JP2013513359A5

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Publication number: JP2013513359A5
Application number: JP2012542401A
Authority: JP
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2013-07-04
Anticipated expiration: 2030-12-10

Claims

メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅方法であって、以下のステップ：
ａ．第一のオリゴヌクレオチドを前記ｍＲＮＡ標的とハイブリダイズさせ、ＲＮＡ指向性合成を行うことができる少なくとも１つの酵素を用いてＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行い、ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは：
ｉ．ベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含み、
ｉｉ．前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、そして
ｉｉｉ．前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする（ｓｐａｎ）；
ｂ．前記第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる少なくとも１つの酵素と共に使用して、ステップａ）の産物を増幅すること；ここで前記第二のオリゴヌクレオチドは、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的である、
を含む、前記方法。
前記ヌクレオチドの前記環外アミノ基が共有結合修飾された塩基が、Ｎ^６−ベンジル−アデニン、Ｎ^６−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルアデニン、Ｎ^２−アルキル−グアニン、Ｎ^４−ベンジル−シトシン及びＮ^４−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルシトシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
以下のステップ：
ｃ．前記ＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成及びＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成の産物を検出すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記ＲＮＡ指向性合成を行うことができる酵素と、前記ＤＮＡ指向性ＤＮＡ合成を行うことができる酵素が同一である、請求項１に記載の方法。
１又は２以上の前記酵素が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較して、５０％以下の５’‐３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つの酵素が、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ、デルタ−Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ、及びデルタ−Ｚ０５−ゴールドＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるか、またはそれらの変異体である、請求項１に記載の方法。
前記第一のオリゴヌクレオチドが、配列番号：３、１０、１１、１３、１４及び１５からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
エキソン‐エキソン接合部を含む、メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅のためのオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡ標的に対して少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）するヌクレオチド配列を含み、そしてベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む、前記オリゴヌクレオチド。
前記環外アミノ基が共有結合修飾された塩基が、Ｎ^６−ベンジル−アデニン、Ｎ^６−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルアデニン、Ｎ^２−アルキル−グアニン、Ｎ^４−ベンジル−シトシン及びＮ^４−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルシトシンからなる群から選択される、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
前記環外アミノ基が共有結合修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドの１つの構造が：

［式中、Ｓは糖部を表し、Ｒはベンジル基又は置換されたベンジル基を表す］
からなる群から選択される、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
エキソン‐エキソン接合部を含む、メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅のための反応混合物であって：前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド；ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、ベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む；並びに、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、を含む、前記反応混合物。
エキソン‐エキソン接合部を含む、メッセンジャーＲＮＡ標的の選択的増幅のためのキットであって：前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的であり、且つ前記標的中のエキソン‐エキソン接合部をスパニングする、少なくとも１つの第一のオリゴヌクレオチド；ここで前記第一のオリゴヌクレオチドは、ベンジル基又は置換されたベンジル基で環外アミノ基が共有結合修飾された、アデニン、グアニン、又はシトシン塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含む；並びに、前記ｍＲＮＡ標的と少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの第二のオリゴヌクレオチド、を含む、前記キット。