

Publication number: CN1678753A
Application number: CN03820275.1A
Authority: CN
Inventors: 布雷恩·麦基翁
Original assignee: Orchid Biosciences Inc
Current assignee: Orchid Cellmark Inc
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2003-06-23
Publication date: 2005-10-05
Also published as: AU2003247603A1; WO2004001063A3; WO2004001063A2; US20030235827A1; EP1534858A2; JP2005530508A; EP1534858A4; CA2490530A1

Abstract

本发明的方法包括使用对照引物监测扩增和/或引物延伸反应的功效，和随后这些对照产物作为大小标记的可能应用。本发明的方法适用于单反应，也适用于高通量和多重系统，包括基于阵列的技术。本发明的一个实施方案包括监测羊搔痒病基因多态性检测反应的功效。

Description

监测引物延伸和多态性检测反应的方法和组合物

发明背景

过去的二十年生物技术领域的广泛发展产生了新的和有前途的用于鉴定和研究所有物种的基因组特性的方法。特别地，核酸合成和测序中的进展导致基因组科学的发展。高通量测序技术实现了重要的里程碑，例如包括人类基因组的多种基因组的作图。由于能够快速测序大量DNA，大规模分析基因组特性已经成为可能。目前，技术可以鉴定和定性与基因型个体或种群变异相关的特征，其可被应用在如鉴别一个个体对某种疾病的易感性，鉴别基因或基因组中感兴趣的特性，和鉴别引起或促进疾病状态的遗传特性。定性个体和种群的基因组变异的最有前途的方法是分析和定性遗传多态性。

多态性涉及例如，不同物种(species)之间，或一个物种的成员之间，一个物种中的种群或亚群之间，或一个物种中的个体之间的基因组变异。这样的变异被表现为所研究的基因组内特定基因座的核苷酸序列的不同。例如，这些不同包括基因组内核苷酸或核苷酸组的缺失、添加或插入、重排、或取代。

多态性的一个重要类型是单核苷酸多态性(SNP)。单核苷酸多态性出现频率大约是1/300到1/1000碱基对，其中DNA序列中的一个单核苷酸碱基在个体中是变化的。SNP可出现在基因编码区域内部和外部。据认为许多疾病，例如包括许多癌症、高血压、心脏病和糖尿病都是人类种群的亚群(subset)中具有SNP或SNP集合的突变所致。例如当前基因组学的一个焦点是鉴定和定性SNP和SNP组和它们与医学和/或药物遗传学相关的表型特征的关联。

已经发展了多种确定或评价大量基因组多态性的方法。虽然这些方法适用于许多类型的基因组多态性，但它们特别适用于确定或评价SNP。

一个优选的多态性检测方法是使用酶辅助引物延伸。SNP-IT^TM(由Goelet，P.et al.WO92/15712及U.S.Patent Nos.5,888,819及6,004,744揭示，这些文献每一个都以其全文并入参考)是确定在靶核酸序列中预先确定的多态性位点的核苷酸特性的优选方法。因此，这个方法特别适用于SNP评价(SNP scoring)，虽然它也通常应用于鉴定多种多态性。SNP-IT^TM是一个多态性位点查询方法，其中在靶核酸序列内多态性位点周围的核苷酸序列信息用于设计与紧邻靶多核苷酸、但是不包括靶多核苷酸的多态性位点内的可变核苷酸的区域互补的引物。通常，在存在一或多种链终止核苷三磷酸前体(或适当的类似物)时使用聚合酶，通过一个单标记的终止子核苷酸如双脱氧核苷酸延伸引物。从而产生一个与SNP-IT^TM引物共价附着的可检测信号或部分。

在SNP-IT^TM的一些实施方案中，在延伸反应前寡核苷酸引物结合到固体支持物(solid support)上。在其它的实施方案中，在溶液中进行延伸反应，延伸产物随后结合到固体支持物上。在SNP-IT^TM的另一个实施方案中，引物被可检测地标记并且延伸的终止子核苷酸被修饰以便能够使延伸的引物产物结合到固体支持物上。

连接酶/聚合酶介导的遗传比特分析(genetic bit analysis)(U.S.PatentNos.5,679,524和5,952,174，二者并入参考)是另一种用于确定在多态性位点的核苷酸特性的适当的聚合酶介导的引物延伸方法实例。连接酶/聚合酶SNP-IT^TM使用两个引物。通常，一个引物被可检测地标记，而设计另一个引物结合到固体支持物上。连接酶/聚合酶SNP-IT^TM的另外一个实施方案中，延伸的核苷酸被可检测地标记。设计连接酶/聚合酶SNP-IT^TM的引物与同一条链上的一个多态性位点每一侧杂交，以便有一个包括多态性位点的缺口。只有在一个成功的延伸反应之后有一个成功的连接反应，才能产生一个可检测信号。这个方法通过仅使用杂交或引物延伸提供了产生具有相当低背景的信号的优势。

确定靶多核苷酸内预先确定的多态性位点的核苷酸特性的另一个方法由Sderlund et al.，U.S.Patent No.6,013,431(以其全文并入参考)描述，在这个方法中，使用靶核酸序列的多态性位点周围的核苷酸序列信息用于设计一个引物，该引物与靶的多态性位点侧翼的一个不包括可变核苷酸的区域互补。这个方法的一些实施方案中，分离后，通过任何适当的手段扩增靶多核苷酸，然后与查询引物(interrogating primer)杂交。常常在存在至少一种标记脱氧核苷酸和一或多种链终止核苷三磷酸前体(或适当的类似物)的混合物时，使用聚合酶延伸引物。标记脱氧核苷酸掺入引物产生一个可检测信号。

由于许多大规模的研究使用SNP信息，SNP检测必须是快速的，高通量的和可靠的。使用基于SNP的应用分析多态性检测或鉴别的结果的可靠性解释是重要的考虑，特别是当使用多重和高通量方案时。引物延伸产物的大小分析是一种解释结果的方法。

标记引物延伸产物的大小分析，特别是在多重方案中可能是有问题的。大小分析通常依赖于检测荧光标记的引物延伸产物，其用不同的荧光标记四种核苷酸A，T，G和C的每一种。还使用第5种荧光染料作为指定未知检测产物大小的标准分子量内标(internal lane size standard)。但是，在同一有限范围的可见光谱内使用5种染料增加了光谱重叠的可能性。此外，当一种染料以高浓度存在时可导致检测仪饱和以及强条带下出现不适当标记的片段。一个测定大小的系统(sizing system)使用第五种染料标准分子量内标，引物延伸完成之后加入到检测引物延伸产物，不能提供最初的产生引物延伸反应中使用的扩增子的聚合酶链反应是否成功的指示。就分析时存在的检测产物的丰度而言，使用第五种染料标记的系统也不能用于评估检测引物延伸分析在这方面的成功。

此外，目前可获得的大小标准含有相对较少的标记的分子，产生群体稀疏(sparsely populated)标准曲线。在不同的分析中，这对一定的未知物种大小的计算可能产生一个无法接受的标准差。另外，需要对扩增产物加入一个外部标准使所述方法增加了一个额外的步骤，使所述分析面临增加污染风险，或成为污染源。

因此，多态性检测和鉴别领域需要分别或者同时提供确认扩增、提供精确检测和鉴别多态性、提供反应产物丰度分析的系统。还需要更精确的测定大小的手段，其使用与未知物非常接近的已知大小的标准。

发明简述

在一个实施方案中，本发明包括鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基的方法，包括：提供具有一变异核苷酸碱基和一不变(invariant)核苷酸碱基的靶核酸序列，提供能够与靶核酸序列不变核苷酸碱基紧邻处(immediately adiacent)杂交的对照引物，提供能够与靶核酸序列变异核苷酸碱基紧邻处杂交的检测引物；使对照引物和检测引物与靶核酸序列杂交；在聚合剂存在及适于引物延伸的条件下，使对照引物和检测引物延伸一或多个核苷酸碱基；从检测引物中分离对照引物；及通过检测任何延伸的对照引物和检测引物并从延伸的对照引物中分离延伸的检测引物以确定已经产生引物延伸而鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基，因此鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基。

在另外一个实施方案中，本发明包括监测引物延伸反应或产生靶核酸的反应的方法，包括：提供具有一变异和一不变核苷酸碱基的靶核酸序列，提供能够与靶核酸序列不变核苷酸碱基紧邻处杂交的对照引物，提供能够与靶核苷酸序列变异核苷酸碱基紧邻处杂交的检测引物；使对照引物和检测引物与靶核酸序列杂交；在聚合剂存在和适于引物延伸的条件下，使对照引物和检测引物延伸一或多个核苷酸碱基；分离对照引物和检测引物；及通过检测任何延伸的对照引物和检测引物并从延伸的对照引物中分离延伸的检测引物以确定已经产生引物延伸来鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基，确定加入到检测引物和对照引物中的核苷酸特性，因此鉴别监测引物延伸反应。

在另一个实施方案中，本发明包括鉴别引物延伸反应产物的方法，包括：提供两或多个对照引物，一或多个靶核酸序列和一或多个检测引物，其中检测引物能够与靶核酸序列上多态性位点紧邻的不变核苷酸序列或其互补序列杂交，且其中一和多个对照引物都与一或多个靶核酸序列上的不变序列杂交，所述不变序列与一或多个检测引物所杂交的不变序列不同；使一或多个对照引物和一或多个检测引物与一或多个靶核酸序列杂交；在一或多个标记的核苷酸碱基存在下，在聚合剂存在下，在充分允许引物延伸发生的条件下，延伸所述一或多个对照引物和一或多个检测引物；从所述一或多个检测引物中分离对照引物；及从所述一或多个对照引物中通过分离一或多个检测引物来检测一或多个检测引物，因此鉴别引物延伸反应的产物。

在另外一个实施方案中，本发明包括监测引物延伸反应的方法，包括：在聚合剂存在和适于扩增的条件下，从感兴趣的核酸分子中扩增靶核酸序列，其中使用一对能够与感兴趣的核酸分子的不变区域杂交的扩增引物，且其中这对扩增引物5’端带有包含不变碱基的不变标记序列从而包含不变碱基的不变标记序列掺入包含靶核酸的扩增核酸分子中，其中不变标记序列不能与感兴趣的核酸分子杂交；提供能够与扩增的靶核酸中不变标记序列的不变碱基紧邻处杂交的对照引物，并提供能够与扩增的靶核酸中变异核苷酸碱基紧邻处杂交的检测引物；使对照引物和检测引物与扩增的靶核酸序列杂交；在聚合剂存在和允许引物延伸发生的适当条件下，使对照引物和检测引物延伸一或多个核苷酸碱基；从检测引物中分离对照引物；及鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基，其是通过检测任何延伸的对照和检测引物并从延伸的对照引物中分离延伸的检测引物以确定引物延伸已经产生，由此鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基。

为更好的理解本发明以及其它的和更多的优点和实施方案，参照以下描述和实施方案，本发明的保护范围由权利要求书限定。

附图简述

选择本发明的优选实施方案用于阐述和描述目的，但不是以任何方式试图限制本发明的范围。本发明某些方面的优选实施方案在以下附图中示出，其中：

图1说明本发明的实施方案，其中使用4个对照引物，这些引物与靶核酸上同一不变序列杂交。

图2说明本发明的实施方案，其中扩增靶核酸以便将序列导入能与对照引物杂交的扩增子中。

图3说明本发明的实施方案，其中用设计来将外源序列掺入扩增子中的扩增引物共扩增4个感兴趣的不同区域，其中外源序列作为对照引物的靶。

图4说明本发明的实施方案，其中对照引物的靶不是含有感兴趣的变异碱基的扩增子的部分，而是在引物延伸前PCR之后加入分析中的核酸分子。

图5说明本发明的实施方案，其中对照引物也用作flip-back引物，所以由于flip-back引发所致的自身延伸程度可以与靶核酸扩增子延伸的程度进行比较。

图6说明本发明的实施方案，其中示出flip-back引物的某些特性和行为。

图7说明本发明最优选实施方案的特征。

最佳实施方式

本发明提供了监测引物延伸反应和靶核酸扩增反应的方法和组合物。而且，本发明提供了监测多态性的高通量多重检测的方法和组合物。

为清楚起见，附图进行了简化。例如，如果变异位置是纯合的，与变异碱基邻近的引物延伸产物显示为单峰。可以预期如果变异位置是杂合的，能够产生非常邻近的关联双峰，两个延伸产物具有非常微小不同的质量：电荷比率，这是由于掺入不同的末端碱基，以及可能由于粘附到末端碱基的不同标记所致。

图1说明本发明一个实施方案的某些特征。例如，通过聚合酶链反应从样品扩增靶核酸。如果能够获得丰富的靶核酸，扩增可能不是必需的。扩增之后，制备反应混合物进行引物延伸。本领域已知的许多方法可完成这个步骤，例如使用磷酸酶处理反应混合物，其将失活任何存在于反应混合物中的脱氧核苷酸；添加核酸酶去除单链引物，然后分离或失活磷酸酶和核酸酶，以及其它本领域技术人员已知的方法。然后加入检测引物和对照引物，荧光标记的终止子，开始进行引物延伸。图1中使用4个对照引物，但是可以使用更多或更少的引物。图1中，所有4个对照引物与靶核酸相同的不变区域杂交，并通过相同的不变残基“C”延伸。图1中，引物仅仅由于其5’末端的标记序列的大小(和可能的碱基组成)不同而不同，其中设计标记序列以允许彼此进行大小分离和从检测引物中进行大小分离。5’末端的修饰可以包括与靶序列退火的额外碱基，当然本领域技术人员能理解相比于具有更少杂交碱基的引物，这种修饰将改变这个引物的杂交特性。可以利用这样的修饰影响一个引物与另一个引物相比的结合亲和力和因此的延伸。在另一个实施方案中，这些5’延伸也能够使延伸的对照引物(或检测引物)与具有特异标记互补序列的固定化DNA阵列上的特异地理位置(geographic locations)杂交。在图1中，包含标记序列的核苷酸的数量和性质上存在差别。可以使用许多其它种类的标记序列进行这样的分离。在此，选择示出的标记以基于质量：电荷比分离引物。图1示出一个单检测引物，当然反应能够在多重系统中进行。图1示出单检测引物与SNP位点紧邻处杂交，但是变异可以是本领域已知的任何类型的变异，如缺失、添加、插入等。一旦引物延伸反应已经发生，使用例如具有荧光检测仪的毛细管凝胶电泳装置分析反应产物。该装置基于质量：电荷比分离引物，并通过检查对照引物的分布确定检测引物的性质。图1中，对照引物可以通过荧光特性与检测引物区分，通过标记序列不同所致的质量：电荷比率不同而彼此区分。在这个实例中未示出丰度分析、大小算法(sizing algorithms)和flip-back引物的使用。

图2说明本发明另外一个实施方案的某些特性。在图2中，使用特异性扩增引物扩增包含一个可变残基的靶核酸。这些扩增引物含有在选择的条件下不与样品或靶核酸杂交的序列，但是含有在靶成功的PCR扩增反应中将被掺入到含有靶核酸的扩增子中的外源序列。扩增之后，制备反应混合物用于引物延伸。如上述，本领域已知许多方法完成这个步骤。然后加入检测和对照引物，荧光标记的终止子，并开始进行引物延伸。在图2中使用了4个对照引物，但是也可以使用更多或更少的引物。在图2中，4个对照引物的靶向是使两个与导入到扩增子的一个末端的同一外源序列杂交，而两个与导入到另一端的同一外源序列杂交。这些对照引物对在其核心序列和任何5’标记延伸的长度上可能不同。核心序列和标记序列上的不同可用于最大化任何质量：电荷比率的差异，同时在所给定的分析条件下维持类似的杂交特性。如本例所示，尽管靶不同，所有的对照引物的靶向是使得在成功的延伸中掺入相同的不变碱基。在此，通过相同的不变残基″G″延伸对照引物，也可以使用其它的碱基。在图2中，对照引物对在核心序列和其5’末端的标记序列的大小上不同，其中标记序列的序列差异和长度(和/或碱基组成)的组合设计用于互相分离和从检测引物中分离。在图2中，对照序列对在序列和包含标记序列的核苷酸的数量和性质上存在不同，当然也可以标记序列单独用于改变对照引物的特性，其中对照引物的核心序列是相同的。可以使用许多其它类型的标记序列进行这样的分离。在此，选择所示的标记以基于质量：电荷比率分离引物。图2示出一个单检测引物，当然反应也可在多重系统中进行。图2示出单检测引物与SNP位点紧邻处杂交，但是变异可以是本领域内已知任何类型的变异，例如缺失、添加、插入等。一旦引物延伸反应已经发生，使用例如具有荧光检测仪的毛细管凝胶电泳装置分析反应产物。这种装置基于质量：电荷比率分离引物，并通过检查对照引物的分布确定检测引物的性质。在图2中，对照引物可以通过荧光特性与检测引物区分，并通过由于标记序列不同所致的质量：电荷比率不同而彼此区分。在这个实例中未示出丰度分析、大小算法和flip-back引物的使用。

根据图2的说明，可以知道与通过原始扩增引物导入的外源DNA的2个独特区域杂交的2对对照引物可以多种方式使用。对照引物的核心序列可以被设计为非常不同以便于例如当使用毛细管凝胶电泳分析时使这些引物的延伸产物的分离最大化。如何有利地利用对照引物的不同的一个实例是操纵包含它们的序列的核苷酸的性质和序列长度。例如，如果第一对对照引物富含GC，则它们可呈现70℃的解链温度，而长度只有20和22个碱基对。然而例如，第二对对照引物可以富含AT，为了达到与第一对对照引物相同的退火温度，它们长度应被设计为35到37个碱基对。这些差异产生了一个非常大的靶区域使得检测引物能够位于两对对照引物之间。

阅读并理解本说明后，本领域技术人员无需过多实验即可实现本发明教导的使用对照引物的大量实施方案。例如，这样的实施方案包括分析来自同一个靶扩增子中一个变异核苷酸和一个不变对照核苷酸的单(singleplex)反应；包括在一起扩增和分析的多个单反应的多重反应，其中每个对照产物对设备分析每个检测引物都有贡献；包含来自相同靶扩增子的多个检测和对照引物、多个flip-back引物等的多重反应等。而且，本领域技术人员知道将外源序列导入含有靶核酸的扩增子在对照引物的设计上提供了很大的空间。本发明的这一实施方案提供了特异性匹配对照引物与检测引物性质(例如解链温度，聚合剂活性等)的能力，在某种意义上，这使得通过例如丰度分析对引物延伸反应的监测可有高度定量置信度(quantitative confidence)。同样地，使用一或多个flip-back引物，或使用一或多个对照引物作为flip-back引物，提供了具有高度定量置信度度的监测扩增反应的能力。在阅读和理解本说明后，本领域技术人员将明白这些以及其它优势。

图3表示本发明另一个实施方案的某些特性。在图3中，使用为掺入至少一个外源DNA序列到扩增子而构建的扩增引物，对感兴趣的4个独特的区域共扩增。这样，每个扩增的感兴趣的区域将产生一个可以用至少一个产生已知性质的延伸产物的对照引物探查的对照靶序列，探查与同一多重系统中的其它对照反应相同或不同的掺入的碱基，以及在特异的反应条件下对照反应的预期反应动力学。

本领域技术人员可以知道，通过明智地选择附着于起始扩增引物的外源5’序列构建大的多重扩增将产生对照产物，其能够通过例如利用单个对照产物作为大小阶梯(sizing ladder)的成分来帮助阐明单个检测引物反应以及全面阐明多重分析。

已知通过分析一个特异性对照引物返回的信号水平可以推论多重系统内特定扩增子的扩增的相对成功性。

在将要被多次分析的同一多态性的分析中，有可能平衡非常接近的对照引物和检测引物的特性以便于从对照反应的信号强度和检测反应的信号强度之间得出可信度增强的相关性。当没有这些广泛的发展存在时，本领域技术人员知道引物延伸反应的信号强度可以是至少以下条件组合的反映：分析条件，靶(扩增子)丰度，延伸引物(对照和检测)丰度，掺入的碱基和掺入碱基周围的序列。

图4表示本发明一个实施方案的某些特性，其中对照引物的靶不是含有感兴趣的可变碱基的扩增子的一部分，而是在引物延伸之前、PCR之后加入分析中的一种序列。在所给定的分析条件下，这个系统可以产生密切反映对照靶序列和对照引物浓度水平的强度信号。这样一个系统可用于产生完全通用的对照，其至少可被用作为大小阶梯以分析存在于分析中的延伸的检测引物。本领域技术人员知道使用未知的电泳迁移势、使用新的检测引物具有优势。已知短的寡核苷酸在电泳条件下迁移所至的位置不仅由质量：电荷决定，还由包含寡核苷酸的DNA的碱基序列决定。涵盖相对较大的大小范围的大小阶梯可以最大化电势以能够例如通过Local Southern算法区分新的延伸产物的大小。

图4示出从单一靶DNA序列产生的所有对照延伸产物，但是也可以同样使用多个外源序列，其中每一个由一个对照引物靶定。

图5说明延伸引物的某些特性，其可以是对照引物或检测引物。在示出的实例中，对照引物靶定成功的PCR扩增生成的扩增子的一部分。如果PCR反应不成功，由于它产生有限数量的靶扩增子，对照引物可能具有自身杂交的能力，与预期的对照引物和它的完全互补序列杂交相比具有更低程度的亲和力。本领域技术人员将理解，只要有足够的碱基配对维持DNA的双链性质使DNA聚合酶结合3’末端并通过添加单个核苷酸延伸3’末端，一个引物在其3’末端自身退火这个倾向将导致引物的引物延伸维持在一定程度。

显然，加到这样一个flip-back引物的3’末端的碱基将依赖于邻近引物3’末端的碱基，并且，这种所加入的碱基可以与作为优选情况的加入的使flip-back引物与高丰度靶序列退火的碱基相同或不同。

当自身延伸掺入与加入的正常碱基不同的碱基时，与高丰度的靶序列的延伸相比的自身延伸程度是可计算的。例如，这可以通过比较每个掺入对照/flip-back引物的核苷酸的量来实现，如通过测定在电泳分离时产生的双峰的每一个峰下面积，或两个核苷酸的每一个的标记捕获时产生的信号强度。

图6表示一个flip-back引物，其用于分型分析4个绵羊SNP的多重分析中(见图7和如下实例)。设计生成36和38bp对照产物的引物具有部分自身互补性并具有在没有完全同源的模板用于退火时(例如，生成扩增子的PCR反应失败的情况下)维持自身延伸的能力。

图7表示本发明最优选的实施方案，其允许分析绵羊PrP基因序列内的4个SNP位点。通过PCR扩增从绵羊血中制备的全基因组DNA生成一个310bp扩增子，并且在示出的大约位置和方向内，对照和检测引物与这个扩增子杂交。进行引物延伸反应以加入与每个杂交的对照和检测引物3’末端互补的碱基。当在毛细管电泳下分离时，荧光标记的延伸引物分离形成一个峰型，其基于碱基大小和/或颜色而彼此相区分。用于这个实例的峰型表明出现在136F的SNP是一个纯合C，在154R的也是一个纯合C，但是171-1F和171-2R的SNP位点分别是杂合GA和杂合CA。可知无论136F，154R，171-1F和171-2R的SNP的排列如何，对照峰是不变的并以这样形式出现。更进一步可以理解，通过在此示出的确保对照产物迁移到检测产物附近将可以在确定SNP位点延伸产物的大小时获得高精确度。通过添加非互补碱基(例如，聚T尾)到对照或检测引物的5’末端，本领域技术人员将知道在如特定分析所要求的电泳条件下，可以精细地改变这些引物的延伸产物迁移的位置。

本发明包括获得包含一或多个多态性的靶核酸序列的方法。考虑到这个核酸序列与一个寡核苷酸或多核苷酸分子杂交的能力，靶核酸序列优选是生物学活性的。靶核酸序列可以是DNA或RNA，单链或双链或DNA/RNA杂合双螺旋。靶核酸序列可以是多核苷酸或寡核苷酸。为了便于检测，优选靶核酸序列在长度上介于40到大约2000个核苷酸之间。在某些情况下，例如在分析具有已知的假基因的核酸区域内的多态性时，需要直至几十kb的特别长的靶核酸片段和长扩增子以能够选择特异于基因而不是假基因的扩增引物。如果是有益的，则可采用本领域已知的方法，例如机械或水力切割方法如超声波，或酶方法如限制性酶或核酸酶，将大的靶核酸序列切割或片段化成较短的片段。然后，这些较短的片段被分级分离以便于从任何在分析多态性时可能参与非所需副反应的冗余序列中分离出具有感兴趣的多态性位点的较短序列。回收这样分级分离的DNA的方法是本领域熟知的，包括凝胶电泳、HPLC和利用基于与一个捕获序列杂交的多种序列的回收技术。

靶核酸可以从一个生物学样品分离或衍生。术语“分离”在此指基本上不含其它物质的状态，所述其它物质如非核蛋白、脂质、糖类或其它物质如细胞碎片或靶核酸所可能结合的培养基。典型地，术语“分离”不是指完全不含这些物质。通常，术语“分离”也不是指如水、缓冲液或其盐之类的稳定剂不存在，除非它们存在的量基本上干扰本发明的方法。通常，术语“样品”在此指含有核酸，或是DNA或是RNA或是DNA/RNA杂合体的任何物质。样品可以是任何来源的，包括植物和包括人类在内的动物。通常，这样的物质是血样品、组织样品、直接来自个体或培养繁殖的细胞、植物、酵母、真菌、支原体、病毒、古细菌、组织碎片、或口腔拭样的形式，样品可以是新鲜的、固定的、冷冻的或包埋于石蜡或其它固定剂中。适宜样品的一个实例是收集在含有抗凝剂如EDTA钾的收集设备中的静脉血。例如，这样的样品用于碱性裂解法制备模板。其它样品类型也适用于分析，但是许多可能需要不同或更深入的模板制备，例如通过酚/氯仿抽提，或当存在高盐浓度时，在一个硅矩阵上捕获DNA。

优选地，靶核酸来源于不同种群的基因组DNA以便进行遗传学图谱或单元型分析或其它研究。这样的基因组DNA含有多态性位点，并用于通过扩增方法，如聚合酶链反应(PCR)扩增包围感兴趣的多态性位点的区域。典型地，PCR反应是多重的，在同样的反应容器中，2个或多个或达到100或更多个多态性序列被同时扩增。优选地，在与扩增反应相同的反应中进行引物延伸，且优选是依次地进行。

靶核酸可以是单链和来源于双链DNA、RNA或其它核酸分子的上链或下链。靶核酸的上链包括核酸的正链或有义链。靶核酸的下链是指负链或反义链，其与靶核酸的上链互补。因此，描述时可以指任一链并且包括多态性位点，而且引物可以设计与任一条或两条链杂交。靶核酸不局限于编码区域内的序列，也可以包括含有至少一个多态性的基因组或基因组部分的任何区域。术语基因组包括复杂基因组(complexgenome)，如在包括人类在内的动物和植物中发现的，以及非常简单和少量来源的核酸，如病毒、类病毒和包含核酸的任何其它生物学材料的核酸。适于分析的核酸序列的一个实例是绵羊PrP基因编码序列内的扩增子，其编码朊蛋白。这个蛋白质具有已知的同种型，其可以通过DNA序列的改变而分析。包含这些多态性位点的PCR产物是适于分析的模板。

靶核酸序列或其片段含有多态性位点，或包括位于所述位点远端或近端的位点和序列。这些多态性位点或突变可以是缺失、插入、重排、重复序列、碱基修饰或核酸序列内特定位点的单或多碱基改变的形式。这个改变的序列以及更优势的或正常的序列可共存于一个种群中。在一些情况中，这些改变没有赋予物种或物种内的个体优势或劣势，序列的多个等位基因可处于稳定或准稳定平衡。但是在一些情况中，这些序列改变将赋予物种生存或进化优势，从而最终随着时间的流逝，改变的等位基因将掺入那个物种的许多或大多数成员的基因组中。在其它情况中，改变的序列导致物种缺陷，其中突变导致个体患遗传疾病或缺陷或者使个体倾向于患遗传疾病或缺陷。在此，术语“突变”或“多态性位点”指物种的一些成员之间，一个物种的种群之间或物种之间的核酸序列的变异。这样的突变或多态性包括，但是不局限于，单核苷酸多态性(SNP)，一或多个碱基缺失，或一或多个碱基插入。

多态性在个体内可以是杂合的或纯合的。纯合个体在同源染色体的一或多个相应基因座上具有同样的等位基因。杂合个体在同源染色体的一或多个相应基因座上具有不同的等位基因。在此，等位基因包括基因或核酸序列的另一可选择形式，其位于基因编码区域内部或者外部，包括内含子、外显子和非转录或非翻译区域内。通常，一个特异基因的等位基因占据同源染色体的相同位置。因此一个多态性被描述为“等位基因的”，因为由于多态性的存在，一个物种的一些成员携带一个序列的基因(例如，原始或野生型“等位基因”)，但是其它成员可具有改变的序列(例如，变种或突变“等位基因”)。在最简单的情况中，可以只存在序列的一个突变变体，该多态性被称为双等位基因的。例如，如果一个基因座上的2个等位基因是不能区别的(如A/A)，则在这个基因座上个体被认为是纯合的。如果一个基因座的2个等位基因是可区别的(如A/G)，则在这个基因座上个体被认为是杂合的。大多数已知的单核苷酸多态性是双等位基因的，其中在特定基因座上有2个可选择的碱基。术语“个体”包括任何物种的个体，包括但不局限于人类。

本发明利用至少一个检测引物，至少一个对照引物，以及任选地，一个可作为对照引物的flip-back对照引物。本发明也可利用2个或多个扩增引物。为了将寡核苷酸作为一个引物，典型地序列需要充分互补以便在采用的条件下能够形成一个双链结构。建立这样条件典型地包括选择溶剂和盐浓度，温育温度，温育时间，分析试剂和本领域技术人员已知的稳定因子。术语“引物”或“引物寡核苷酸”指在此定义的寡核苷酸，其在诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下使用时，例如在DNA复制反应如PCR反应中使用时，能够作为合成起始点。与非引物寡核苷酸一样，引物寡核苷酸可以依据本领域已知的任何技术进行标记，所述技术如放射性原子、荧光标记、酶标记、蛋白质、半抗原、抗体、序列标记等等。

引物可以是能够在延伸反应中在3’末端延伸的多核苷酸或寡核苷酸。在此，术语“多核苷酸”包括任何数量的核苷酸聚合物。术语“寡核苷酸”包括任何数目核苷酸的多核苷酸分子，优选少于大约200个核苷酸的多核苷酸分子。更优选的，寡核苷酸的长度在5到100个核苷酸之间。最优选的，寡核苷酸长度在15到60个核苷酸之间。但是，特定寡核苷酸或多核苷酸的精确长度将依赖于许多因素，其依赖于其最终的功能或使用。影响寡核苷酸长度的一些因素是，例如寡核苷酸的序列，分析中使用的盐浓度和温度等变量的分析条件，以及是否寡核苷酸在5’末端被修饰以包括为了修饰寡核苷酸的质量：电荷比率的额外碱基，和/或提供一个标记捕获序列，其可用于地理分离寡核苷酸到DNA芯片上特异的杂交位置。短引物需要较低温度以与模板形成足够稳定的杂交复合体。本发明的引物应与靶核酸上链或下链互补。优选地，起始扩增引物在它们的3’末端不应自身互补，以避免引物折叠导致自身引导(self-priming)的结构和分析噪干扰信号。优选引物在3’末端缺乏自身互补的一个例外是在本发明的一个实施方案中，当使用一个延伸引物为flip-back引物时，优选某些程度的自身互补。当使用一个引物为flip-back引物时，引物应具有足够的自身互补性以便在没有靶核苷酸，或没有足够量的与自身引导事件竞争的靶核酸时，能够自身引导。本发明的优选引物包括从大约8到大约40个核苷酸长度的寡核苷酸，到直至几千个核苷酸长度的更长的多核苷酸。优选地，仅对照引物能够flip-back。在扩增和检测引物中优选没有flip-back能力。

在现有技术中在非靶核酸的背景下，大约10个核苷酸的引物是可用于与互补的靶核酸序列选择性杂交的最短序列。最优选地，使用超过至少大约20到大约35个核苷酸的完整互补序列以保证充分水平的杂交特异性，当然靶DNA分子序列的长度可能有相当大的变化。本发明的引物必须能够与靶核酸序列特异性杂交，例如一或多个上游引物与一或多个靶核酸上链或一或多个核酸下链杂交。在此，如果2个分子在足以促进杂交的条件下能够形成反平行、双链核酸结构或杂合体，则这2个核酸序列被认为能够相互特异性杂交，但是在相同的条件下，与一个非靶核酸序列温育时它们必须基本上互相不能形成一个双链结构或杂合体。但是，依据本发明的其它实施方案，当使用一个引物作为flip-back引物时，当没有足够的靶核酸时，引物应能够自身引导。为此，当一个引物被用作flip-back引物时，当没有足够的靶核酸时，引物必须拥有自身引导的能力。可设计Flip-back引物以便于当由于自身引导的延伸发生时，与靶核酸引导的延伸比较，这些引物掺入不同的核苷酸。

优选地，当延伸反应中没有靶DNA时，flip-back引物将在某些程度上自身延伸，自身延伸的程度将反映自身互补的程度以及延伸分析中的分析条件。当完全没有靶扩增子时，通常由于PCR完全失败，flip-back引物将是最有用的。优选地，在通过2个延伸产物种类(species)的存在，flip-back引物的自身延伸和flip-back引物的所需延伸都表现出来的情况下，可以检测非常低水平的靶扩增子，只要flip-back延伸可掺入与在正确的对照引物延伸过程中掺入的碱基不同的碱基。因此，甚至当一个对照引物也作为一个flip-back引物时，延伸产物的性质将会揭示引物是在扩增子上延伸还是flip-back自身引导的结果。

如果一个核酸分子呈现完全的序列互补性，则称其是另一个核酸分子或是其自身的“互补物”。在此，当每个分子的每个核苷酸都能够与另一个分子的核苷酸形成碱基对时，这些分子被称是呈现“完全互补”。“基本上互补”指在至少常规的低严格条件下能够相互杂交或与自身杂交并具有足够的稳定性以允许退火的能力。同样地，如果在常规的高严格条件下，分子可相互杂交并具有足够稳定性以允许它们保持相互退火，则它们被称为是“互补的”。常规的严格条件例如Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)(在此并入参考)描述。不是完全互补因而是可能的，只要这没有完全排除分子形成一个双链结构或杂合体的能力。当存在不足量的靶核酸时，用作flip-back引物的引物必须呈现足够的自身互补性以自身引导，但是优选不呈现完全的自身互补性。优选地，flip-back引物在flip-back引物的3’末端有2到4个碱基对的互补。这个2到4个碱基对的互补不需要以单个不间断的自身互补序列段出现。最优选地，3’末端有2个碱基能够在引物上自身杂交，随后是2个不能够在引物上自身杂交的碱基对，随后是2个能够在引物上自身杂交的碱基对。产生一个flip-back引物所需的实际自身互补性是高度序列依赖性的，G-C对比A-T对更稳定，因此G-C更可能以比富含A-T序列段更少的匹配数来支持自身互补性。甚至当邻近的碱基形成一个错配时，在3’末端的单G-C匹配也可足够地维持flip-back自身引导的延伸。

本发明的引物可在5’末端标记。标记包括任何标记，如放射性标记，荧光标记，酶标记，蛋白质，半抗原，抗体，序列标记等。优选地，标记不干扰本发明的方法。典型地，标记可附着到引物的5’末端，其其余引物序列与靶核酸互补。一个优选的标记包括独特标记或标记每种引物，所述引物具有与结合到固体支持物上的序列互补的独特序列，其中这样的固体支持物可包括阵列，包括可寻址阵列。因此，在适当的杂交条件下，当引物暴露于固体支持物时，标记与结合到固体支持物的互补序列杂交。这样，通过阵列上的几何位置或通过其它手段用探针鉴别与标记相关的点可以确定引物特性。与5’标记互补的序列可以在例如可寻址阵列上的离散位置上与固体支持物结合。

在本发明的一个优选实施方案中，一或多个对照引物在其5’末端带有能够延伸对照引物长度的序列标记，由此它们的质量：电荷比率足够不同以允许使用本领域已知的方法例如毛细管凝胶电泳基于质量：电荷比率进行分离。在最优选的实施方案中，使用4个对照引物，其可以通过利用它们的质量：电荷比率不同相互分离，以及从一或多个检测引物中分离。最优选的实施方案也可以包括通过使用sizing算法鉴别一或多个检测引物，例如Southern sizing算法，其中对照引物设计成在毛细管电泳过程中成对迁移：一对对照引物相互迁移得很近但是比一或多个检测引物迁移得快，第二对对照引物相互迁移得很近但是比一或多个检测引物迁移得慢。

为了使用，标记可以是非互补碱基，或是可散布到引物中的较长序列，只要引物序列与随后杂交的靶链序列充分地互补即可。但是，为了检测，在最优选的实施方案中，检测和对照引物应与靶核酸不变区域精确互补以获得最佳结果，而没有对照引物被用作flip-back引物。因此，在特定的使用条件下，本发明中使用的引物通常必须在序列上互补并能够与靶核苷酸序列形成一双链结构或杂交体。

优选的精确互补的一个例外是使用引物作为flip-back引物。在本发明的一些实施方案中，对照引物也可被用作flip-back引物。当使用一个引物作为flip-back引物时，在靶核酸量不足时，引物必须呈现足够的自身互补以自身引导，但是优选不呈现完全的自身互补。

在本发明一个优选的实施方案中，有可能分析对照延伸引物延伸的水平，并将这一水平直接与检测引物延伸的水平相关联(只要在两位点掺入同样的碱基)。本领域技术人员知道，在特异的分析条件下，根据链3’末端存在的碱基，DNA聚合酶具有不同的倾向将特异碱基添加到延伸链上。这从DNA测序中已熟知，在生成链的3’末端缺乏G掺入A的现象使得解释DNA测序结果变得复杂。这样的结果可预期链终止引物延伸反应，并且因此在相同或类似的分析条件下，3’末端匹配对照和检测引物序列可平衡每个引物的延伸水平。在对照和检测引物3’末端放置等价序列不应使3’末端区域在很多碱基都是相同的。优选地，至少一个碱基应是相同的，但是根据分析条件，限制序列相同性不超过大约3个碱基是有益的，因为随着序列相同性增加，引物与结合位点之间可能出现色度干扰，产生错误结果。

在本发明一个优选的实施方案中，对引物延伸反应产物进行分析以便确定标记的对照引物，标记的检测引物，以及在一些实施方案中，标记的flip-back引物的相对丰度。通过比较检测引物，对照引物和flip-back引物的信号强度，及比较引物的相对信号强度以确定发生的每个引物延伸反应的相对成功来进行丰度分析。这样，本领域技术人员通过检测标记引物的相对丰度可检测引物延伸反应，或扩增一引物延伸反应的组合反应。掺入flip-back引物的核苷酸或其类似物的性质在延伸的flip-back引物中反映出来，并将告知扩增反应的功效。自身引导的延伸产物与靶引导(target-primed)的延伸产物的比率将反映扩增的靶核酸的丰度。延伸的延伸引物与对照引物的相对丰度将告知变异核苷酸掺入检测引物的功效。这样，根据本发明的教导，本领域技术人员可知，在一个单反应中，可疑结果是否是由于亚适宜扩增、变异核酸的亚适宜延伸或所采用的反应参数所致。本发明的这个实施方案在多重和高通量方案中是有益的，其大大简化了这些反应的故障检查。

在本发明的一个优选的实施方案中，可设计扩增引物带有特异的、已知序列，其能或不能表现天然发现的序列。即使用完全人工合成的序列。在这个实施方案中，设计扩增引物与含有一或多个感兴趣的多态性的靶核酸序列互补。扩增引物包含一个与扩增的靶核酸不互补的5’标记。而5’标记由特异设计与包含在本发明的对照引物内的序列退火的序列组成。最优选地，在随后的引物延伸反应中，5’标记序列与使用的对照引物的序列完全互补。这样，扩增子，或扩增的靶核酸序列在包含一或多个多态性的靶核酸序列或扩增子的一端或两端带有扩增引物的5’标记序列。最优选地，成为部分扩增子的5’标记序列被最佳化以使它们呈现与通过检测引物检测的一或多个多态性紧邻处的不变区域相同或相似的物理特性。相同或相似的物理特征不是指序列相同性，而是指相同或相似的解链温度或使这些序列具有与检测引物所退火的序列在引物延伸反应中被延伸的能力大约相当(如通过引物延伸反应检测)的特征。因此，在本发明的一个实施方案中，构建扩增引物以导入例如标准非天然序列，其在引物延伸反应中的行为模拟与待通过检测引物检测的靶核酸的一或多个多态性紧邻的不变序列的行为。在最优选的实施方案中，用多个扩增引物扩增包含多个靶核酸的多重引物延伸反应，其中扩增引物对带有与在引物延伸反应中使用的对照引物匹配的标记，因此允许使用特异性对照引物监测包含特异多态性的靶核酸的扩增和检测。在最优选的实施方案中，对于每个被检测的多态性，使用一个独特的对照引物序列。进而，通过使用具有可鉴别的5’标记的对照引物检测和/或分离对照序列。因此，在一个使用多重反应的实施方案中，例如通过5’标记的特征、掺入对照引物的核苷酸的性质、和/或对照引物自身的特征鉴别和/或分离对照引物。

聚合剂可从多种生物体中分离或克隆，所述生物体包括病毒、细菌、古细菌、真菌、支原体、原核生物和真核生物。优选的聚合剂包括聚合酶。使用本发明的方法和设备进行单碱基延伸的优选聚合酶是呈现很少或没有核酸外切酶活性的聚合酶。更优选的是耐受并在超过生理温度具有活性的聚合酶，例如50℃到70℃或耐受至少90℃到大约95℃。优选的聚合酶包括来自水生栖热菌(T.aquaticus)(购自ABI，Foster City，CA)的Taq聚合酶，Sequenase和ThermoSequenase(购自U.S.Biochemical，Cleveland，OH)和Exo(-)聚合酶(购自New England Biolabs，Beverley，MA)。也可使用任何呈现热稳定性的聚合酶，例如，栖热菌属来源的聚合酶，包括水生栖热菌(Thermus aquaticus)，Thermus brocianus，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)和黄栖热菌(Thermus flavus)；火球菌(Pyrococcus)属，包括激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，火球菌GB-D(Pyrococcus sp.GB-D)和沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)，Thermococcuslitoralis和Thermogata maritime。生物活性的蛋白酶片段，重组聚合酶，遗传工程化的聚合酶和修饰的聚合酶都包括在聚合剂的定义中。可以理解不用过多的实验，本发明即可以使用多种来源的多种类型的聚合酶。

检测多态性位点的一个优选方法是使用酶辅助的引物延伸。SNP-IT^TM(由Goelet，P.et al.，和U.S.Pat.Nos.5,888,819和6,004,744揭示，每一个都以其全文并入参考)是一个用于确定靶核酸序列中预先确定的多态性位点的核苷酸性质的优选方法。因此，它非常适用于SNP评价(scoring)，当然通常它也适用于多种多态性的确定。SNP-IT^TM是一个多态性位点查询方法，其中在靶核酸序列内多态性位点周围的核苷酸序列信息用于设计紧邻、但是不包括靶多核苷酸的多态性位点内的可变核苷酸的区域互补的引物。靶多核苷酸从一个生物学样品分离并与查询引物(interrogating primer)杂交。分离后，通过任何适当的手段扩增靶多核苷酸，然后与查询引物杂交。通常，在存在一或多种链终止核苷三磷酸前体(或适当的类似物)时使用聚合酶，通过一个单标记的终止子核苷酸如双脱氧核苷酸延伸引物。从而产生一个与可检测信号。在此，紧邻多态性位点包括多态性位点的3’或5’方向的大约1到大约100个核苷酸，更优选大约1到大约25个核苷酸。最优选地，引物杂交在多态性位点5’方向的与多态性位点紧邻1个核苷酸的位置。

在SNP-IT^TM的一些实施方案中，在延伸反应前引物结合到固体支持物上。在其它的实施方案中，在溶液中(如在一个试管内或微孔内)进行延伸反应，延伸产物随后结合到固体支持物上。在SNP-IT^TM的另一个实施方案中，引物被可检测地标记并且延伸的终止子核苷酸被修饰以便能够使延伸的引物产物结合到固体支持物上。这例如包括引物被荧光标记，终止子核苷酸是生物素标记的终止子核苷酸，且固体支持物用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被或衍生。在这样的实施方案中，一个延伸的引物将能够与固体支持物结合并且非延伸的引物将不能够与支持物结合，因此依赖一个成功的延伸反应产生可检测的信号。

连接酶/聚合酶介导的遗传比特分析(genetic bit analysis)(U.S.PatentNos.5,679,524和5,952,174，二者并入参考)是另一种用于确定在多态性位点的核苷酸性质的适当的聚合酶介导的引物延伸方法实例。连接酶/聚合酶SNP-IT^TM使用两个引物。通常，一个引物被可检测地标记，而设计另一个引物结合到固体支持物上。连接酶/聚合酶SNP-IT^TM的另外一个实施方案中，延伸的核苷酸被可检测地标记。设计连接酶/聚合酶SNP-IT^TM的引物与一个多态性位点每一侧杂交，以便有一个包括多态性位点的缺口。只有在一个成功的延伸反应之后有一个成功的连接反应，才能产生一个可检测信号。这个方法通过仅使用杂交或引物延伸提供了产生具有相当低背景的信号的优势。

确定靶多核苷酸内预先确定的多态性位点的核苷酸特性的另一个方法由Sderlund et al.，U.S.Patent No.6,013,431(以其全文并入参考)描述，在这个方法中，使用靶核酸序列的多态性位点周围的核苷酸序列信息设计一个引物，该引物与靶的多态性位点5′侧翼的一个不包括可变核苷酸的区域互补。靶多核苷酸从生物学样品分离并且与一个查询引物杂交。这个方法的一些实施方案中，分离后，通过任何适当的手段扩增靶多核苷酸，然后与查询引物杂交。常常在存在至少一种标记脱氧核苷酸和一或多种链终止核苷三磷酸前体(或适当的类似物)的混合物时，使用聚合酶延伸引物。标记脱氧核苷酸掺入引物产生一个可检测信号。

本发明的引物延伸反应使用一或多个标记核苷酸混合物和聚合剂。在此使用的术语“核苷酸”或核酸指处于通过聚合剂能够被加入到引物中的任何磷酸化状态的核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，核苷酸无环衍生物，和其功能性等价物或衍生物。例如，在一个扩增方法或一个引物延伸方法中，核苷酸的功能性等价物可作为聚合酶底物。核苷酸的功能性等价物也可形成保留了与靶多核苷酸以序列特异性方式杂交的能力的多核苷酸。核苷酸例如包括链终止核苷酸，最优选的是双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，如ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP；但是，本领域技术人员已知的其它的终止子，例如无环核苷酸类似物，其它无环类似物和阿拉伯糖苷三磷酸也在本发明的范围内。优选ddNTP与常规的2’脱氧核苷三磷酸(dNTP)的不同在于它们在糖组分的3’位置没有羟基。

使用的核苷酸可带有一个可检测的特性。在此使用的可检测特性包括能够区分核苷酸的任何可鉴别的特性。重要的是，可检测的特性不能干扰本发明的任何方法。可检测的特性指使用适当的检测方法能够检测到的原子或分子或分子部分。可检测的特性包括固有质量(inherentmass)，电荷，电子自旋，质量标记，发射性同位素，染料，生物发光，化学发光，核酸特性，半抗原，蛋白质，光散射/相移位(phase shifting)特性，或荧光特性。在此使用的短语“相同的可检测特性”包括由于具有相同的信号因此可被检测的核苷酸。相同的可检测特性包括核苷酸用相同类型的标记物标记的实施方案，例如，A和C核苷酸可被发射相同类型信号的相同类型的染料标记。

可依据本领域已知的任何技术标记核苷酸和引物。优选的标记包括放射性标记，荧光标记，酶标记，蛋白质，半抗原，抗体，序列标记，质量标记，荧光标记等。优选的染料类型包括，但是不局限于，TAMRA(羧基-四甲基罗丹明)，ROX(羧基-X-罗丹明)，FAM(5-羧基荧光素)等。

本发明的引物延伸反应可使用一或多种标记核苷酸碱基。优选地，使用两或多种不同碱基的核苷酸。最优选地，本发明的引物延伸反应使用4个不同碱基的核苷酸。在最优选的实施方案中，所有4个不同类型的核苷酸被可区分的标记物标记。例如，使用dR6G标记A，使用dTAMRA标记C，使用dR110标记G和使用dROX标记T。

一旦使用引物延伸反应，延伸的和未延伸的引物(如果有)可被相互分离以便于鉴别一或多个被查询的等位基因的多态性位点。可通过任何本领域已知的方法分离核酸。一些分离方法包括使用嵌入染料例如溴化乙锭检测DNA双链，检测特异性序列和/或分离或捕获已知或未知结构的寡核苷酸分子的杂交方法以及与本领域熟知的印迹方法相关的杂交方法。杂交方法可与本领域熟知的其它分离技术组合使用，如通过固相捕获分离标记的寡核苷酸，如免疫亲和珠捕获半抗原连接的寡核苷酸，该珠可以是磁性的。固相捕获技术也包括DNA亲和层析，其中通过带有互补序列的固定化寡核苷酸捕获寡核苷酸。特异性多核苷酸标记被工程化入寡核苷酸引物，且通过与固定化互补序列杂交而分离。这样的固相捕获技术还包括在链霉抗生物素蛋白包被的珠(磁性或非磁性的)上捕获生物素标记的寡核苷酸。使用更传统的方法如离心，电泳方法或沉淀或表面沉积方法也可分离DNA。当延伸的或未延伸的引物存在于溶液相时，该方法非常好。术语“溶液相”在此指均相或非均相混合物。这样的混合物可以是水溶液的，有机的或同时含有水性成分和有机成分。术语“溶液”在此与悬浮液同义，其中包括悬浮在液体介质中的微粒。

通过任何本领域已知的方法可检测多态性位点。一个核苷酸检测方法是通过荧光技术。例如，可以构建在没有与靶核酸序列杂交时猝灭的荧光杂交探针。其它的方法利用具有重叠吸收(overlapping absorption)和发射光谱的荧光团之间的能量转移作用，所以当如捕获或杂交时，在2个荧光团非常接近时可以检测信号。

通过涉及电磁辐射行为的多种分光光度法，或标记可检测的部分来检测核苷酸。这些分光光度法包括，例如，电子自旋共振，光学活性或旋光光谱学如圆二色谱学，荧光学，荧光偏振化，吸收/发射光谱学，紫外线，红外线，可见光或质谱学，Raman光谱学和核磁共振光谱学。

依据本领域已知的任何技术可标记核苷酸和其类似物，终止子和/或引物。优选的标记包括放射性标记，荧光标记，酶标记，蛋白质，半抗原，抗体，序列标记，质量标记，荧光标记等。优选的染料类型标记包括，但不局限于TAMRA(羧基-四甲基罗丹明)，ROX(羧基-X-罗丹明)，FAM(5-羧基荧光素)等。

术语“检测”指鉴别一种可检测的部分。这一术语包括通过电磁特性鉴别一种部分的能力，例如，电荷，光，荧光，化学发光，电磁特征的改变，例如，荧光偏振，光偏振，二色性，光散射，折射率改变，反射，红外线，紫外线和可见光谱，质量，质量：电荷比率和所有依赖于电磁辐射或电磁辐射改变的检测技术的方式。术语也包括基于结合亲和力，内在质量，质量沉积，和静电特性，大小和序列长度鉴别部分。要注意特性，如质量和分子量可以通过表观质量或表观分子量评估，所以术语“质量”或“分子量”在此不排除通过多种设备和方法评估，因此不限制这些术语是任何唯一的绝对数值，而不参考获得质量和分子量的方法和设备。

检测多态性位点的核苷酸的另一个方法是通过比较引物延伸反应之后任意时间点，保持在反应混合物中的游离的、未掺入的核苷酸的浓度。在本实施方案中通常使用质谱学例如电喷射质谱检测未掺入的核苷酸。这个检测方法是可行的，因为在引物延伸反应过程中，在反应混合物中只有与多态性碱基互补的核苷酸被耗尽。因此，可使用质谱比较核苷酸质量峰的相对强度，同样地，可确定未标记引物的浓度且使用这一信息获得多态性位点核苷酸的性质。

在本发明优选的实施方案中，本发明包含一个作为检测分析一部分的产生荧光标记引物延伸产物的系统，其使用少于5种光谱可区分的染料。在一个实施方案中，使用4种染料，其中一或多种染料也可被用于标记对照反应的延伸产物，及如果使用，也可以标记一或多个flip-back引物的延伸产物。在一个实施方案中，也可监测产生包含一或多个待鉴别的多态性位点的扩增子靶核酸的PCR反应的成功与否，；如果PCR反应失败，由于靶核酸序列的缺乏，一或多个对照引物将不能在靶核酸序列上延伸。如果PCR反应成功产生扩增子靶核酸，一或多个对照引物可以具有至少双重目的：它们可被用于鉴定可能存在的检测引物，且提供一定水平的确认，即确定被认为是延伸的检测引物的信号确实是延伸的检测引物的信号而非背景噪声。此外，在本发明的优选的实施方案中，由于对照引物序列和/或分析条件的明智选择或设计，可通过在此描述的方法确定一或多个对照引物和一或多个检测引物产生的信号的表观丰度。也可以使用flip-back引物，或者作为分离引物或者作为对照引物的特征。

最优选地，通过毛细管凝胶电泳分离和鉴定引物延伸产物，其中使用荧光检测仪来鉴别荧光终止核苷酸标记的引物延伸产物。在这个最优选的实施方案中，通过它们的质量：电荷比率分离带有荧光标记的延伸引物。但是，本领域技术人员已知许多分离和检测方法，一旦本领域技术人员获知本发明的内容，本发明可以使用多种检测和分离方案。本发明的主要优点是多种可检测的特性和标记可被放置在检测和/或对照和/或flip-back引物中以帮助它们分离和/或检测。当然，在没有标记时，通过本领域技术人员已知的它们固有的物理性质或行为，本发明的引物也可被分离，检测，和/或鉴别。

优选的分离方法使用暴露任何延伸的和未延伸的引物到固体支持物上。固体支持物包括阵列。术语“阵列”在此指固定化生物分子在固体，半固体，凝胶或聚合物相上多个位置上的有序排列。这个定义包括已用二氧化硅，硅烷，硅，硅酸盐和其衍生物，塑料和其衍生物，例如，聚苯乙烯，尼龙和，特别是聚苯乙烯板，玻璃和其衍生物，包括衍生化玻璃，玻璃珠，可控孔度玻璃(CPG)处理或包被的相。固定化的生物分子包括寡核苷酸，其可以包括其它部分，如标记和/或亲和性部分。术语“阵列”包括且与术语“芯片”、“生物芯片”、“生物芯片阵列”、“DNA芯片”、“RNA芯片”、“核苷酸芯片”和“寡核苷酸芯片”同义。所有这些术语包括阵列的阵列，并包括生物学聚合物，例如，已知或未知序列的寡核苷酸和DNA分子的阵列。

本发明优选的阵列包括，但不局限于，包括以上定义的阵列的可寻址阵列，其中各个位置具有已知坐标以便阵列上一定位置的信号可被鉴别为具有特殊可鉴别的特性。术语“芯片”，“生物芯片”，“生物芯片阵列”，“DNA芯片”，“RNA芯片”，“核苷酸芯片”和“寡核苷酸芯片”包括阵列和微阵列的组合。这些术语也包括任何形状或构型的阵列，2维阵列和3维阵列。

一个特别优选的阵列是Affymetrix，Inc.的GenFlex^TM标记阵列，它由2000个标记序列的捕获探针组成。它们是20聚体，选自具有相似杂交特性且与公开的数据库中的序列至少具有最小的同源性的所有可能的20聚体。

另一个优选的阵列是可寻址的阵列，其具有与检测、对照和flip-back引物的5’标记互补的序列标记。这些互补的标记结合阵列上的已知位置。这种类型的标记在适当杂交条件下与阵列杂交。通过定位结合的引物和检测一或多个延伸的引物，多态性位点的核苷酸性质可被确定。

在本发明的一个优选的实施方案中，靶核酸序列被排列为允许多个同时检测(多重技术(multiplexing))以及使用寡核苷酸阵列平行处理的形式。

在另一个实施方案中，本发明包括虚拟(virtual)阵列，其中延伸的和未延伸的引物在包含微球体悬液的阵列上分离，其中微球体带有一或多个捕获部分以便分离独特标记的引物。微球体进而带有独特的鉴别特性以便它们能够基于该特性，例如，直径，密度，大小，颜色等而被分离。

已经完成本发明常规的描述，通过以下实施例使本发明更易理解，且除非指明，实施例不限制本发明的范围。

实施例

实施例1

4个购得的SNP位于绵羊PrP基因编码区域内(该序列在GENBANK可获得，编号M31313，并在此并入参考)并且通过多重链终止引物延伸进行分析。因为这些SNP相互靠近，因此可通过一个310bp的单PCR扩增子分析它们。这个扩增子为4个检测引物提供了靶，每个检测引物邻近4个感兴趣的SNP之一的3’末端。但是，在这个310bp扩增子上也有大量的不变异DNA，这个不变异DNA可被用作延伸不变碱基的对照引物的靶，由此产生可预知的产物，与SNP位点的碱基无关。通过对对照和检测引物序列的明智选择，有可能发展一个单试管分析来查询SNP，并产生4个位于标记的检测引物侧翼的标记对照物。2个对照物在电泳下迁移的表观质量小于所有可能的标记的检测引物。这些对照物靶向310bp扩增子内相同的核心DNA序列并查询相同的非变异碱基。它们仅仅在5’末端不同，其在与靶序列退火的50％的引物延伸2个T碱基。另2个对照物在迁移时，其表观质量大于检测引物。它们是通过靶向310bp序列内非变异序列的另一部分的2个对照引物产生的，其不同仅在于一个比另一个长2个T碱基，这个延伸同样又是一个5’末端添加。任何对照引物的延伸均导致G的掺入，其带有在激光照射时反射蓝色信号的荧光染料。这样，如此的标记的检测引物产物的侧翼允许用Local Southern sizing算法准确确定标记的检测引物产物的大小。

标记的对照延伸产物的产生使我们能发展一个自动调用(calling)软件，其能够在尝试评估标记的检测引物产物之前，评估从对照物产生的信号的质量。

由于产生较大对照产物的对照引物的部分自身互补性，在没有PCR扩增子时，这些引物将自身延伸，提供了一个评定由于PCR失败或引物延伸失败导致的不能产生可评分图谱的方法。

实施例2

制备模板

通过碱裂解处理白细胞沉淀，然后中和和稀释提取物从绵羊血中制备模板。6μl PCR反应物如下组成：3μl提取的模板(～5ng模板)+3μlMastermix[2×Gold缓冲液，(ABI，Foster City，CA)，4mM MgCl₂，400μMdNTP，200μg/ml热失活BSA，400nM初始扩增引物I(CAAGGTGGTAGCCACAGTCAGTGGAACAAG)(SEQ ID NO.1)，400nM初始扩增引物II(CCTTGGTGGTGGTGGTGACTGTGTGTTG)(SEQID NO.2)和0.025单位Taq Gold DNA聚合酶(ABI，Foster City，CA)。按照如下程序进行32个PCR循环：[(94.0℃，11分钟)×1，(94.0℃，30秒；64℃，1分钟；72℃，30秒)×32个循环，(25℃，浸泡)]。

实施例3

EXO/SAP消化

为了去除未掺入的核苷酸和引物，使用5个单位的SAP(USB)和2个单位的EXO I(NEB)处理6μl的PCR产物，在37℃温育1小时之后提高温度到72℃，保温15分钟以中和酶。

实施例4

引物延伸

2.5μl的EXO/SAP消化的扩增产物与2.5μl的SNaPshot^TM(ABI，FosterCity，CA)反应混合物组合，所述混合物含有TaqFS DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP，此外还包括为这个分析特异设计的8个延伸引物：4个对照引物(靶向2个非变异碱基，均为G掺入)和4个延伸引物(靶向4个可变SNP位置)。延伸引物的序列如下：

对照引物：

TCATGTGGCAGGAGCTGCTGCA[23bp(+G)对照](SEQ ID NO.3)

TTTCATGTGGCAGGAGCTGCTGCA[25bp(+G)对照](SEQ ID NO.4)

TTTTTTCCTCATAGTCATTGCCAAAATGTATAAGA[36bp(+G)对照](SEQ ID NO.5)

TTTTTTTTCCTCATAGTCATTGCCAAAATGTATAAGA[38bp(+G)对照](SEQ ID NO.6)

下划线的碱基表示靶向相同核心序列的配对引物的不同。指示的大小是指掺入一个不变G碱基之后的大小。

检测引物：

TGGTGGCTACATGCTGGGAAGTG[136F，C/T](SEQ ID NO.7)

TGGTTGGGGTAACGGTACATGTTTTCA[154R，C/T](SEQ ID NO.8)

CAACCAAGTGTACTACAGACCAGTGGATC[171-1F，G/A](SEQ ID NO.9)

CAGTCATGCACAAAGTTGTTCTGGTTACTATA[171-2R，C/A](SEQ IDNO.10)

每个引物靶向一个不同的SNP，其命名见序列后的括号内，SNP类型也一起示出。这些引物在最终的5μl延伸反应物中以不同浓度存在，范围从4fmol/μl到16fmol/μl。这些低水平的多种延伸引物促使平坦的信号强度，其中通过初始PCR产生的靶扩增子的程度可改变。进行25个循环[(94℃，10秒)，(54℃，40秒)，(60℃，20秒)]的引物延伸。

实施例5

CIP消化

引物延伸反应完成之后，使用1个单位CIP(NEB)处理产物以中和未掺入的荧光标记的ddNTP，然后在毛细管电泳仪上进行电导注射。

实施例6

描述的分析获得非常清晰的电泳图谱(见实施例图7)，其具有如下特性：对照引物对照其靶延伸掺入带有蓝色荧光染料的G碱基。这些对照物典型地非常平衡，并作为说明检测引物延伸产物的一个参照。在没有靶扩增子时，产生36bp和38bp产物的对照引物具有部分自身互补性(见图6)并作为flip-back引物，对自身延伸以掺入一个G碱基。这导致在PCR失败的电泳中出现2个蓝峰。证明这是一个有用的特征，因为其在分析中指示失败。如果在引物延伸阶段已经失败，将根本没有可检测的信号。

本发明描述了能够在多重引物延伸反应中查询多态性碱基的方法。作为引物延伸分析的一个主要部分，加入对照引物延伸以掺入不变碱基，产生一个可预知的产物。这些对照延伸产物能够精确确定延伸的检测引物的大小和容许依据产生的信号量评价分析成功的水平。这可能涉及PCR扩增子产生阶段和引物延伸阶段分析的成功。允许对照引物在引物3’末端具有部分自身互补性导致低水平的自身延伸，这在PCR反应失败不能产生使分析最佳进行的足够扩增子的条件下是有用的。

将现有分析延伸到其它分析中必须解决在产生的扩增子中没有适于扩增多态性区域的对照引物的靶的情况。在这样的情况中，使用对照引物的人工靶是显而易见的。这些对照物可能具有定性非常好的物理性质，并可以是通用的，在对相同作用的不同分析中可使用相同的对照序列。

本发明已经描述与其相关的特异性实施方案，可以理解本发明所属领域的技术人员能够对其进一步修饰，因此本发明的权利要求书的保护范围还涵盖对本发明内容的任何变化、应用、或改动。

序列表

<110>兰华生物科技公司

<120>监测引物延伸和多态性检测反应的方法和组合物

<130>13164PCT

<140>To be assigned

<141>2003-06-23

<150>10/179,826

<151>2002-06-25

<160>10

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>1

caaggtggta gccacagtca gtggaacaag 30

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>2

ccttggtggt ggtggtgact gtgtgttg 28

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>3

tcatgtggca ggagctgctg ca 22

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>4

tttcatgtgg caggagctgc tgca 24

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>5

ttttttcctc atagtcattg ccaaaatgta taaga 35

<210>6

<211>37

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>6

ttttttttcc tcatagtcat tgccaaaatg tataaga 37

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>7

tggtggctac atgctgggaa gtg 23

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>8

tggttggggt aacggtacat gttttca 27

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>Artifical Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>9

caaccaagtg tactacagac cagtggatc 29

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Primer-organism matches to Ovis aries

<400>10

cagtcatgca caaagttgtt ctggttacta ta 32

Claims

1.一种鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基的方法，包括：

提供具有一变异核苷酸碱基和一不变核苷酸碱基的靶核酸序列，提供能够与靶核酸序列的不变核苷酸碱基紧邻处杂交的对照引物，提供能够与靶核酸序列的变异核苷酸碱基紧邻处杂交的检测引物；

使所述对照引物和检测引物与靶核酸序列杂交；

在使引物延伸发生的适当条件下，在存在聚合剂时延伸所述对照引物和检测引物一或多个核苷酸碱基；

使所述对照引物与所述检测引物分离；及

通过检测任何延伸的对照和检测引物及从所述延伸的对照引物中分离延伸的检测引物以保证引物延伸已经发生而鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基。

2.权利要求1的方法，其中能够与所述对照引物杂交的所述靶核酸序列与能够与所述检测引物杂交的靶核酸序列是在不同的核酸分子上。

3.权利要求1的方法，其中所述对照引物和检测引物被延伸一或多个标记的核苷酸碱基，而且能够通过如下的特性被检测：质量，表观质量，分子量，表观分子量，质量电荷组合或比率，碱基数，磁共振，分光光度法，荧光测定，电荷，旋光测定法，光散射，发光，和抗原抗体相互作用。

4.权利要求1的方法，其中所述对照引物具有与所述检测引物可区分的特性。

a.权利要求1的方法，其中所述对照引物是flip-back引物。

5.权利要求1的方法，其进一步包括能够与所述靶核酸序列的不变核苷酸碱基紧邻处杂交的flip-back引物。

6.权利要求1的方法，其中所述对照引物和所述检测引物通过链终止子延伸。

7.权利要求7的方法，其中所述链终止子包括双脱氧核苷酸和无环终止子。

8.权利要求1的方法，其中2或多个所述对照引物被延伸。

9.权利要求7的方法，其中所述链终止子具有可检测的部分。

10.权利要求3的方法，其中一或多个标记核苷酸的每一个都具有不同的标记。

11.一种监测引物延伸反应或产生靶核酸的反应的方法，包括：

使所述对照引物和检测引物与靶核酸序列杂交；

在允许引物延伸发生的适当条件下，在存在聚合剂时延伸所述对照引物和检测引物一或多个核苷酸碱基；

相互分离所述对照引物和检测引物；及

通过检测任何延伸的对照和检测引物及从所述延伸的对照引物中分离延伸的检测引物以保证引物延伸已经发生而鉴别靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基，和确定添加到所述检测引物和所述对照引物中的核苷酸的性质，因而鉴别监测引物延伸反应。

12.权利要求12的方法，其中能够与所述对照引物杂交的所述靶核酸序列与能够与所述检测引物杂交的靶核酸序列是在不同的核酸分子上。

13.权利要求12的方法，其中所述对照引物和检测引物被延伸一或多个标记的核苷酸碱基，而且能够通过如下的特性被检测：质量，表观质量，分子量，表观分子量，质量电荷组合或比率，碱基数，磁共振，分光光度法，荧光测定，电荷，旋光测定法，光散射，发光，和抗原抗体相互作用。

14.权利要求12的方法，其中所述对照引物具有与所述检测引物可区分的特性。

15.权利要求12的方法，其中所述对照引物是flip-back引物。

16.权利要求12的方法，其中所述对照引物和所述检测引物通过链终止子延伸。

17.权利要求17的方法，其中所述链终止子包括双脱氧核苷酸和无环终止子。

18.权利要求12的方法，其中2或多个所述对照引物被延伸。

19.权利要求17的方法，其中所述链终止子具有可检测的部分。

20.权利要求14的方法，其中一或多个标记核苷酸的每一个都具有不同的标记。

21.一种鉴别引物延伸反应的产物的方法，包括：

提供2或多个对照引物，一或多个靶核酸序列和一或多个检测引物，其中所述检测引物能够与靶核酸序列或其互补体的多态性位点紧邻处的不变核苷酸序列杂交，且其中一或多个对照引物均与一或多个靶核酸序列上的一或多个检测引物所杂交的不变序列不同的不变序列杂交；

使所述一或多个对照引物和所述一或多个检测引物与一或多个靶核酸序列杂交；

在足以允许引物延伸发生的条件下，在存在聚合剂时，在存在一或多个标记的核苷酸碱基时延伸所述一或多个对照引物和所述一或多个检测引物；

从所述一或多个检测引物中分离所述对照引物；及

通过从所述一或多个对照引物中分离所述一或多个检测引物检测所述所述一或多个检测引物，因而鉴别所述引物延伸反应的产物。

22.权利要求22的方法，其中能够与所述对照引物杂交的所述靶核酸序列与能够与所述检测引物杂交的靶核酸序列是在不同的核酸分子上。

23.权利要求22的方法，其中所述对照引物和检测引物被延伸一或多个标记的核苷酸碱基，而且能够通过如下的特性被检测：质量，表观质量，分子量，表观分子量，质量电荷组合或比率，碱基数，磁共振，分光光度法，荧光测定，电荷，旋光测定法，光散射，发光，和抗原抗体相互作用。

24.权利要求22的方法，其中所述对照引物具有与所述检测引物可区分的特性。

25.权利要求22的方法，其中所述对照引物是flip-back引物。

26.权利要求22的方法，其中所述对照引物和所述检测引物通过链终止子延伸。

27.权利要求27的方法，其中所述链终止子包括双脱氧核苷酸和无环终止子。

28.权利要求22的方法，其中2或多个所述对照引物被延伸。

29.权利要求27的方法，其中所述链终止子具有可检测的部分。

30.权利要求24的方法，其中所述一或多个标记核苷酸的每一个都具有不同的标记。

31.一种监测引物延伸反应的方法，包括：

在适于扩增发生的条件下，在存在聚合剂时，从感兴趣的核酸分子中扩增靶核酸序列，其中使用能够与感兴趣的核酸分子的不变区域杂交的一对扩增引物，且其中所述扩增引物对在其5’末端具有一个包含一不变碱基的不变标记序列，其中所述不变标记序列能够与感兴趣的核酸分子杂交，因此包含不变碱基的所述不变标记序列被掺入包含所述靶核酸的扩增的核酸分子中；

提供能够与所述扩增的靶核酸中的不变标记序列的不变碱基紧邻处杂交的对照引物，并提供与所述扩增的靶核酸的一变异核苷酸碱基紧邻处杂交的检测引物；

使所述对照引物和检测引物与所述扩增的靶核酸序列杂交；

在足以允许引物延伸发生的条件下，在存在聚合剂时，延伸所述对照引物和检测引物一或多个核苷酸碱基；

从所述检测引物中分离所述对照引物；及

通过检测任何延伸的对照引物和检测引物和从所述延伸的对照引物中分离所述延伸的检测引物以保证引物延伸发生而鉴别所述靶核酸序列的一或多个核苷酸碱基。

32.权利要求32的方法，其中能够与所述对照引物杂交的所述靶核酸序列与能够与所述检测引物杂交的靶核酸序列是在不同的核酸分子上。

33.权利要求32的方法，其中所述对照引物和检测引物延伸一或多个标记的核苷酸碱基，而且能够通过如下的特性被检测：质量，表观质量，分子量，表观分子量，质量电荷组合或比率，碱基数，磁共振，分光光度法，荧光测定，电荷，旋光测定法，光散射，发光，和抗原抗体相互作用。

34.权利要求32的方法，其中所述对照引物具有与所述检测引物可区分的特性。

35.权利要求32的方法，其中所述对照引物是flip-back引物。

36.权利要求32的方法，其进一步包含能够与所述靶核酸序列的不变核苷酸碱基紧邻处杂交的flip-back引物。

37.权利要求32的方法，其中所述对照引物和所述检测引物通过链终止子延伸。

38.权利要求38的方法，其中所述链终止子包括双脱氧核苷酸和无环终止子。

39.权利要求32的方法，其中2或多个所述对照引物被延伸。

40.权利要求38的方法，其中所述链终止子具有可检测的部分。

41.权利要求33的方法，其中所述一或多个标记核苷酸的每一个都具有不同的标记。