CN101076608A - 在pcr扩增中提高再现性和降低引物错导的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在聚合酶链反应(PCR)扩增及分析中防止引物错导的添加剂，其包含具有长度大于6个核苷酸的茎双链体和稳定茎端的发夹寡核苷酸。当将所述添加剂添加到起始扩增反应混合物中时可改进PCR扩增，包括LATE－PCR扩增。所述添加剂可包含在用于PCR扩增和分析的寡核苷酸组中和试剂盒中。

Description

在PCR扩增中提高再现性和降低引物错导的试剂和方法
技术领域
本发明涉及利用聚合酶链反应(PCR)的核酸扩增反应和分析，包括实时以及终点均相分析。
背景技术
利用聚合酶链反应(PCR)的核酸扩增以及包括PCR扩增的分析众所周知。参见美国专利第4,683,202号、第4,683,195号和第4,965,188号，以及通常参见PCRPROTOCOLS，a guide to Methods and Applications，Innis等人编辑，Academic Press(SanDiego，CA(USA)1990)。人们也熟知均相PCR分析，其不需要进行洗涤来除去未结合的检测剂或探针，因此在实施时无需打开扩增反应器。均相PCR分析既包括在扩增反应结束时检测扩增产物的终点分析，也包括在反应进行时的某些或全部热循环期间检测扩增产物的实时分析。参见美国专利第5,994,056号、第5,487,972号、第5,925,517号及第6,150,097号。
PCR扩增反应通常设计成具有对称性，即通过利用“匹配”的正向引物和反向引物(即它们具有尽可能接近的解链温度并且它们以等摩尔浓度添加到反应中)来制备双链扩增子。仅限于用于在PCR反应中直接制备单链DNA的技术是“不对称PCR”。Gyllensten和Erlich，“Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase ChainReaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus，”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：7652-7656(1988)；及美国专利第5,066,584号。不对称PCR与对称PCR的不同之处在于引物中的一种以有限量添加，通常为另一引物浓度的1％至20％。
新近，已开发出一种不对称PCR扩增方法，称为“指数后线性(Linear-After-The-Exponential)”PCR或简称为“LATE-PCR”。参见Sanchez等人(2004)PNAS 101：1933-1938，Pierce等人(2005)PNAS 102：8609-8614，及公开的国际专利申请案WO 03/054233(2003年7月3日)，其全部内容以引用方式并入本文中。LATE-PCR计及扩增开始时PCR引物的实际解链温度，称为Tm[0]。Tm[0]可根据经验确定(当使用非天然核苷酸时必须如此)，或可使用盐浓度调节根据“最近邻”方法(Santa Lucia，J.(1998)PNAS(USA)95：1460-1465；以及Allawi，H.T.和Santa Lucia，J.(1997)Biochem.36：10581-10594)计算。在我们的研究中利用0.07M的单价盐浓度。
PCR扩增的不利特点是重复试样之间的发散，而在LATE-PCR中情况有所改观。在所述扩增的指数阶段后，实时监测的重复扩增发散并于不同水平处达到稳定。发散表明重复试样不具有相同的反应动力学并降低准确性。此问题在PCR分析中常见，但在终点分析以及依赖线性阶段期间的信号斜率的分析中更为常见。
PCR扩增的另一突出问题是引物错导，我们认为引物错导表现为至少三种类型：1型，扩增开始前在反应混合物制备期间发生的引物错导；2型，在循环温度包括任何显著低于引物解链温度的温度情况下在扩期期间发生的引物错导；和3型，在已产生高浓度扩增子后继续进行的PCR扩增的后期发生的引物错导。已使用数种方法来解决所述第一种类型的引物错导。一种方法是用化学方式修饰聚合酶，以便其在加热到诸如95℃的高温之前无活性。参见美国专利第5,677,152号及第5,773,258号。另一种方法是使抗体与聚合酶结合来抑制所述聚合酶，直至反应加热到诸如95℃的高温而不可逆地使所述抗体变性。参见美国专利第5,338,671号。再一方法是将适配子纳入反应混合物中。参见Doug和Jayasena(1996)，J.Mol.Biol.264：268-278以及美国专利第6,020,130号。适配子是长度约30个核苷酸的单链寡核苷酸，其与聚合酶结合并抑制聚合酶在低温下延伸3′凹端的能力。适配子在RCR循环的典型最高温度即95℃下不发生不可逆的变性。Kainz等人(2000)Biotechniques 28：278-282报导，将一定量的长度为16个至21个核苷酸的双链DNA片段添加到PCR反应混合物中在低于典型PCR延伸温度下抑制聚合酶并抑制非特异性产物的合成。DNA片段在PCR循环期间未不可逆地发生变性。Eppendorf-5 Prime公司出售一种专有配体，据称所述配体可以温度依赖方式与Taq聚合酶结合并且在低于约50℃的温度下抑制所述聚合酶与双链DNA的结合。尽管进行了这么多的尝试，PCR扩增仍然存在引物错导的问题。
PCR扩增期间引物错导的另一表现形式称为引物-二聚体形成和扩增。根据此现象，一种引物与另一引物或与其自身杂交，然后经受3′端延伸，产生小的双链扩增子，所述小的双链扩增子然后可进一步扩增或可多聚化并进一步扩增。引物-二聚体形成可在不存在靶的情况下发生。
通过实时检测方法已能对PCR扩增实施定量分析，因为超出反应阈值循环或CT的当荧光信号变得明显时的PCR循环可指示起始靶浓度。终点分析至多为半定量性，这部分是因为当反应退出指数扩增时重复试样间出现发散。双链扩增子的电泳分析是半定量性的，且可利用荧光标记引物。利用荧光标记探针(等位基因识别探针或耐错配探针)的终点分析也至多是半定量的。通过降低发散以及产生单链产物，LATE-PCR在终点分析中提供显著的改进，但是重复试样间的发散通常不能完全消除，导致准确性比期望的要低的定量性多重检测。
本发明一方面涉及一类试剂添加剂，其用来在PCR扩增反应中提高产物特异性并消除引物错导效应。这些添加剂在所有类型的PCR中均胜于现有的“热启动”方法，且可在反应的早期阶段以及在具有许多循环(通常60个循环以及更多)的LATE-PCR反应期间用来防止不期望产物(包括引物-二聚体和引物错导扩增子)的积聚。
本发明的另一方面涉及PCR扩增和分析方法，对称PCR或不对称PCR二者，包括但不限于LATE-PCR，以及涉及包括这样的试剂添加剂的试剂盒、部分试剂盒和寡核苷酸组。
发明内容
本发明的试剂是能够在至少某些PCR扩增中防止引物错导的一或多种表现形式的添加剂。“防止表现形式”意指在反应结束时通过本文所述技术(即荧光DNA染料、凝胶电泳、DNA测序和熔点分析)检测不到引物错导的一种产物或多种产物。本发明的试剂可在扩增开始前以相对低的浓度纳入PCR扩增混合物中，所述浓度小于1微摩尔(μM)即1000nM，优选地不超过650纳摩尔(nM)，更优选地不超过300nM，最优选地为50nM至250nM，甚至当利用同时具有聚合活性和5′-至-3′核酸外切酶活性的聚合酶时。本发明试剂为经修饰的单链寡核苷酸。可用来构筑本发明试剂的寡核苷酸是广义上的寡核苷酸。其可为DNA、RNA或混合的DNA-RNA。它们可含有经修饰的核苷酸、非天然核苷酸(例如，2′O-甲基核糖核苷酸)、非天然核苷酸间键、非核苷酸连接子、PNA、LNA和添加的化学部分，例如Glenn Research描述的加帽核苷酸。
本发明试剂为单链寡核苷酸，其在PCR扩增反应混合物中形成茎-环结构，通常称为“发夹”结构，但其也可由其中环不是由核苷酸组成的茎环结构组成。在此一结构中，分子的中央部分仍是单链(未杂交)(环)而端部彼此杂交形成茎。茎可是平端的或一条链可超出另一条链的末端。茎可包含连续的双链区，或其可包括内部错配，导致突起。由寡核苷酸的末端形成的茎的端部可经稳定以便结合程度比DNA-DNA杂合体牢固。我们将本发明试剂的茎参照其解链温度或Tm来表征。解链温度是50％的茎互补序列未杂交(开放构造)而50％互补序列与自身杂交或部分杂交(闭合构造)时以摄氏度表示的温度。在本申请案中，茎的“计算Tm”指使用M-fold程序：Zucker，M.(2003).“Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction.”Nucl.Acids Res.31：3406-3415在假定钠浓度为70毫摩尔(mM)及镁浓度为3mM下获得的相应未经稳定完全DNA寡核苷酸茎部分的计算解链温度。在具有添加的猝灭基因对(优选地非荧光猝灭基因，例如吸收光但以热形式散发所吸收能量的Dabcyl和Black Hole Quencher)的优选实施例情况中，Tm为无猝灭基因的DNA发夹的计算Tm。在于其末端具有加帽核苷酸的实施例情况中，Tm为含有等效的加帽核苷酸的DNA发夹的计算Tm。在于茎端处纳有2′-O-甲基核糖核苷酸的情况下，Tm为含有2′-O-甲基核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸类似物的所有DNA发夹的计算Tm。我们利用此方法的实际原因是难以获得稳定发夹的实际熔点，认识到所述稳定修饰将导致实际熔点比计算的Tm高数度。本发明试剂具有不超过94℃且优选地在50℃与85℃之间的计算茎Tm。对于某些实施例而言，优选为计算茎Tm比扩增反应的引物退火温度高(通常为55℃至72℃，即在72℃与85℃之间)，但在另外一些实施例中，优选比引物退火温度低的计算茎Tm，即在50℃与71℃之间。在PCR循环期间，在用于解链的温度即95℃下，茎的互补序列打开，变成单链。此外，本发明试剂的茎在低至足以形成闭合的自杂交构造的温度下具有超过6个核苷酸的长度。目前，我们的优选实施例形成9个至12个碱基对长的茎，优选地9个至11个碱基对，当闭合时，更优选地9个至12个、最优选地9个至11个无内部错配的连续互补碱基对，最优选地9个至12个碱基对长且完全互补的平端茎。所述试剂的3′端在扩增反应中不能被NDA聚合酶延伸，所以所述反应不是PCR引物。举例而言，通过添加磷酸或某一封阻化学部分封阻任一突出3′端来防止延伸。
环的长度可显著变化。如果环是由核苷酸及核苷酸间键组成，则其长度为至少3个核苷酸。另外，如果其长度正好为3个核苷酸，则其含有胸苷残基。目前我们的优选核苷酸环的长度在3个至22个核苷酸之间。环也可是非核苷酸化学连接子，例如亚烷基链。对于碳链连接子，优选3个至6个碳原子的长度，最优选长度为3个碳原子。在亚烷基碳链中，碳链每一成员的余留两价电子也参加到共价键中。这样的键可连接到氢原子，连接到短链烷基或亚烷基，连接到用于将所述试剂连接到固体表面的取代基。包含化学连接子的非寡核苷酸环并不限于烃链，且可包括杂(非碳或氢)原子。优选地，化学连接子呈电中性，以便不与所述聚合酶结合。由于所述试剂的活性取决于茎的闭合构造，所以优选的是对于具有含5个以上核苷酸的环的试剂而言，环的成分不与所述反应中的或由所述反应产生的任何另外的一个或多个序列大范围地互补。本发明试剂不是任何扩增反应产物的杂交探针，并且不显示产物积聚。
如所示，本发明试剂包括远离环的茎端的稳定，以便所述茎端比DNA-DNA杂合体的端部的结合程度要牢固。在我们的目前最优选实施例中，所述茎是平端的，并且所述茎的末端与天然DNA-DNA杂合体相比以抑制部分链分离的方式经修饰。下文举例说明将稳定活性化学部分添加到所述茎末端的效应，所述稳定活性化学部分为借助市售连接子共价结合到所述茎的3′和5′核苷酸的一对Dabcyl部分以及一对市售BlackHoleTM猝灭基因(由Biosearch Technologies，Novato，CA，U.S.A.出售的专有猝灭基因)。也举例说明在茎的末端处利用强结合非天然核苷酸2′O-甲基核糖核苷酸的效应。优选稳定部分不具有荧光性，以便所述试剂不将背景荧光施予扩增及扩增分析。以低于1μM的浓度添加的本发明试剂的不稳定寡核苷酸DNA发夹如果未如所述经修饰来稳定结合氢的茎端(并且在许多情况下并不这样做)，则其不一定实质降低引物错导。因此，在本发明试剂中稳定至关重要。
本发明发夹试剂可阐述为含有两个互补核苷酸寡聚物的分子，所述两个寡聚物合在一起，以便其可形成具有6个以上碱基对的茎，所述茎的开放端通过一种方式或另一方式加以化学修饰，这样来抑制所述茎在其开放端处解旋或“绽裂”的趋势。尽管透彻理解分子作用机制有待通过在存在和不存在本发明试剂情况下的酶动力学进一步分析，以及通过电子显微术、核磁共振及X射线结晶术对这些试剂与聚合酶的相互作用进行结构分析，但预计根据本文及科学文献中所列信息可部分理解作用机制。文献教示，Taq聚合酶像其他DNA聚合酶一样是由合成结构域与5′核酸外切结构域构成。Stoffel片段中不存在5′核酸外切结构域。文献进一步教示，所述合成结构域通过首先与双链DNA结合并沿其滑动来实施DNA聚合。所述合成结构域具有已被比作“张开的手”的形状，在dNTP的存在下，其在与双链DNA接触时在多肽水平上发生形状改变。结果，“手”的“手指”环绕所述双链DNA分子“闭合”。双链分子内的错配序列使得所述聚合酶支持某些核苷酸并使用所述合成结构域的3′编辑功能取代正确的碱基。当酶读取模板链并延伸互补引物的3′端时发生新DNA链的合成。如果酶遇到早已结合到模板链的寡核苷酸的5′尾，则所述聚合酶可侵入结合寡核苷酸的区域1个至2个核苷酸，并借助所述酶的5′核酸外切酶结构域裂解所述的5′尾。
依据这一信息可假定本发明试剂的双链茎至少部分通过与呈开放构造的聚合酶的合成结构域结合并使其闭合来起作用。从而抑制合成酶的合成活性。因此，虽然不欲受限于任何理论，但可断定第一作用模式是作为聚合酶合成活性的温度依赖性抑制剂。下文所列证据表明，至少某些形式的所述试剂在其双链区(例如茎)的解链温度下不会被酶释放，而是在更高温度(尤其包括典型PCR延伸温度)下仍保持结合状态。然而，在PCR循环的变性(或解链)步骤期间，本发明试剂会自DNA聚合酶释放。在PCR循环的变性步骤(也称为解链步骤)期间，通常高于90℃，本发明发夹试剂的茎分解开来，并且只有且当温度降低足以使所述双链区重新形成的温度时它们才再次与聚合酶结合。因此，可选择设计本发明试剂，其在所述第一变性之前才呈双链，即在扩增前当添加至PCR反应混合物中时(通常在室温下)呈双链，但之后被维持在其茎的Tm以上。对于此一实施例，所有扩增循环的引物退火温度和任一LATE-PCR低温检测温度均优选地比计算的茎Tm高至少5℃。或者，可选择设计本发明试剂，使之在扩增后期又变成双链。此可通过利用比所有或某些扩增循环中所用引物退火温度高的茎Tm(如所述计算)来达成。或者，在LATE-PCR扩增中，此可通过利用低于引物退火温度但高于低温度检测温度的茎Tm达成。前一设计类型通常不会抑制聚合，此由CT中的延迟表明，而利用低于茎Tm的引物退火温度通常会使1个至3个扩增循环的CT略有延迟。
因此，虽然不欲受限于任何理论，但可断定本发明试剂的第二作用模式是作为聚合酶的5′核酸外切活性的温度依赖性抑制剂。下文显示本发明试剂在高达至少55℃温度下抑制所述聚合酶酶的5′-至-3′核酸外切酶活性，但不会不适当地抑制所述酶通过聚合其3′端来延伸DNA链的能力(如在PCR扩增中延伸PCR引物)。
另外，虽然不欲受任何理论限制，但可断定本发明试剂的第三作用模式是作为温度依赖性配体与聚合酶结合，使所述聚合酶的多肽改变形状。当配体自酶释放后，所述酶在变回其先前形状前在一段时间内保持所述经改变的形状。而与部分错配的引物模板杂合体相比，呈经改变形状的酶优先与完全互补的引物模板杂合体结合。
基于此模型，但预见本发明试剂茎的改变聚合酶合成结构域的能力不同于本发明试剂抑制聚合酶的合成功能(上述第一模式)或聚合酶的5′核酸外切酶功能(上述第二模式)的能力。所述第一作用模式和所述第二作用模式实际上均依赖于聚合酶释放所结合试剂的速率。快速释放的本发明试剂优先通过所述第三模式起作用，即使是在高浓度下也不显著抑制聚合酶的合成活性。相比，自聚合酶缓慢释放的本发明试剂在高浓度下很有可能具有抑制性。举例而言，由茎和3个亚甲基(-CH2)基团的碳连接子环组成的化合物12-C3DD或由茎和6个亚甲基(-CH2)基团的碳连接子环组成的化合物12-C3 C3DD在3000nM的浓度下均仅部分抑制PCR扩增。相反，在实例1的分析中，具有由核苷酸组成的环的本发明试剂通常在＜1000nM的浓度下且有时在小于＜500nM的浓度下完全抑制PCR扩增。
熟悉蛋白-核酸相互作用的人员将了解，本发明试剂的作用可通过模式1至3中的一种以上实现，这些作用模式并不相互排斥，而是相互关联。如下文所述，我们已设计出定量测试(实例14)，其可用来测定连接两个构成茎的寡核苷酸的特定分子结构使整个化合物起酶抑制剂作用(经由所述第一模式或所述第二模式)或主要起酶特异性增强剂作用(经由所述第三作用模式)的程度。
基于上述模型可进一步预计，一或多个聚合酶分子可结合至相等数量的本发明试剂分子，其又可共价连接到更大的部分，例如珠粒、颗粒或由固定材料构成的材料。所述固体从而可视为“装载”有聚合酶。本发明试剂与固体的连接键可是暂时的或可由多种业内熟知的方法裂解。连接键的裂解可将试剂或试剂-聚合酶复合体释放入溶液中(随后试剂可自聚合酶释放)。
本发明试剂的设计在所属领域的技术内。可了解，茎的解链温度可通过改变其G-C含量来进行相当大的调整。举例而言，下文所述两个优选实施例的茎均具有9个核苷酸的长度，但具有相差25℃的计算Tm(81℃与56℃)。通常使用上述M-fold计算机软件程序结合一或多个可能的环序列来计算茎Tm。尚未另外发现环序列对于本发明引物错导试剂有影响。在我们的设计中，利用形成完全平端的茎(即，无内部错配并且无突出端的茎)的序列。然后可通过简单的试验来评价产生内部错配(末端错配具有去稳定性并且不可接受，如实例1所述)或一个或至多两个超出双链区的核苷酸的短延伸的效应。
本发明试剂的构筑在所属领域的技术内。举例而言，可在寡核苷酸合成仪上制备寡核苷酸序列。稳定部分可使用习知方法纳入。举例而言，Dabcyl可方便地通过以dabcyl化管柱(Glen Research)起始并以Dabcyl修饰的核苷酸结束添加。非天然核苷酸可用作合成的第一个、倒数第二个和最后一个核苷酸。
在设计并构筑候选试剂后，其茎的解链温度在某些情况下可通过添加荧光DNA结合染料并在激发所述染料的同时实施解链分析根据经验估算(认识到染料本身对Tm有影响)。并且，有关本发明试剂稳定茎的实际解链温度的实际有用信息在许多情况下可通过利用不同的退火温度实施实时PCR扩增以推论方式来获得。需要时，可对茎长度或G-C含量进行调整，以达成期望的Tm。然后通过测定候选试剂在例如下文实例1中所述严格PCR扩增中的性能来评价所述候选试剂对引物错导的各种表现形式和扩增效率的影响。如果当将候选试剂以某一低于1000nM、优选地不超过650nM的浓度纳入实例1的反应混合物中时可获得纯净的扩增子，则可判断所述候选试剂为本发明试剂(参见图1)。使用实例1的分析法来评价候选分析法，不同之处为使用预期的靶及预期的引物。然而，本发明的扩增和分析(扩增加检测)并不限于实例1的条件或程序。虽然本发明试剂当相比1.25单位/25μl反应混合物的聚合酶浓度以低于1000nM的浓度添加时必定抑制引物错导的至少一种表现形式(实例1)，但所述试剂可以任何相对于聚合酶浓度有效的浓度使用，即任何其可防止引物错导但并不实质防止扩增的浓度(或相对浓度)。在评价中利用预期的引物将显示未曾预期的结果，例如不能阻断所述试剂的3′端或忽略的互补性。
本发明包括PCR扩增反应及包括PCR扩增反应的分析，包括其中扩增反应混合物包括具有聚合活性及5′-3′核酸外切酶活性的热稳定DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)且其中至少一本发明试剂纳入扩增反应混合物中的反应。许多本发明试剂抑制聚合酶的活性并在热循环之前或期间以在上述范围内的相对于聚合酶浓度的浓度添加，即对于含有1.25单位DNA聚合酶/25μl反应体积的反应而言不超过1000nM，较佳不超过650nM。某些本发明试剂虽然在低于1000nM之浓度下且优选地在低于650nM的浓度下有效，但对于此一聚合酶浓度其可在更低程度上抑制聚合酶活性且可以高达1500nM或甚至3000nM的浓度添加。在含有一种以上本发明试剂的分析中，各试剂可具有拥有其特有的Tm的茎且可以其特有的浓度添加，以便不同的试剂在扩增过程中步骤的不同部分起作用。如果本发明试剂在热循环期间添加，则添加其时不应将反应混合物吸入工作区中。这样的扩增反应包括对称PCR扩增、不对称PCR扩增及LATE-PCR扩增，如果涉及RNA靶，则任一所述扩增可进一步包括反向转录。PCR扩增可用于制备用于任何目的(例如作为双脱氧测序的起始材料)的扩增产物。在分析中PCR扩增可与扩增产物的检测相结合，所述分析尤其包括采用经标记引物、经标记探针或荧光DNA结合染料(例如SYBR Green或溴化乙锭)的均相分析。所述分析可为其中在多个扩增循环期间进行检测读取的实时分析，或可为其中在扩增结束后实施检测的终点分析。其可是定性的或定量的，包括但不限于定量终点分析。所述分析可经设计来扩增单独的双链或单链产物，或不具有或具有相关单链产物的一种以上的双链产物。
本申请案中所用“LATE-PCR”意指采用聚合酶链反应(PCR)过程的不对称DNA扩增，其利用一种相对于另一种引物(“限量引物”)至少过量5倍的寡核苷酸引物(“过量引物”)，限量引物本身以至多200nM的低浓度使用，以便在大致足够的PCR循环中被消耗来产生可以荧光方式检测到的双链扩增子，其中在扩增开始时限量引物的浓度调节解链温度Tm[0]比扩增开始时过量引物的浓度调节解链温度Tm[0] X高或比Tm[0] X低的程度不超过5℃，较佳高3℃至10℃，且其中热循环在限量引物耗尽后持续多个循环，以产生单链产物，即过量引物的延伸产物。LATE-PCR分析可包括低温检测步骤，其中温度在至少某些线性扩增循环期间降至低于引物退火温度。优选地，此一步骤在延伸后在解链前发生。
本发明也包括完整的PCR试剂盒、部分试剂盒和寡核苷酸组。完整PCR扩增试剂盒包括至少所有的用于实施PCR扩增或分析的试剂，包括至少一对PCR引物、dNTP、反应缓冲液、热稳定DNA聚合酶(优选地具有5′-至-3′核酸外切酶活性的聚合酶)及至少一本发明试剂。均相PCR分析的完整试剂盒进一步包括任何另外的所需检测试剂，例如荧光DNA染料或荧光标记探针。优选地，任一类型的完整试剂盒均包括用于制备试样的试剂且在某些实施例中可包括反向转录酶。本发明的部分试剂盒略去完整试剂盒的至少某些成分，但至少包括热稳定DNA聚合酶(并且必要时，反向转录酶)和至少一本发明试剂。举例而言，商业上习知的“主混合物(master mix)”或“基本试剂盒(basic kit)”通常略去PCR引物和探针。优选部分试剂盒包括除试样制备以外的扩增或分析所需的所有试剂。本发明寡核苷酸组包括至少一对PCR引物和至少一本发明试剂。其可进一步包括寡核苷酸探针或测序引物。
本发明一或多个实施例的细节在附图和下文的实施方式中列出。自实施方式和附图以及自权利要求书可看出本发明的其他特征、目的和优点。
附图说明
图1显示来自经设计用于测试本发明所述试剂抑制活性的引物错导错误定性严格PCR分析的试样的凝胶电泳分析。
图2显示，本发明试剂使得能够进行基于PCR的实时和终点分析。
图3显示自单链DNA产物获得的DNA序列层析谱，所述单链DNA产物使用本文所述试剂在不存在引物错导错误的情况下在70个LATE-PCR扩增循环后产生。
图4显示化学物9-3DD对五重LATE-PCR扩增的影响。
图5证明，当本发明试剂结合Taq聚合酶后，其直到PCR循环温度达到变性步骤才自所述聚合酶释放。
图6显示对于在25℃下本发明试剂对DNA聚合酶活性的影响的直接比较。
图7图解说明用于评价本发明试剂在不存在聚合酶活性的情况下对聚合酶的核酸外切酶活性的影响的分析。
图8图解说明本发明试剂在对称PCR分析中防止引物错配的能力。
图9图解说明用于定量核酸外切酶抑制的分析。
图10显示本发明试剂在LATE-PCR扩增中对于引物-二聚体和引物寡聚物的形成的剂量依赖性效应。
图11显示低浓度试剂9-22DD对两个靶序列和两对引物的双重LATE-PCR扩增的影响。
图12显示改变试剂9-3DD的茎组成对两个靶序列和两对引物的双重LATE-PCR扩增的影响。
图13显示改变试剂9-3bDD的浓度对两个靶序列和两对引物的双重LATE-PCR扩增的影响。
图14显示增加试剂9-3DD的浓度在CT值方面对LATE-PCR扩增效率的影响。
图15显示增加试剂9-3DD的浓度在荧光信号斜率和最终荧光方面对LATE-PCR扩增效率的影响。
图16显示在有和无本发明化合物混合物的情况下实施的多重反应的产物。
图17显示对于化合物12-3DD作用的测试结果。
图18显示对于化合物12-C3DD作用的测试结果。
各附图中的类似标记表示类似元件。
具体实施方式
如上所述，我们已确认我们所认为的引物错导错误的三种不同类型和原因。为评价所有三种类型的引物错配，我们已开发出以下实例1的严格分析。扩增以已剪切DNA开始，其促进引物错导。物理处理，例如将DNA吸入吸液管往往会剪切DNA。此外，因为仅1型引物错导可通过“热启动”试剂和方法防止，所以我们已在分析中纳入许多温度循环(至少60个)。另外，我们已在某些LATE-PCR分析中纳入所使用的低温检测步骤。此外，我们也将引物-二聚体的形成和其进一步的寡聚合和扩增视为另一类型的引物错导。引物-二聚体形成和扩增可在存在和不存在所添加的模板DNA的两种情况下发生，并且我们已开发出分析这些现象的方法。
然而热启动酶仅在扩增开始前有效，这是因为在加热到高温(例如95℃)时其会发生不可逆的改变，本发明的引物错导试剂不会不可逆地出现变性并且如果纳入低温步骤则可在反应的后期具有正向或负向效应，或同时具有两种效应。
可设计对扩增具有不同影响的具有高于或低于特定循环温度的解链温度Tm的茎。在设计茎时，优选地是考虑到解链是在一定温度范围内发生的动态现象，其中Tm指分子中有50％呈双链形式且50％呈单链形式时的温度。我们认为，某些闭合的茎与聚合酶的结合使使保持未与聚合酶结合的分子间的平衡向有利于更多茎闭合的方向移动。如果希望大部分茎在特定循环温度(例如引物退火温度)下闭合，则我们通常以具有通常比所述温度高至少5℃的计算Tm的未经修饰寡核苷酸茎开始，认识到稳定茎修饰将使实际Tm升高数度。相反，如果希望大数茎在特定循环温度下打开，则我们通常以具有比所述特定循环温度低至少5℃(优选地至少低约10℃)的计算Tm的未经修饰寡核苷酸茎开始，同样认识到稳定茎修饰将很可能使实际Tm升高数度。
利用具有不同引物退火温度的特定本发明试剂对扩增效率可具有不同的效应，如在下文实例5中所展示。下文论述的我们的目前计算实施例之一(化合物9-22DD)具有81℃的计算Tm。在每个典型PCR热循环期间当温度自解链温度(例如95℃)降低至引物退火温度(例如55℃)时其将闭合。具有此一茎的试剂将在每个扩增循环期间均具有效应。我们的另一目前优选实施例(化合物9-3DD)具有56℃的计算Tm。当在室温下制备PCR扩增混合物时，此试剂具有闭合的茎并结合至聚合酶。在扩增开始时当温度上升时其仍保持结合状态。结合聚合酶的9-3DD分子在初始高温步骤期间变成未结合状态并打开，并且除非温度低至足以使未结合分子的茎闭合，否则其不再与聚合酶结合。这样，通过使最低循环温度保持在65℃，所述茎不会重新形成。在这些条件下，本实施例将在所述扩增中起热启动剂作用，来防止在扩增开始前发生的引物错导。然而，如果包括低温检测步骤，例如在LATE-PCR循环中延伸后在40℃下培养，以允许低温分子信标或其他经标记探针与在线性扩增阶段期间积聚的单链杂交，则具有56℃计算茎解链温度的茎将闭合，允许所述试剂再次与聚合酶结合，直至达到解链高温。
下文实例1阐述我们用来评价本发明试剂性能的严格LATE-PCR分析。图1显示不仅“普通”Taq DNA聚合酶即具有5′-至-3′核酸外切酶活性但不具有热启动修饰的热稳定DNA聚合酶(泳道b和泳道c)出现引物错导错误，而且热启动Taq聚合酶(泳道d和泳道e)也出现引物错导错误。图1进一步显示消除因引物错导错误形成的非特异性产物，以及仅存在期望的特异性产物，其通过以300nM的浓度添加试剂9-22DD获得，不仅添加到使用热启动聚合酶的扩增(泳道h和泳道i)，而且也添加到使用普通Taq DNA聚合酶的扩增(泳道f和泳道g)。利用实例1中所述分析法评价化合物9-22DD和9-3DD在抑制引物错导上的功效。发现二者均可抑制1型引物错导。通过利用所有循环温度均为60℃和以上的RCR扩增方案，9-3DD的茎的低计算Tm(56℃)允许其仅用作有效的热启动剂。通过保持高于所述茎的熔点，当扩增进行时所述茎不再重新形成。当这样使用时，化合物9-3DD对聚合效率不具有抑制效应。下文实例5在这点上具有指导性。其比较利用试剂9-3DD以及65℃和55℃的退火温度的扩增。当利用65℃时，未发现对聚合效率有影响，这通过CT表现出来。然而，当利用55℃时，CT延迟。这证明，如果温度降低至足以使茎闭合并使聚合酶被接合，则接合在温度升高时仍继续以进行引物延伸，即使引物延伸温度高于茎Tm。另一方面，9-22DD茎的高Tm(81℃)允许茎在每一PCR循环的引物退火步骤期间重新形成发夹。其不仅防止1型引物错导表现形式，而且也防止2型引物错导、3型引物错导和引物-二聚体形成。然而，其确实在一定程度上影响聚合效率，当其以100nM浓度使用时，使用SYBR Green I或靶特异性分子信标探针的实时监测PCR扩增的阈值循环(CT)出现1.5的循环延迟，此证明了所述影响的存在。
实例1中的表I报导将所述严格分析应用到一系列添加剂中，并进一步报导当使用普通Taq DNA聚合酶而非热启动形式时达成预防引物错导表现(即避免可检测水平的因引物错导错误而形成的非特异性产物，以及仅存在期望的特异性扩增产物，例如在图1的泳道f和g中所示产物)所需的最小浓度。在表I中，化合物用我们的命名系统标识。未经修饰的发夹分子由茎环长度标识。举例而言，化合物6-22具有6个核苷酸长的茎和22个核苷酸长的环。由于环标识符以数字开始或仅为一个数字(“22”或“3b”)，所以所述环为核苷酸。进一步对非核苷酸环加以规定。化合物12-C3C3具有12个核苷酸长的茎和为6-碳链(即由6个亚甲基(CH2)基团组成的链)的环。对基本发夹的一端或两端进行各种修饰。这些通过后缀来命名，其中3D为添加至3′端核苷酸的Dabcyl(5′-二甲氧基三苯甲氧基-5-[(N-4′-羧基-4-(二甲基胺基)-偶氮苯)-胺基己基-3-丙烯酰亚胺基]-2′-脱氧尿苷-3′-[(2-氰基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺)，5D为添加至5′端核苷酸的Dabcyl，DD为添加到两个末端核苷酸的Dabcyl，BHQBHQ为添加到两个末端核苷酸的Black Hole Quencher，FF为添加到两个末端核苷酸的萤光团(在此例中为FAM)，AA为添加到两个末端核苷酸的腺苷(A)，TT为添加到两个末端核苷酸的胸苷(T)。
除添加外，也可对基本茎进行数种修饰。后缀2′OM4表示四个末端核苷酸(最后两个位于各茎寡核苷酸或臂上)自脱氧核糖核苷酸变成2′-O-甲基核苷酸。为改变茎的解链温度，我们改变G-C含量。其中茎序列而非茎长度改变的化合物由在末端修饰后缀前的小写字母标识符表示，例如9-3bDD或9-3iDD。表I中各化合物的核苷酸序列(显示也使用碳链环)列于表II中。表I在数个方面上具有指导性。举例而言，其表明，在所述分析中，未经修饰的DNA发夹寡核苷酸或者无效或者仅在高浓度(1000nM或更高)下有效。寡聚物9-22(茎为9个核苷酸长，环为22个核苷酸长)仅在3000nM的浓度下有效，所述浓度为报导的双链DNA抑制引物错导的量。寡聚物6-22(茎为6个核苷酸长，环为22个核苷酸长)和9-5(茎为9个核苷酸长，环为5个核苷酸长)甚至在3000nM的浓度下也无效。然而，当通过向茎的两端添加Dabcyl部分对9-22寡聚物加以修饰来产生化合物9-22DD这一本发明优选试剂时，仅需要50nM的浓度便可防止引物错导的表现。当以类似方式修饰9-3寡聚物时，仅需要100nM的浓度。
表I显示茎长度的影响。虽然茎为9个和12个核苷酸的数种寡聚物当用一对相互作用的Dabcyl猝灭基因修饰时在低浓度下消除引物错导，但寡聚物6-22对修饰并不如此响应：合成物6-22DD并非本发明的试剂，其仅在高(3000nM)浓度下有效。在大多数情况下本发明试剂的茎的长度长于6个核苷酸并且短于14个碱基对。短于14个碱基对的长度目前为优选。
表I也显示增大茎末端结合强度的其他修饰的功效。向寡聚物9-5的茎添加一对相互作用的Black HoleTM猝灭基因产生试剂9-5BHQBHQ，仅需要100nM的9-5BHQBHQ便可消除因引物错导错误形成的非特异性产物，而仅存在期望的特异性扩增产物。用两个2′-O-甲基核糖核苷酸在寡聚物9-5的各端取代产生试剂9-5 2′OM4，对于9-5 2′OM4而言仅需要50nM的浓度。
表I显示，寡核苷酸环的长度可大幅度改变。环长度为3个核苷酸(试剂9-3DD)、5个核苷酸(试剂9-5DD)和22个核苷酸(试剂9-22DD)均产生在100nM或更低浓度下防止引物错导的本发明试剂。同时，表I显示需要一定程度的试探性调整来达成最优化。如果用一对2′-O-甲基核糖核苷酸取代寡聚物9-5的稳定修饰形式中的Dabcyl猝灭基因(比较试剂9-5 2′OM与试剂9-5DD)，则功效水平不改变：仅需要50nM的浓度。然而，对经修饰的寡聚物9-3加以相同的改变(比较试剂9-3 2′OM4与试剂9-3DD)，则虽然功效水平仍较佳，但却有所下降：需要300nM的浓度而非50nM的浓度。相同的数据表明，通过将试剂9-3 2′OM4的环长度增加两个核苷酸来产生试剂9-5 2′OM4可提高功效：仅需要50nM的浓度而非300nM的浓度。可借助于严格分析例如实例1中所述分析来以常规方式对候选试剂加以评价和调整。
表I也显示，由被非核苷酸桥键(环)以相反极性结合在一起的两个互补寡核苷酸构成的化合物在自由寡核苷酸的3′和5′端根据本发明(在所测试实施例中为被Dabcyl部分)加以修饰时也具有活性。表I显示非核苷酸桥键的大小并不十分重要。表I中所述桥键是由3个至6个碳原子的线性链构成的化学连接子，但所属领域的技术人员可构建非核苷酸桥键(环)的许多其他变化形式。表I中的数据表明，当寡核苷酸茎相同时，3个碳原子的链的桥键要优于6个碳原子的链的桥键(在更低浓度下具有活性)，并且虽然未加以严格测试，但我们猜测此差异反映所述桥键的相对灵活性和因此而产生的其升高或降低茎解链温度的效应或能力。我们优选利用化学中性连接子(不带电荷)。
本发明试剂和方法的不同应用列示于下文实例2至4中。实例2阐述在LATE-PCR分析中利用试剂9-22DD，所述LATE-PCR分析为实时分析，但被证明也适合于终点分析。实例2的分析利用是我们同时提出申请的美国临时专利申请案第60/619,654号的标的物的检测技术，申请案第60/619,654号名称为“用于核酸扩增的引物、探针和方法(Primers，Probes and Methods for Nucleic Acid Amplification)”，其全部内容以引用方式并入本文中。所述检测技术包括：同时添加在与双链DNA结合时发荧光的荧光DNA染料(例如SYBR Gold)和荧光团标记的杂交探针，所述探针与在限量引物耗尽后LATE-PCR扩增中产生的单链扩增子互补，其中所述荧光团被来自所述染料的发射激发；激发所述染料；检测来自所述染料和所述荧光团的发射；以及计算荧光信号与染料信号的比率。因此，实例2显示本发明试剂与荧光探针和荧光染料相容，以及当与任一种或二者一起使用时可有效地防止引物错导。
实例4阐述利用两对、三对、四对且甚至五对引物的数个多重LATE-PCR扩增，并且显示当将试剂9-3DD添加到反应混合物中时所有情况中正确扩增子的扩增。尽管对于实例4而言，通过凝胶电泳来分析扩增产物，但所述多重方法也适用于采用另外的检测手段(例如预期扩增子的荧光杂交探针)的多重分析，包括定性和定量分析，例如实时分析。对于实时LATE-PCR分析，我们优选利用在引物延伸步骤后的低温检测步骤和低温探针，举例而言如实例3中所述。
实例13说明，也可利用使用含有一种以上的本发明试剂的扩增反应混合物的扩增反应。例如，扩增反应混合物可同时含有具有高解链温度的本发明化合物和另一具有低解链温度的本发明化合物，每一化合物均以其自身的最优化浓度添加。计算Tm为81℃的化合物9-22DD的茎在反应开始时和在每一热循环期间温度降低后不久呈闭合构造，而计算Tm为58℃的化合物12-3DD仅在相对低的温度下闭合。因此，当反应混合物是在室温下制备时其可起“热启动”作用来防止引物错导，但在退火温度为60℃或更高的随后的RCR扩增热循环期间不闭合并结合至聚合酶。试剂混合物尤其用于构建多重反应，其中将在覆盖多种退火温度的多对引物加以组合来扩增多种扩增子。实例13中所用试剂混合物优于任何单独的试剂。
实例3阐述利用试剂9-3DD来制备扩增单链产物的LATE-PCR扩增，所述扩增单链产物具有足够的量并且基本不含由引物错导产生的非特异性产物，适合用作测序的起始材料。扩增持续70个循环，以确保获得充足的起始材料。我们已发现，某些扩增子比另外的一些扩增子更容易出现2型和3型引物错导错误。在更可能出现此引物错导的扩增中，我们希望本发明试剂的茎在循环温度自解链步骤降至引物退火步骤时闭合。此可通过调节茎Tm、退火温度或同时调节两者来确保。在相关研究中，我们已发现，产物稀释是供测序使用的简单纯化方法，如我们同时提出申请的上述美国临时专利申请案中所揭示。
我们已研究本发明试剂实施例与未经修饰DNA发夹形成寡聚物彼此间的功能和功效对比。我们设计DNA聚合分析来测定在测试试剂存在下Taq DNA聚合酶延伸标记引物的程度。所述分析利用标记有荧光团的引物，所述荧光团由来自荧光染料的发射激发，如我们的同时提出申请的上述美国临时专利申请案中所揭示。分析混合物包含0.5μM浓度的合成寡核苷酸DNA模板、1.5μM浓度的与所述模板的3′端互补并在其5′端标记有Cy5的DNA引物、PCR缓冲液、MgCl2、Taq DNA聚合酶、1∶40,000稀释度的SYBR Green荧光DNA染料和测试试剂。通过添加dNTP达成反应的受控启动。所述反应为恒温反应：其在指定的温度下持续指定的一段时间。为评价测试化合物对DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性的影响，向反应混合物中添加“封阻剂”，即与所述模板的5′端互补的寡核苷酸，其3′端被磷酸阻断并且其5′端标记有ROX。当评价测试化合物对DNA聚合酶的聚合活性的效应时，不使用封阻剂。为便于通过解链曲线分析来分析反应产物，模板、引物和封阻剂经设计，以便下述杂合体可容易地通过其解链温度来辨别：引物-模板、封阻剂-模板、全长延伸产物-模板和部分延伸产物(取决于封阻剂)-模板。实时分析通过定期激发所述染料并定期监测来自所述染料和来自所述两种荧光团(均由来自所述染料的发射间接激发)的荧光发射获得。SYBRGreen I荧光增加指示聚合。ROX荧光降低指示封阻剂的降解。终点分析通过下列步骤获得：通过添加12mM EDTA来终止反应，将SYBR Green I稀释度调节至1∶14,200，并将测试化合物浓度调节至800nM；然后实施标准解链曲线分析，同时激发染料并监测来自两种荧光团中每一种的荧光。
在55℃下培养60分钟来评价化合物9-22、9-22DD和9-3DD。我们也包括无测试化合物的对照。来自在存在封阻剂但无测试化合物下培养的对照的结果表明，TaqDNA聚合酶使引物延伸穿过封阻剂区，尽管在这些条件下并不完全，但根据Cy5荧光却产生具有几乎唯一的解链峰的产物。因此，所述酶展示出聚合活性和5′-3′核酸外切酶活性。以300nM浓度或1000nM浓度存在的化合物9-22DD的结果显示产生部分延伸产物以及以剂量依赖方式对残余封阻剂量的影响。因此，化合物9-22DD在55℃下抑制聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。尤其在1000nM浓度下，全长产物的产生有所降低，表明在所述高浓度下化合物9-22DD开始抑制聚合。
我们用来研究本发明试剂性质的另一分析法在下文实例6中阐述。所述分析检测测试试剂在25℃下抑制由Taq DNA聚合酶导致的延伸的能力。实例7中报导的结果表明，虽然未经修饰的发夹寡核苷酸9-22和9-3相对于对照而言无功效，但试剂9-22DD和9-3DD却可以剂量依赖方式抑制引物延伸。因此，即便在低至足以允许本发明试剂以低浓度抑制聚合活性的温度下，本发明试剂的未经修饰类似物在相同浓度下也不具有所述性质。
我们已利用两种分析法来研究本发明试剂对DNA聚合酶的5′-至-3′核酸外切酶活性的抑制效应。一种分析法阐述于下文实例7中。所述分析法测量热循环期间对5′-至-3′核酸外切酶活性的抑制。图7显示，试剂9-22DD在介于50nM与300nM间的低浓度下以剂量依赖方式抑制核酸外切酶活性。
第二分析法阐述于下文实例9中。其定量地测量在25℃下对5′-至-3′核酸外切酶活性的抑制。图9显示试剂9-22DD在自50nM至1000nM的浓度下的剂量依赖抑制作用。
而在下文实例6中阐述的另一分析法测量试剂对由Taq DNA聚合酶的Stoffel片段实施的引物延伸的抑制作用。如同完整Taq聚合酶的情况，对延伸的抑制要求在寡核苷酸茎上存在经修饰端并且其不显著地受茎间环长度的影响。然而，不同于完整Taq聚合酶的是，Stoffel片段受化合物6-22DD的抑制，化合物6-22DD是其茎上仅有6个核苷酸的试剂。我们可得出结论，Stoffel片段与试剂相互作用的方式不同于完整的聚合酶。
本发明试剂可用于防止对称PCR分析的引物错导，如下文实例8中所展示。所述分析法测量囊性纤维化病基因中序列的扩增，其使用一对等摩尔的具有极类似Tm值的引物。
目前使用的PCR扩增和分析通常包括在室温下制备扩增反应混合物，因此需要将本发明试剂纳入起始混合物中以抑制1型引物错导。然而，情况可能并不是这样。某些自动化方法，例如微流体方法，允许将聚合酶在高温下添加到反应混合物中以进行热启动，从而绕过1型引物错导。对于这样的方法，本发明试剂可在扩增开始后添加。
引物-二聚体形成是可在完全反应(即含有所有扩增所需成分加起始靶序列的反应)中以及在不含有靶序列的反应中发生的引物错导表现形式。引物-二聚体通常是短的双链DNA序列，其由反应中一或多种引物的引物错导形成，引物杂交至或者相同单链引物的另一拷贝或者反应中存在的某一另外的引物并沿其延伸。在存在靶序列的情况下，当形成引物-二聚体时观察到除预期扩增子积聚外，引物-二聚体也出现积聚。在不存在靶序列的情况下，在形成引物-二聚体时，观察到引物-二聚体的积聚但无特异性扩增子的积聚。引物-二聚体也可形成序列比基本引物-二聚体长的寡聚物，因为它们含有所述两种引物中的一种或两种的另外的连接拷贝。寡聚合的过程目前未并十分清楚，但却可容易地通过对反应产物的凝胶电泳或熔点分析来测定。引物-二聚体的形成导致在给定数量的热循环期间产生的预期扩增子的量减少，因为所述两种引物中的一种或两种在引物-二聚体的产生和积聚中被消耗。因此最好是消除引物-二聚体，因为这样既可提高特异性又可提高正确产物的产率。实例10中阐明引物-二聚体的这些特征，以及通过添加本发明所述试剂来消除引物-二聚体。
下列可导致引物-二聚体形成的几率增大：一种引物的3′端与同一引物或不同引物所固有的序列间的序列同源性，以及许多其他因素，例如，提高引物浓度，增加镁浓度，增加引物长度，降低热循环的退火温度，以及增加反应中纳入的引物的总数量。另外，业内习知，在使用非热启动聚合酶的反应中，引物-二聚体形成的可能性要远远高于使用热启动聚合酶的反应。这是因为当混合反应组分时，引物-二聚体杂交和延伸可在相对低的温度下发生。热启动酶降低但不完全消除引物-二聚体的产生和积聚。实例11中阐明引物-二聚体的这些特征，以及通过添加本发明所述试剂来消除引物-二聚体。
引物-二聚体的形成也可对反应的动力学具有细微的影响，并且可观察到通过添加本发明试剂可消除引物-二聚体并在动力学上加以优化。实例12阐述由两对引物组成并产生两种单链产物的LATE-PCR扩增。这些产物之一的动力学积聚通过杂交至荧光探针来检测，并在图13和图14中显示。数据表明，动力学的线性受试剂茎的精确组成(因为其影响解链温度)和试剂浓度的影响。此外，试剂的最优和次优使用可改变LATE-PCR中的线性扩增率并从而可改变反应结束时信号的大小，同时不影响反应的CT值。图15和图16阐明，当以150nM和300nM使用化合物9-3DD时，通过多种模板起始浓度下的CT值可判断扩增效率相同，但在存在300nM 9-3DD时自100和1000模板起始数量产生的信号大小比使用150nM 9-3DD获得的信号要高，这可能是因为未形成引物-二聚体。
                             实例
实例1用于评价引物错导错误的严格分析
为评价PCR扩增反应中的1型、2型和3型引物错导，我们利用剪切基因组DNA实施LATE-PCR扩增，并通过熔点分析和凝胶电泳来研究产物。我们已使用的特定扩增如下：
A.底物：剪切基因组DNA的10个至10,000个基因组当量。购买所述DNA并通过多次冷冻和融化基因组DNA或通过熟习剪切DNA技术的人员习知的任何其他类似方法来加以处理。
B.PCR扩增混合物基(参见Sanchez等人(1994)PNAS 101：1933-1938)：
底物：剪切基因组DNA的2000个基因组
1X PCR缓冲液
Mg+2：3毫摩尔(mM)
dNTP：各为250微摩尔(μM)浓度的四种dNTP
过量引物：序列5′CTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3′(SEQ ID NO：13)，
1000纳摩尔(nM)
限量引物：序列5′CCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3′(SEQ ID NO：14)，50nM
DNA聚合酶：1.25单位/25微升(μl)反应混合物。
C.扩增方案：
低温培养：室温下35分钟。
PCR扩增方案：95℃下高温浸泡15分钟；10个在95℃下10秒、55℃下30秒和70℃下30秒的循环；随后为70个在95下℃下10秒、50℃下30秒和70℃下30秒的循环。
通过利用两种热稳定DNA聚合酶Promega Taq和Invitrogen Taq而不使用任何热启动方法来确定引物错导的基线情况。利用两种不同的市售热启动DNA聚合酶QiagenHot Star Taq和Platinum Taq(Invitrogen)实施另外的扩增。最后，在添加300nM的目前优选本发明试剂实施例的情况下实施另外的扩增。本实例中使用的一个实施例是我们称为合成物9-22DD的试剂(在我们的命名法中，“9”是茎长度，“22”是环长度，而“DD”表示稳定化修饰，在此例中为一对Dabcyl猝灭基因)。化合物9-22DD具有81℃的计算Tm。其具有表II中所示的通过添加5′端和3′端Dabcyl部分修饰的序列。
利用溴化乙锭染色的各种扩增的凝胶电泳结果示于图1中，其在未标记边缘柱中包括尺寸标记物(100个碱基对差异)。以一式两份实施分析，所以各LATE-PCR扩增的产物均有两个泳道。泳道a，其中略去DNA的基线情况；泳道b，其中DNA聚合酶为Promega Taq的基线情况；泳道c，其中DNA聚合酶为Invitrogen Taq的基线情况；泳道d，用热启动酶Qiagen Hot Star Taq取代；泳道e，用热启动酶Platinum Taq取代；泳道f，在添加化合物9-22DD的情况下利用Promega Taq聚合酶扩增；泳道g，利用Invitrogen Taq聚合酶和化合物9-22DD扩增；泳道h，利用Qiagen Hot Star Taq DNA聚合酶和化合物9-22DD扩增；泳道i，利用Platinum Taq聚合酶和化合物9-22DD扩增。
由图1可看出，同时具有聚合活性和5′-3′核酸外切酶活性的普通Taq DNA聚合酶(泳道b和泳道c)产生多种产物尺寸，这些产物中几乎没有一种为由所述引物对定义的期望扩增子，所述期望扩增子是泳道f至i中的产物。转变成经修饰的“热启动”聚合酶(泳道d至e)有助于但仍未能消除因引物错导错误形成的非特异性产物。然而，当化合物9-22DD以300nM的浓度存在时，在所述酶为普通Taq DNA聚合酶(泳道f至g)和所述酶为热启动Taq DNA聚合酶(泳道h至i)两种情况下均获得期望的扩增子，并且没有因引物错导错误形成的非特异性产物。
使用本实例的严格分析，我们已比较多种未经修饰和经修饰DNA发夹分子，彼等不具有末端稳定，具有末端去稳定(通过将相同的核苷酸添加到各臂的末端获得)，具有本发明的末端稳定，和具有不稳定末端添加。为使比较具有定量性，我们使用所述分析法对每一展示出引物错导抑制活性的化合物进行剂量响应测试，旨在确定消除因引物错导错误形成的非特异性产物和仅存在期望的特异性产物(如图1中所示使用普通Taq DNA聚合酶获得)需要的最低浓度。结果示于表I中，其包括各测试试剂的计算茎Tm。表I中报导的各化合物的序列在表II中列出。
表I
  化合物  修饰   茎长度/Tm(bp/C)   环长度(bp)   预防非特异性扩增   最低浓度(nM)
  6-22  无   6/80   22   否
  9-3  无   9/56   3   是   1000
  9-5  无   9/93   5   否
  9-22  无   9/81   22   是   3000
  11-22  无   11/81   22   是   1000
  12-3  无   12/56   3   否
  12-C3  C3间隔子   12/56   3   否
  12-C3C3  C3间隔子   12/56   3   否
  6-22DD  5′3′dabcyl   6/80   22   是   3000
  9-3DD  5′3′dabcyl   9/56   3   是   100
  9-3bDD  5′3′dabcyl   9/62   3   是   100
  9-3iDD  5′3′dabcyl   9/68   3   是   100
  9-5DD  5′3′dabcyl   9/93   5   是   50
  9-22DD  5′3′dabcyl   9/81   22   是   50
  9-5BHQBHQ  5′3′Black Hole QuencherTM   9/93   5   是   100
  9-3 2′OM4  2′O′甲基核苷酸   9/93   3   是   300
  9-5 2′OM4  2′O′甲基核苷酸   9/93   5   是   50
  12-3DD  5′3′dabcyl   12/58   3   是   50
  12-3bDD  5′3′dabcyl   12/63   3   是   100
  12-3cDD  5′3′dabcyl   12/68   3   是   100
  12-C3DD  C3间隔子5′3′dabcyl   12/56   3   是   300
  12-C3C3DD  C3间隔子5′3′dabcyl   12/56   3   是   300
  9-22-3D  3′dabcyl   9/81   22   是   1000
  9-22-5D  5′dabcyl   9/81   22   否
  9-22FF  5′3′Fam   9/81   22   否
  9-22AA  5′3′AA   9/85   22   否
  9-22TT  5′3′TT   9/78   22   否
  9-22TT 5D  5′3′TT和5′dabcyl   9/78   22   否
表II
  化合物   序列   SEQ.IDNO.
  6-22   GGCGTCAGGCATATAGGATACCGGGACAGACGCC   1
  9-3   CATTATAATGAAATTATAATG   2
  9-5   CGCGGCGTCATATAGACGCCGCG   3
  9-22   CGCGGCGTCAGGCATATAGGATACCGGGACAGACGCCGCG   4
  11-22   GCTCGCTGCCGACCGTATATCCTATGGCCCTGACGGCAGCGAGC   5
  12-3   CTTAATTATAATGAAATTATAATTAAG   6
  12-C3   CTTAATTATAAT-(CH2)3-ATTATAATTAAG   7
  12-C3C3   CTTAATTATAAT-(CH2)3(CH2)3-ATTATAATTAAG   8
  9-3b   CGTTATAATGAAATTATAACG   9
  9-3i   CGCTATAATGAAATTATAGCG   10
  12-3bDD   CGTAATTATAATGAAATTATAATTACG   11
  12-3cDD   CGCTATTATAATGAAATTATAATAGCG   12
表I比较数种具有和不具有修饰的DNA发夹，并标识数种为本发明试剂(在小于1000nM浓度下无引物错导产物的纯净扩增子)或为本发明优选试剂(在不超过650nM的浓度下无引物错导产物的纯净扩增子)的端部经稳定发夹分子。未经修饰的发夹用两个数字标识，第一个数字为茎长度，第二个为环长度。表I中出现的本发明化合物具有数种稳定修饰：借助于市售连接子共价结合到端部核苷酸的5′Dabcyl猝灭基因和3′Dabcyl猝灭基因(由后缀“DD”表示)、以类似方式结合的3′Black HoleTM猝灭基因和5′Black HoleTM猝灭基因(由后缀“BHQBHQ”表示)、以及取代茎末端的脱氧核糖核苷酸的两个3′2′-O-甲基核糖核苷酸和两个5′2′-O-甲基核糖核苷酸(由“2′OM4”表示)。对茎末端的去稳定修饰包括在分子的3′和5′端取代一对A或T。添加一对FAM荧光团(被认为彼此间不以茎稳定方式相互作用)具有去稳定性，添加单个5′Dabcyl也具有去稳定性。然而，添加单个3′Dabcyl略微稳定9-22发夹，这通过所需浓度下降表现出来。发夹9-22仅在高(3000nM)浓度下抑制引物错导，而9-22DD在低浓度(50nM)下抑制引物错导。
我们的另一目前优选发夹化合物9-3仅在高(1000nM)浓度下抑制引物错导，而9-3DD和9-3 2′OM4在低得多的浓度(100nM至300nM)下抑制引物错导。而另一实施例9-5DD、9-5BHQBHQ和9-5 2′OM4在低浓度(50nM至100nM)下也抑制引物错导。寡核苷酸9-5具有与寡核苷酸9-22相同的茎，但具有更短的环，其核苷酸为A和T。寡核苷酸9-5的计算茎Tm为93℃，比寡核苷酸9-22的计算茎Tm约高12℃，这是由于环的影响。
对于甚至更长的茎，获得类似的结果。化合物12-3不抑制引物错导，但化合物12-3DD在仅50nM的浓度下便有效。
表I显示经稳定茎可经修饰以改变计算茎解链温度(Tm)。举例而言，Tm为56℃的化合物9-3DD在100nM的浓度下有效。通过改变茎的G-C含量，我们产生化合物9-3bDD(Tm 62℃)和9-3iDD(Tm 68℃)。二者均在100nM的浓度下有效。化合物12-3DD的Tm为58℃，其在50nM的浓度下有效。具有改变的茎的化合物即化合物12-3bDD(Tm 63℃)和化合物12-3cDD(Tm 68℃)在100nM的浓度下有效，这仍然很好。
实例2LATE-PCR终点分析
重复试样间反应动力学的随机变化导致来自杂交探针的信号发散并阻碍终点分析。LATE-PCR显著降低所述问题。利用本发明试剂可进一步提高利用终点检测的能力。图2给出在扩增一扩增子中获得的结果，所述扩增子包含导致泰-萨克斯病(TaySachs disease)的己糖胺酶A的G269等位基因。反应混合物含有0.6μM杂交探针和或者1000个基因组纯合野生型DNA靶(+/+)或者杂合DNA靶(G269/+)。如下扩增每一类型的重复试样：1x PCR缓冲液，3mM MgCl2，250μM各dNTP，25nM的序列为5′CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC 3′(SEQ ID NO：15)的限量引物，1000nM的序列为5′TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT 3′(SEQ ID NO：16)的过量引物，1.25单位的Platinum(热启动)Taq聚合酶，0.6μM的序列为5′Cy5-GGGACCAGGTAAGAA-磷酸3′(SEQ ID NO：17)的Cy5标记的杂交探针和1∶40,000稀释度的SYBR Gold I，存在或不存在100nM的实施例9-22DD，在25μl反应中。PCR循环参数为95℃下3分钟；25个95℃下10秒、65℃下20秒和72℃下20秒的循环；和30个95℃下10秒、65℃下20秒、72℃下20秒、55℃下20秒和45℃下20秒的循环，在72℃下收获SYBR Gold的荧光，在55℃和45℃下收获Cy5的荧光。为校正反应动力学中试管间的变化，用55℃下Cy5信号与72℃下SYBR Gold信号的比率使杂交信号标准化。此标准化的一个结果是遮蔽掉任何CT延迟。
图2中，由圆21标识的线和由圆22标识的线显示在不添加本发明试剂但具有热启动聚合酶的情况下多份重复试样的结果。纯合重复试样(圆21)和杂合重复试样(圆22)可通过其线性图的斜率来辨别。约40个循环后由杂交探针信号下降(“钩状效应”)看出的这些试样中的重复试样间发散和引物错导错误阻碍对这些试样进行终点鉴别。图2中，由圆23至24标识的线显示添加本发明试剂即100nM 9-22DD的结果。在这些条件下，不发生引物错导，在分析过程中保持线性动力学，发散降低，避免钩状效应并且可在50个循环下对纯合和杂合试样进行终点鉴别。
实例3制备用于双脱氧测序的DNA试样
LATE-PCR为不对称扩增方法，当扩增反应以60个和以上热循环实施时其有可能产生大量的适合DNA测序的单链DNA。然而，如此大数目的扩增循环有可能导致出现引物错导产物，据认为包括形成2型和3型引物错导错误，所述引物错导错误通过可检测非特异性产物的积聚来表现，所述非特异性产物最终变成反应中的主要物质。本发明试剂使得当使用70个和以上的LATE-PCR扩增循环时能够合成大量的适合DNA测序的单链DNA而不出现非特异性产物。适合于通过毛细管凝胶电泳的双脱氧测序的试样如下制备：首先制备25μl的含有下列物质的LATE-PCR反应混合物：1XPCR缓冲液，3mM MgCl2，1000nM的具有序列5′GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA3′(SEQ ID NO：18)的过量引物，25nM的具有序列5′CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3′(SEQ ID NO：19)的限量引物，1.25单位的Platinum Taq聚合酶，600nM试剂9-3DD和250μM的各dNTP。化合物9-3DD是将Dabcyl猝灭基因添加到寡核苷酸9-3的各末端核苷酸。实施扩增：95℃下3分钟；10个95℃下10秒、65℃下20秒和72℃下20秒的循环；以及60个95℃下10秒、65℃下20秒、72℃下20秒和45℃下20秒的循环。用1∶40,000稀释度的SYBR Green或2.4μM具有序列5′FAM-CGTGCGCTCTGGTAAGGGTTTGCACG-Dabcyl 3′(SEQ IDNO：20)的低Tm分子信标实施平行反应，来分别监测双链和单链DNA合成。每一试样均含有6ng(约1000个基因组)的人类DNA。另外，在不添加化合物9-3DD的情况下分析对照。
扩增反应的结果为，具有热启动Taq DNA聚合酶但无化合物9-3DD的对照表现出显著的引物错导，表现为在扩增的后期在限量引物已耗尽后SYBR Green信号第二次升高。由于产物为这样的混合物，所以无法测定对照的序列。另一方面，添加有化合物9-3DD的扩增结果表明，在整个70个循环中仅存在期望的特异性产物，SYBRGreen信号无延迟升高。自限量引物浓度和设定的50％的线性扩增效率可计算出，所述反应产生250fmoles/μl的纯净产物。将所述产物递送至布兰代斯大学(BrandeisUniversity)双脱氧测序设备来进行测序。
测序反应使用标准方案实施，如利用Beckman CEQ 2000 DNA测序仪的毛细管电泳。测序反应使用1/5等份的扩增产物即仅使用50fmoles的产物实施。机器产生的序列示于图3中，其沿图表的上部即由其得出所述序列的清楚而明确的产物峰显示序列，而在底部显示极低水平的背景信号。我们通过将机器产生的序列与自GenBank登记号NT 010235获得的扩增子的已知序列进行比较来确认前者的正确性。
实例4多重PCR扩增
在其中同时扩增多种产物的多重反应中，对引物错导的抑制特别重要。数个引物对和扩增产物的存在增加这些反应物质两两和更多者之间出现引物错导相互作用的可能性。在存在或不存在化合物9-3DD的情况下实施由更多数量的扩增子组成的多重反应。对于下文所示引物的不同组合，在不存在或存在300nM试剂9-3DD的情况下建立LATE-PCR反应，体积为25μl，并且由下列组成：试样，1X PCR缓冲液，3mM MgCl2，100μM各dNTP，1000nM过量引物，50nM限量引物，和1.25单位的非热启动PromegaTaq聚合酶。使用以下热循环分布来扩增试样：95℃下3分钟；10个95℃下10秒、65℃下30秒和70℃下30秒的循环；以及40个95℃下10秒、50℃下30秒、70℃下30秒的循环。在反应结束时，在9.5xTBE中的3.5％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳来分析试样。如下测试预期的扩增子和引物对
反应A：与泰-萨克斯病有关的Hex-A基因的两个区域TSD 1278+TSD 1421。
TSD 1278过量引物：5′GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3′(SEQ ID NO：21)
TSD 1278限量引物：5′CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3′(SEQ ID NO：22)
TSD 1421过量引物：5′CCGGGTCTCTAAGGGAGAACTCCT 3′(SEQ ID NO：23)
TSD 1421限量引物：5′CCGGCCGACAACACAAACCTGGTCC 3′(SEQ IDNO：24)
反应B：TSD 1278扩增子，TSD 1421扩增子，和CFTR基因的一区域即CF外显子10扩增子。
此反应含有与反应A处相同的引物对加
CF外显子10过量引物：5′GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3′(SEQ ID NO：25)
CF外显子10限量引物：5′CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3′(SEQID NO：26)
反应C：TSD 1278扩增子，TSD 1421扩增子，CF外显子10扩增子和CFTR基因的另一区域即CF外显子11扩增子。
此反应含有与反应B处相同的引物对加
CF外显子11过量引物：5′TCGAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3′(SEQ ID NO：27)
CF外显子11限量引物：5′TGACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT(SEQ ID NO：28)
反应D：TSD 1278扩增子，TSD 1421扩增子，CF外显子10扩增子，CF外显子11扩增子和人类β球蛋白基因的一区域。
此反应含有与反应C处相同的引物对加
β球蛋白过量引物：5′TGGGTTTCTGATACGCACTGACTCTCTC 3′(SEQ ID NO：29)
β球蛋白限量引物：5′GGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACT 3′(SEQ ID NO：30)
用溴化乙锭对电泳凝胶进行染色，以检测在LATE-PCR反应的指数阶段期间产生的双链产物。图4显示来自多重反应A至D的产物凝胶的相关部分。箭头指向特异性双链扩增产物，未用数字标记的带对应于具有第二结构的特异性单链DNA产物，而星号标识非特异性产物。凝胶对A至D分别对应于反应A至D。每一标记有“+”的凝胶均是来自包括化合物9-3DD的扩增的产物。每一标记有“-”的凝胶均是来自不包括化合物9-3DD的扩增的产物。
凝胶对A显示，在不存在9-3DD化合物时，区域TSD 1278(箭头41)不扩增，但区域TSD 1421(箭头42)以及在凝胶中作为污点出现的大量非特异性产物(主要或全部为双链)扩增。添加9-3DD化合物降低非特异性产物的背景，并能够更纯净地扩增TSD 1278(箭头41)和TSD 1421(箭头42)，表明可预防数种引物错导表现形式。
凝胶对B显示，在不存在9-3DD化合物时，区域TSD 1278、TSD 1421和CF外显子10(箭头42)以及在凝胶中作为污点出现的大量非特异性产物扩增。添加9-3DD化合物消除背景非特异性产物，并获得所有三种预期的扩增子。
凝胶对C显示，在不存在9-3DD化合物时，区域TSD 1278、TSD 1421、CF外显子10和CF外显子11(箭头44)以及由星号表示的非特异性产物扩增。添加9-3DD化合物消除非特异性产物的合成，并获得所有四种预期的扩增子。
凝胶对D显示，在不存在9-3DD化合物时，β球蛋白基因的所选区域(箭头45)不扩增，但TSD 1278、TSD 1421、CF外显子10和CF外显子11以及由星号表示的非特异产物扩增。添加9-3DD化合物消除非特异性产物的合成，并能够扩增所有五种预期的扩增子。
我们已证明，当仅一种靶存在于任何给定测试试样中时(当筛选感染病原体时情况可能如此)，本发明化合物在多重扩增和检测反应中的用途。在这种情况下，存在多对引物(我们利用多对用于LATE-PCR扩增的过量引物和限量引物)，但仅一对引物将对具体试样具有活性。如由SYBR绿荧光和扩增后电泳分析所指示，实际上情况也这样，表明当存在少数几种而非全部底物时本发明化合物可有效地抑制多重反应中的引物错导。
实例5茎Tm和退火温度间的关系
使用包含靶的相同扩增混合物来比较两种不同的LATE-PCR扩增方案。每一扩增均在存在600nM化合物9-3DD和无化合物9-3DD两种情况下实施。如先前所示，化合物9-3DD的Tm(即未经修饰寡核苷酸9-3的计算解链温度)为56℃。使用热启动Platinum Taq DNA聚合酶。两种扩增的不同之处主要在于使用的引物退火温度，或65℃(高于茎Tm)或55℃(低于茎Tm)。扩增循环参数为：
分布图A：95℃下3分钟；10个95℃下10秒、65℃下20秒、72℃下20秒的循环；60个95℃下15秒、55℃下20秒、72℃下20秒、50℃下20秒的循环。
分布图B：与分布图A相同，但是不同的是最后60个循环为95℃下10秒，65℃下20秒，72℃下20秒，45℃下20秒。
使用SYBR Green I荧光染料实时监测扩增反应，以监测双链产物的合成，在LATE-PCR反应中所述合成在限量引物耗尽后达到稳定，除非引物错导导致扩增的后一部分发生变化。在低温检测步骤期间进行读取。
结果示于图5中。组A显示当在10个延伸循环后利用55℃的退火温度时在化合物9-3DD纳入(圆52)和未纳入(圆51)两种情况下分布图A的重复试样的荧光读数。组B显示当在10个延伸循环后利用65℃的退火温度时在化合物9-3DD纳入(圆54)和未纳入(圆53)两种情况下分布图B的重复试样的荧光读数。
图5显示，当使用比本发明试剂的茎Tm低的引物退火温度时(组A)，观察到阈值循环CT有数个循环的延迟。然而，当在整个指数PCR阶段将引物退火温度维持为显著高于茎Tm时(组B)，即使有也仅观察到极小的CT延迟。要注意的是，对于在此扩增中利用的具体扩增子，当使用热启动Taq时在有或无化合物9-3DD时均未观察到2型/3型引物错导，表明这些引物错导错误出现的不可预测性。此实例证明，当反应温度降至55℃时试剂9-3DD的茎闭合，并且在反应的更高温度延伸步骤期间所述试剂仍与聚合酶结合。
实例6于25℃下对DNA聚合酶活性的影响
于25℃下进行一系列引物延伸实验，以评价本发明试剂和其未经修饰的寡核苷酸类似物的效应。每一反应混合物均包括模板、引物和Taq DNA聚合酶。在每种情况下反应均进行2小时。引物用Cy5进行荧光标记。将SYBR Green荧光染料添加到反应混合物中。在延伸反应后，绘制解链曲线，其中激发染料并读取由来自染料的FRET转移产生的荧光团发射，如我们同时提出申请的名称为“用于核酸扩增的引物、探针和方法”的美国临时专利申请案中所揭示。结果示于图6中。
图6，组A，包括解链曲线61，其在延伸通过自反应混合物中略去dNTP被排除时获得。曲线61因此为引物-靶杂合体的解链曲线，显示58℃的Tm。组A也包括数种对照，其含有单独的dNTP或同时含有未经修饰的寡核苷酸9-3(300nM，1000nM)或9-22(50nM，100nM，300nM)。对照由圆62标识的曲线在所有情况下均显示延伸，即在58℃下的引物解链峰消失。图6组B显示在反应混合物中纳入试剂9-22DD的剂量依赖效应：曲线63，50nM；曲线64，100nM；曲线65，300nM。58℃下的峰越大，则在恒温测试条件下预防由聚合导致的延伸的效应越大。图6组C显示在反应混合物中纳入试剂9-3DD的剂量依赖效应：曲线66，300nM；曲线67，1000nM。同样，在58℃下的峰越大，则在所述测试条件下预防由聚合导致的延伸的效应越大。
我们也研究对Stoffel片段(Lawyer等人(1993)PCR Methods and Applications 2：275-287)这种缺乏5′-3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的影响。我们将表I中列出的各种化合物与仅含有模板、荧光标记引物、Stoffel片段和dNTP的负性对照加以比较。在此系列中，在40℃下实施延伸，并且每20秒读取一次SYBR Green读数并持续30分钟以上。用肉眼比较曲线，这较为可靠，因为不是获得的曲线几乎正好与对照重合，便是获得的曲线与对照明显不同。测试化合物以50nM、100nM和300nM的浓度添加。未经修饰的发夹6-22、9-3、9-5和9-22在任何浓度下均不抑制由Stoffel片段导致的延长。化合物6-22DD在三种浓度下均抑制延长，化合物9-3DD、9-5DD和9-22DD也如此。下列化合物在50M或100nM浓度下不抑制延长但在300nM浓度下却抑制延长：9-22-5D、9-22-3D、9-5 2′OM4、9-5BHBHQ和9-32′OM4。
实例7在不存在聚合酶活性下对Tag核酸外切酶活性的影响
我们已发现一种证明在不存在DNA合成下对5′-至-3′核酸外切酶活性的抑制的分析法。所述分析法使用一特异性双链DNA分子作为底物，其中一条链在5′端用FAM荧光团标记，另一条链在3′端用Dabcyl猝灭基因标记。所述荧光团紧挨所述猝灭基因，并且当激发所述荧光团时不发出荧光。加热和冷却时的链变性和退火使得FAM标记链裂解并释放荧光团。我们认为，循环以某种方式产生Taq聚合酶5′-至-3′核酸外切酶活性的底物。因此荧光增加提供测量Taq聚合酶5′-至-3′核酸外切酶活性的量度。
所述25μl反应混合物含有在1X PCR缓冲液中的300nM双链DNA模板、3mMMgCl2、1.25单位(U)Taq聚合酶，以及存在或不存在适宜浓度的9-22DD化合物。所述反应除双链DNA外不含有任何dNTP，也不含有任何其他的核酸靶。双链DNA模板的互补链的序列为5′FAM-AGTGTGATGATGGTGAGG-磷酸3′(SEQ ID NO：31)和5′-ACTTTCAACTCTGTCT 3′-Dabcyl(SEQ ID NO：32)。将试样在95℃下变性3分钟，然后使之经受95℃下10秒、67℃下30秒、72℃下30秒和45℃下20秒的循环。荧光在每个循环期间在45℃下获得。
通过对数种试样实施所述分析获得的荧光读数报导于图7中，其中对读数进行标准化以在相同的背景荧光下开始。曲线76为对照，显示不存在Taq聚合酶时的荧光。Taq聚合酶纳入其余的试样中。曲线71显示当不添加试剂9-22DD时的荧光增加结果。荧光在30个循环中稳定上升。曲线72至75显示当试剂9-22DD分别以50nM、100nM、200nM和300nM纳入时的荧光增加。向上述反应中添加9-22DD化合物以剂量依赖方式降低观察到的荧光增加。
实例8对称PCR扩增
我们利用剪切基因组DNA和一对等摩尔浓度的具有类似Tm的引物实施实时PCR扩增。我们在不添加和添加400nM试剂9-3DD的情况下实施重复分析。经由用SYBRGreen染料以及通过凝胶电泳和溴化乙锭染色在总DNA积聚的动力学方面评价试剂的效应。
预期扩增靶为以单碱基转换形式出现在内含子19中的CFTF基因的等位基因(GenBank登记号AC000061)。所述25μl反应混合物含有120皮克(pg)的剪切人类基因组DNA底物、1x PCR缓冲液、5mM MgCl2、250μM各dNTP、1∶40,000稀释度的SYBR Green、1000nM的正向引物：序列5′TAATTACAAGAGTCTTCCAT 3′(SEQID NO：33)，Tm 56.6℃，和1000nM的反向引物：序列5′CATGAATAGAACATTTCCTT3′(SEQ ID NO：34)，Tm 56.3℃，和1.25单位的非热启动Invitrogen Taq聚合酶，不存在或存在400nM的试剂9-3DD。使用以下热循环分布扩增试样：95℃下3分钟，60个95℃下10秒、55℃下30秒和72℃下30秒的循环，并在72℃下监测SYBR Green荧光，最后为30秒1℃增量的54℃至96℃温度梯度。在反应终了时，在存在于0.5xTris、硼酸、EDTA溶液(TBB)中的3.0％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳来分析自每组反应中随机选择的数份试样。
图8列出所获得的结果。图8组A中的扩增曲线显示60个循环的SYBR Green I荧光，其中由圆81标识的曲线为不含有试剂9-3DD的重复试样，而由圆82标识的曲线为具有400nM 9-3 DD的重复试样。源于两组试样的荧光信号的动力学表明，在不存在试样9-3 DD时总双链DNA的积聚速度略快于在存在所述试样时的速度，但在两组反应中60个循环积聚的双链DNA总量实际上相同。
图8的组B显示用溴化乙锭染色的电泳凝胶。在左侧，泳道a为尺寸标记物(50个碱基对差异)，泳道b至i为无试剂9-3DD的试样。在右侧，泳道j至q为具有400nM 9-3DD的试样，泳道r为尺寸标记物。结果显示，不含有本发明试剂的反应产生正确的产物以及许多具有更高分子量的非特异性产物，而含有试样9-3DD的反应仅产生正确的产物。此外，通过凝胶中正确产物带的相对强度判定，含有试剂9-3DD的反应产生的正确产物约为不含有试样9-3DD的反应的两倍。
动力学分析和电泳分析合起来揭示，产生非特异性产物的反应81产生荧光信号的速度要比仅产生正确产物的反应82快。SYBR Green染料插入双链DNA中时不涉及序列特异性。因此，与反应81中更直的动力学相比，反应82的弯曲动力学可用于判断对称反应是否仅积聚正确的产物。
实例9核酸外切酶抑制的定量
本实例阐述用于测量本发明试样对Taq DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性抑制效应的严格分析。此分析使用类似于由M.W.Kaiser，N.Lyamicheva，W.Ma，C.Miller，B.Neri，L.Fors，和V.I.Lyamicheva在J.Bio.Chem.， 274，21387-21394页(1999)中阐述的引物-模板系统，不同之处为模板在5′端标记有Cy5，并且所述分析在存在SYBR GreenI下进行，SYBR Green I为当与双链DNA结合时发出荧光的DNA染料。此分析所用模板由退火至具有核苷酸序列5′-ACGAGCGTCTTTC-3′(SEQ ID NO：36)引物的寡核苷酸序列5′-Cy5-AAAACGCTGTCTCGCTGAAAGCGAGACAGCGAAAGACGCTCGT-3′(SEQID NO：35)构成。较长的寡核苷酸形成具有两个长度不同的单链尾的发夹结构。所述模板的较短5′尾含有Cy5荧光团并由4个腺苷残基组成，模板较长的3′尾用作引物寡核苷酸的靶，这样所述引物位于5′模板尾正前方，其中1个碱基对重叠。向此模板-引物复合体中添加SYBR Green I，结果SYBR Green I结合到所述复合体的双链DNA区。当用480nm激光激发SYBR Green I时，来自所结合DNA染料的荧光能量完全被Cy5吸收，所述吸收被认为是经由荧光共振能量转移发生，在最大SYBR Green发射波长(最大发射波长：521nm)处未检测到荧光。Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性使5′尾水解，结果使Cy5部分自模板-引物复合体除去，恢复可检测到的SYBR GreenI荧光。在Taq DNA聚合酶存在下SYBR Green I荧光恢复的动力学提供5′-3′核酸外切酶活性的定量量度。本发明试剂抑制Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性并减缓SYBRGreen I荧光的增加。
所述分析由下列组成：在1X PCR缓冲液中混合的0.5μM上述模板和1.5μM的上述引物，3mM MgCl2，1∶40000稀释的市售SYBR Green I原液(Molecular Probes，Eugene，OR)，1.25U Taq聚合酶(Invitrogen，Calrsbad，CA)，不存在或存在50nM、100nM、300nM或1000nM的9-22DD化合物，体积为25微升(μl)。反应混合物中未添加dNTP，因为所述分析不依赖于DNA聚合酶活性。在25℃下建立无模板和引物的反应混合物，以促进9-22DD化合物与Taq DNA聚合酶间的反应。然后将试样置于冰上，补充模板和引物，并保持在冰上直至反应开始。负性对照缺乏Taq DNA聚合酶。反应通过在ABI Prism Sequence Detector 7700中在25℃下培养试样60分钟启动，并每30秒收集一次SYBR Green I通道中的荧光。对于每一控制和试剂9-22DD的每一浓度，将三次不同试验加以平均。
图9列出分析结果。检测到的SYBR Green I荧光提供关于5′-3′核酸外切酶活性程度的量度。“无Taq”对照不显示SYBR荧光信号，这与SYBR Green I荧光被Cy5完全吸收和完全不存在5′-3′核酸外切酶活性(线96)一致。添加Taq聚合酶恢复SYBRGreen I荧光并为在所述分析条件下5′-3′核酸外切酶活性的最大水平提供基线(线91)。向反应混合物中添加9-22DD化合物以剂量依赖方式减缓SYBR-Green I荧光的恢复，这是因为9-22DD对Taq聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性具有抑制作用(线92，50nM；线93，100nM；线94，300nM；线95，1000nM)。下表III根据在25℃下培养60分钟后达成的相对SYBR Green I荧光水平定量不同浓度的9-22DD化合物对5′-3′核酸外切酶活性的抑制百分比。
表III
  反应   荧光   ％5′-3′核酸外切酶抑制
  无9-22DD   1378单位   0.0
  50nM9-22DD   1315单位   4.6
  100nM9-22DD   1155单位   16.2
  300nM 9-22DD   989单位   28.2
  1000nM 9-22DD   624单位   54.7
  无Taq：   0单位   无5′-3′核酸外切酶活性
实例10在存在和不存在靶DNA时阻止引物-二聚体形成和寡聚合
以25μl的终体积在存在或不存在100个基因组人类胎盘DNA(Sigma，St Louis，MO)下建立一系列LATE-PCR扩增反应。在此实验中，LATE-PCR扩增反应由下列组成：1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，3mM MgCl2，0.25mM dNTP，1000nM过量引物，50nM限量引物，0.25μM FAM标记的探针链，0.3μM Dabcyl标记的反向互补链，1.25单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。所述引物和探针的序列如下：
过量引物：5′GTTTCTTTGCTGCCGTGTTC 3′(SEQ ID NO：37)
限量引物：5′CCCCAGAGACCCCAGTTGCTAACCAGAC 3′(SEQ ID NO：38)
FAM标记的探针链：5′[TET]AGACAGAGTTGAAAGTCAGG[Phos]3′(SEQ IDNO：39)
Dabcyl标记的反向互补链：5′ACTTTCAACTCTGTCT[Dabcyl]3′(SEQ ID NO：40)
这些引物和探针扩增并检测涵盖人类p53基因的外显子5和6的488个碱基对(bp)扩增子。
扩增在ABI Prism 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems，CA)中以由下列组成的热分布实施：1个在95℃下3分钟的循环；25个在95℃下10秒、64℃下30秒、75℃下30秒的循环；和35个在95℃下10秒、64℃下30秒、75℃下30秒、45℃下20秒的循环，在45℃步骤期间在TET通道中检测荧光。
所得扩增产物在存在于0.5X TBE缓冲液中的3％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳分析2小时，并用溴化乙锭染色。结果示于图10中。泳道3、5、7、9、11中的试样在无基因组DNA的情况下制备。泳道2、4、6、8、10中的试样在有基因组DNA的情况下制备。泳道1含有呈100个碱基对梯的电泳尺寸标记物。如下将试剂9-22DD添加到起始反应中：泳道2和3，0nM；泳道4和5，50nM；泳道6和7，100nM；泳道8和9，200nM；泳道10和11，300nM。
毗邻凝胶的右侧，我们已标记正确产物的尺寸以及我们推断为引物-二聚体和引物寡聚物的尺寸。图10中所示结果表明，在用基因组DNA启动的反应中，增加试剂9-22DD的浓度以剂量依赖方式起作用来预防包括引物-二聚体和引物寡聚物在内的非特异性产物的表现，从而增加正确产物的特异性和产率。增加试剂9-22DD的浓度也防止在不含有基因组DNA的反应中引物二聚体和引物寡聚物的表现。
实例11在双重反应中预防引物-二聚体形成
以25μl的终体积在存在或不存在100个基因组人类胎盘DNA(Sigma，St Louis，MO)下建立一系列LATE-PCR扩增反应。在此实验中，LATE-PCR扩增反应由1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)、3mM MgCl2、0.20mM dNTP组成。在每份试样中Taq聚合酶以1.25单位使用。第一扩增靶序列(产物1)为囊性纤维化病基因外显子11的一部分并用100nM的限量引物：5′GACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT 3′(SEQ ID NO：41)和2,000nM的过量引物：5′TCCAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3′(SEQ ID NO：42)扩增。第二扩增靶序列(产物2)为囊性纤维化病基因外显子10的一部分并用50nM的限量引物：5′CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3′(SEQ ID NO：43)和1000nM的过量引物：5′GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3′(SEQ ID NO：44)扩增。
扩增在ABI Prism 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems，CA)中在95℃下实施2分钟，随后为25个95℃下10秒、56℃下15秒、70℃下20秒的循环，随后为50个95℃下10秒、56℃下15秒、70℃下20秒和45℃下30秒的循环，获得荧光。
所得扩增产物在存在于0.5X TBE缓冲液中的3％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳分析2小时，并用溴化乙锭染色。结果示于图11中。在泳道1至6中分析的反应利用非热启动Taq聚合酶，而在泳道7至12中分析的反应利用Taq聚合酶加热启动抗体。试剂9-22DD以100nM添加至泳道反应4至6和10至12中以加以分析。
毗邻凝胶的右侧，我们已添加我们对于扩增产物身份的注释，所述扩增产物包括产物1和产物2的单链扩增子(ssDNA)和双链扩增子(ds DNA)以及我们推断为引物-二聚体的更短产物。其他非特异性产物用星号标记。用非热启动聚合酶扩增而无本发明试剂(泳道1至3)产生引物-二聚体和其他非特异性产物。用热启动聚合酶扩增而无本发明试剂(泳道7至9)基本上略为纯净，但仍显示引物错导表现形式。向热启动扩增中添加本发明试剂(泳道10至12)仅产生期望的产物。将本发明试剂添加到非热启动扩增(泳道4至6)中消除引物-二聚体并且在三份重复试样中有两份(泳道4和6)也消除所有其他非特异性产物，仅一份重复试样(泳道5)表现非特异性产物。图11中所示结果表明，低浓度(100nM)的试剂9-22DD在使用非热启动Taq聚合酶或热启动Taq聚合酶时均足以防止引物-二聚体的形成，并且进一步显示，即使在使个靶和两对引物的扩增中与非热启动Taq聚合酶一起使用时，低浓度试剂9-22DD也几乎足以防止所有的引物错导表现形式。
实例12通过防止引物-二聚体形成来优化双重实时PCR和实时PCR的动力学
我们设计双重实时LATE-PCR分析来同时扩增鼠科动物Oct4和Xist基因的外显子内的序列(GenBank登记号分别为NM_013633和L04961)。每一反应均以50μl的终体积实施并含有下列试剂：1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其由20mMTris-HCl，pH8.4，和50mM KCl组成，3mM MgCl2，0.4mM各dNTP，50nM具有序列5′TGGCTGGACACCTGGCTTCAGACT 3′(SEQ ID NO：45)的Oct4限量引物，2μM具有序列5′CAACTTGGGGGACTAGGC 3′(SEQ ID NO：46)的Oct4过量引物，100nM具有序列5′GGTCGTACAGGAAAAGATGGCGGCTCAA 3′(SEQ ID NO：47)的Xist限量引物，2μM具有序列5′TGAAAGAAACCACTAGAGGGCA 3′(SEQ ID NO：48)的Xist过量引物，1μM具有序列5′TET-CCG CCT GGG ATG GCA TAG TGT GGA AGGCGG-Dabcyl 3′(SEQ ID NO：49)的低Tm Oct4分子信标和2单位的抗体复合的PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。化合物9-3DD或化合物9-3bDD也以下文所规定浓度纳入所述PCR混合物中。在此实例中不添加用于检测Xist扩增子的分子信标。各分析也在2.5μl的体积中含有按照PurAmp方案(参见Hartshom等人(2005)BMC Biotechnol 5：2)用于细胞裂解和反向转录所需的试剂。在此双重LATE-PCR中，此等试剂的最终浓度如下：2.5mM乙酸Tris，pH8.4，3.75mM乙酸钾和0.4mM乙酸镁(稀释的cDNA合成缓冲液，ThermoScriptTM RT-PCR System，Invitrogen，Carlsbad，CA)，另外的50μM各dNTP，0.13mM异硫氰酸胍，6.7μM β-巯基乙醇，0.7μM柠檬酸钠，pH7.0，0.7×10-4％(vol/vol)二甲基亚砜和0.2×10-4％月桂酰肌氨酸。
小鼠基因组DNA(Sigma，St Louis，MO)也添加到各分析中，提供PCR扩增模板。添加到各试管中基因组的数量基于6pg/基因组尺寸计算(参见Vendrely和Vendrely(1949)Experientia 5：327-329)。
扩增在ABI Prism 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems，CA)中用由下列构成的热分布实施：1个在95℃下5分钟的循环；15个在95℃下10秒、63℃下20秒和72℃下30秒的循环；和40个在95℃下15秒、55℃下25秒、72℃下35秒和45℃下30秒的循环，其中，在45℃下在TET通道中获取荧光。
在PCR结束时，扩增产物在存在于0.5X TBE缓冲液中的3％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳分析2小时，并用溴化乙锭染色。对于所述两种共扩增基因，均可见具有预期尺寸的双链和单链产物，表明为有效的双重LATE-PCR。
图12阐明改变试剂9-3DD的茎成分对上述双重LATE-PCR动力学的影响，上述双重LATE-PCR含有两组用于扩增Oct4和Xist基因内的两种非同源序列的引物。所述图显示由通过与TET-Oct4分子信标杂交积聚Oct4扩增子产生的荧光信号。结果表明，在300nM 9-3DD(具有三角形的线)或相同浓度的其经修饰形式9-3bDD(无三角形的粗线)的存在下在各所分析基因组浓度下(10个基因组，圆122；100个基因组，圆123；1000个基因组，圆124)，CT值极为相似。相反，实时荧光信号的动力学受所述试剂茎的成分的影响。化合物9-3bDD与9-3DD相比具有Tm更高的茎，因此，我们认为，最优地防止引物-二聚体形成，这又在所有所测试基因组浓度下产生极直和平行的信号。相反，在存在不太严格的化合物9-3DD时，某些荧光信号具有更陡的斜率，但另外一些在反应早期便达到稳定，表明引物二聚体形成的随意性。在不同模板浓度和存在化合物9-3DD下产生的信号比在存在化合物9-3bDD(具有经修饰的茎)下获得的信号的平行性要低。线性扩增产生完全平行的信号(具有恒定斜率)理想上较为合意并且对于终点型分析而言尤其适宜。
含有9-3DD试样的琼脂糖分析揭示可能为引物二聚体的尤其在较高模板数下明显的带，在较低模板数下的极小的带与引物一致。这样的带在分析含9-3bDD的试样时未出现。
图13阐明改变试剂9-3bDD的浓度对本实例中所述并且也用于图12中的双重LATE-PCR的影响。在此例中，将试剂9-3bDD的浓度自300nM(无三角形的粗线)降低至200nM(具有三角形的线)再次影响线性扩增的斜率，这是因为形成引物二聚体，如通过琼脂糖凝胶分析所确认。结果，某些含有低起始模板数(10个基因组，圆132)的试样在最后一次循环(“终点”)时具有比含有更高起始模板数(100个基因组，圆133，和1000个基因组，圆134)高的荧光。
也在使用一对引物扩增一个模板的LATE-PCR中测试本专利申请案中所述试剂对PCR效率的浓度效应。扩增的模板为与图12和图13中阐述的双重扩增中所用相同的鼠科动物Oct4序列，引物和分子信标序列也与所述反应中的相同。
每一反应均以100μl的终体积实施并含有下列试剂：1X PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其由20mM Tris-HCl，pH8.4，和50mM KCl组成，3mM MgCl2，0.25mM各dNTP，50nM Oct4限量引物，2μM Oct4过量引物，1μM低Tm TET-Oct4分子信标和2单位的抗体复合的PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。化合物9-3DD也以150nM或300nM或450nM的浓度纳入所述PCR混合物中。如同上述双重的情况(参见图12和图13)，各分析也在10.5μl的体积中含有按照PurAmp方案的细胞裂解和反向转录所需的试剂。在此LATE-PCR中，此等试剂的最终浓度如下：5mM乙酸Tris，pH8.4，7.5mM乙酸钾和0.8mM乙酸镁(稀释的cDNA合成缓冲液)，1ng/μlRandom Hexamers和另外的100μM各dNTP(Thermo ScriptTM RT-PCR System，Invitrogen，Carlsbad，CA中的所有组分)，0.4mM异硫氰酸胍，20μM β-巯基乙醇，2μM柠檬酸钠，pH7.0，2×10-4％(vol/vol)二甲基亚砜和0.5×10-4％月桂酰肌氨酸。
小鼠基因组DNA也添加到各分析中并提供PCR扩增模板，如此实例中所述双重LATE-PCR中所规定。扩增同样在ABI Prism 7700 Sequence Detector中用与所述双重反应中所详述热分布相同的热分布实施。在PCR结束时，扩增产物在存在于0.5X TBE缓冲液中的3％琼脂糖凝胶中通过凝胶电泳分析2小时，并用溴化乙锭染色。所述双链和单链产物在凝胶上均可见并具有预期的尺寸，表明有效的LATE-PCR扩增。
也测试增加化合物9-3DD的浓度对Oct4模板扩增效率的影响。CT值自使用每一测试的9-3DD浓度：150nM、300nM、450nM实施的含有5个基因组(对于所测试的每一9-3DD浓度，两个重复试样的平均值)、20个基因组(对于所测试的每一9-3DD浓度，两个重复试样的平均值)、100个基因组和1000个基因组的实时PCR分析获得。每一浓度下各CT点系列的线性回归示于图14中，其中三角形为450nM浓度，空白正方形为300nM，填充正方形为150nM。自此图立即可看出，450nM 9-3DD将荧光信号的出现大大延迟于阈值以上，也改变PCR扩增的剂量依赖性(参见在10个基因拷贝和40个基因拷贝处的点，其远离回归线)。另一方面，使用150nM或300nM 9-3DD获得的CT值极为相似，表明模板拷贝数与荧光信号的第一次出现之间有线性关系。
然而，对荧光实时图案的分析突出两种条件(浓度)间的差异，如图15中所示。由100个基因组(圆151)或1000个基因组(圆152)产生的曲线的斜率在使用300nM9-3DD时(无三角形的粗线)比在使用150nM 9-3DD(具有三角形的线)时要陡，表明更为严格的条件即300nM消除引物二聚体，从而提高扩增效率。
实例13多种本发明试剂的用途
制备LATE-PCR反应混合物来逐个扩增五种不同的人类基因DNA起始材料的靶序列并在多重反应中一起扩增所有五种序列。各靶序列需要其自己的限量和过量引物对。靶序列为(1)191个碱基对的Globin等位基因，(2)312个碱基对的Tay Sachs G269等位基因，(3)452个碱基对的Tay Sachs 1278和1421等位基因，(4)线粒体超变区1的549个碱基对区段，和(5)包含p53基因外显子7和8的611个碱基对区段。所述25μl反应混合物含有1x PCR缓冲液(Invitrogen)、0.4mM dNTP、3mM Mg++、0.24xSYBR Green和1.5单位的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)。限量引物以50nM的浓度添加，超量引物以1000nM的浓度添加。将所有5对引物均添加到多重反应中。热循环为45个在95℃下10秒、64℃下20秒和72℃下1分钟的循环。
具有单个引物对和单个靶的反应混合物和具有所有五对引物和所有五种靶的反应混合物均在存在25nM化合物9-2DD和100nM化合物12-3DD的组合的情况下扩增。也在不添加任一本发明试剂的情况下扩增所述五重反应混合物。通过凝胶电泳检验反应产物。各扩增的凝胶电泳结果显示于图16中，其包括在泳道r中的尺寸标记物(100个碱基对差异)。中央泳道g至k分别为靶序列(1)至(5)的单独扩增的产物。泳道1至q为包括化合物9-22DD和化合物12-3DD的混合物的六份重复试样五重扩增的产物。泳道a-f为不包括本发明试剂的六份重复试样五重扩增的产物。图16显示，与不添加任何化合物的多重反应相比，本发明混合物增强扩增(更多和更纯净的期望扩增子)，表明试剂混合物可用于本发明试剂盒、扩增和分析中。
实例14作用测试模式
我们已设计一种测试法来定量地研究本发明试剂的引物错导降低(提高特异性)和聚合酶抑制效应，我们认为其将第一作用模式和第三作用模式区别开来。所述测试为PCR扩增分析，其基本上类似于实例1中所述分析，下列除外：所述扩增反应混合物含有一半(1000个基因组)的剪切基因组DNA，热循环的最后部分自70个循环降低至40个循环。扩增在添加变化量的本发明试剂下实施，添加量通常为25nM、50nM、100nM、300nM、1500nM和3000nM。所述测试包括两个分析：第一，特异性分析，扩增产物的解链曲线；和，第二，抑制性分析，合成的双链产物的实时荧光曲线。
图17至18分别给出两种本发明试剂化合物12-3DD和化合物12-C3DD的一部分分析结果。在各图1中，栏I给出数种选择的试剂浓度的解链曲线，如所显示。在各图中，栏II给出相同浓度的实时荧光曲线，如所显示。参照图17，栏I解链曲线显示，化合物12-3DD在100nM和以上的浓度下(最低浓度100nM略高于实例1中所述反应中的最低浓度)达成高特异性(避免引物错导)。参照图17，栏II实时荧光曲线显示，当化合物12-3DD的浓度在100nM以上增加时聚合酶抑制程度逐渐增加，直到反应在高于1000nm的浓度下基本停止。抑制反应反映在产生的总双链产物(包括期望的特异性产物和引物错导的非特异性产物)的较低量上，表现为稳定的荧光水平和CT值中的延迟(100nM为19.6，300nM为21.1，1500nM和3000nM下不存在即至少40)。参照图18，栏I解链曲线显示，化合物12-3DD在300nM和以上的浓度下(最低浓度300nM略高于实例1中所述反应中的最低浓度)达成高特异性。参照图18，栏II实时荧光曲线显示，聚合酶抑制随着化合物12-C3DD的浓度在300nM以上增加而逐渐增大(CT值为100nM下18.8，300nM下18.8，1500nM下21.1，而3000nM下为24.5)，但反应甚至在3000nM的浓度下也不停止。
比较图18和图18，可看出，化合物12-C3DD总性能比化合物12-3DD总性能的浓度依赖性要小。因此，对于此特定扩增反应，当化合物12-C3DD浓度自300nM变至1500nM时产物的CT延迟和稳定的荧光增加与当化合物12-3DD浓度自100nM变至300nM时产生的结果大致相同。
已阐述许多本发明实施例。然而，应理解，在不背离本发明精神和范围的情况下可作出各种修改。因此，其他实施例在随附申请专利范围的范围内。

Claims (20)

1、一种试剂，当其以不超过650nM的浓度添加到包括1.25单位的热稳定DNA聚合酶/25μl反应混合物的PCR扩增混合物中时，能在聚合酶链反应(PCR)扩增中防止至少一种引物错导表现形式产生至少一种扩增DNA产物，所述试剂为不可延伸寡核苷酸，其具有茎-环结构、不是所述至少一种扩增DNA产物的杂交探针、具有长度大于6个核苷酸的茎、其远离所述环的末端经稳定化、以及具有低于94℃的计算茎解链温度(Tm)。
2、如权利要求1所述的试剂，其中所述环为包含至少3个核苷酸的寡核苷酸。
3、如权利要求1所述的试剂，其中所述环为非核苷酸化学连接子。
4、如权利要求1至3中任一项所述的试剂，其中经共价结合到所述茎的3′和5′核苷酸的相互作用的化学部分而使所述茎末端稳定化。
5、如权利要求4所述的试剂，其中所述相互作用的化学部分无一具有荧光性。
6、如权利要求1至5中任一项所述的试剂，其中在低于其Tm的温度下为双链的所述茎的部分具有9个至12个碱基对的长度。
7、如权利要求1至6中任一项所述的试剂，其中所述计算茎解链温度在72℃至85℃的范围内。
8、如权利要求1至6中任一项所述的试剂，其中所述计算茎解链温度在50℃至71℃的范围内。
9、一种方法，其用于在聚合酶链反应(PCR)扩增期间防止至少一种引物错导表现形式自包括磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和热稳定DNA聚合酶的扩增反应混合物产生至少一种扩增DNA产物，所述方法包括向所述反应混合物中添加至少一种权利要求1至8中任一项所述的试剂。
10、如权利要求9所述的方法，其中所述试剂具有寡核苷酸环并且所述试剂的浓度不超过300nM。
11、如权利要求9所述的方法，其中所述试剂具有为非核苷酸化学连接子的环并且所述试剂以不超过1000nM的浓度添加到所述反应混合物中。
12、如权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述扩增为包括在低于所述Tm的温度下实施的低温检测步骤的指数后线性PCR(LATE-PCR)分析。
13、如权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述扩增为对称PCR分析。
14、如权利要求9至13中任一项所述的方法，其中在所述扩增后进行终点检测。
15、一种用于实施聚合酶链反应(PCR)扩增的试剂盒，其包括热稳定DNA聚合酶、至少一对PCR引物、dNTP和至少一种权利要求1至8中任一项所述的试剂。
16、如权利要求15所述的试剂盒，其进一步包括用于分离核酸的试剂。
17、一种用于实施聚合酶链反应(PCR)扩增的寡核苷酸组，其包括至少一对PCR引物和至少一种权利要求1至8中任一项所述的试剂。
18、如权利要求17所述的寡核苷酸组，其进一步包括至少一个荧光标记探针，所述荧光标记探针与由所述至少一对PCR引物定义的扩增产物杂交。
19、如权利要求17或权利要求18所述的寡核苷酸组，其中所述至少一对引物包括以适合实施指数后线性PCR(LATE-PCR)扩增的比率的限量引物和过量引物。
20、如权利要求17至19中任一项所述的寡核苷酸组，其中所述扩增产物为单链产物。
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