JP5848255B2

JP5848255B2 - 化学修飾されたプライマーを用いた、ＤＮＡを超えるｍＲＮＡの優先的増幅

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Publication number: JP5848255B2
Application number: JP2012542401A
Authority: JP
Inventors: スタイナーロリ; ツァンアリソン; ジー．ウィルスティーブン; ニュートンニコラス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2030-12-10
Also published as: CN102639719A; CA2781133C; CN102639719B; JP2013513359A; ES2440073T3; WO2011069676A2; EP2510118B1; EP2510118A2; US20110312040A1; WO2011069676A3; US8614071B2; CA2781133A1

Description

発明の技術分野
本発明は、核酸増幅の分野に関する。より具体的には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＴ−ＰＣＲ）による、ＲＮＡ増幅の分野に関する。

発明の背景
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、ＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを発生させ、且つ指数関数的に増幅させる方法である。当該方法は、遺伝子発現の分野において定性的および定量的利用がなされている。当該方法により、生物によって発現されるｍＲＮＡのレベルを検出且つ測定することが可能である。

ＲＴ−ＰＣＲにおける第一の問題点は、ＲＮＡ調製物におけるゲノムＤＮＡの混入（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）である。ＲＮＡ単離試薬の主要な販売業者によって、および当該技術分野において認められている通り、ほとんどのＲＮＡ単離技術では、有意な量のゲノムＤＮＡの混入したＲＮＡが生じる（Ambion, Austin, Tex., (Life Technologies, Inc.), Technical Bulletin #176 “Avoiding DNA contamination in RT-PCR.”）。少量の混入ＤＮＡが指数関数的に増幅され得るＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＤＮＡによる汚染は特に問題となる。ＲＴ−ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を減少させる１つの方法は、デオキシリボヌクレアーゼで、例えばＤＮＡａｓｅＩを用いて試料を前処理することを含む（Huang, et al. (1996) Biotechniques 20:1012-1020を参照）。残念ながら、この手法には問題がある。ＲＴ−ＰＣＲの過程中における新生ＤＮＡアンプリコンの消化を防止するために、前処理後にＤＮＡａｓｅは完全に不活化されなければならない。しかし、ＤＮＡａｓｅの完全な不活化には高温が必要であり、それによりＲＮＡ鋳型の分解が起こる。加熱の代わりに、ＤＮＡａｓｅをフェノール抽出によって、またはＤＮＡａｓｅを反応混合物から除去する種々の複雑且つ高額な試薬を用いることによって、ＤＮＡａｓｅを化学的に除去することができる。要約すると、多段階の追加の工程を必要とし、そして通常分解されやすいＲＮＡ標的を脅かすため、ＤＮＡａｓｅの使用は、ＲＴ−ＰＣＲにおいて実用的ではない。

ＤＮＡ混入の問題は解決困難であると考えられるために、ＲＴ−ＰＣＲによるＤＮＡ混入の増幅を防止することに注力されている。かかる方略は、真核細胞ゲノムＤＮＡにおけるイントロンの存在を利用する。成熟ｍＲＮＡにイントロンは存在しない。プライマーがイントロンをフランキングする（ｆｌａｎｋ）ように設計される場合、当該イントロンは、ｍＲＮＡから生じるアンプリコンには含まれない。しかしイントロンは、対応するゲノムＤＮＡ鋳型から生じるＲＴ−ＰＣＲアンプリコン中には含まれ得る。当該イントロンが十分に大きい場合、より短いｍＲＮＡ配列（及びその後のｃＤＮＡ配列）は優先的に増幅され、一方でゲノムＤＮＡはさほど効率的に増幅されないか、又は全く増幅されない。（Ambion, Tech. Bull. #176）。最悪のシナリオにおいて、ゲノムＤＮＡは所望のｍＲＮＡ標的と共に増幅される。しかし、２つのアンプリコンは電気泳動で区別され得る。

残念なことに、プライマーの設計は、ＤＮＡ混入の問題を必ずしも解決できるわけではない。多くのＰＣＲ試験は現在、リアルタイムＰＣＲを含む。リアルタイムＰＣＲは、電気泳動を含まずに、核酸を増幅と同時に検出できる技術である。（米国特許第５，９９４，０５６号、第５，８７６，９３０号、および関連特許を参照）。リアルタイムＰＣＲは、電気泳動せずに、同一セットのプライマーを用いて生成した、大きさの異なるアンプリコンを解析することはできない。ｍＲＮＡ標的を検出するリアルタイムＰＣＲプローブであればどれでも、対応するゲノムＤＮＡ混入物を必ず検出し得る。ｍＲＮＡ及びその対応するゲノムＤＮＡは、区別され得ない。したがって、対象領域におけるイントロンが小さすぎて、ゲノムＤＮＡの増幅を防ぐことができない場所では、リアルタイムＰＣＲは使用することができない。

したがって、ゲノムＤＮＡ混入物が、ＲＴ−ＰＣＲにおいてｍＲＮＡと共に増幅されないことを確保する、プライマー設計の新規方法を創出することが望ましい。かかるプライマー設計方法により、アンプリコンに存在するイントロンの大きさとは無関係に、ｍＲＮＡ標的の定量的増幅が可能となるだろう。

発明の概要
第一の態様において、本発明は、試料中のエキソン‐エキソン接合部（ｅｘｏｎ−ｅｘｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）を含むメッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅方法であって、以下のステップ：ａ）第一のオリゴヌクレオチドを前記ｍＲＮＡ標的とハイブリダイズさせ、ＲＮＡ指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成を行うことができる少なくとも１つの酵素を用いてＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行い、ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングし（ｓｐａｎ）；そしてｂ）前記第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる少なくとも１つの酵素と共に使用して、ステップａ）の産物を増幅すること、ここで前記第二のオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的である、を含む、前記方法に関する。本発明を実施するためのオリゴヌクレオチド、反応混合物及びキットもまた、開示される。

図１は、本明細書中の以下で定義される、エキソン‐エキソン接合部の略図である。図２は、本発明のプライマー設計の略図である。図３は、本発明の方法で使用される、配列番号３のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図４は、本発明の方法で使用される、配列番号６のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図５は、本発明の方法で使用される、配列番号７のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図６は、本発明の方法で使用される、配列番号１０のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図７は、本発明の方法で使用される、配列番号１１のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図８は、本発明の方法で使用される、配列番号１２のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図９は、本発明の方法で使用される、配列番号１３のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図１０は、本発明の方法で使用される、配列番号１４のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。図１１は、本発明の方法で使用される、配列番号１５のプライマーを使用した場合の増幅曲線を示す。

発明の詳細な説明
定義
本発明の明細書及び請求の範囲において、以下の定義が使用される。以下で特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。

用語「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」は、ゲノムＤＮＡから転写され、タンパク質合成のためのコード配列を運搬するＲＮＡのことである。真核生物において、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、タンパク質コード配列を形成するために修飾される。通常、当該修飾は、「スプライシング」又はｍＲＮＡ配列からのイントロンの除去を含む。幾つかの場合において、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列はまた、タンパク質コード配列を形成するために、「編集」により変化される。

ｍＲＮＡ合成に関して、用語「対応するゲノムＤＮＡ」は、問題となっているｍＲＮＡのための鋳型を含むゲノムＤＮＡのことである。対応するゲノムＤＮＡは、ｍＲＮＡの鋳型、例えば問題となっている遺伝子と類似した又は相補的な追加の配列、並びにその遺伝子及び偽遺伝子の複製物を含み得る。通常、対応するゲノムＤＮＡはｍＲＮＡと同一の生物由来である。しかし対応するゲノムＤＮＡは、特定のウィルスの場合のように、異なる生物由来であってもよい。ＲＮＡ形態で存在するレトロウィルスの場合、対応するゲノムＤＮＡは、（ウィルスＤＮＡを組み込んだ）プロウィルスを含む宿主ＤＮＡであってもよい。

用語「核酸」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクロチド、ヌクレオチド類縁体など）のことである。それは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体、ＰＮＡ−ＲＮＡ複合体などを含む。それは、直鎖で又は分岐した形で、共有結合により連結されたヌクレオチドを含む。核酸は通常、１本鎖又は２本鎖であり、一般的にホスホジエステル結合を含む。しかし幾つかの場合においては、代替的なバックボーンを有し得る核酸類縁体が含まれる。代替的なバックボーンは、例えばホスホロアミダイト（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925）；ホスホロチオエート(Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; 及び米国特許第５，６４４，０４８号明細書)、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト・リンケージ（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)参照）、並びにペプチド核酸バックボーン及びリンケージ（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895）を含む。他の核酸類縁体は、プラスに帯電したバックボーンを有するもの（Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）、非イオン性バックボーンを有するもの（米国特許出願公開第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号明細書）、並びに非リボースバックボーンを有するもの、例えば米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号明細書に記載されたものを含む。１又は２以上の炭素環式糖（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp. 169-176参照）を含む核酸も、核酸の定義に含まれ、類縁体は例えば、Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35にも記載されている。リボース‐ホスフェートバックボーンのこれらの修飾は、さらなる部分、例えば標識の追加を容易とするように、又は生理環境においてかかる分子の安定性及び半減期を変更するためになされてもよい。

核酸中で通常見られる天然のヘテロ環塩基（例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）に加えて、核酸はまた、非天然のヘテロ環塩基、例えばSeela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640に記載されているものを有するヌクレオチド類縁体を含んでもよい。ヌクレオチド中で使用される特定の塩基は、融解温度（Ｔｍ）変更剤として作用する。例えば、これらの幾つかは、７−デアザプリン（７−デアザグアニン、７−デアザアデニンなど）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えばプロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣなど）などを含む。米国特許第５，９９０，３０３号明細書を参照のこと。他の代表的なヘテロ環塩基は例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン、及びそれらの誘導体を含む。

「ヌクレオシド」は、糖部、糖部の誘導体、又は糖部の機能的等価体（例えば炭素環）と共有結合で連結した、（少なくとも１つの単素環、少なくとも１つのヘテロ環、少なくとも１つのアリール基などを含む）塩基又は塩基性置換基を含む、核酸構成成分のことである。例えば、ヌクレオシドが糖部を含むとき、塩基は通常、糖部の１’位と連結される。上記の通り、塩基は天然塩基又は非天然塩基であり得る。ヌクレオシドは例えば、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド、及び炭素環ヌクレオシドを含む。

「ヌクレオチド」は、例えば、糖部、又はその誘導体若しくは等価体と共有結合で連結された、１、２、３又は４個以上のホスフェート基を有するヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドのリン酸エステルのことである。

「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２個、しかし通常５〜５０個、より一般的には１５〜３５個のヌクレオチドを含む核酸のことである。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、種々の因子に依存する。当該因子は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能及び当該オリゴヌクレオチドの用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、当業者に既知の適切な任意の方法により製造され得る。例えば当該方法は、適当な配列のクローニング及び制限消化、又は、直接的化学合成を含む。当該化学合成法は、例えば、Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル法；Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法; Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホロアミダイト法；Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191のトリエステル法；自動合成法；米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固相法、又は当技術分野で既知の任意の他の化学的方法を含む。

「プライマー」は、鋳型核酸とハイブリダイズすることができ、ヌクレオチド組み込み酵素を用いて鎖延長又は鎖伸長を可能とするオリゴヌクレオチドである。他のプライマー長が利用されることもあるが、プライマーは通常、１５〜３５ヌクレオチドの範囲内である。短いプライマーは一般的に、鋳型核酸との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度で使用される。鋳型核酸のサブ配列と少なくとも部分的に相補的であるプライマーは通常、鋳型核酸とハイブリダイズし、延長が起こるために十分なものである。しかし延長の成功には一般的に、プライマーの３’末端においてより高い相補性（すなわち、鋳型鎖とのより少ないミスマッチ）が必要となる。望ましくは、放射線学的、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、又は化学的技術によって検出可能な標識を組み込むことによって、プライマーは標識され得る。

「プライマー延長」は、追加のヌクレオチドを当該プライマーへと付加する、酵素の作用のことである。

「鋳型核酸」、「鋳型」又は「標的」は、プライマーがハイブリダイズして、適切な条件下で延長され得る、核酸のことである。核酸増幅に関連して、「標的」は好ましくは、少なくとも２つのプライマー配列、及び介在配列と少なくとも部分的に相補的である配列からなる、核酸の領域である。鋳型又は標的核酸は、単離された核酸断片として存在し得るか、又はより大きな核酸断片の一部であり得る。標的核酸は、基本的に任意の生物資源に由来するか、またはそれから単離され得る。当該生物資源は例えば、微生物、複雑な生物学的混合物、組織、血清であって、ヒト患者試料又は組織および血清、古い又は保存された組織又は試料、環境分離株などを含む。さらに、鋳型核酸は場合により、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローン化されたゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、酵素により断片化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ、化学的に断片化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ、物理学的に断片化されたＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを含む、又はそれらに由来する。鋳型核酸はまた、当技術分野で既知の技術を使用して、化学的に合成され得る。

「リアルタイムＰＣＲ」アッセイは、ＰＣＲサイクル中においてアンプリコンが検出され且つ定量化される、ＰＣＲアッセイである。典型的なリアルタイムＰＣＲアッセイは、当該サイクル中で繰り返し行われる、増幅産物の光学的検出を含む。増幅の評価基準は、「閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ）」又は「Ｃｔ」であり、それは、バックグラウンドを超える蛍光が最初に検出されるときのサイクルのことである。より速いＣｔ値は、閾値レベルへの迅速な達成を反映しており、したがってより高い初期鋳型インプット、又はより多くの効率的な増幅を反映している。より遅いＣｔ値は、より少ない量の初期鋳型インプット、又は非効率的であって若しくは阻害された増幅を反映し得る。

本明細書において使用される「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントのことである。したがって遺伝子は、コード配列、介在非コード配列（イントロン）及び場合により、当該コード配列の発現のために必要とされる調節配列を含む。

「部位（ｍｏｉｅｔｙ）」又は「基（ｇｒｏｕｐ）」は、例えば分子のようなものが分割された一部分のことである（例えば官能基、置換基など）。例えばヌクレオチドは、典型的には塩基部位（例えばアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシルまたは類縁体）、糖部位、及び１若しくは２以上のホスフェート基を含む。

「アルキル基」は、直鎖、分岐鎖、又は環状の、飽和炭化水素基であり、全ての位置異性体を含む。例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル、及び１−エチル−２−メチルプロピル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシルなどである。アルキル基は一般的、約１〜２０個の炭素原子を含み、より一般的には約２〜１５個の炭素原子を含む。アルキル基は、置換又は無置換であり得る。

１つの産物が他の可能性のある産物よりも優先して（すなわち、１００％未満だが、過半数）製造される場合、増幅アッセイは「選択的」又は「標的選択的」である。標的配列の望ましくないバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）の増幅が検出可能である限り、アッセイは「選択的」であると表される。望ましくない標的の増幅が検出できないアッセイは、「特異的」と呼ばれる。検出方法がより高感度となるとき、以前は特異的であることが知られていた幾つかのアッセイは、単に選択的であることとなる。すなわち、標的の望ましくないバリアントの幾つかの増幅が検出可能となる。したがって本発明において、用語「特異的」は、厳密に標的特異的な増幅、及び標的選択的増幅の両方を含む意味である。

「相補的核酸」は、別の核酸の少なくとも１つのサブ配列とハイブリダイズすることができるか、又は二重鎖を形成することができる、核酸又は核酸セグメントである。相補性は、二重鎖を形成するために完全である必要はなく、すなわち二重鎖中の核酸は「部分的に相補的」であり得る。核酸技術分野における当業者は、多くの変数を経験的に考慮することによって、二重鎖の安定性を決定することができる。当該変数は例えば、相補性領域の長さ、相補性領域における塩基の組成及びヌクレオチド配列、核酸の溶液のイオン強度、及びミスマッチ塩基対の発生を含む。

検体、例えば試料中における核酸に関して、用語「検出可能」とは、最先端の検出方法を用いて検出可能であることを意味する。検出方法は改良されるため、現在検出不能なレベルの検体は検出可能となり得るものとして理解される。したがって本明細書において、用語「検出可能」とは、研究室設備内で合理的に利用可能であり、実用的であり、そして当業者に既知である好適な分析技術を使用して、ある種類のものの存在又は非存在を測定する能力のことである。

「ヌクレオチド組み込み酵素（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ）」は、核酸へのヌクレオチドの組み込みを触媒する酵素のことである。ヌクレオチド組み込み酵素の例は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リバーストランスクリプターゼ、テロメラーゼなどを含む。

「熱安定酵素」は、選択された時間で上昇した温度をかけたときに、安定であり（すなわち、分解又は変性に対して耐性であり）、且つ十分に触媒活性を維持する酵素のことである。例えば、二重鎖核酸を変性させるために必要な時間、上昇した温度をかけたときに、熱安定ポリメラーゼは、その後のプライマー延長反応を起こすために十分な活性を保持する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号明細書に例示されている。本明細書において使用される、熱安定ポリメラーゼは通常、温度サイクル反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）における使用のために適切である。熱安定核酸ポリメラーゼの例は、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、サーマス種（ｓｐ．）Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ）ポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ）ポリメラーゼを含み、例えばＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等を含む。

「修飾された」酵素は、少なくとも１つのモノマーが対照配列とは異なるアミノ酸ポリマーを含む酵素、例えば天然若しくは野生型の酵素、又は酵素の別の修飾形態のことである。修飾の例は、モノマー挿入、欠失、及び置換を含む。修飾された酵素はまた、２又は３以上の親に由来する、識別可能な構成成分配列（例えば構造ドメイン又は機能ドメインなど）を有するキメラ酵素を含む。対照配列の化学的修飾を含むものも、修飾された酵素の定義内に含まれる。修飾されたポリメラーゼの例は、Ｇ４６ＥＥ６７８ＧＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＬ３２９ＡＥ６７８ＧＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＬ３２９ＡＤ６４０ＧＳ６７１ＦＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＬ３２９ＡＤ６４０ＧＳ６７１ＦＥ６７８ＧＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６ＥＥ６７８ＧＣＳ６ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ポリメラーゼ、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５ＧＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８ＧＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、Ｅ６７８ＧＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどを含む。

用語「５’→３’ヌクレアーゼ活性」又は「５’−３’ヌクレアーゼ活性」は、核酸鎖合成に通常関連し、それにより核酸が核酸鎖の５’末端から除去される、核酸ポリメラーゼの活性のことである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩがこの活性を有するが、一方でＫｌｅｎｏｗ断片はこの活性を有さない。

「実質的に５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠く」ポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較して、５’−３’ヌクレアーゼ活性が５０％以下（例えば２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満）であるポリラーゼのことである。５’−３’ヌクレアーゼ活性の測定方法及び測定条件は、当技術分野で周知である。例えば米国特許第５，４６６，５９１号明細書を参照のこと。５’→３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片；Ｎ末端の２３５個のアミノ酸を欠くサーマス・アクアチクスＤＮＡポリラーゼ（Ｔａｑ）（例えば、米国特許第５，６１６，４９４号明細書に記載のもの、及び一般的に当技術分野で「Ｓｔｏｆｆｅｌ断片」と呼ばれるもの）を含む。他の例は、５’−３’ヌクレアーゼ活性に関与するドメインを除外するか又は不活化するための、十分な欠失（例えばＮ末端の欠失）、変異、又は修飾を有する、熱安定ＤＮＡポリメラーゼを含む。例えば、米国特許第５，７９５，７６２号明細書を参照のこと。

「標識」は、分子と（共有結合的に、又は非共有結合的に）結合し、当該分子についての情報を提供することができる基のことである。標識の例は、蛍光標識、比色分析用標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基（ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇｇｒｏｕｐ）、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、及び酵素を含む（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどを含む）。

「エキソン」は、ゲノムＤＮＡ中に、及びメッセンジャーＲＮＡの成熟体中に存在する核酸である。エキソン配列は、タンパク質へと翻訳される、遺伝子の一部である。エキソンは一般的に、オープン読み枠（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ））の一部である、コード配列を含む。

表現「エキソン‐エキソン接合部」は、２つのエキソンに隣接するイントロンの除去時に、前記エキソンの接合から生じる、２つのエキソン間の接合部のことである。

表現「標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする（ｓｐａｎ）第一のオリゴヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチド中のイントロンによって分離されている２つのエキソンをスパニングすることができるオリゴヌクレオチドのことである。図１は、説明の目的のためのみに提供される。図１は、エキソン及びイントロンを含む典型的なオリゴヌクレオチドの略図である。図１は、オリゴヌクレオチド中のエキソン‐エキソン接合部の例を示し、この接合部をスパニングする第一のオリゴヌクレオチドは、矢印で示される。第一のオリゴヌクレオチドは、イントロンではなく、イントロンに隣接する２つのエキソンにハイブリダイズすることによってエキソン‐エキソン接合部をスパニングする。

「イントロン」は、ゲノムＤＮＡには存在するが、メッセンジャーＲＮＡの成熟体中には存在しない核酸のことである。イントロン配列は、ＲＮＡへ転写されず、タンパク質へと翻訳もされない遺伝子の一部である。

「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能遺伝子産物（例えばタンパク質又は機能ＲＮＡ）の合成において使用される工程のことである。遺伝子発現の一部は通常、ゲノムＤＮＡの一部を、「転写」として知られる工程によってＲＮＡ分子へと複製することを含む。遺伝子発現試験は、遺伝子中の情報を使用して合成されたＲＮＡ又はタンパク質を試験することを含む。

「逆転写」は、１本鎖ＲＮＡ鋳型から２重鎖ＤＮＡ分子を製造する工程のことである。逆転写は、リバーストランスクリプターゼ活性を有する核酸ポリメラーゼによって触媒される。

「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の変形であり、ここでＲＮＡ鎖は、最初にそのＤＮＡ相補体（ｃＤＮＡ）へと逆転写され、生じたｃＤＮＡは、従来のＰＣＲを使用して増幅される。ＲＴ−ＰＣＲは、リバーストランスクリプターゼ活性を有する酵素を、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する熱安定酵素を必要とする。幾つかの場合において、２つの活性は、同一の酵素に存在する。

核酸増幅反応において、「ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒｔ）」は、１又は２以上のプライマーの必須のハイブリダイズ特異性を提供するために十分に昇温されるまで、少なくとも１つの重要な試薬が、反応混合物への追加を保留する（または、反応混合物中に物理的に存在する場合には、試薬は不活化されたままである）手順のことである。「ホットスタート酵素」は、ホットスタート手順において、「保留された（ｗｉｔｈｈｅｌｄ）」又は不活性な試薬として作用することができる酵素、典型的には核酸ポリメラーゼである。かかるホットスタート酵素は例えば、酵素を化学的に修飾することによって得られ得る。かかる化学修飾された酵素の非限定の例は、市販のＥａｇｌｅＴａｑである。これらのホットスタート酵素はまた、ポリメラーゼに結合する抗体又はアプタマーを用いて得られ得る。例えばそれは、市販のＨａｗｋＺ０５である。

用語「検出不能」は、本願発明時点において実施される検出方法によって検出できないことである。用語「検出不能」は、検出されるべき物質が完全に存在しないことを意味してはいないと理解されるべきである。それは、本願発明時点において既知の従来法によって、検出されるべき物質の検出ができないことを意味する。

用語「分析特異度（ａｎａｌｙｔｉｃａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、所望の核酸標的に対して、アッセイが依然として特異的である、所望ではない核酸標的の量のことである。例えば、ｍＲＮＡ増幅アッセイにおいて、「ゲノムＤＮＡの１マイクログラムの分析特異度」は、ゲノム遺伝子ＤＮＡ混入のレベルが１反応あたり１マイクログラムであるとき、ＤＮＡは検出可能に増幅されず、一方でｍＲＮＡは検出可能に増幅されることを意味する。

本発明は、化学修飾されたプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ混入物の存在下、メッセンジャーＲＮＡの優先的増幅方法を提供する。本発明は、試料中のＤＮＡを超える、ｍＲＮＡの優先的増幅及び検出のために有用な方法、キット及び反応混合物を含む。本発明は、種々の真核生物及び真核生物組織（患者の組織及び臨床適用における試料を含む）由来のｍＲＮＡを検出、同定及び定量化するために使用され得る。

ｍＲＮＡを定量化するための例示的適用は、遺伝子発現試験である。遺伝子発現試験は、基本的及び応用的研究、並びに臨床診断の一部である。臨床適用において、メッセンジャーＲＮＡのレベルは、疾患の進行を反映し得る。薬剤治療において、ｍＲＮＡのレベルは、特定の遺伝子発現経路を標的化する薬剤の有効性を反映し得る。例えば、ＥＧＦ受容体ファミリーに対する抗体を用いた治療は、ＥＧＦＲ経路における多くの遺伝子の下方制御をもたらす。Tzahar et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta 1337:M25。ＥＧＦＲ経路の遺伝子発現において測定された変化は、特定の薬剤の有効性を反映する。

典型的な試験において、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡは、試料から単離され、そして最適な核酸分析手順にかけられる。残念ながら、ＲＮＡとＤＮＡとの間の化学的特性における類似性により、ＲＮＡとＤＮＡが同時に単離される。幾つかの分析方法のために、少量のＤＮＡ混入物の存在は許容される。しかし、より感受性の増幅法のために、例えばＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲにとって、少量のＤＮＡでさえ、試験結果を誤らせ得る。大部分の場合において、ＲＮＡの特定の種類に特異的なプライマー及びプローブは、対応するゲノムＤＮＡ配列とハイブリダイズして、ゲノムＤＮＡ混入物の同時増幅及び同時検出をもたらす。したがって、ゲノムＤＮＡ混入物の存在は、偽陽性の結果を生み、そしてそれは遺伝子発現を誤って示すか、または定量的結果を誤らせ、その結果、不正確な遺伝子発現レベルを示す。

ＤＮＡ混入の問題は一般的に、解決困難なものと考えられる。すなわち、幾つかのＤＮＡは常にＲＮＡ調製物中に存在し得る。したがって、混入物の効果を最小化することが望ましい。ＲＴ−ＰＣＲに関して、ＤＮＡ混入物の増幅を最小化することが望ましい。ｍＲＮＡに対する特異性の指標として、各々のＲＮＡ特異的アッセイが、分析特異度によって、又はゲノムＤＮＡ混入物の量によって特徴付けられ得る。ここで当該ＤＮＡは検出可能に、ｍＲＮＡと共に増幅されない。

本発明は、ゲノムＤＮＡの存在下、臨床的に許容される分析特異度でｍＲＮＡを選択的に増幅する方法である。例えば、本発明を限定しないが、説明する一例において、分析特異度は１反応あたり１マイクログラムのゲノムＤＮＡである。混入物のいくらかの増幅は、本発明の方法において生じ得るものと理解される。しかし方法は、特定の許容される最大レベルまで存在するＤＮＡ混入物の増幅が、使用される最先端の検出方法によって検出不能である限り、満足に実行されるものと考えられる。

ＲＴ−ＰＣＲ反応において混入するＤＮＡの増幅を減少又は除外するための既存の方法は、イントロンの存在を利用する。標的ｍＲＮＡは、介在配列又はイントロンが欠如していることによって、対応するゲノムＤＮＡとは異なる。混入しているゲノムＤＮＡの増幅を防止するための１つの方法は、イントロンをフランキングする（ｆｌａｎｋ）、増幅プライマーを設計することである。プライマーがイントロンをフランキングする場合、ゲノムＤＮＡは異なる大きさの産物を生成し得るか、又はイントロンが非常に大きいときには、産物を生成しない。残念ながら、幾つかの場合において、目的の配列中におけるイントロンは、増幅を防ぐ程度に十分に大きくはない。望ましくない増幅が起こるとき混入を避けるために、大きさによって増幅産物を分離するために、余剰の工程が必要である。

混入するＤＮＡの増幅を減少させるか排除する別の方法は、２つのエキソンの接合部をスパニングする（ｓｐａｎ）プライマーを設計することによって、イントロンを利用することである。その場合において、プライマー‐鋳型ハイブリッドの５’部位と３’部位との間のイントロンの存在のために、プライマーは、アニールして、ゲノムＤＮＡ配列と安定なハイブリッドを形成することができない。残念ながら、実用において、かかる方法は必ずしも成功していない。幾つかの場合において、ゲノムＤＮＡと、イントロンをスパニングするプライマーとの間で、安定なハイブリッドが形成される。これは、イントロンの「ループアウト（ｌｏｏｐｏｕｔ）」のためか、又はプライマーの３’端とイントロン配列との間の十分な類似性のために起こり得る。実施例において説明される通り（表１）、ゲノムＤＮＡは、エキソン‐エキソン接合部をスパニングする少なくとも１つのプライマーの存在下、ＰＣＲによって容易に増幅される。

ｍＲＮＡに対する、エキソン‐エキソン接合部スパニングプライマーの特異度は、特定の化学修飾によって大きく改善され得ることが発見された。

化学修飾されたヌクレオチドを有する増幅プライマーが近年報告されている。例えば、修飾ヌクレオチドを含むプライマー、具体的には環外アミノ基が共有結合修飾された塩基を有するヌクレオチドを含むプライマーが、米国特許第６，００１，６１１号明細書に記載されている。かかるヌクレオチド、及びかかるヌクレオチドを組み込んだオリゴヌクレオチドの合成もまた、米国特許第６，００１，６１１号明細書に記載されている。

一の実施形態において、本発明は、対応するゲノム混入物の存在下、エキソン‐エキソン接合部を含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的の選択的増幅のためのオリゴヌクレオチドを含む。当該オリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ標的に対して少なくとも部分的に相補的である配列を含み、当該標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングし、そして環外アミノ基で共有結合修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む。

本発明は一般的に、標的核酸の特異的領域を選択的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーの設計及び使用を含む。増幅プライマーの設計のためのパラメーターは、当業者に既知である。かかる設計のために有用なプログラムは、例えば、ＶｉｓｕａｌＯＭＰ（ＤＮＡＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）、Ｏｌｉｇｏ６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）、及びＤＮＡＳｔａｒ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む。

本発明は、環外アミノ基で化学修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを有する少なくとも１つのプライマーの使用を含む。好ましくは、修飾されたプライマーは、エキソン‐エキソン接合部スパニングプライマーである。環外アミノ基の共有結合修飾を有するヌクレオチドは、米国特許第６，００１，６１１号明細書に記載されている。かかるヌクレオチド、及びかかるヌクレオチドを組み込んだオリゴヌクレオチドもまた、米国特許第６，００１，６１１号明細書に記載されている。

本発明において、環外アミノ基の適切な修飾は、以下の特性の存在に基づいて選択され得る：（１）当該修飾は、二重鎖核酸において、修飾塩基と相補的塩基とのワトソン‐クリック塩基対を干渉する（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）が、防止（ｐｒｅｖｅｎｔ）しない；（２）当該修飾は、ｍＲＮＡ鋳型を使用する、修飾塩基を含むプライマーの、逆転写酵素による伸長を干渉するが、防止しない；（３）当該修飾によって、当該修飾を組み込んだ鎖に対して相補的な鎖の合成を可能とする；そして（４）当該修飾は、ＤＮＡ鋳型を超える、ｍＲＮＡ鋳型に対する、修飾を組み込んだプライマーの選択性を増大させる。

環外アミノ基の例は、アデノシンの６位、グアノシンの２位、及びシチジンの４位におけるアミノ基を含む。相補鎖核酸との塩基対形成に参画する環外アミノ基はまた、ヌクレオチド中における、非従来型の窒素含有塩基において存在する。非従来型塩基を有するヌクレオシドの例は、限定されないが、３−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、３−メチルグアノシン、５−メチルシチジン、及び５−ヒドロキシメチルシチジンを含む。かかる非従来型塩基の環外アミノ基の適切な修飾はまた、本発明の経験的方法に従って選択され得る。

修飾されたアデニン、グアニン及びシトシン塩基の構造は、各々以下に示される：

［式中、Ｓは糖部を表し、Ｒは修飾基を表す］。

上記の４つの特性を有する種々の修飾基が想定される。本発明の好ましい実施形態において、修飾基は以下の構造：

［式中、
Ｒ₁及びＲ₂は、水素、アルキル、アルコキシ、置換若しくは未置換のアリール、及びフェノキシから独立して選択される］
を有する。

アルキル基は分岐していてもよく、または分岐していなくてもよい。

アルキル基は、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキルであり得、例えばＣ₁−Ｃ₁₀アルキルである。

アルコキシ基は、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルコキシであり得、例えばＣ₁−Ｃ₁₀アルコキシである。

アリールは、未置換の若しくは置換された、フェニルまたはナフチルであり得る。

別の好ましい実施形態において、修飾基Ｒは、ベンジル基又は置換されたベンジル基である。特定の実施形態において、置換されたベンジル基は、以下の構造：

［式中、
Ｒ₃は、分岐又は未分岐のＣ₁−Ｃ₆アルキル基、より好ましくは分岐若しくは未分岐のＣ₁−Ｃ₄アルキル基、アルコキシ基、又はニトロ基を表す］
を有し得る。好ましくは、Ｒ₃は、パラ位に結合している。

本発明の好ましい修飾基は、以下に示す構造によって表わされる：

本明細書に記載された化合物群からの特に適切な修飾基の経験的選択は、一般的に、上で列記した４つの特性の存在に基づいて当業者によってごく普通に行われ得る。好ましくは特定の基の適切さは、ＤＮＡ増幅反応と比較して、ｍＲＮＡ増幅反応において、修飾ヌクレオチドを有するプライマーを用いることによって経験的に決定される。修飾の適切性は、修飾プライマーが使用されるときにおける、ｍＲＮＡ鋳型の増幅によって、及び対応するＤＮＡ鋳型の検出可能な増幅の欠如又は実質的な遅延によって示唆される。反応の選択性の増大は、未修飾のプライマーを用いた同一の反応と比較して、塩基修飾を有するプライマーを利用することによって観察される。

別の実施形態において、本発明は、対応するゲノムＤＮＡ混入物の存在下における、エキソン‐エキソン接合部を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的の選択的増幅方法である。当該方法は、試料を提供し、ここで前記試料は場合により標的メッセンジャーＲＮＡのみならず、対応するゲノムＤＮＡを含んでもよく；ａ）第一のオリゴヌクレオチドを前記ｍＲＮＡ標的とハイブリダイズさせ、ＲＮＡ指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成を行うことができる少なくとも１つの酵素を用いてＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行い、ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングし（ｓｐａｎ）；そしてｂ）前記第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる少なくとも１つの酵素と共に使用して、ステップａ）の産物を増幅すること、ここで前記第二のオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的である、を含む。

本発明は、標的核酸配列の増幅のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する。特にｍＲＮＡ標的を増幅するために、本発明は、逆転写‐ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用する。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、「リアルタイム」ＰＣＲ又は「キネティック（ｋｉｎｅｔｉｃ）」ＰＣＲを利用する。典型的にはキネティックＰＣＲは、増幅の間において増幅された産物の検出を可能とするために、少なくとも２つのプライマー、及び標識化されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下で行われる。幾つかの実施形態において、当該プローブは、増幅の各サイクル中において標的配列へのハイブリダイゼーション時に検出可能なシグナルを放出する、ハイブリダイゼーションプローブである。他の実施形態において、当該プローブは、増幅の各サイクル中におけるＤＮＡポリメラーゼによる、ハイブリダイズされたプローブの５’‐３’ヌクレアーゼ消化時においてシグナルを放出する、ヌクレアーゼプローブである。

幾つかの実施形態において、ＲＴ‐ＰＣＲ反応は、ホットスタート手順を含む。ＲＴ‐ＰＣＲに関して、ＲＮＡ及び対応するＤＮＡに対するプライマーの選択性は、ホットスタート手順の使用により向上され得る。多くのホットスタート手順が、当技術分野で既知である。例えば、ワックスの使用、重要な試薬の残りの反応混合物からの分離（米国特許第５，４１１，８７６号明細書）、核酸ポリメラーゼの使用、抗体による可逆的不活化（米国特許第号５，３３８，６７１明細書）、その活性部位に特異的に結合するように設計されているオリゴヌクレオチドによって可逆的に不活化された核酸ポリメラーゼ（米国特許第５，８４０，８６７号明細書）、又は可逆的化学修飾を有する核酸ポリメラーゼの使用（例えば米国特許第５，６７７，１５２号、及び第５，７７３，５２８号明細書に記載）がある。

本発明の幾つかの実施形態において、ＲＴ‐ＰＣＲアッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイを含む。リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、増幅の評価基準は、「閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）サイクル」又はＣｔ値である。より早いＣｔ値は、早期の閾値レベルへの達成を反映し、したがってより効率的な増幅、又は標的核酸のより高いインプットを反映する。より遅いＣｔ値は、不十分な若しくは阻害された増幅を反映し得るか、又は標的核酸のより低いインプットを反映し得る。ＲＮＡ特異的増幅アッセイに関して、ＤＮＡ標的に対応するより高いＣｔ値は、ＲＮＡとＤＮＡ標的との間の区別の基準、又は当該アッセイの選択性の基準である。

ＲＴ‐ＰＣＲアッセイは、任意の適切な、当技術分野で既知の熱安定ヌクレオチド組み込み酵素、及び非熱安定酵素、例えばＭＭＬＶＲＴ及びＡＭＶＲＴ、を使用し得る。校正（３’−５’−エキソヌクレアーゼ）活性を有さない酵素を使用することが時折望ましい。当該酵素は、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、例えばｒＴｔｈ又はＺ０５である。５’−３’ヌクレアーゼ活性を実質的に又は完全に欠いている酵素、例えば米国特許第５，７９５，７６２号明細書に記載されている酵素もまた、望ましい。かかる酵素の一例は、ΔＺ０５ポリメラーゼである。「ホットスタート」能力を有する酵素が、時折望ましい。当該酵素は例えば、米国特許第５，６７７，１５２号、及び第５，７７３，５２８号明細書に記載された酵素である。ホットスタート酵素の一例は、ΔＺ０５−ゴールドポリメラーゼである。幾つかの実施形態において、望ましい操作された特性を有する修飾酵素もまた使用され得る。

増幅産物の検出は、当技術分野で既知の任意の方法によって達成され得る。これらの方法は、標識化されたプライマー及びプローブ、並びに種々の核酸結合色素の使用を含む。検出手段は、標的配列の１つのバリアントに特異的であり得るか、或いは、標的配列の全てのバリアントに一般的であり得るか、又は全ての二重鎖ＤＮＡにとってでさえ一般的であり得る。非特異的検出方法は、標的の望ましくないバリアントが最少であるか、当該方法の検出限界未満であると予想される場合に使用され得る。

増幅産物は、増幅が完了した後に、例えば未標識の産物のゲル電気泳動、及び核酸結合性染料を用いたゲルの染色によって検出され得る。或いは当該増幅産物は、合成中における組み込みによるか、又は標識されたプライマーの伸長産物によって、放射性標識又は化学標識を有していてもよい。電気泳動後、又は電気泳動中において、標識された増幅産物は、当技術分野で既知の適切な放射性ツール又は化学ツールを用いて検出されてもよい。電気泳動後、当該産物はまた、当技術分野で既知の方法の任意の１つによって標識された標的特異的プローブを用いて検出されてもよい。標識されたプローブはまた、電気泳動することなく、すなわち、「ドットブロット（ｄｏｔｂｌｏｔ）」アッセイなどにおいて、標的へ適用されてもよい。

他の実施形態において、増幅産物の存在は、均質のアッセイにおいて検出され得る。均一系アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓａｓｓａｙ）はすなわち、新生産物の存在が増幅サイクル中に検出されるか、又は少なくとも同一の未開封のチューブ中で検出され、そして、増幅後の処理が必要とされないものである。均一系増幅は、例えば米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されている。核酸インターカレーティング染料を用いた均一系増幅アッセイは、例えば、米国特許第５，８７１，９０８号及び第６，５６９，６２７号明細書に記載されている。均一系アッセイはまた、２つの相互作用性フルオロフォアで標識された経口プローブを使用してもよい。当該プローブは例えば、「モレキュラー・ビーコン」プローブ(Tyagi et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14:303-308)又は蛍光標識されたヌクレアーゼプローブ(Livak et al., (1995) PCR Meth. Appl., 4:357-362)である。これらの技術の特定の変形において、増幅産物はまた、その固有の融解温度によって同定されてもよい。米国特許第５，８７１，９０８号及び第６，５６９，６２７号明細書参照。

均一系増幅の場合において、標的は、オリゴヌクレオチドプローブを使用して検出される。当該プローブは、標的の存在決定又は同定を容易とする標識を用いて標識化される。当該プローブは、１又は２以上の標識部位、及び場合により１又は２以上のクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）部位を含む。標識部位は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的又は化学的手段によって検出可能なものであり得る。

幾つかの実施形態において、標識は蛍光性部位である。蛍光標識は、負に荷電した染料、例えばフルオレセインファミリーの染料、又は電荷的に中性である染料、例えばローダミンファミリーの染料、又は正に荷電した染料、例えばシアニンファミリーの染料を含む。本発明において使用され得る他のファミリー染料は、例えば、ポリハロフルオレセイン‐ファミリー染料、ヘキサクロロフルオレセイン‐ファミリー染料、クマリン‐ファミリー染料、オキサジン‐ファミリー染料、チアジン‐ファミリー染料、スクアリン（ｓｑｕａｒｉｎｅ）ファミリー染料、キレート化ランタノイド‐ファミリー染料、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）染料、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）‐ファミリー染料（Molecular Probes, Inc., Eugene, Ore.）を含む。

蛍光標識に加えて、当該プローブは、１又は２以上のクエンチャー部位を有していてもよい。クエンチャーは、蛍光染料から放出されるエネルギーを吸収する、又は光を放出する蛍光染料の能力を妨害する化学部位のことである。クエンチャーは、そのクエンチャーに特有のシグナルで、蛍光染料から吸収されたエネルギーを再放出してもよい。あるいは、クエンチャーは、蛍光染料から吸収されたエネルギーを熱として放散してもよい。非蛍光性クエンチャーの例は、Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Calif.)によって市販されているBlack Hole Quenchers（商標）、Epoch Biosciences (Bothell, Wash.)製のEclipse Dark Quenchers、及びIowa Black (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)を含む。標識及びクエンチャーは、種々の技術によって直接的に又は間接的にオリゴヌクレオチドプローブへと結合され得る。使用される標識の正確な種類に依存して、当該標識は、プローブの５’末端若しくは３’末端に配置され得るか、又はヌクレオチド配列の内部に配置され得る。標識及びクエンチャーは、ヌクレオチドに直接的に結合され得るか、又はリンカー若しくはスペーサーを介して間接的に結合され得る。市販の試薬、例えばホスホロアミダイトからの標識化オリゴヌクレオチドの製造は、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al.編, Academic Press, Inc., 1990に記載されている。

別の実施形態において、本発明は、対応するゲノムＤＮＡ混入物の存在下における、ｍＲＮＡを特異的若しくは選択に増幅するための反応混合物を提供し、ここで前記混合物は、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド；ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む；並びに、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、を含む。当該反応混合物は、ＲＮＡ指向性及びＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる１又は２以上の酵素をさらに含み得る。当該反応混合物は、核酸の増幅のために一般的に必要である試薬及び溶液をさらに含んでもよい。当該試薬は、核酸前駆体、すなわち、ヌクレオシドトリホスフェート、並びに当該反応混合物中に存在する酵素の活性を支援するために適している有機イオン及び無機イオンを含む。当該反応混合物は、標的ｍＲＮＡをさらに含んでもよい。当該反応混合物は、対応するゲノムＤＮＡをさらに含んでもよい。さらに、当該反応混合物は、増幅された核酸の検出のために必要な試薬を含んでもよい。

別の実施形態において、本発明は、対応するゲノムＤＮＡ混入物の存在下における、ｍＲＮＡを特異的若しくは選択に増幅するためのキットを提供し、ここで前記キットは、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド；ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む；並びに、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、を含む。当該キットはまた、ＲＮＡ指向性及びＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる１又は２以上の酵素を含み得る。当該キットは、核酸の増幅のために一般的に必要である試薬及び溶液をさらに含んでもよい。当該試薬は、当該キット中に存在する酵素の活性を支援するために適している、核酸前駆体、すなわちヌクレオシドトリホスフェート、並びに有機イオン及び無機イオンを含む。当該キットは、ある量の標的ｍＲＮＡをさらに含んでもよい。当該キットは、ある量の対応するゲノムＤＮＡをさらに含んでもよい。さらに、当該キットは、増幅された核酸の検出のために必要な試薬を含んでもよい。さらに、当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を含んでもよい。

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供される。ここで本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から離れることなく、実施手順中において改良がなされ得る。

実施例
以下の実施例において、各５０μｌの反応液は、ヒトゲノムＤＮＡを１０ｎｇ、１００ｎｇ、又は１μｇ含むか、或いは、鋳型としてｆｆｐｅｔＲＮＡを１０ｎｇ又は１００ｎｇ含んだ。幾つかの実験において、インビトロＲＮＡ転写産物を含む陽性対照試薬を鋳型として使用した。異なる鋳型が、結果の表中に記載される。各々異なる逆方向プライマーを含有する別の反応液を、共通の順方向プライマー及び共通のプローブと混合した。各反応液は、０．３μＭの各順方向及び逆方向プライマー、０．１μＭのプローブ、２．５ｍＭ酢酸マンガン、５０ｍＭトリシン、１５０ｍＭ酢酸カリウム、１３．４ｍＭ水酸化カリウム、８％グリセロール、１％ＤＭＳＯ、２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、５０μＭのｄＴＴＰ、０．０７５μＭのＨａｗｋＺ０５、０．２Ｕ／μｌのＺ０５ポリメラーゼ、０．０４Ｕ／μｌのＵＮＧ、０．０１８％アジ化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び０．１ｍＭＥＤＴＡを含んだ。

逆転写（ＲＴ）及び増幅を、Roche LightCycler 480 装置を用いて行った。反応液を以下の温度プロファイルにかけた：５０°Ｃにて５分間（ＵＮＧステップ）９５°Ｃにて１分間（ポリメラーゼ活性化）、６１°Ｃにて３０分間（ＲＴステップ）、その後、９５°Ｃにて１５秒間及び６１°Ｃにて３０秒間の５５サイクル。最後の５３サイクルの、各６１°Ｃステップの最後に、蛍光データを回収し、増殖曲線を作成した（示さず）。最後に、反応液を４０°Ｃにて３０秒間冷却した。

実施例１
ｍＲＮＡ特異的プライマーを用いた、ゲノムＤＮＡの画期的増幅
本実施例中、ｅｒｂＢ２標的の増幅において、順方向プライマー（配列番号１）、逆方向プライマー（配列番号３）、及び検出プローブ（配列番号２）を利用した。順方向プライマー及びプローブをＥｘｏｎ３０に配置し、一方で逆方向プライマーはｅｒｂＢ２遺伝子のＥｘｏｎ３０とＥｘｏｎ３１との接合部をスパニングする。鋳型核酸を、Rocheから購入した（マテリアル＃１１６９１１１２００１）。

増幅反応のＣｔ値として、結果を表２に示す。当該結果は、ＤＮＡ混入物の増幅を避けるための先行技術における戦略は不十分であることを実証している。ゲノムＤＮＡは、エキソン‐エキソン接合物をスパニングするｍＲＮＡ特異的逆方向プライマーを用いて容易に増幅される。

実施例２
ｅｘｏｎ３０に相補的なより多くの塩基を含む、ｍＲＮＡ特異的プライマーを用いた、ＲＮＡ特異的増幅の改善
本実施例中、ｅｒｂＢ２標的の増幅において、順方向プライマー（配列番号１）、配列番号３〜６から選択される逆方向プライマー、及び検出プローブ（配列番号２）を利用した。順方向プライマー及びプローブをＥｘｏｎ３０に配置し、一方で逆方向プライマーはｅｒｂＢ２遺伝子のＥｘｏｎ３０とＥｘｏｎ３１との接合部をスパニングする。ここで当該逆方向プライマーは、配列番号３の逆方向プライマーよりも、Ｅｘｏｎ３０に相補的なより多くの塩基を含む。使用される鋳型は、ゲノムＤＮＡ、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）から単離されたＤＮＡ、及びＦＦＰＥＴから単離されたＲＮＡであった。増幅反応のＣｔ値として、結果を表３に示す。ＲＮＡとＤＮＡ鋳型との間のＣｔの差異は、ＲＮＡ鋳型に対する、当該アッセイのより大きな特異性を示している。配列番号６の逆方向プライマーは、ＲＮＡ鋳型に対する特異性において、最も大きな改善を示した。

実施例３
ｅｘｏｎ３０に相補的なより多くの塩基を含む、ｍＲＮＡ特異的プライマーを用いた、ＲＮＡ特異的増幅の更なる改善
本実施例中、ｅｒｂＢ２標的の増幅において、順方向プライマー（配列番号１）、配列番号６〜９から選択される逆方向プライマー、及び検出プローブ（配列番号２）を利用した。順方向プライマー及びプローブをＥｘｏｎ３０に配置し、一方で逆方向プライマーはｅｒｂＢ２遺伝子のＥｘｏｎ３０とＥｘｏｎ３１との接合部をスパニングする。ここで当該逆方向プライマーは、配列番号３の逆方向プライマーよりも、ｅｘｏｎ３０に相補的なより多くの塩基を含む。使用される鋳型は、ゲノムＤＮＡ、ＦＦＰＥＴから単離されたＲＮＡ、及び陽性対照試薬であった。当該陽性対照試薬は、反応液中に１６コピー／μｌのＥＲＢＢ２を含有するＲＮＡ転写産物のブレンドである。

増幅反応のＣｔ値として、結果を表４及び５に示す。ＲＮＡとＤＮＡ鋳型との間のＣｔの差異は、ＲＮＡ鋳型に対する、当該アッセイのより大きな特異性を示している。ＮＤ（検出不能）は、鋳型の増幅がないことを示す。配列番号７の逆方向プライマーは、ＲＮＡ鋳型に対する特異性において、最も大きな改善を示す。

実施例４
修飾を含むｍＲＮＡ特異的プライマーを用いた、ＲＮＡ特異的増幅の改善
本実施例中、ｅｒｂＢ２標的の増幅において、順方向プライマー（配列番号１）、配列番号３〜１０から選択される逆方向プライマー、及び検出プローブ（配列番号２）を利用した。順方向プライマー及びプローブをＥｘｏｎ３０に配置し、一方で逆方向プライマーはｅｒｂＢ２遺伝子のＥｘｏｎ３０とＥｘｏｎ３１との接合部をスパニングする。ここで当該逆方向プライマーは、配列番号３の逆方向プライマーよりも、ｅｘｏｎ３０に相補的なより多くの塩基を含む。配列番号１０の逆方向プライマーは、修飾を含む。使用される鋳型は、ヒトゲノムＤＮＡ、及び陽性対照試薬であった。当該陽性対照試薬は、反応液中に１６コピー／μｌのインビトロＲＮＡＥＲＢＢ２を含有するＲＮＡ転写産物のブレンドである。

増幅反応のＣｔ値として、結果を表６に示す。ＲＮＡとＤＮＡ鋳型との間のＣｔの差異は、ＲＮＡ鋳型に対する、当該アッセイのより大きな特異性を示している。ＮＤ（検出不能）は、鋳型の増幅がないことを示す。配列番号１０の逆方向プライマーは修飾を含み、そしてＲＮＡ鋳型に対する特異性において、最も大きな改善を示す。

実施例５
修飾を含むｍＲＮＡ特異的プライマーを用いた、ＲＮＡ特異的増幅の改善
本実施例中、ｅｒｂＢ２標的の増幅において、順方向プライマー（配列番号１）、配列番号７〜１０から選択される逆方向プライマー、及び検出プローブ（配列番号２）を利用した。順方向プライマー及びプローブをＥｘｏｎ３０に配置し、一方で逆方向プライマーはｅｒｂＢ２遺伝子のＥｘｏｎ３０とＥｘｏｎ３１との接合部をスパニングし、そして修飾を含む。使用される鋳型は、ヒトゲノムＤＮＡ、ＦＦＰＥＴから単離されたＲＮＡ及び陽性対照試薬であった。当該陽性対照試薬は、反応液中に１６コピー／μｌのインビトロＲＮＡＥＲＢＢ２を含有するＲＮＡ転写産物のブレンドである。

増幅反応のＣｔ値として、結果を表７に示す。ＲＮＡとＤＮＡ鋳型との間のＣｔの差異は、ＲＮＡ鋳型に対する、当該アッセイのより大きな特異性を示している。配列番号１０の逆方向プライマーは修飾を含み、そしてＲＮＡ鋳型に対する特異性において、最も大きな改善を示す。

実施例６
修飾を含むｍＲＮＡ特異的プライマーを用いた、ＲＮＡ特異的増幅の改善
本実施例中、ｅｒｂＢ２標的の増幅において、順方向プライマー（配列番号１）、配列番号３、６、７、１０、１１、１２、１３、１４及び１５から選択される逆方向プライマー、並びに検出プローブ（配列番号２）を利用した。順方向プライマー及びプローブをＥｘｏｎ３０に配置し、一方で逆方向プライマーはｅｒｂＢ２遺伝子のＥｘｏｎ３０とＥｘｏｎ３１との接合部をスパニングし、そして修飾を含む。使用される鋳型は、ヒトゲノムＤＮＡ、およびＦＦＰＥＴから単離されたＲＮＡであった。増幅反応のＣｔ値として、結果を表８に示す。ＲＮＡとＤＮＡ鋳型との間のＣｔの差異は、ＲＮＡ鋳型に対する、当該アッセイのより大きな特異性を示している。配列番号１０の逆方向プライマーは修飾を含み、そしてＲＮＡ鋳型に対する特異性において、最も大きな改善を示す。配列番号１１及び１５の逆方向プライマーもまた、ＲＮＡ鋳型に対する特異性の改善を示す；しかし、ＲＮＡＦＦＰＥＴ鋳型に関するＣｔ値は、配列番号１０で得られた結果と比較して遅延する。

配列番号３、６、７、１０、１１、１２、１３、１４及び１５のプライマーに関する増幅曲線は各々、図３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１において見ることができる。

具体的実施例を参照して、本発明が詳細に説明されたが、種々の変更が本発明の範囲内でなされ得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載されたいずれの実施例にも限定されるべきではなく、以下に示す特許請求の範囲によって限定されるべきである。

Claims

メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅方法であって、以下のステップ：
ａ．第一のオリゴヌクレオチドを前記ｍＲＮＡ標的とハイブリダイズさせ、ＲＮＡ指向性合成を行うことができる少なくとも１つの酵素を用いてＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行い、ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは：
ｉ．ベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、
ｉｉ．前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、そして
ｉｉｉ．前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする（ｓｐａｎ）；
ｂ．前記第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる少なくとも１つの酵素と共に使用して、ステップａ）の産物を増幅すること；ここで前記第二のオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ標的の少なくとも部分的な配列を有する、
を含む、前記方法。
前記ヌクレオチドの前記環外アミノ基が共有結合修飾された塩基が、Ｎ^６−ベンジル−アデニン、Ｎ^６−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルアデニン、Ｎ^４−ベンジル−シトシン及びＮ^４−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルシトシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
以下のステップ：
ｃ．前記ＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成及びＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成の産物を検出すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ＲＮＡ指向性合成を行うことができる酵素と、前記ＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる酵素が同一である、請求項１に記載の方法。
１又は２以上の前記酵素が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較して、５０％以下の５’‐３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つの酵素が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ若しくはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらの変異体である、請求項１に記載の方法。
前記第一のオリゴヌクレオチドが、配列番号：３、１０、１１、１３、１４及び１５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
エキソン‐エキソン接合部を含む、メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅のためのオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡ標的に対して少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）するヌクレオチド配列を含み、そしてベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む、前記オリゴヌクレオチド。
前記環外アミノ基が共有結合修飾された塩基が、Ｎ^６−ベンジル−アデニン、Ｎ^６−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルアデニン、Ｎ ^４−ベンジル−シトシン及びＮ^４−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルシトシンからなる群から選択される、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
前記環外アミノ基が共有結合修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドの１つの構造が：

［式中、Ｓは糖部を表し、Ｒはベンジル基又は置換されたベンジル基を表す］
からなる群から選択される、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
エキソン‐エキソン接合部を含む、メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅のための反応混合物であって：前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド；ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、ベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む；並びに、前記ｍＲＮＡ標的の少なくとも部分的な配列を有する少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、を含む、前記反応混合物。
エキソン‐エキソン接合部を含む、メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅のためのキットであって：前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド；ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、ベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む；並びに、前記ｍＲＮＡ標的の少なくとも部分的な配列を有する少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、を含む、前記キット。