JP2012505641A5 - - Google Patents
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Description
一般的に、本明細書に記載の化合物の種類から特定の好適な修飾基の経験的な選択は、上に上げた4つの性質の存在に基づいて、当業者にはいつも決まって実行することができる。好ましくは、特定の基の好適性は、アレル-特異的増幅反応における修飾されたヌクレオチドを有するプライマーを用いて、経験的に決定される。該修飾の好適性は、非修飾プライマーとの同一反応に比べた時に、塩基修飾を有するプライマーを用いる反応の高い選択性によって示される。本発明によれば、特に好ましくは、環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基がN 6 -ベンジル-アデニン、N 6 -パラ-tert-ブチル-ベンジル-アデニン、N 2 -アルキル-グアニン及びN4-ベンジル-シトシンから選択されるオリゴヌクレオチドである。
Claims (11)
- 数個の変形体配列の形態で存在する、標的配列の変形体のアレル-特異的増幅の方法であって、以下：
（a）おそらく標的配列の少なくとも1つの変形体を含む試料を提供し；
（b）該標的配列の1以上の変形体に少なくとも部分的に相補的な第1オリゴヌクレオチドを提供し；
（c）該標的配列の唯一の変形体の相補的な3’-末端ヌクレオチドを有する、標的配列の1以上の変形体に少なくとも部分的に相補的な第2オリゴヌクレオチドを提供し；ここで、前記第2オリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを導入し、前記塩基は、N 6 -ベンジル-アデニン、N 6 -パラ-tert-ブチル-ベンジル-アデニン、N 2 -アルキル-グアニン及びN 4 -ベンジル-シトシンからなる群より選ばれる；
（d）該標的配列の少なくとも1つの変形体への前記第1及び第2オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに好適な条件を提供し；及び
（e）ヌクレオチド-導入生物触媒によるオリゴヌクレオチド伸長に好適な条件を提供すること；ここで、前記生物触媒は、前記第2オリゴヌクレオチドが前記の相補的な3'-末端ヌクレオチドを有する標的配列の変形体にハイブリダイズする時に、前記第2オリゴヌクレオチドを伸長することができ、そして、前記第2オリゴヌクレオチドが非-相補的3'-末端ヌクレオチドを有する標的配列の変形体にハイブリダイズする時には実質的にほとんど伸張することができない、
を含む、方法。 - 環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基を有するヌクレオチドが、前記第2オリゴヌクレオチドの3'-末端に対して位置-5、-4、-3、-2又は-1に位置する、請求項１記載の方法。
- ステップ（e）での前記ヌクレオチド-導入生物触媒が、前記オリゴヌクレオチドが前記の3'-末端ヌクレオチドを有する標的配列の変形体にハイブリダイズする時にもっぱら、前記第2オリゴヌクレオチドを伸長することができる、請求項１記載の方法。
- 前記のヌクレオチド-導入生物触媒が、Taq DNAポリメラーゼ、Z05 DNAポリメラーゼ、ΔZ05 DNAポリメラーゼ、及びΔZ05-ゴールドDNAポリメラーゼからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
- 前記標的配列が、配列番号1及び/又は配列番号2である、請求項１記載の方法。
- 前記第1ヌクレオチドが、スコーピオン又はスコーピオン-様型を有する、請求項１記載の方法。
- 前記第1オリゴヌクレオチドが、配列番号6であり、及び/又は前記第2オリゴヌクレオチドが配列番号3、4、5、7、8、10、11、12及び13からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
- 数個の変形体配列の形態で存在する、試料中の標的配列の変形体の検出方法であって、以下：
（a）該標的配列の少なくとも1つの変形体に第1及び第2オリゴヌクレオチドをハイブリダイズし；ここで、該第1オリゴヌクレオチドは、該標的配列の1以上の変形体に少なくとも部分的に相補性であり、該第2オリゴヌクレオチドは、該標的配列の1以上の変形体に少なくとも部分的に相補性であり、該標的配列の唯一の変形体に相補的な3'-末端ヌクレオチドを有し、前記第2オリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを導入し；
（b）ヌクレオチド-導入生物触媒を有する第2オリゴヌクレオチドを伸長し；ここで、前記生物触媒は、前記の相補的3'-末端ヌクレオチドを有する標的配列の変形体にハイブリダイズされた、オリゴヌクレオチドのみを検出可能な程度に伸長することができる；及び
（c）前記第2オリゴヌクレオチド伸長の産物を検出すること、ここで、該伸長は、該オリゴヌクレオチドが相補的3'-末端オリゴヌクレオチドを有する標的配列の変形体の存在を示す、
を含む、方法。 - 数個の変形体配列の形態で存在する標的配列のアレル-特異的増幅のためのキットであって、以下：
（a）該標的配列の1以上の変形体に少なくとも部分的に相補的である、第1オリゴヌクレオチド；
（b）該標的配列の1以上の変形体に少なくとも部分的に相補的であり、及び該標的配列の唯一の変形体に相補的な3'-末端ヌクレオチドを有する、第2オリゴヌクレオチド；ここで、前記第2オリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを導入する；及び
（c）ヌクレオチド-導入生物触媒、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオチド-導入生物触媒による核酸の伸長に好適なバッファ、及びアレル-特異的増幅を行うための1組の教示、
を含む、キット。 - 数個の変形体配列の形態で存在する標的配列のアレル-特異的増幅を行うためのオリゴヌクレオチドであって、以下：
-前記標的配列の1以上の変形体の一部に少なくとも部分的に相補的な配列；
-前記標的配列の唯一の変形体に相補的な3'-末端ヌクレオチド；及び
-環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1つのヌクレオチド、ここで、前記修飾されたヌクレオチドは3'-末端ヌクレオチドに対して位置-5、-4、-3、-2又は-1に位置し、前記塩基は、N 6 -ベンジル-アデニン、N 6 -パラ-tert-ブチル-ベンジル-アデニン、N 2 -アルキル-グアニン及びN 4 -ベンジル-シトシンからなる群より選ばれる、オリゴヌクレオチド。 - 配列番号3、4、5、7、8、10、11、12及び13からなる群より選ばれる配列を有する、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
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