JP2003116586A - ポリヌクレオチド配列の線形等温増幅のための方法および組成物 - Google Patents

ポリヌクレオチド配列の線形等温増幅のための方法および組成物

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    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な、等温単一プライマー線形核酸増幅方
法を提供すること。 【解決手段】 以下の工程を包含する方法：（ａ）該標
的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを複合プライマ
ーとハイブリダイズさせる工程であって、該複合プライ
マーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む、工程；
（ｂ）必要に応じて、終結ポリヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドを、該テンプレートへの該複合プライ
マーのハイブリダイゼーションに対して５’側にある該
テンプレートの領域にハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて該複合プライマーを
伸長させる工程；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドか
らＲＮＡを切断する酵素を用いて、該アニールした複合
プライマーのＲＮＡ部分を切断して、別の複合プライマ
ーが該テンプレートにハイブリダイズし得かつ鎖置換に
よりプライマー伸長を反復し得るようにする工程。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】（関連出願の相互参照）本出願は、仮特許
出願、米国出願番号６０／１５３，６０４（１９９９年
９月１３日出願）および米国出願番号６０／１７５，７
８０（２０００年１月１２日出願）の優先権の利益を主
張する（両者は、その全体を参考として本明細書中で援
用する）。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明はポリヌクレオチド増
幅の分野に関連する。より詳細には、本発明は、標的ポ
リヌクレオチド配列を増幅する（すなわち、複数コピー
を作製する）ための方法、組成物、およびキットを提供
し、それらは単一ＲＮＡ／ＤＮＡ複合プライマーを使用
し、必要に応じて、転写を含む増幅を用いる。
【０００３】
【従来の技術】核酸増幅および増幅産物の検出のための
方法の開発は、最近の核酸配列の検出、同定、定量およ
び配列分析を進歩させてきた。
【０００４】核酸分析は、病原体の検出および同定、規
定された表現型の原因となる遺伝子変化の検出、遺伝病
または疾患に対する感受性の診断、発育、疾患および規
定された刺激への応答における遺伝子発現の評価、なら
びに種々のゲノムプロジェクトに対し、有用である。核
酸増幅法の他の適用は、希少な細胞の検出、病原体の検
出、および悪性腫瘍における変異遺伝子発現の検出など
である。核酸増幅は、規定された核酸配列の存在の検出
のような定性分析、および規定された遺伝子配列の定量
化の両者に対して強力に有用である。後者は、正常な細
胞型から悪性腫瘍細胞型への細胞形質転換において頻繁
に見出されるような、病原体配列の評価および病原体配
列の量の評価、ならびに遺伝子増加または欠失の決定に
対して有用である。
【０００５】核酸配列における配列の変化の検出は、遺
伝子分析に関連して、変異体遺伝子型の検出、薬物耐性
をもたらす変異の検出、ゲノム薬理学（ｐｈａｒｍａｃ
ｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）等において重要である。特定の変
異を検出する種々の方法は対立遺伝子特異的プライマー
伸長、対立遺伝子特異的プローブ結合、および示差的プ
ローブハイブリダイゼーションを含む（例えば、米国特
許Ｎｏ．５，８８８，８１９；６，００４，７４４；
５，８８２，８６７；５，７１０，０２８；６，０２
７，８８９；６，００４，７４５；およびＷＯ ＵＳ８
８／０２７４６参照）。規定された核酸配列における配
列変化の存在を、変化の特定の知見なしに、検出する方
法も示された。これらの方法のいくつかは、試験増幅産
物と参照増幅産物のハイブリダイゼーションにより形成
されたミスマッチの検出に基く。そのようなヘテロ二重
鎖におけるミスマッチの存在は、ミスマッチ特異的結合
タンパク質の使用、またはミスマッチの化学的もしくは
酵素的切断により検出され得る。十字型の４つの鎖状Ｄ
ＮＡ構造における分岐点移動の阻害に基く、配列の変化
を検出するための方法が、最近示された（例えば、Ｌｉ
ｓｈａｎｓｋｉ，Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ ２８（９）：Ｅ４２（２０００）参照）。他
の方法は、一本鎖増幅産物の特定の高次構造の検出に基
いている。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの二次元構造は特
定の配列に依存する。参照配列に関連する試験核酸の標
的における配列の変化は、変化した高次構造をもたら
す。一本鎖増幅産物の変化した高次構造は、試験増幅産
物の電気泳動移動度を参照増幅産物の電気泳動移動度と
比較した場合の変化により、検出し得る。一本鎖高次構
造多型（ＳＳＣＰ）は、配列変化の検出に、広く使用さ
れている（例えば、ＯｒｉｔａＭ．ら Ｐｒｏｃ Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６（８）：２７６
６〜７０（１９８９）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ら Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ ５（７）：１０３７〜４３（１９９０）；
および米国特許Ｎｏ．５，８７１，６９７参照）。本方
法は、異なる株または種の特異的核酸配列における規定
された変化に基く、微生物の同定にも使用される。ＳＳ
ＣＰ法を用いる変異の検出は、ほとんどＤＮＡ増幅産物
を使用するが、ＲＮＡ−ＳＳＣＰ法も示されてきた。一
本鎖ＲＮＡ配列依存の高次構造は、十分に立証されてお
り、規定された電気泳動移動パターンをもたらすことが
示された（例えば、Ｓａｒｋａｒら Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（４）：８７１〜８
７８（１９９２）およびＧａｓｐａｒｉｎｉら Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅｔ．９７：４９２から４９５（１９９６）
参照）。
【０００６】規定された核酸配列の存在の検出、および
その配列分析は、プローブハイブリダイゼーションによ
って行われ得るが、試験サンプル中に存在する核酸配列
が、数分子というような低量である場合、その方法は一
般的に感受性に欠ける。この障害の解決法のひとつは、
規定された核酸配列の複数コピーの作製方法の開発であ
った。その方法は、さらなる分析に適する。特定の核酸
配列の複数コピーの作製方法は、標的増幅法として一般
的に規定される。ハイブリダイゼーション分析の検出感
度を向上させるための他の方法は、ハイブリダイズした
プローブ、またはプローブからの複数産物の形成に基く
（例えば、複数産物を形成するためのハイブリダイズし
たプローブの切断または独特なハイブリダイゼーション
依存産物を形成するための隣接プローブの結合）。同様
に、ハイブリダイゼーション反応の感度の向上は、分岐
ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに基く方法の
ように、ハイブリダイゼーション事象により発生した信
号を増幅する方法によって達成された。
【０００７】核酸増幅には多くのバリエーションがある
（例えば、対数増幅、連鎖線形増幅（ｌｉｎｋｅｄ ｌ
ｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、連結に基
く増幅、および転写に基く増幅）。対数核酸増幅法の例
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、多くの刊
行物に開示されてきた（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａ
ｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３〜２７３（１９８６）；
Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．欧州特許番号２０１、１８４号；Ｍ
ｕｌｌｉｓら米国特許Ｎｏ．４，５８２，７８８；Ｅｒ
ｌｉｃｈら 欧州特許番号５０，４２４号，欧州特許番
号８４，７９６号，欧州特許番号２５８，０１７号，欧
州特許番号２３７，３６２号；およびＳａｉｋｉ Ｒら
米国特許Ｎｏ．４，６８３，１９４、参照）。連鎖線
形増幅はＷａｌｌａｃｅらによって米国特許Ｎｏ．６，
０２７，９２３に開示されている。連結に基く増幅の例
は、ＷｕらによりＧｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９
８９）に開示された連結増幅反応（ＬＡＲ）、および欧
州特許出願Ｎｏ．０３２０３０８Ｂ１に開示されたリガ
ーゼ連鎖反応である。転写に基く増幅の種々の方法は、
米国特許番号５，７６６，８４９号および同５，６５
４，１４２号に開示され、ＫｗｏｈらによってＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：
１１７３（１９８９）およびＧｉｎｅｒｇｅｒａｓらに
よってもＷＯ ８８／１０３１５に開示されている。
【０００８】最も一般的に用いられている標的増幅法は
ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲであり、それは変性、２
つのオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれの標的鎖
と反対の鎖に対するハイブリダイゼーション、および標
的配列の複数の二重鎖コピーを作製するためのヌクレオ
チドポリメラーゼによるプライマーの伸長の複数のサイ
クルに基いている。ＰＣＲの多くのバリエーションが示
されており、その方法はＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列の
増幅、配列決定、変異分析などに用いられている。単一
のプライマーを使用する温度サイクルに基く方法が、ま
た示されてきた。（例えば、米国特許番号 ５，５０
８，１７８；５，５９５，８９１；５，６８３，８７
９；５，１３０，２３８；および５，６７９，５１２参
照）プライマーは、米国特許Ｎｏ．５，７４４，３０８
に開示されたようにＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーで
あり得る。温度サイクルに依存する他の方法は、リガー
ゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および関連修復連鎖反応（ｒｅｌ
ａｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ）（ＲＣＲ）である。
【０００９】種々の温度（すなわち、温度サイクリン
グ）、または１つの温度（等温工程）で、複数サイクル
のインキュベーションを行うことにより、標的核酸の増
幅を行い得る。熱安定性核酸修飾酵素の発見は，核酸増
幅技術における迅速な進歩に貢献してきた（Ｓａｉｋｉ
ら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）参
照）。ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ヌ
クレアーゼなどの熱安定性核酸修飾酵素は、温度サイク
リングに依存する方法および等温で増幅する方法の両方
法で使用される。鎖置換増幅（ＳＤＡ）のような等温の
方法は、Ｆｒａｉｓｅｒらにより米国特許Ｎｏ．５，６
４８，２１１に；Ｃｌｅｕｚｉａｔらにより米国特許Ｎ
ｏ．５，８２４，５１７に；およびＷａｌｋｅｒらによ
りＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８９；３９２〜３９６（１９９２）に開示されてい
る。他の等温標的増幅法は、転写に基く増幅方法であ
り、その方法において、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー配列は、増幅の早い段階でプライマー伸長産物に取り
込まれ（ＷＯ ８９／０１０５０）、さらに標的配列ま
たは標的相補性配列は転写工程およびＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッド中間産物中のＲＮＡ鎖の消化によって増幅さ
れる（例えば、米国特許番号５，１６９，７６６および
同４，７８６，６００参照）。これらの方法は、転写媒
介増幅（ＴＭＡ）、自己維持配列複製（３ＳＲ）、核酸
配列に基く増幅（ＮＡＳＢＡ）などを包含する（例え
ば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４〜１８７８
（１９９０）；米国特許番号５，７６６，８４９（ＴＭ
Ａ）；および同５，６５４，１４２（ＮＡＳＢＡ）参
照）。他の増幅法は、テンプレートスイッチオリゴヌク
レオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＴＳＯ）およびブロ
ッキングオリゴヌクレオチドを用いる。例えば、キメラ
ＤＮＡを利用するテンプレートスイッチ増幅は、米国特
許番号５、６７９、５１２およびＰａｔｅｌらによりＰ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９
３：２９６９〜２９７４（１９９６）に開示され、そし
てブロッキングオリゴヌクレオチドはＬａｎｅｙらによ
り米国特許Ｎｏ．５，６７９，５１２に開示されてい
る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】等温標的増幅法は、サ
ーモサイクラーを必要とせず、従って、一般的な計測プ
ラットフォームに適応し易い。しかし前述した等温標的
増幅法はいくつかの弱点を有している。ＳＤＡ法による
増幅は、規定された制限酵素に対する部位の存在が必要
であり、その適応性が制限されている。一方、ＮＡＳＢ
ＡおよびＴＭＡのような転写に基く増幅法は、ポリメラ
ーゼプロモーター配列のプライマーによる増幅産物への
組込み（不特定の増幅という結果になる傾向のある工
程）の必要に限定される。さらに、これらの転写に基く
増幅法によるＤＮＡ標的増幅機構は十分に確立されてい
ない。
【００１１】現在の増幅法の他の欠点は、前の増幅反応
の増幅産物による混入の可能性のある試験サンプルであ
り、サンプル中で非標的特異的増幅を生じる。本欠点は
周知の問題であり、これは標的増幅技術力および増幅基
質である増幅産物の形成の結果である。増幅反応の最
後、または標的増幅の開始前のいずれかでの試験サンプ
ルの汚染除去の種々の方法が、示されてきた。加えて、
物理的方法による試験溶液の封じ込めの方法も示され
た。これらの溶液はすべて、一般的な実験設定において
は、核酸試験の複雑さに加えて、取り扱いにくい。
【００１２】さらに、温度サイクリング工程を使用する
増幅方法は、それぞれのサイクルで温度サイクルブロッ
クが「目的」温度に達するまでに長いラグタイムを要す
るというさらなる不利益を有する。したがって、温度サ
イクリング工程を使用して実施した増幅反応は、完了に
達するまでにかなり長時間を要する。
【００１３】したがって、これらの弱点を克服する改良
された核酸増幅法の必要性がある。本明細書中に記載さ
れた本発明は、この必要性を充足し、付加的な利点を提
供する。
【００１４】特許出願および刊行物を含む、本明細書中
で引用した参考文献はすべて、その全体が参考として援
用される。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明はポリヌクレオチ
ド増幅のための方法および組成物、ならびに増幅法の適
用を提供する。
【００１６】従って、一局面において本発明は、標的ポ
リヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列の
増幅法を提供する。本法は、以下の工程を包含する：
（ａ）標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを複合
プライマーとハイブリダイズする工程であって、上記複
合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含む
工程；（ｂ）テンプレートへの複合プライマーのハイブ
リダイゼーションに対して５’側にあるテンプレートの
領域に、終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
チドを、必要に応じてハイブリダイズさせる工程；
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸
長させる工程；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから
ＲＮＡを切断する酵素を用いて、アニールした複合プラ
イマーのＲＮＡ部分を切断して、別の複合プライマー
が、テンプレートにハイブリダイズし得かつ鎖置換によ
りプライマー伸長を反復し得るようにする工程であっ
て、それによって、標的配列の相補的配列の複数コピー
が生成される工程。
【００１７】他の局面において、本発明は標的ポリヌク
レオチド配列増幅法を提供する。本法は、以下の工程を
包含する：（ａ）標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレ
ートを複合プライマーとハイブリダイズさせる工程であ
って、上記複合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮ
Ａ部分を含む工程；（ｂ）テンプレートへの複合プライ
マーのハイブリダイゼーションに対して５’側にあるテ
ンプレートの領域に、終結ポリヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程；（ｃ）
ＤＮＡポリメラーゼを用いて複合プライマーを伸長させ
る工程；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ
を切断する酵素を用いて、アニールした複合プライマー
のＲＮＡ部分を切断して、別の複合プライマーが、テン
プレートとハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライ
マー伸長を反復して置換されたプライマー伸長産物を生
成し得るようにする工程；（ｅ）プロモーターと置換さ
れたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域とを
含むポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼにより転
写を生じるのを可能にする条件下でハイブリダイズさ
せ、置換されたプライマー伸長産物と相補的な配列を含
むＲＮＡ転写物が生成されるようにする工程であって、
それによって、標的配列の複数コピーが生産される工
程。
【００１８】本発明の方法で使用された複合プライマー
の種々の実施形態を本明細書中に示す。例えば、いくつ
かの実施形態において、複合プライマーのＲＮＡ部分
は、３’ＤＮＡ部分に対し、５’側に存在する。なお、
別の実施形態において、５’ＲＮＡ部分は、３’ＤＮＡ
部分に隣接している。本明細書中に示した方法に対し、
１以上の複合プライマーを使用し得る。
【００１９】終結配列を含むポリヌクレオチドの種々の
模範的な実施形態についても本明細書中に示す。いくつ
かの実施形態において、終結配列を含むポリヌクレオチ
ドは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ｔｅ
ｍｐｌｅｔｅ ｓｗｉｔｃｈｏｌｉｇｏｎｕｇｌｅｏｔ
ｉｄｅ）（ＴＳＯ）であり、テンプレートへの結合を強
める１以上の改変を含み得る（しかし、必要ではな
い）。従って、いくつかの実施形態において、ＴＳＯ
は、テンプレートにハイブリダイズする領域に改変を含
み、その中で、所定のセットの条件下、このＴＳＯは、
改変を含まないＴＳＯと比較して、より緊密にその領域
に結合する。適切な改変の例を本明細書中で提供する。
いくつかの実施形態において、終結配列を含むポリヌク
レオチドはブロッキング配列であり、その配列（ＴＳＯ
など）は、テンプレートへの結合を強めるための改変を
１以上含み得る。従って、いくつかの実施例において、
ブロッカー配列はテンプレートにハイブリダイズする領
域に改変を含み、その中で、所定のセットの条件下、こ
のブロッカーは、改変を含まないブロッカーと比較し
て、その領域により緊密に結合する。適切な改変の例を
本明細書中で提供する。
【００２０】この方法および組成物において使用し得る
酵素を本明細書中に示す。例えば、ＲＮＡを切断する酵
素は、ＲＮアーゼＨであり得る。
【００２１】いくつかの局面において、ＴＳＯはプロモ
ータ機能を提供し、置換されたプライマー伸長産物とハ
イブリダイズする領域（そのプロモーターと隣接しても
よいし、しなくてもよい）も含む。他の実施形態とし
て、プロモーターを含むポリヌクレオチドは、３’末端
に、置換されたプライマー伸長産物とハイブリダイズす
る領域を含んでおり、そのため、置換伸長産物のＤＮＡ
ポリメラーゼ伸長は二重鎖プロモーターを生成し、その
二重鎖プロモーターから転写が生じる。いくつかの実施
形態において、プロモーターを含むポリヌクレオチド
は、ＰＴＯである。
【００２２】本法は任意のＤＮＡ標的の増幅に適用でき
る（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む）。１
以上の工程を組み合わせ得、および／または連続的に
（所望の産物が形成し得る限り、頻繁にいかなる順番で
も）実行し得る。
【００２３】本発明は、本発明の増幅方法の産物を用い
る（一般的には分析する）方法（例えば、配列決定およ
び配列変化の検出）も提供する。
【００２４】従って、一局面において、本発明は、標的
ヌクレオチド配列の配列決定の方法を提供する。その方
法は以下の工程を包含する：（ａ）標的配列を含む一本
鎖ＤＮＡテンプレートを複合プライマーとハイブリダイ
ズさせる工程であって、上記複合プライマーがＲＮＡ部
分および３’ＤＮＡ部分を含む工程；（ｂ）複合プライ
マーとテンプレートとのハイブリダイゼーションに対し
て５’側にあるテンプレートの領域に、終結ポリヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドを、必要に応じてハ
イブリダイズさせる工程；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、
ならびにｄＮＴＳとｄＮＴＰアナログ（それは、標識ま
たは非標識であり得る）との混合物を用い、複合プライ
マーを伸長させ、その結果、プライマー伸長が、ｄＮＴ
Ｐアナログ（標識または非標識であり得る）の取り込み
の際に終結するようにする、工程；（ｄ）ＲＮＡ／ＤＮ
ＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用いて、ア
ニールした複合プライマーのＲＮＡ部分を切断して、別
の複合プライマーが、テンプレートとハイブリダイズし
得、かつ鎖置換によりプライマー伸長を反復し得るよう
にする工程であって、それにより、標的配列の相補配列
の（種々の長さの）複数コピーが生成される工程；
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の産物を分析し、配列を決定
する工程。
【００２５】別の局面において、本発明は標的ヌクレオ
チド配列の配列決定方法を提供する。その方法は、以下
の工程を包含する。（ａ）複合プライマーに対し、標的
配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートをハイブリダイズ
させる工程であって、上記複合プライマーはＲＮＡ部分
および３’ＤＮＡ部分を含む工程；（ｂ）複合プライマ
ーとテンプレートとのハイブリダイゼーションに対して
５’側にあるテンプレートの領域に、終結ポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドとテンプレートをハイ
ブリダイズさせる工程；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用
いて複合プライマーを伸長させる工程；（ｄ）ＲＮＡ／
ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素を用い
て、アニールした複合プライマーのＲＮＡ部分を切断し
て、別の複合プライマーが、テンプレートとハイブリダ
イズし得かつ鎖置換によりプライマー伸長を反復して、
置換されたプライマー伸長産物を生成し得るようにする
工程；（ｅ）５’末端のプロプロモーターと、置換され
たプライマー伸長産物とハイブリダイズする領域とを含
むポリヌクレオチドを、ｒＮＴＰとｒＮＴＰアナログ
（それは、標識または非標識であり得る）との混合物を
使用して、ＲＮＡポリメラーゼにより伸長産物から転写
が生じる条件下で、ハイブリダイズさせ、置換されたプ
ライマー伸長産物と相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が
生成されるようにし、そしてその転写が、ｒＮＴＰアナ
ログ（標識または非標識であり得る）組込みの際に終結
するようにする工程であって、それにより標的配列の
（種々の長さの）複数コピーが生成される工程；（ｆ）
工程（ａ）〜（ｅ）の産物を分析し、配列を決定する工
程。
【００２６】いくつかの局面において、本発明は、標的
配列の特徴付け、または分析の方法を提供する。いくつ
かの局面は複合プライマーのＲＮＡ部分に基いており、
従ってこの結果は、複合プライマーのＲＮＡ部分とハイ
ブリダイズする標的の一致する領域（相補的または十分
に相補的である場合）に関する情報を反映する。参照標
的配列に対する同様の増幅反応を実行することからの産
物の量と比較した産物の量は、配列の存在または非存在
を示す。そのことは、野生型、変異、または対立遺伝子
改変体の存在または非存在もまた示し得る。種々の配列
検出実施形態を本明細書中に示す。従って、例えば、本
発明は、標的ポリヌクレオチド配列の領域における変異
を検出する方法（本明細書中で示した増幅法の実行を包
含する）を提供する。その中で、標的ポリヌクレオチド
配列の領域は、複合プライマーのＲＮＡ部分と対応し、
標的ポリヌクレオチドにおける変異は、変異を含まない
複合プライマーのＲＮＡ部分に対応する領域を含む参照
テンプレートから生成された増幅産物の量と比較して、
検出可能に少ない増幅産物を生じる。これらの実施形態
において、変異を含まない（複合プライマーのＲＮＡ部
分と比較して）複合プライマーのＲＮＡ部分と対応する
領域を含む参照テンプレートからの産物と比較して、鎖
置換による増幅は減少する。
【００２７】従って、本発明は、標的ポリヌクレオチド
において、目的の配列の特徴付けの方法を提供する。上
記方法は本発明の増幅法の実行を包含する。その中で、
複合プライマーのＲＮＡ部分の配列は既知であり、
（ａ）参照テンプレート（複合プライマーのＲＮＡ部分
と相補的な領域を含む）からの増幅産物の量と比較し
て、テンプレートからの検出可能に少ない増幅産物の生
成は、標的ポリヌクレオチドが複合プライマーのＲＮＡ
部分と相補的な配列を含んでいないこと、および複合プ
ライマーのＲＮＡ部分と相補的な配列に対する配列改変
体であることを示すか；または（ｂ）参照テンプレート
（複合プライマーのＲＮＡ部分と相補的な領域を含まな
い）からの増幅産物の量と比較してテンプレートからの
検出可能に多い増幅産物の生成は、標的ポリヌクレオチ
ドが複合プライマーのＲＮＡ部分と相補的な配列を含ん
でいること、および複合プライマーのＲＮＡ部分と相補
的な配列に対する配列改変体でないことを示す。１つの
実施形態において、複合プライマーのＲＮＡ部分の配列
は野生型配列を含み、野生型配列の存在または非存在の
決定において、目的の配列が特徴付けられる。別の実施
形態において、複合プライマーのＲＮＡ部分の配列は変
異配列を含み、変異配列の存在または非存在の決定にお
いて、目的の配列が特徴付けられる。なお、別の実施形
態において、複合プライマーのＲＮＡ部分の配列は対立
遺伝子配列を含み、対立遺伝子配列の存在または非存在
の決定において、目的の配列が特徴付けられる。
【００２８】他の局面において、本発明は、標的ポリヌ
クレオチド中の変異を検出する方法（または、いくつか
の局面において、配列を特徴付ける方法）を提供し、本
法は、以下の工程を包含する：（ａ）本明細書中で示し
た増幅方法を実施する工程；および（ｂ）一本鎖高次構
造について本法の増幅産物を分析する工程。ここで、参
照一本鎖ポリヌクレオチドと比較して、高次構造の差異
は、標的ポリヌクレオチド中の変異を示す。他の実施形
態において、本発明は、標的ポリヌクレオチド中の変異
を検出する方法（または、いくつかの局面において、配
列を特徴付ける方法）を提供し、一本鎖高次構造につい
て、本明細書中で示したいずれかの方法の、増幅産物を
分析する工程を包含する。ここで、参照一本鎖ポリヌク
レオチドと比較して、高次構造における差異は、標的ポ
リヌクレオチドにおける変異を示す（または、いくつか
の局面において、標的配列を特徴付ける）。
【００２９】他の局面において、本発明は、マイクロア
レイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を生成する方法を提供
し、その方法は、以下の工程を包含する。（ａ）本明細
書中に示した増幅方法を実施する工程；および（ｂ）増
幅産物を固体基材に付着させ、増幅産物のマイクロアレ
イを作製する工程。他の実施形態において、本明細書中
で示したいずれかの方法により、増幅産物を固体基板に
付着させることで、増幅産物のマイクロアレイを作製す
ることにより、マイクロアレイが生成される。
【００３０】本明細書中に示したように、これらの適用
はすべて、いずれかの増幅法（種々の成分、および任意
の成分の種々の実施形態を含む）を使用し得る。例え
ば、使用された複合プライマーは、５’ＲＮＡ部分を有
し得、それは３’ＤＮＡ部分と隣接し得る。
【００３１】本発明は、本明細書中で示された増幅法に
おいて使用された、組成物、キット、複合体、反応混合
物、および種々の成分（および成分の種々の組み合わ
せ）を含むシステムも提供する。１つの局面において、
例えば、本発明は、複合プライマーを含む組成を提供す
る。上記複合プライマーは、３’ＤＮＡ部分および５’
ＲＮＡ部分を含む。いくつかの実施形態において、５’
ＲＮＡ部分は３’ＤＮＡ部分と隣接する。なお他の実施
形態において、５’ＲＮＡ部分は、約５〜約２０ヌクレ
オチドであり、３’ＤＮＡ部分は、約５〜約１５ヌクレ
オチドである。別の局面において、本発明は、ＴＳＯを
含む組成物を提供する。ここで、ＴＳＯは、テンプレー
トとハイブリダイズする領域において改変を含む。ここ
で、所定のセットの条件下で、ＴＳＯは、改変を含まな
いＴＳＯと比較して、より緊密にその領域と結合する。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、本明
細書中に示したいずれかの複合プライマーおよびＴＳＯ
を含む。なお他の実施形態において、本発明は、本明細
書中に示したいずれかの複合プライマー、および本明細
書中に示したいずれかのブロッキング配列（テンプレー
トへの結合を強める改変を含むブロッキング配列を含
む）を含む組成物を提供する。他の実施形態において、
本発明は、本明細書中に示したいずれかの複合プライマ
ーおよびＰＴＯを含む組成物を提供する。
【００３２】別の局面において、本発明は、本明細書中
に示したいずれかの複合体（それは、一般的に最終増幅
産物に対して中間産物と考えられる）を含む組成物を提
供する（それらの種々の複合体の概略的な図も参照）。
例えば、本発明は（ａ）テンプレート鎖と（ｂ）複合プ
ライマーとの複合体を含む組成物を提供する。上記複合
プライマーは、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含
む。ＲＮＡ部分は５’側に存在し得、ＤＮＡ部分に隣接
し得る。いくつかの実施形態において、複合体はさらに
終結配列（例えば、それは、ＴＳＯまたはブロッキング
配列であり得る）を含むポリヌクレオチドを含む。いく
つかの実施形態において、複合体はさらにＰＴＯを含
む。
【００３３】別の局面において、本発明は本明細書中に
示された構成成分の種々の組み合わせを含む反応混合物
（または、反応混合物を含む組成物）を提供する。例え
ば、本発明は、（ａ）ポリヌクレオチドテンプレート；
（ｂ）３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プラ
イマー；および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、を含む反応
混合物を提供する。本明細書中で示したように、複合プ
ライマーのいずれか（または複数の複合プライマー）が
反応混合物中に存在し得、それは、３’ＤＮＡ部分と隣
接する５’ＲＮＡ部分を含む複合プライマーを含み得
る。反応混合物は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲ
ＮＡを切断する酵素（ＲＮアーゼＨのような）もさらに
含み得る。本発明の反応混合物は、本明細書中で示した
終結配列を含むいずれかのポリヌクレオチド、およびプ
ロモーターと置換されたプライマー伸長産物とハイブリ
ダイズする領域を含むポリヌクレオチド、およびＲＮＡ
ポリメラーゼも含み得る。本発明の反応混合物は、ＰＴ
Ｏも含み得る。
【００３４】別の局面において、本発明は、本明細書中
に示した方法を行うためのキットを提供する。これらキ
ット（適切な包装形態で、一般的に（しかし、必ずしも
必要ではない）適切な説明書を含む）は、増幅方法にお
いて使用した１以上の成分を含む。例えば、本発明は、
複合プライマーを含むキットを提供し、その複合プライ
マーは３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分（それは、５’
であっても、さらに３’ＤＮＡ部分に隣接してもよい）
を含む。キット中の複合プライマーは、本明細書中で示
したいずれかであり得る。本キットは、さらに以下のい
ずれかのような成分を含み得る：（ａ）終結ポリヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチド；（ｂ）プロモータ
ーを含むポリヌクレオチド；（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイ
ブリッドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮアー
ゼＨ）のような、本明細書中に示したいずれかの酵素；
および（ｄ）プロモーター、および置換されたプライマ
ー伸長産物とハイブリダイズする領域を含むポリヌクレ
オチド。
【００３５】別の局面において、本発明は、本明細書中
に示した増幅法を行うためのシステムを提供する。例え
ば、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列、またはその
相補配列を増幅するためのシステムを提供し、以下を含
む。（ａ）３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複合
プライマー；（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｃ）
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素
（ＲＮアーゼＨのような）。複合プライマーは、本明細
書中で示したいずれか（１以上）であり得、３’ＤＮＡ
部分と隣接する５’ＲＮＡ部分を含む複合プライマーを
含む。
【００３６】１つの局面において、本発明は、標的ポリ
ヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を増
幅するための方法を提供し、この方法は、以下： （ａ）上記標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを
複合プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、
上記複合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分
を含む、工程； （ｂ）必要に応じて、終結ポリヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドを、上記テンプレートへの上記複合プ
ライマーのハイブリダイゼーションに対して５’側にあ
る上記テンプレートの領域にハイブリダイズさせる工
程； （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて上記複合プライマー
を伸長させる工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
る酵素を用いて、上記アニールした複合プライマーのＲ
ＮＡ部分を切断して、別の複合プライマーが上記テンプ
レートにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマ
ー伸長を反復し得るようにする工程であって、それによ
り上記標的配列の相補的配列の複数のコピーが生成され
る、工程、を包含する。
【００３７】別の局面において、本発明は、標的ポリヌ
クレオチド配列を増幅するための方法を提供し、この方
法は、以下： （ａ）上記標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレート
を、複合プライマーとハイブリダイズさせる工程であっ
て、上記複合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ
部分を含む、工程； （ｂ）終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ドを、上記テンプレートへの上記複合プライマーのハイ
ブリダイゼーションに対して５’側にある上記テンプレ
ートの領域にハイブリダイズさせる工程； （ｃ）上記複合プライマーをＤＮＡポリメラーゼを用い
て伸長させる工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
る酵素を用いて、上記アニールした複合プライマーのＲ
ＮＡ部分を切断して、別の複合プライマーが上記テンプ
レートにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマ
ー伸長を反復して置換されたプライマー伸長産物を生成
し得るようにする工程； （ｅ）プロプロモーターと上記置換されたプライマー伸
長産物にハイブリダイズする領域とを含むポリヌクレオ
チドを、ＲＮＡポリメラーゼにより転写が生じるのを可
能にする条件下でハイブリダイズさせ、上記置換された
プライマー伸長産物と相補的な配列を含むＲＮＡ転写物
が生成されるようにする工程であって、それにより該標
的配列の複数のコピーが生成される、工程、を包含す
る。
【００３８】１つの実施形態において、上記複合プライ
マーのＲＮＡ部分は、前記３’ＤＮＡ部分に対して５’
側にあり得る。
【００３９】他の実施形態において、上記５’ＲＮＡ部
分は、上記３’ＤＮＡ部分に隣接し得る。
【００４０】別の実施形態において、上記方法におい
て、複数の複合プライマーが使用され得る。
【００４１】なお別の実施形態において、上記終結配列
を含むポリヌクレオチドは、テンプレートスイッチオリ
ゴヌクレオチド（ＴＳＯ）であり得る。
【００４２】なお別の実施形態において、上記ＴＳＯ
は、上記テンプレートにハイブリダイズする領域におい
て改変を含み得、所定のセットの条件下で、上記ＴＳＯ
は、上記改変を含まないＴＳＯと比較した場合に、より
緊密に該領域に結合し得る。
【００４３】なお別の実施形態において、上記終結配列
を含むポリヌクレオチドは、ブロッキング配列であり得
る。
【００４４】なお別の実施形態において、上記ブロッキ
ング配列は、上記テンプレートにハイブリダイズする領
域において改変を含み得、所定のセットの条件下で、上
記ブロッキング配列は、上記改変を含まないブロッキン
グ配列と比較した場合に、より緊密に該領域に結合し得
る。
【００４５】なお別の実施形態において、上記ＲＮＡを
切断する酵素は、ＲＮアーゼＨであり得る。
【００４６】なお別の実施形態において、上記プロプロ
モーターと上記置換されたプライマー伸長産物にハイブ
リダイズする領域とを含むポリヌクレオチドは、テンプ
レートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）であり得
る。
【００４７】なお別の実施形態において、上記プロプロ
モーターを含むポリヌクレオチドは、上記置換されたプ
ライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を３’末端
に含み得、それにより置換されたプライマー伸長産物の
ＤＮＡポリメラーゼ伸長は、転写を生じる二本鎖プロモ
ーターを生成し得る。
【００４８】なお別の実施形態において、上記プロプロ
モーターを含むポリヌクレオチドは、プロプロモーター
テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）であり得
る。
【００４９】なお別の実施形態において、工程（ａ）お
よび（ｂ）は、どちらの順序でも実施され得る。
【００５０】なお別の実施形態において、工程（ａ）お
よび（ｂ）は、同時に実施され得る。
【００５１】なお別の実施形態において、工程（ａ）、
（ｂ）および（ｃ）は、同時に実施され得る。
【００５２】なお別の実施形態において、工程（ａ）お
よび（ｂ）は、工程（ｃ）の前に実施され得る。
【００５３】なお別の実施形態において、工程すべて
は、同時に実施され得る。
【００５４】別の局面において、本発明は、標的ヌクレ
オチド配列を配列決定する方法を提供し、この方法は、
以下： （ａ）上記標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを
複合プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、
上記複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部
分を含む、工程； （ｂ）必要に応じて、終結ポリヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドを、上記テンプレートへの上記複合プ
ライマーのハイブリダイゼーションに対して５’側にあ
る上記テンプレートの領域にハイブリダイズさせる工
程； （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼならびにｄＮＴＰとｄＮＴＰ
アナログとの混合物を用いて、上記複合プライマーを終
結部位へと伸長させて、プライマー伸長がｄＮＴＰアナ
ログの取り込みの際に終結するようにする、工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
る酵素を用いて、上記アニールした複合プライマーのＲ
ＮＡ部分を切断して、別の複合プライマーが上記テンプ
レートにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマ
ー伸長を反復し得るようにする工程であって、それによ
り上記標的配列の相補的配列の種々の長さの複数のコピ
ーが生成される、工程； （ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の産物を分析して配列を決定
する工程、を包含する。
【００５５】なお別の局面において、本発明は、標的ヌ
クレオチド配列を配列決定する方法を提供し、この方法
は、以下： （ａ）上記標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを
複合プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、
上記複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部
分を含む、工程； （ｂ）終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ドを、上記テンプレートへの上記複合プライマーのハイ
ブリダイゼーションに対して５’側にある上記テンプレ
ートの領域にハイブリダイズさせる工程； （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて上記複合プライマー
を伸長させる工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
る酵素を用いて、上記アニールした複合プライマーのＲ
ＮＡ部分を切断して、別の複合プライマーが上記テンプ
レートにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマ
ー伸長を反復して置換されたプライマー伸長産物を生成
し得るようにする工程； （ｅ）プロプロモーターと上記置換されたプライマー伸
長産物にハイブリダイズする領域とを含むポリヌクレオ
チドを、ｒＮＴＰとｒＮＴＰアナログとの混合物を使用
して、ＲＮＡポリメラーゼにより上記伸長産物から転写
が生じるような条件下で、ハイブリダイズさせ、上記置
換されたプライマー伸長産物と相補的な配列を含むＲＮ
Ａ転写物が生成されるようにし、そして転写がｒＮＴＰ
アナログの取り込みの際に終結するようにする工程であ
って、それにより上記標的配列の種々の長さの複数のコ
ピーが生成される、工程； （ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）の産物を分析して配列を決定
する工程、を包含する。
【００５６】１つの実施形態において、上記複合プライ
マーのＲＮＡ部分は、上記３’ＤＮＡ部分に対して５’
側にあり得る。
【００５７】他の実施形態において、上記５’ＲＮＡ部
分は、上記３’ＤＮＡ部分に隣接し得る。
【００５８】なお他の局面において、本発明は、標的ポ
リヌクレオチド中の目的の配列を特徴付ける方法を提供
し、この方法は、上記方法であって、上記複合プライマ
ーのＲＮＡ部分の配列が既知である方法を実行する工程
を包含し、そしてここで、（ａ）上記複合プライマーの
ＲＮＡ部分と相補的な領域を含む参照テンプレートから
の増幅産物の量と比較して検出可能に少ない、上記テン
プレートからの増幅産物の生成は、上記標的ポリヌクレ
オチドが、上記複合プライマーのＲＮＡ部分と相補的な
配列を含まずかつ上記複合プライマーのＲＮＡ部分と相
補的な配列に対する配列改変体であることを示すか；ま
たは（ｂ）上記複合プライマーのＲＮＡ部分と相補的な
領域を含まない参照テンプレートからの増幅産物の量と
比較して検出可能に多い、上記テンプレートからの増幅
産物の生成は、上記標的ポリヌクレオチドが、上記複合
プライマーのＲＮＡ部分と相補的な配列を含みかつ上記
複合プライマーのＲＮＡ部分と相補的な配列に対する配
列改変体ではないことを示す、方法。
【００５９】１つの局面において、上記複合プライマー
のＲＮＡ部分の配列は、野生型配列を含み得、そして上
記目的の配列は、上記野生型配列の存在または非存在を
決定することにおいて特徴付けられ得る。
【００６０】他の実施形態において、上記複合プライマ
ーのＲＮＡ部分の配列は、変異配列を含み得、そして上
記目的の配列は、上記変異配列の存在または非存在を決
定することにおいて特徴付けられ得る。
【００６１】別の実施形態において、上記複合プライマ
ーのＲＮＡ部分の配列は、対立遺伝子配列を含み得、そ
して上記目的の配列は、上記対立遺伝子配列の存在また
は非存在を決定することにおいて特徴付けられ得る。
【００６２】なお別の局面において、本発明は、標的ポ
リヌクレオチドにおける変異を検出する方法を提供し、
（ａ）上記方法を実行する工程；および（ｂ）一本鎖高
次構造について上記方法の増幅産物を分析する工程、を
包含し、参照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した場合の
高次構造における差異が、上記標的ポリヌクレオチドに
おける変異を示す。
【００６３】１つの実施形態において、上記複合プライ
マーのＲＮＡ部分は、上記３’ＤＮＡ部分に対して５’
側にあり得る。
【００６４】他の実施形態において、上記５’ＲＮＡ部
分は、上記３’ＤＮＡ部分に隣接し得る。
【００６５】なお別の局面において、本発明は、マイク
ロアレイを作製する方法を提供し、この方法は、（ａ）
上記増幅方法を実行する工程；および（ｂ）上記増幅産
物のマイクロアレイを作製するために固体基材上に上記
増幅産物を付着させる工程、を包含する。
【００６６】なお別の局面において、本発明は、複合プ
ライマーを含む組成物を提供し、この複合プライマー
は、３’ＤＮＡ部分および５’ＲＮＡ部分を含む。
【００６７】１つの実施形態において、上記５’ＲＮＡ
部分は、上記３’ＤＮＡ部分に隣接し得る。
【００６８】他の実施形態において、上記５’ＲＮＡ部
分は、約５〜約２０ヌクレオチドであり得、そして上記
３’ＤＮＡ部分は、約５〜約１５ヌクレオチドであり得
る。
【００６９】なお別の局面において、本発明は、ＴＳＯ
を含む組成物を提供し、このＴＳＯは、テンプレートに
ハイブリダイズする領域における改変を含み、所定のセ
ットの条件下で、上記ＴＳＯは、上記改変を含まないＴ
ＳＯと比較した場合により緊密に該領域に結合する。
【００７０】なお別の局面において、本発明は、上記複
合プライマーおよび上記ＴＳＯを含む組成物を提供す
る。
【００７１】なお別の局面において、本発明は、上記複
合プライマーおよびブロッキング配列を含む組成物を提
供する。
【００７２】なお別の局面において、本発明は、上記複
合プライマーおよびプロプロモーターテンプレートオリ
ゴヌクレオチド（ＰＴＯ）を含む組成物を提供する。
【００７３】なお別の局面において、本発明は、（ａ）
テンプレート鎖と（ｂ）複合プライマーとの複合体を含
む組成物を提供し、上記複合プライマーは、３’ＤＮＡ
部分およびＲＮＡ部分を含む。
【００７４】１つの実施形態において、上記ＲＮＡ部分
は、上記３’ＤＮＡ部分の５’側にありかつ隣接し得
る。
【００７５】他の実施形態において、上記複合体は、さ
らに終結配列を含み得る。
【００７６】別の実施形態において、上記終結配列は、
ＴＳＯであり得る。
【００７７】なお別の実施形態において、上記終結配列
は、ブロッキング配列であり得る。
【００７８】なお別の局面において、本発明は、反応混
合物を提供し、この反応混合物は、（ａ）ポリヌクレオ
チドテンプレート；（ｂ）３’ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分
とを含む複合プライマー；ならびに（ｃ）ＤＮＡポリメ
ラーゼを含む。
【００７９】１つの実施形態において、上記複合プライ
マーは、上記３’ＤＮＡ部分に隣接する５’ＲＮＡ部分
を含み得る。
【００８０】他の実施形態において、上記反応混合物
は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する
酵素をさらに含み得る。
【００８１】別の実施形態において、上記記酵素は、Ｒ
ＮアーゼＨであり得る。
【００８２】なお別の実施形態において、上記反応混合
物は、終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ドをさらに含み得る。
【００８３】なお別の実施形態において、上記反応混合
物は、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドをさら
に含み得る。
【００８４】なお別の実施形態において、上記プロプロ
モーターを含むポリヌクレオチドは、ＴＳＯであり得
る。
【００８５】なお別の実施形態において、上記プロプロ
モーターを含むポリヌクレオチドは、プロプロモーター
テンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）であり得
る。
【００８６】なお別の局面において、本発明は、標的ポ
リヌクレオチド配列の増幅のためのキットを提供し、こ
のキットは、３’ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含む複合
プライマーを備える。
【００８７】１つの実施形態において、上記ＲＮＡ部分
は、上記３’ＤＮＡ部分に対して５’側にあり得る。
【００８８】他の実施形態において、上記５’ＲＮＡ部
分は、上記３’ＤＮＡ部分に隣接し得る。
【００８９】別の実施形態において、上記キットは、終
結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさら
に備え得る。
【００９０】なお別の実施形態において、上記終結ポリ
ヌクレオチド配列は、ＴＳＯであり得る。
【００９１】なお別の実施形態において、上記終結ポリ
ヌクレオチド配列は、ブロッカー配列であり得る。
【００９２】なお別の実施形態において、上記キット
は、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに
備え得る。
【００９３】なお別の実施形態において、上記プロプロ
モーターを含むポリヌクレオチドは、ＴＳＯであり得
る。
【００９４】なお別の実施形態において、上記プロプロ
モーターを含むポリヌクレオチドは、ＰＴＯであり得
る。
【００９５】なお別の実施形態において、上記キット
は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する
酵素をさらに備え得る。
【００９６】なお別の実施形態において、上記酵素は、
ＲＮアーゼＨであり得る。
【００９７】なお別の局面において、本発明は、標的ポ
リヌクレオチド配列またはその相補体を増幅するための
システムを提供し、このシステムは、（ａ）３’ＤＮＡ
部分とＲＮＡ部分とを含む複合プライマー；（ｂ）ＤＮ
Ａポリメラーゼ；ならびに（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッドからＲＮＡを切断する酵素、を含む。
【００９８】１つの実施形態において、上記酵素は、Ｒ
ＮアーゼＨであり得る。
【００９９】他の実施形態において、上記複合プライマ
ーは、上記３’ＤＮＡ部分に隣接する５’ＲＮＡ部分を
含み得る。
【０１００】
【発明の実施の形態】本発明は、ポリヌクレオチド配列
を増幅するための方法、組成物およびキットを提供す
る。本法は、一般に、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合プライマー、
必要に応じて終結配列、および転写が使用される実施形
態では、プロモーターオリゴヌクレオチド配列を使用す
る工程を包含する。
【０１０１】全体的な要約として、増幅法の操作は、以
下のようである：複合ＲＮＡ／ＤＮＡプライマーは、標
的配列の複製のための基礎を形成する。いくつかの実施
形態において、終結配列は、標的に沿ったさらなる複製
を切換え、またはブロックのいずれかにより、複製に対
する終点のための基礎を提供する。以下に示すように、
いくつかの実施形態において、終結配列を含むポリヌク
レオチドは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド
（ＴＳＯ）であり、このテンプレートスイッチオリゴヌ
クレオチドは、テンプレート鎖とハイブリダイズするに
は相補性が十分でない配列（ハイブリダイズするのに十
分な相補性のある配列に加えて）を含む；他の実施形態
では、終結配列は、テンプレート鎖にハイブリダイズす
るために十分な相補性のある配列を、主に含む。ＤＮＡ
ポリメラーゼはプライマーからの標的配列のコピーをも
たらす。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断
する酵素（ＲＮアーゼＨのような）は、ハイブリッドか
らＲＮＡ配列を切断（除去）する。テンプレート鎖上に
残っている配列は、別の複合プライマーによる結合に利
用可能である。別の鎖は、前に複製された鎖を置換する
ＤＮＡポリメラーゼにより生成され、結果として置換伸
長産物を生じる。必要に応じて、プロプロモーター（ｐ
ｒｏｐｒｏｍｏｔｅｒ）、および置換されたプライマー
伸長産物（例えば、それはテンプレート置換オリゴヌク
レオチド、またはプロプロモーターテンプレートオリゴ
ヌクレオチドであり得る）とハイブリダイズする領域を
含むポリヌクレオチドは、置換伸長産物の３’末端にハ
イブリダイズするために十分な相補性のある配列を含
み、置換されたプライマー伸長産物と結合する。プロモ
ーターは転写（ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを介し
て）を駆動し、センスＲＮＡ産物を生成する。
【０１０２】従って、本発明は、少なくとも１つの標的
ポリヌクレオチド配列コピーを生成する方法（一般に、
標的ポリヌクレオチド配列を増幅する方法）を提供し、
その方法は、以下を組み合わせる工程と反応させる工程
を包含する：（ａ）標的配列を含む一本鎖標的ポリヌク
レオチド；（ｂ）ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含
む複合プライマー；（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｄ）
デオキシリボヌクレオシド三リン酸または適切なアナロ
グ；（ｅ）ＲＮアーゼＨのようなＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖
からＲＮＡを切断する酵素；および（ｆ）一般的ではあ
るが、必要に応じて、テンプレートポリヌクレオチドと
ハイブリダイズする部分（または領域）を含む終結配列
（本明細書中で示す、任意の終結配列のような）を含む
ポリヌクレオチド。転写に基く増幅（以下参照）も使用
される場合には、終結配列が使用される。その組み合わ
せは、以下の適切な条件下に供される：（ａ）複合プラ
イマー（および、必要に応じて、終結配列を含むポリヌ
クレオチド）とテンプレートがハイブリダイズする条
件；（ｂ）複合プライマーからプライマー伸長が生じ、
二重鎖を形成する条件；（ｃ）ＲＮアーゼＨがＲＮＡ／
ＤＮＡ二重鎖から複合プライマーのＲＮＡを切断する条
件；（ｄ）別の複合プライマーが、テンプレートにハイ
ブリダイズし、別のプライマー伸長（ＤＮＡポリメラー
ゼにより媒介される）の繰り返しが生じ、テンプレート
から、既にコピーされた鎖が、置換する条件。
【０１０３】必要に応じて、増幅反応（上記、それらの
組成物と同時に、または別に加える、いずれかにおい
て）に、以下も含まれる：（ｅ）プロプロモーター配列
（本明細書中に示したように、多くの形状のいずれかで
存在し得る）、および置換されたプライマー伸長産物と
ハイブリダイズする領域を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）リボヌクレオシド三リン酸、または適切なアナロ
グ；および（ｇ）ＲＮＡポリメラーゼ（置換鎖の転写が
生じ得るような条件下）。本発明の方法の種々の成分に
関する詳細は、以下に提供される。
【０１０４】いくつかの実施形態において、本発明は、
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定の方法を提供す
る。配列決定方法に関して、標識、または非標識であり
得る適切なｄＮＴＰ（または、転写に基く増幅に依存す
る実施形態が使用される場合は、適切なｒＮＴＰ）が使
用される。従って、本発明は、上記の方法を含む標的ヌ
クレオチド配列の配列決定の方法を提供し、ここでプラ
イマー伸長ターミネーターであるｄＮＴＰおよびｄＮＴ
Ｐアナログ（標識または非標識であり得る）、および／
またはプライマー伸長ターミネーターであるｒＮＴＰお
よびｒＮＴＰアナログ（標識または非標識であり得る）
が使用され、以下に示すように、増幅産物は配列情報に
ついて、分析される。
【０１０５】他の実施形態において、本発明は、核酸配
列の変異を検出する方法、および／または標的配列を特
徴付ける方法を提供する。１つの実施形態において、標
的ポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在
は、複合プライマーを用いる標的ポリヌクレオチドを増
幅する能力に基いて検出される。その複合プライマーの
ＲＮＡ部分は、本発明の方法を使用する変異配列を含
む、または欠如するのいずれかである。別の実施形態に
おいて、増幅産物は特異的プローブとのハイブリダイゼ
ーションによる変異の検出のために使用される。なお別
の実施形態において、増幅産物は、標的ポリヌクレオチ
ドにおける一本鎖高次構造多型を検出、および／または
同定するために使用される。
【０１０６】なお他の実施形態において、本発明は、本
発明の、線形核酸増幅法または増強型線形核酸増幅法の
増幅産物を用いて、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のマイ
クロアレイを生成するための方法を提供する。
【０１０７】本明細書中で示した増幅産物を使用する他
の方法は、以下に提供される。
【０１０８】（本発明の増幅方法の利点）本発明の増幅
方法は、他の核酸増幅方法を超えるいくつかの顕著な利
点を提供する。プライムされたテンプレート、プライマ
ー伸長および以前に作製された伸長産物の置換の形成
は、リボヌクレアーゼ活性による、ハイブリダイズした
プライマーのＲＮＡ部分の切断に依存する。従って、プ
ライマー伸長産物は、プライマーのもっとも５’側の部
分を欠いている。その結果として、伸長産物とテンプレ
ートスイッチオリゴヌクレオチドまたはプロモーターテ
ンプレートオリゴヌクレオチドとの複合体から作製され
たＲＮＡ転写産物は、プライマーのこの部分に相補的な
配列をその３’末端に含まない。従って、増幅産物は、
生産的な増幅についてそのプライマーにハイブリダイズ
し得ず、本発明の増幅方法を、先の増幅反応によって作
製された産物の夾雑に起因する非特異的増幅に抵抗性に
する。この特徴は、他の既知の標的増幅方法（例えば、
ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡなど）から本発明の方法を明確に区
別し、そして本発明の方法を、臨床の研究室での高スル
ープット試験部位などにおいて共通に使用されるオープ
ンチューブプラットフォーム（ｏｐｅｎ ｔｕｂｅ ｐ
ｌａｔｆｏｒｍ）に適切なものとする。
【０１０９】標的核酸配列の増幅のさらなる進行につい
て、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅＨなど）によってハ
イブリダイズされかつ伸長された形態の複合プライマー
のＲＮＡ部分の切断に独特な要求は、ＤＮＡ標的の排他
的増幅を生じる。従って、過剰なｍＲＮＡの存在下でゲ
ノムＤＮＡ標的の増幅について、本発明の方法を使用し
得る。この特徴は、遺伝子用量の正確な定量について有
用である。試験標的核酸配列がＲＮＡの場合、この標的
は、本発明の方法を使用して増幅され得るｃＤＮＡを産
生するためにまず転写される。
【０１１０】本発明の方法はまた、テンプレートに関し
て高精度での標的核酸の増幅を提供する。各増幅産物
は、（線形増幅方法での）インプットのテンプレートＤ
ＮＡ、または（増強型線形増幅方法での）インプットの
テンプレートＤＮＡおよびインプットのテンプレートＤ
ＮＡのプライマー伸長産物における、標的配列の直接の
コピーである。
【０１１１】本発明の方法は、増幅が等温で実施され得
る点で熱サイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）
を必要としない。この特徴は、多くの利点（核酸の高ス
ループット増幅および／または分析についての自動化お
よび適応を容易にすることを含む）を提供する。例え
ば、本発明の増幅法に基づく配列決定法は、反応を等温
で実施するこの能力によって単純化される。報告された
他の方法は、標的配列からプライマー伸長産物を分離す
るための熱サイクリング（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉ
ｎｇ）を必要とする。この等温反応は、熱サイクリング
によって提供される反応より速く、そして小型化された
デバイスにおいて標的核酸の配列決定を実施するために
適切である。
【０１１２】本発明の方法の別の利点は、単一のプライ
マーのみしか必要とされないことである。単一のプライ
マーは、テンプレート核酸の増幅を生じる、一方向性プ
ライマー伸長を提供するために使用される。これは、プ
ライマー対を使用しなければならない際に付随する多く
の不利益（例えば、２セットのプライマーの設計および
作成の費用、テンプレート核酸内のさらなる配列領域を
予め知っておく必要性、および増幅された産物が非特異
的プライミングによって生じる増加した可能性）を除外
する。
【０１１３】本発明の線形等温増幅法はまた、核酸標的
の検出、規定された核酸配列の定量、および規定された
核酸配列に対するプローブの作製に使用するに適切であ
る。本発明の方法は、核酸配列の定性的検出、標的核酸
配列の量の定量的決定、遺伝子型決定に必要な場合の規
定された配列改変の存在の検出、および配列決定に有用
である。本発明の方法に従った増幅産物は、一本鎖であ
り、そして種々の既知の核酸検出法によって容易に検出
可能である。
【０１１４】本発明の方法はさらに、核酸配列の多重分
析に有用である。すなわち、種々の標的配列は、単一の
反応混合物において同時に増幅され得る。種々の標的配
列は、単一のゲノムＤＮＡの一部であり得るか、または
単一の試験サンプルに存在し得る種々の核酸標的の特定
の配列を示し得る。例えば、本発明の方法は、単一の生
物学的サンプルにおける種々の病原体の存在を検出する
に有用である。同様に、単一のＤＮＡサンプルにおける
種々の多型部位の決定は、単一の反応において同時に決
定され得る。
【０１１５】本明細書中に記載される実施形態全てに関
して、一般に構成要素または局面を「含む」ように、本
発明はまたこれらの構成要素または局面「から実質的に
なる」実施形態を含むことが理解される。本発明はま
た、これらの構成要素または局面「からなる」実施形態
を含む。このことは、本明細書中に記載される全ての実
施形態に適用される。
【０１１６】（一般的技術）本発明の実施は、他のよう
に示されない限り、当業者の範囲内である分子生物学
（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学
および免疫学の従来の技術を利用する。このような技術
は、文献に完全に説明される。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９）；「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｓｔｈｅ
ｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉ
ｍａｌＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓ
ｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」
（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、および定期
的更新版）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら
編、１９９４）のような文献である。
【０１１７】本発明において利用されるプライマー、オ
リゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、当該分野
において標準の技術を使用して作製され得る。
【０１１８】（定義）本明細書で使用される場合、「標
的配列」は、増幅が所望される、目的のポリヌクレオチ
ド配列である。標的配列は、その実際の配列に関して既
知であっても既知でなくてもよい。一般に、本明細書中
で使用される場合、「テンプレート」は、標的ヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドである。いくつかの場
合、用語「標的配列」、「テンプレートＤＮＡ」、「テ
ンプレートポリヌクレオチド」「標的核酸」、「標的ポ
リヌクレオチド」およびこれらの変異体は、相互交換可
能に使用される。
【０１１９】本明細書中で使用される場合、「増幅」
は、一般に所望の配列の複数のコピーを産生するプロセ
スをいう。「複数のコピー」は、少なくとも２コピーを
意味する。「コピー」は、テンプレート配列に対する完
全な配列相補性、または同一性を必ずしも意味しない。
例えば、コピーは、デオキシイノシンのようなヌクレオ
チドアナログ、意図的な配列変化（例えば、テンプレー
トにハイブリダイズし得るが相補的でない配列を含むプ
ライマーを介して導入される配列変化）、および／また
は増幅の間に生じる配列エラーを含み得る。
【０１２０】本明細書中で相互交換可能に使用される場
合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長
さのヌクレオチドのポリマーをいい、そしてＤＮＡおよ
びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレ
オチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドも
しくは塩基、および／またはこれらのアナログ、あるい
はＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼにより
ポリマーに取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリ
ヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メ
チル化ヌクレオチドおよびそのアナログ）を含み得る。
存在する場合、ヌクレオチド構造についての改変は、ポ
リマーのアセンブリの前または後に与えられ得る。ヌク
レオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込
まれ得る。ポリヌクレオチドはさらに、ポリマー化の後
に（例えば、標識された成分と組み合わせることによっ
て）改変され得る。改変の他の型としては、以下が挙げ
られる：例えば、「キャップ」、天然の存在するヌクレ
オチドの１つ以上のアナログによる置換、ヌクレオチド
間改変（例えば、非荷電結合を含むもの（例えば、メチ
ルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデー
ト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カバメート（ｃ
ａｂａｍａｔｅ）など）および荷電結合を含むもの（例
えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートな
ど））、ペンダント部分を含むもの（例えば、タンパク
質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプ
チド、ポリ−Ｌ−リジンなど））、挿入物（ｉｎｔｅｒ
ｃａｌａｔｏｒ）を有するもの（例えば、アクリジン、
ソラレンなど）、キレート剤を含むもの（例えば、金
属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）、アルキル
化剤を含むもの、改変された結合を有するもの（例え
ば、αアノマー（ａｎｏｍｅｒｉｃ）核酸など）、なら
びにポリヌクレオチドの未改変形態。さらに、糖に通常
存在する水酸基のいずれかが、例えば、標準の保護基に
よって保護されたか、もしくはさらなるヌクレオチドへ
のさらなる結合を調製するために活性化された、ホスホ
ネート基、リン酸基によって置換され得るか、または固
体支持体に結合され得る。５’末端および３’末端のＯ
Ｈは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１〜
２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換され
得る。他の水酸基もまた、標準的保護基へ誘導体化され
得る。ポリヌクレオチドはまた、当該分野で一般に公知
のリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態を含
み得る。この擬似形態は、例えば、２’−Ｏ−メチルリ
ボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロ−
リボースまたは２’−アジド−リボース、炭素環式糖ア
ナログ、α−アノマー化糖、エピマー化糖（例えば、ア
ラビノース、キシロースまたはリキソース）、ピラノー
ス糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナロ
グおよび非塩基性（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシドアナロ
グ（例えば、メチルリボシド）を含む。１以上のホスホ
ジエステル結合は、代替の連結基によって置換され得
る。これらの代替の連結基としては、以下が含まれる
が、これらに限定されない：ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ
（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエー
ト」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）
Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセ
タール」）によって置換される実施形態（ここで、各Ｒ
またはＲ’は、独立してＨであるか、あるいは置換もし
くは非置換のアルキル（１−２０Ｃ）（必要に応じてエ
ーテル（−Ｏ−）結合を含む）、アリール、アルケニ
ル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラル
キル（ａｒａｌｄｙｌ））。ポリヌクレオチドにおける
全ての結合が、同一である必要はない。先述の記載は、
本明細書中でいわれるポリヌクレオチド（ＲＮＡおよび
ＤＮＡを含む）全てに適用される。
【０１２１】本明細書中で使用される場合、「オリゴヌ
クレオチド」は、一般に短く、一般に一本鎖で、一般に
合成のポリヌクレオチド（一般には約２００ヌクレオチ
ド長未満であるが、その必要はない）をいう。本発明に
おけるオリゴヌクレオチドは、複合プライマー、ＴＳ
Ｏ、ＰＴＯおよびブロッカー配列を含む。用語「オリゴ
ヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互に
排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の記
載は、オリゴヌクレオチドに対して、等しくかつ完全に
適用可能である。
【０１２２】「プライマー」は、一般に短い一本鎖のポ
リヌクレオチドであり、遊離３’−ＯＨ基を一般に含
み、標的配列にハイブリダイズすることによって目的の
サンプルに潜在的に存在する標的に結合し、その後標的
に相補的なポリヌクレオチドのポリマー化を促進する。
【０１２３】本明細書中で相互交換可能に使用される場
合、「終結（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）ポリヌクレオチ
ド配列」または「終結配列」は、標的配列を含むテンプ
レートに関して、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製
の停止をもたらすポリヌクレオチド配列である。終結配
列は、一般に、終結点（部位）の５’側の位置でテンプ
レートにハイブリダイズする部分（または領域）を含
む。ハイブリダイズし得る部分は、終結配列の全体を含
んでも含まなくてもよい。適切な終結ポリヌクレオチド
配列の例（例えば、ブロッカー配列およびＴＳＯ）は、
本明細書中に提供される。
【０１２４】本明細書中で相互交換可能に使用される場
合、「ブロッカー配列」または「ブロッキング配列」
は、終結配列の例であり、そして、終結部位の５’側の
位置でテンプレート核酸に一般に高親和性で結合し、か
つ標的配列を含むテンプレートに関してＤＮＡポリメラ
ーゼによるＤＮＡ複製の停止をもたらす、オリゴヌクレ
オチドをいう。この３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼに
よる伸長についてブロックされてもされなくてもよい。
【０１２５】本明細書中で相互交換可能に使用される場
合、「終結部位」または「終結点」は、ポリマー化（一
般に、プライマー伸長）の終結またはテンプレートスイ
ッチの前にＤＮＡポリメラーゼによって最後に複製され
るテンプレートの部位、点または領域をいう。例えば、
ＴＳＯに関して、この部位は、テンプレートポリメラー
ゼからＴＳＯの非ハイブリダイズ部位へとテンプレート
をスイッチする前のプライマー伸長産物の３’末端に相
補的である、標的配列中の位置または領域である。
【０１２６】本明細書中で使用される場合、「プロトプ
ロモーター（ｐｒｏｔｏｐｒｏｍｏｔｏｒ）配列」およ
び「プロプロモーター配列」は、二本鎖の形態でＲＮＡ
転写を媒介し得る一本鎖ＤＮＡ配列領域をいう。いくつ
かの状況で、「プロトプロモーター配列」、「プロトプ
ロモーター」、「プロプロモーター配列」、「プロプロ
モーター」、「プロモーター配列」および「プロモータ
ー」は、相互交換可能に使用される。
【０１２７】本明細書中で使用される場合、「テンプレ
ートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）」は、プラ
イマー伸長の終結部位の５’側の位置でテンプレートに
ハイブリダイズし得、かつＤＮＡポリメラーゼによるプ
ライマー伸長のプロセスにおいてテンプレートスイッチ
をもたらし得る、部分（または領域）を含むオリゴヌク
レオチドをいう。ＴＳＯは、一般に当該分野において公
知である。「テンプレートスイッチ」は、プライマー伸
長の一回の過程の間に、一般に標的核酸からＴＳＯの非
ハイブリダイズ部分へと、テンプレート核酸において変
化することをいう。
【０１２８】本明細書中で使用される場合、「プロプロ
モーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）」
は、プロプロモーター配列と、プライマー伸長産物の
３’領域にハイブリダイズし得る部分（一般に３’部
分）とを含む、オリゴヌクレオチドをいう。このプロプ
ロモーター配列とハイブリダイズし得る部分とは、オリ
ゴヌクレオチドの同一のヌクレオチドであっても、別個
のヌクレオチドであっても、または重複するヌクレオチ
ドであってもよい。
【０１２９】第２配列に「対応する」第１配列（例え
ば、複合プライマーのＲＮＡ部分）は、第１配列が第２
配列に関して顕著な配列同一性を有することを意味す
る。この用語は、一般に標的の変異を検出する状況でか
または配列を特徴付ける状況で使用される。
【０１３０】「阻害」するは、参照と比較する場合に活
性、機能、および／または量を減少するかまたは低減す
ることである。
【０１３１】「複合体」は、成分のアセンブリである。
複合体は、安定であってもなくてもよく、そして直接的
にかまたは間接的に検出され得る。例えば、本明細書中
に記載されるように、特定の反応成分、および反応産物
の型を考慮すると、複合体の存在が、推測され得る。本
発明の目的について、複合体は、一般に、増幅最終産物
に関する中間体である。
【０１３２】本明細書中で相互交換可能に使用される場
合、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの「部
分」または「領域」は、２以上の塩基の連続する配列で
ある。他の実施形態において、領域または部分は、少な
くとも約３、５、１０、１５、２０、２５のいずれかの
個数連続するヌクレオチドである。
【０１３３】他の配列に「隣接する」領域、部分、また
は配列は、その領域、部分、または配列に直接接する。
例えば、複合プライマーの５’ＤＮＡ部分に隣接するＲ
ＮＡ部分は、その領域に直接接する。この例の実例につ
いて、図１Ａ−Ｃを参照のこと。
【０１３４】「反応混合物」は、適切な条件下で反応し
て複合体（中間体であり得る）および／または産物を形
成する成分の集合である。
【０１３５】他のように示されない場合、「ａ」、「ａ
ｎ」および「ｔｈｅ」などは複数の形態を含む。
【０１３６】「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、含
む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味する。
【０１３７】事象が生じるのを「可能にする」条件、ま
たは事象が生じる（例えば、ハイブリダイゼーション、
鎖伸長など）に「適切な」条件、あるいは、「適切な」
条件は、このような事象が生じることを妨げない条件で
ある。従って、これらの条件は、これらの事象を可能に
し、増強し、容易にし、および／または招く。当該分野
において公知でありそして本明細書に記載される、この
ような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温
度、および緩衝液の条件に依存する。これらの条件はま
た、どの事象（例えば、ハイブリダイゼーション、切
断、鎖伸長または転写）が所望されるかに依存する。
【０１３８】本明細書中で使用される場合、配列「変
異」は、参照配列と比較した、目的の配列における任意
の配列変化をいう。参照配列は、野生型配列であり得る
かまたは目的の配列と比較されることが望まれる配列で
あり得る。配列変異は、置換、欠失または挿入などの機
構に起因する、配列における単一のヌクレオチド変化、
または１より多いヌクレオチドの変化を含む。単一ヌク
レオチド多型（ＳＮＰ）もまた、本明細書中で使用され
る場合、配列変異である。
【０１３９】本明細書中で使用される場合、「一本鎖高
次構造多型」および「ＳＳＣＰ］は、その特定の核酸配
列によって影響されるように、一本鎖核酸の特定の高次
構造を一般にいう。一本鎖ポリヌクレオチドの配列の変
化（例えば、単一のヌクレオチド置換、欠失または挿
入）は、その一本鎖ポリヌクレオチドの高次構造の変
化、または多型を生じる。ポリヌクレオチドの高次構造
は、一般に、当該分野において公知の方法（ゲル電気泳
動、キャピラリー電気泳動）によって測定される、電気
泳動的移動、および／またはエンドヌクレアーゼ消化に
対する感受性）を使用して検出可能であり、同定可能で
あり、および／または区別可能である。
【０１４０】本明細書中で相互交換可能に使用される場
合、「マイクロアレイ」および「アレイ」は、集中化さ
れた位置におけるヌクレオチド配列の収集物の配置をい
う。アレイは、ガラススライドのような固体基材上、ま
たはニトロセルロース膜のような半固体基材上であり得
る。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその
任意の順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）であり得る。
【０１４１】用語「３’」は、一般に、同一のポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域ま
たは部分から３’（下流）側の、ポリヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドにおける領域または部分をいう。
【０１４２】用語「５’」は、一般に、同一のポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドにおける別の領域ま
たは部分から５’（上流）側の、ポリヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドにおける領域または部分をいう。
【０１４３】用語「３’−ＤＮＡ部分」、「３’−ＤＮ
Ａ領域」、「３’−ＲＮＡ部分」および「３’−ＲＮＡ
領域」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
の３’末端方向に位置するポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そしてその同
一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も
３’側のヌクレオチドに付着する、最も３’側のヌクレ
オチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も
３’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約２０ヌク
レオチド、より好ましくは約３〜約１８ヌクレオチド、
さらにより好ましくは約５〜約１５のヌクレオチドであ
り得る。
【０１４４】用語「５’−ＤＮＡ部分」、「５’−ＤＮ
Ａ領域」、「５’−ＲＮＡ部分」および「５’−ＲＮＡ
領域」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
の５’末端方向に位置するポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドの部分または領域をいい、そしてその同
一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの最も
５’側のヌクレオチドに付着する、最も５’側のヌクレ
オチドまたは部分を含んでも含まなくてもよい。最も
５’側のヌクレオチドは、好ましくは約１〜約２０ヌク
レオチド、より好ましくは約３〜約１８ヌクレオチド、
さらにより好ましくは約５〜約１５のヌクレオチドであ
り得る。
【０１４５】「検出」は、直接検出および間接検出を含
む、任意の検出手段を含む。例えば、「検出可能に少な
い」産物は、直接または間接に観察され得、そしてこの
用語は、全ての減少（産物がないことを含む）を示す。
同様に、「検出可能に多い」産物は、直接にかまたは間
接にかで観察される、全ての増加を意味する。
【０１４６】（本発明の方法において使用される成分お
よび反応条件） （テンプレート核酸）増幅される核酸（ＮＡ）標的は、
精製された形態または未精製の形態の任意の供給源から
の核酸を含み、これは、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮ
Ａ、ミトコンドリアのＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体のＤ
ＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、また
はこれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、生物
学的物質（例えば、微生物（例えば、細菌、酵母、ウイ
ルス、ウイロイド、カビ、真菌、植物、動物、ヒト））
のゲノム、およびこれらのフラグメントを含む、ＤＮＡ
（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡであり得
る。核酸を得る工程および精製する工程は、当該分野に
おいて標準の技術を使用する。ＲＮＡ標的の増幅は、当
該分野において公知であるように、最初のｃＤＮＡ合成
を必要とする。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの増幅は、
ｓｓＤＮＡを得るためにハイブリッドの変性、またはｃ
ＤＮＡを得るための変性に引き続く逆転写を必要とす
る。標的核酸は、生物学的サンプルのような複合混合物
のほんの微量の部分であり得、そして当該分野において
周知の手順によって種々の生物学的物質から取得され得
る。
【０１４７】標的核酸配列の増幅の最初の工程は、この
標的を一本鎖にする工程である。標的核酸が二本鎖（ｄ
ｓ）ＤＮＡの場合、最初の工程は標的の変性である。こ
の変性工程は、温度による変性であっても、アルカリ処
理のような当該分野において公知の他の任意の方法であ
ってもよい。標的がＲＮＡの場合、最初の工程は、一本
鎖ｃＤＮＡの合成であり得る。ＲＮＡからのｃＤＮＡ合
成の技術が、当該分野において公知である。
【０１４８】（複合プライマー）本発明の増幅法は、Ｒ
ＮＡ部分およびＤＮＡ部分から構成される単一の複合プ
ライマーを使用する。このプライマーの複合設計は、新
たな（さらなる）複合プライマーの結合によるプライマ
ー伸長産物の引き続く置換、およびポリメラーゼによる
新たなプライマーの伸長に重要である。さらに、プライ
マー伸長産物のＲＮＡ部分の切断は、以下に記載される
ように、複合プライマーによる増幅についての基質では
ない増幅産物の生成を導く。
【０１４９】本発明の方法および組成物における使用の
ための複合プライマーは、少なくとも１つの以下のよう
なＲＮＡ部分を含む：（ａ）標的核酸上の配列へのＤＮ
Ａ部分のハイブリダイゼーションと無関係に標的核酸
（テンプレート）上の配列に結合（ハイブリダイズ）し
得るＲＮＡ部分；および（ｂ）標的ＤＮＡにハイブリダ
イズした場合、リボヌクレアーゼで切断され得るＲＮＡ
部分。複合プライマーは、標的核酸に結合して、部分的
ヘテロ二重鎖（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成し、
このヘテロ二重鎖において、ＲＮａｓｅ Ｈのようなリ
ボヌクレアーゼと接触する際にプライマーのＲＮＡ部分
のみが切断されるが標的鎖はインタクトなままであり、
従って別の複合プライマーをアニーリングし得る。
【０１５０】複合プライマーはまた、標的配列（テンプ
レート）へのハイブリダイゼーションがＤＮＡポリメラ
ーゼによって標的核酸から置換される核酸鎖のハイブリ
ダイゼーションより支持されるように、標的核酸（テン
プレート）上の配列にハイブリダイズし得る３’ＤＮＡ
部分を含む。このようなプライマーは、核酸結合親和性
に影響する周知の因子（例えば、配列の長さおよび／ま
たは同一性ならびにハイブリダイゼーション条件）に基
づいて合理的に設計され得る。好ましい実施形態におい
て、複合プライマーの３’ＤＮＡ部分の、標的核酸にお
けるその相補的配列へのハイブリダイゼーションは、置
換される鎖の５’末端における相同な配列の標的核酸に
対するハイブリダイゼーションより支持される。
【０１５１】ポリマー化による伸長に適切なプライマー
の生成は、当該分野において周知である（例えば、ＰＣ
Ｔ公開番号ＷＯ９９／４２６１８（およびその中で列挙
される参考文献）に記載される）。複合プライマーは、
３’末端ヌクレオチドが核酸伸長に適切なヌクレオチド
であるＲＮＡおよびＤＮＡの組合せ（上記の定義を参照
のこと）を含む。３’末端ヌクレオチドは、プライマー
中に存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可
能な任意のヌクレオチドまたはアナログであり得る。一
般に、３’末端ヌクレオチドは、３’−ＯＨを有する。
適切なプライマーとしては、少なくとも１つのＲＮＡ部
分、および少なくとも１つのＤＮＡ部分を含むプライマ
ーが挙げられる。１つの遺伝子について実施例５（Ｅ．
ｃｏｌｉＪ遺伝子の増幅について使用される種々のプラ
イマーの相対的性能を示す）に示されるように、複合プ
ライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分
を含み得る（この場合、ＲＮＡ部分は、３’−ＤＮＡ部
分に隣接する）か；または介在ＲＮＡ部分を有する、
５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み得る。
従って、１つの実施形態において、複合プライマーは、
５’ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含み、好まし
くは、ここで、ＲＮＡ部分は３’−ＤＮＡ部分に隣接す
る。別の実施形態において、複合プライマーは、少なく
とも１つの介在ＲＮＡ部分を有する、５’−ＤＮＡ部分
および３’−ＤＮＡ部分（すなわち、この２つのＤＮＡ
部分の間にＲＮＡ部分）を含む。なお別の実施形態にお
いて、本発明の複合プライマーは、３’−ＤＮＡ部分お
よび少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分（すなわち、ＤＮ
Ａ部分の間のＲＮＡ部分）を含む。
【０１５２】３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む
複合プライマーにおけるＲＮＡ部分の長さは、好ましく
は約１〜約２５ヌクレオチド、より好ましくは約３〜約
２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約４〜約１５
ヌクレオチド、そして最も好ましくは約５〜約１０ヌク
レオチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部
分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態におい
て、ＲＮＡ部分は、約１０、１５、２０、２５、３０ヌ
クレオチドのいずれかが上限である、少なくとも約１、
３、４、５ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５３】５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分
を含む複合プライマーにおける５’−ＲＮＡ部分の長さ
は、好ましくは約３〜約２５ヌクレオチド、より好まし
くは約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは
約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは約８〜約１７ヌ
クレオチド、そして最も好ましくは約１０〜約１５ヌク
レオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分および３’−Ｄ
ＮＡ部分を含む複合プライマーの別の実施形態におい
て、５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０ヌ
クレオチドのいずれかが上限である、少なくとも約３、
５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５４】非５’−ＲＮＡ部分をさらに含む、５’−
ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマ
ーの実施形態では、非５’−ＲＮＡ部分は、好ましくは
約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約６ヌ
クレオチド、そして最も好ましくは約３〜約５ヌクレオ
チドであり得る。非５’−ＲＮＡ部分をさらに含む、
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プ
ライマーの特定の実施形態では、非５’−ＲＮＡ部分
は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかが上限
である、少なくとも約１、２、３、５のいずれかであり
得る。
【０１５５】５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣
接している、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分
を含む複合プライマーの実施形態では、５’−ＲＮＡ部
分の長さは、好ましくは約３〜約２５ヌクレオチド、よ
り好ましくは約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好
ましくは約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは約８〜
約１７ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜約
１５ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分が３’
−ＤＮＡ部分に隣接している、５’−ＲＮＡ部分および
３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーの特定の実施形
態では、５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２
０ヌクレオチドのいずれかが上限である、少なくとも約
３、５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得
る。
【０１５６】少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有す
る、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複
合プライマー中の介在ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは
約１〜約７ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約６ヌ
クレオチド、そして最も好ましくは約３〜約５ヌクレオ
チドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有
する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む
複合プライマーのいくつかの実施形態では、介在ＲＮＡ
部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのいずれかが
上限である、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチド
のいずれかであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なく
とも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の介
在ＲＮＡ部分の長さは、好ましくは約１〜約７ヌクレオ
チド、より好ましくは約２〜約６ヌクレオチド、そして
最も好ましくは約３〜約５ヌクレオチドであり得る。
３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部
分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態では、介
在ＲＮＡ部分は、約５、６、７、１０ヌクレオチドのい
ずれかが上限である、少なくとも約１、２、３、５ヌク
レオチドのいずれかであり得る。５’−ＲＮＡ部分をさ
らに含む、３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介
在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーでは、５’−ＲＮＡ
部分は、好ましくは約３〜約２５ヌクレオチド、より好
ましくは約５〜約２０ヌクレオチド、さらにより好まし
くは約７〜約１８ヌクレオチド、好ましくは約８〜約１
７ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜約１５
ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分をさらに含
む、３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮ
Ａ部分を含む複合プライマーのいくつかの実施形態で
は、５’−ＲＮＡ部分は、約１５、１７、１８、２０ヌ
クレオチドのいずれかが上限である、少なくとも約３、
５、７、８、１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０１５７】３’−ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む
複合プライマーにおいて３’−ＤＮＡ部分の長さは、好
ましくは約１〜約２０、より好ましくは約３〜約１８、
さらにより好ましくは約５〜約１５、そして最も好まし
くは約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。３’−ＤＮ
Ａ部分およびＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつ
かの実施形態では、３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１
２、１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかが
上限である、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレ
オチドのいずれかであり得る。
【０１５８】５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分
を含む複合プライマーにおける３’−ＤＮＡ部分の長さ
は、好ましくは約１〜約２０ヌクレオチド、より好まし
くは約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは
約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは約７
〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮＡ部分お
よび３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつか
の実施形態では、３’ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１
５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかが上限で
ある、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチド
のいずれかであり得る。
【０１５９】非３’−ＤＮＡ部分をさらに含む、５’−
ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プライマ
ーの実施形態では、非３’−ＤＮＡ部分は、好ましくは
約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２〜約８
ヌクレオチド、そして最も好ましくは約３〜約６ヌクレ
オチドであり得る。非３’−ＤＮＡ部分をさらに含む、
５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複合プ
ライマーのいくつかの実施形態では、非３’−ＤＮＡ部
分は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドのいずれかが
上限である、少なくとも約１、２、３、５ヌクレオチド
のいずれかであり得る。
【０１６０】５’−ＲＮＡ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣
接している、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分
を含む複合プライマーの実施形態では、３’−ＤＮＡ部
分の長さは、好ましくは約１〜約２０ヌクレオチド、よ
り好ましくは約３〜約１８ヌクレオチド、さらにより好
ましくは約５〜約１５ヌクレオチド、そして最も好まし
くは約７〜約１２ヌクレオチドであり得る。５’−ＲＮ
Ａ部分が３’−ＤＮＡ部分に隣接している、５’−ＲＮ
Ａ部分および３’−ＤＮＡ部分を含むプライマーの特定
の実施形態では、３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、
１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかが上限
である、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチ
ドのいずれかであり得る。
【０１６１】少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有す
る、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む複
合プライマー中の非３’−ＤＮＡ部分の長さは、好まし
くは約１〜約１０ヌクレオチド、より好ましくは約２〜
約８ヌクレオチド、そして最も好ましくは約３〜約６ヌ
クレオチドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部
分を有する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分
を含むプライマーのいくつかの実施形態では、非３’−
ＤＮＡ部分は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドのい
ずれかが上限である、少なくとも約１、２、３、５ヌク
レオチドのいずれかであり得る。
【０１６２】少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有す
る、５’−ＤＮＡ部分および３’ ＤＮＡ部分を含む複
合プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましく
は約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３〜約
１８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５〜約１５
ヌクレオチド、そして最も好ましくは約７〜約１２ヌク
レオチドであり得る。少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分
を有する、５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を
含む複合プライマーのいくつかの実施形態では、３’−
ＤＮＡ部分は、約１０、１２、１５、１８、２０、２２
ヌクレオチドのいずれかが上限である、少なくとも約
１、３、５、７、１０ヌクレオチドのいずれかであり得
る。
【０１６３】３’−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの
介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマー中の非３’−ＤＮ
Ａ部分（すなわち、３’−ＤＮＡ部分以外の任意のＤＮ
Ａ部分）の長さは、好ましくは約１〜約１０ヌクレオチ
ド、より好ましくは約２〜約８ヌクレオチド、そして最
も好ましくは約３〜約６ヌクレオチドであり得る。３’
−ＤＮＡ部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を
含む複合プライマーのいくつかの実施形態では、非３’
−ＤＮＡ部分は、約６、８、１０、１２ヌクレオチドの
いずれかが上限である、少なくとも約１、３、５、７、
１０ヌクレオチドのいずれかであり得る。３’−ＤＮＡ
部分および少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合
プライマー中の３’−ＤＮＡ部分の長さは、好ましくは
約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは約３〜約１
８ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５〜約１５ヌ
クレオチド、そして最も好ましくは約７〜約１２ヌクレ
オチドであり得る。３’−ＤＮＡ部分および少なくとも
１つの介在ＲＮＡ部分を含む複合プライマーのいくつか
の実施形態では、３’−ＤＮＡ部分は、約１０、１２、
１５、１８、２０、２２ヌクレオチドのいずれかが上限
である、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチ
ドのいずれかであり得る。種々の部分についての長さ
は、本発明の方法の反応条件下で適切な場合、より長く
てもより短くてもよいことが理解される。
【０１６４】いくつかの実施形態では、複合プライマー
の５’−ＤＮＡ部分としては、プライマーの最も５’側
のヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態で
は、複合プライマーの５’−ＲＮＡ部分としては、プラ
イマーの最も５’側のヌクレオチドが挙げられる。他の
実施形態では、複合プライマーの３’−ＤＮＡ部分とし
ては、プライマーの最も３’側のヌクレオチドが挙げら
れる。他の実施形態では、３’−ＤＮＡ部分は５’−Ｒ
ＮＡ部分に隣接し、そしてプライマーの最も３’側のヌ
クレオチドを含む（そして５’−ＲＮＡ部分は、プライ
マーの最も５’側のヌクレオチドを含む）。
【０１６５】複合プライマーの合計の長さは、好ましく
は約１０〜約４０ヌクレオチド、より好ましくは約１５
〜約３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは約２０〜
約２５ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態で
は、この長さは、約２５、３０、４０、５０ヌクレオチ
ドのいずれかが上限である、少なくとも約１０、１５、
２０、２５ヌクレオチドのいずれかであり得る。この長
さは、本発明の方法の反応条件下で適切な場合、より長
くてもより短くてもよいことが理解される。
【０１６６】ハイブリダイゼーション（これは、当該分
野で周知であり、そして理解されるように、例えば、イ
オン強度および温度のような他の因子に依存する）を達
成するために、本発明の方法および組成物において使用
するための複合プライマーは、標的核酸に対して、好ま
しくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも
約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、
そして最も好ましくは少なくとも約９５％の相補性のプ
ライマーである。複合プライマーの個々のＤＮＡ部分お
よびＲＮＡ部分は、標的核酸に対して、好ましくは少な
くとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、
さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も
好ましくは少なくとも約９５％の相補性のものである。
【０１６７】本明細書中で記載される場合、１以上の複
合プライマーが増幅反応において用いられ得る。
【０１６８】（終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチド）本発明の方法のいくつかの実施形態では、
特に、転写に基づく増幅が用いられる場合、終結配列を
含むポリヌクレオチドが含まれ、その例を以下に提供す
る。
【０１６９】（テンプレートスイッチオリゴヌクレオチ
ド）本発明の増幅方法において用いられ得る第２のオリ
ゴヌクレオチドは、終結スイッチ（ｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｓｗｉｔｃｈ）オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）で
ある。１つの実施形態では、ＴＳＯは、終結配列として
機能する。別の実施形態では、ＴＳＯは、終結配列とし
て機能し、そしてプロプロモーター（ｐｒｏｐｒｏｍｏ
ｔｅｒ）配列を提供する。
【０１７０】テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド
に基づく、以前に記載された増幅方法は、第２のプライ
マーのハイブリダイゼーションの阻害に、またはこの方
法が、単一のプライマー種を利用するように設計されて
いる場合、同じプライマーの第２のハイブリダイゼーシ
ョン工程の阻害に起因して、このオリゴヌクレオチドの
濃縮において制限された。本発明の方法は、この制限が
ない。ＴＳＯを使用する、以前に記載された方法とは対
照的に、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、
本発明の方法に従って、増幅のために高濃度で使用され
得る。この特徴は、標的鎖へのオリゴヌクレオチドの効
率的なハイブリダイゼーションを確実にし、そして３分
子複合体の収量、プライマー伸長のための基質およびテ
ンプレートスイッチを最大にする。この特徴のさらなる
特性は、記載されるように、ＲＮＡポリメラーゼについ
ての基質を形成する、テンプレートスイッチオリゴヌク
レオチドへの置換されたプライマー伸長産物の効率的な
ハイブリダイゼーションである。
【０１７１】ＴＳＯは、重合の間の鎖スイッチのために
設計された、標的および５’部分にハイブリダイズし得
る３’部分を含む（図２Ａ〜Ｃを参照のこと）。鎖スイ
ッチをもたらすＴＳＯの設計は、Ｐａｔｅｌら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’１ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９
６，９３：２９６９−２９７４に以前に記載されたよう
に、当該分野で公知である。
【０１７２】３’部分は、テンプレートポリヌクレオチ
ド中の、プライマー伸長産物の３’末端に相補的である
位置または領域の５’側の位置でこのテンプレートにハ
イブリダイズし、その後、テンプレートをテンプレート
ポリヌクレオチドから、ＴＳＯの非ハイブリダイズ部分
（「終結部位」）へとスイッチする。
【０１７３】１つの実施形態では、鎖スイッチは、ＴＳ
Ｏのハイブリダイズした部分と非ハイブリダイズ部分と
の連結部に対してすぐ５’側および３’側の、ＴＳＯセ
グメント中の互いに相補的な短い配列の存在によって促
進される。理論によって束縛されることを意図しない
が、１つの説明は、プライマー伸長産物が、（ＴＳＯの
ハイブリダイズした部分の置換によって）ＴＳＯにハイ
ブリダイズする標的核酸の一部分に伸長される事象で
は、プライマー伸長産物の３’末端は、ＴＳＯのハイブ
リダイズした部分と非ハイブリダイズ部分との間の連結
部にすぐ隣接する、ＴＳＯのセグメント中のその相補的
な短い配列に結合し得る、短い配列を含むということで
ある。このことは、プライマー伸長産物がテンプレート
としてＴＳＯテール部分へとスイッチする確率を増大さ
せることによって、テンプレートスイッチの効率を増大
させる。短い相補的な配列の長さは、好ましくは約３〜
約２０ヌクレオチド、より好ましくは約５〜約１５ヌク
レオチド、そして最も好ましくは約７〜約１０ヌクレオ
チドである。いくつかの実施形態では、長さは、約１
０、１５、２０、２５ヌクレオチドのいずれかが上限で
ある、少なくとも約１、３、５、７、１０ヌクレオチド
のいずれかである。この長さは、本発明の方法の反応条
件下で適切な場合、より長くてもより短くてもよいこと
が理解される。
【０１７４】いくつかの実施形態では、ＴＳＯの５’部
分は、ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖プロモーターの形成
のために設計される配列（本明細書の以後では、「プロ
プロモーター配列」）を含む。ＴＳＯのこの実施形態
は、終結配列として、そしてプロモーターテンプレート
を提供するための両方で機能する。この実施形態では、
ＴＳＯのプロプロモーター配列は、プロプロモーター配
列（一般に、テンプレートＴＳＯのプロプロモーター配
列に対して相補的）の、プライマー伸長産物への取り込
みのためのテンプレートとして作用する。プライマー伸
長産物のプロプロモーター配列にハイブリダイズし得る
プロプロモーター配列を含むＴＳＯのその後のハイブリ
ダイゼーションは、適切なＲＮＡポリメラーゼによる転
写をもたらし得る二本鎖プロモーターの形成をもたら
す。テンプレートＤＮＡの転写を可能にするプロモータ
ー配列は、これを取得および／または作製するための方
法と同様に、当該分野で公知である。好ましくは、プロ
モーター配列は、使用される特定のＲＮＡポリメラーゼ
の最適の転写活性を提供するように選択される。このよ
うな選択（すなわち、特定のＲＮＡポリメラーゼによっ
て特に好まれる特定のプロモーター配列）についての基
準もまた、当該分野で公知である。例えば、Ｔ７ＤＮＡ
依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６による転写のた
めのプロモーターの配列は、当該分野で公知である。こ
のプロモーター配列は、原核生物供給源または真核生物
供給源由来であり得る。
【０１７５】１つの実施形態では、プロモーター配列
は、用いられるＲＮＡポリメラーゼによって増強された
か（またはより最適な）転写を提供するように設計され
た、配列に隣接する。いくつかの実施形態では、この配
列は、標的核酸には関連していない（すなわち、実質的
にハイブリダイズしない）。より最適な転写は、この配
列に作動可能に連結されたプロモーターからのポリメラ
ーゼの転写活性が、このようには連結されていないプロ
モーターからのポリメラーゼ活性よりも大きい場合、場
合に生じる。最適な転写のための配列の必要条件は一般
に、種々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについて
（例えば、米国特許第５，７６６，８４９号および同第
５，６５４，１４２号において）以前に記載されたとお
りに当該分野で公知である。
【０１７６】好ましい実施形態では、テンプレートＤＮ
Ａにハイブリダイズする、ＴＳＯの３’部分のセグメン
ト（標的にハイブリダイズする３’部分全体を含む）
は、プライマー伸長をもたらすポリメラーゼによるＴＳ
Ｏの置換が、実質的に、または少なくとも十分に阻害さ
れるように、テンプレートＤＮＡに結合される。このよ
うな結合を達成するための適切な方法としては、Ｇ−ク
ランプ複素環式改変を含むシトシンアナログ（Ｆｌａｎ
ａｇａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ １９９９，９６（７）：３５１３−８に記載さ
れる）およびロックされた核酸（例えば、Ｋｕｍａｒ
ら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．１９
９８，８（１６）：２２１９−２２；およびＷａｈｌｅ
ｓｔｅｄｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ２０００，９７（１０）：５６３３−８に
記載される）を用いるような、当該分野で公知の技術が
挙げられる。他の適切な方法としては、適切な場合、高
ＧＣ含量および／または架橋を有する配列を用いること
が挙げられる。増強された結合を得るためのこれらの方
法のいずれかは、単独で、または組み合わせて用いられ
得る。ＴＳＯの置換は、ポリメラーゼがテンプレートを
標的核酸鎖から、プライマー伸長事象の少なくとも約２
５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは
少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも
約９０％において、ＴＳＯの非ハイブリダイズ部分へと
スイッチする場合、実質的に、または十分に阻害され
る。実質的にまたは十分に阻害されたＴＳＯ置換はま
た、増幅方法が、所望の産物の量に関して満足のいく結
果をもたらす場合、経験的に示され得る。一般に、所定
のセットの条件下で、「改変された」ＴＳＯは、テンプ
レートに対して、このようには改変されていないＴＳＯ
と比較してより強固に結合する。
【０１７７】標的核酸鎖にハイブリダイズするＴＳＯ部
分の長さは、好ましくは約１５〜５０ヌクレオチド、よ
り好ましくは約２０〜４５ヌクレオチド、そして最も好
ましくは約２５〜４０ヌクレオチドである。他の実施形
態では、この長さは、少なくともほぼ以下のうちのいず
れかである：１０、１５、２０、２５、３０；そして、
ほぼ以下のいずれか未満である：３５、４０、４５、５
０、５５。この長さは、本発明の方法の反応条件下で適
切な場合、より長くてもより短くてもよいことが理解さ
れる。標的核酸鎖にハイブリダイズするＴＳＯ部分の相
補性は、標的核酸上のその意図される結合配列に対し
て、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少
なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約
７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％であ
る。
【０１７８】（ブロッカー配列）いくつかの実施形態で
は、プライマー伸長終結配列は、ブロッカー配列によっ
て提供される。ブロッカー配列は、一本鎖であって、プ
ライマー伸長産物の３’末端（「終結部位」）に相補的
である、標的配列中の位置の５’側の標的核酸配列のセ
グメントに対してハイブリダイズし得る（好ましくは相
補的である）配列を含むポリヌクレオチド（通常、合成
ポリヌクレオチド）である。ブロッカーは、親和性（好
ましくは、高い親和性）を有する標的核酸に結合するヌ
クレオチドを含み、その結果、ブロッカー配列は、プラ
イマー伸長事象のうちの好ましくは約３０％より高く、
より好ましくは約５０％より高く、さらにより好ましく
は約７５％より高く、そして最も好ましくは約９０％よ
り高く、プライマー伸長の経過におけるＤＮＡポリメラ
ーゼによる置換を妨害する。ブロッカーポリヌクレオチ
ドの長さおよび組成は、本発明の方法の条件下での過度
のランダム非特異的ハイブリダイゼーションが回避され
るものであるべきである。ブロッカーポリヌクレオチド
の長さは、好ましくは約３〜約３０ヌクレオチド、より
好ましくは約５〜約２５ヌクレオチド、さらにより好ま
しくは約８〜約２０ヌクレオチド、そして最も好ましく
は約１０〜約１５ヌクレオチドである。他の実施形態で
は、ブロッカーポリヌクレオチドは、ほぼ少なくとも以
下のうちのいずれかである：３、５、８、１０、１５；
そしてほぼ以下のうちのいずれか未満である：２０、２
５、３０、３５。その長さは、本発明の方法の反応条件
下で適切な場合、より長くてもより短くてもよいことが
理解される。ブロッカーポリヌクレオチドの相補性は、
標的核酸上のその意図される結合配列に対して、好まし
くは、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも
約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、
そして最も好ましくは少なくとも約９０％である。
【０１７９】１つの実施形態では、ブロッカー配列は、
標的ＤＮＡに結合される、標的ＤＮＡにハイブリダイズ
するセグメントを含み、その結果、プライマー伸長をも
たらすポリメラーゼによるブロッカー配列の置換が実質
的に（または少なくとも十分に）阻害される。このよう
な結合を達成するための適切な手段および置換の実質的
な（または十分な）阻害を決定するための適切な手段
は、本発明の方法において用いられるＴＳＯについて上
記の通りである。
【０１８０】１つの実施形態では、ブロッカーポリヌク
レオチドは、核酸伸長のためのプライマーとして効率的
に機能できない（すなわち、ブロッカー配列からの伸長
が低減されるかまたは阻害される）。ブロッカーポリヌ
クレオチドのプライマー機能をブロックするための技術
としては、ＤＮＡポリメラーゼによるこのプライマーの
３’末端へのヌクレオチドの付加を妨害する任意の技術
が挙げられる。このような技術は、当該分野で公知であ
り、例えば、３’ヒドロキシル基の置換もしくは改変、
またはＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの添加を
係留できない改変ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌ
クレオチド）の、ブロッカーポリヌクレオチドの最も
３’側の位置への取り込みを含む。
【０１８１】（プロプロモーターと置換されたプライマ
ー伸長産物にハイブリダイズする領域とを含む、ポリヌ
クレオチド）いくつかの実施形態は、プロプロモーター
と置換されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする
領域とを含む、ポリヌクレオチドを用いる。いくつかの
実施形態では、このポリヌクレオチドは、上記で考察さ
れたプロプロモーター配列を含むＴＳＯである。他の実
施形態では、プロプロモーター配列は、以下に記載の通
りに、ＰＴＯ中に含まれる。
【０１８２】（プロプロモーターテンプレートオリゴヌ
クレオチド）いくつかの実施形態では、この方法は、プ
ロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴ
Ｏ）によって提供される、転写のためのプロモーター配
列を用いる。
【０１８３】本発明の方法および組成物において使用す
るためのＰＴＯは、ＲＮＡポリメラーゼのｄｓプロモー
ターの形成のために設計されたプロプロモーター配列
と、プライマー伸長産物の３’末端にハイブリダイズし
得る部分とを含む、一本鎖ポリヌクレオチド（一般に、
ＤＮＡ）である。好ましい実施形態では、プロプロモー
ター配列は、オリゴヌクレオチドの５’部分に位置し、
そしてハイブリダイズする配列は、オリゴヌクレオチド
の３’部分に位置する。１つの実施形態において、そし
て最も代表的には、プロモーターおよびハイブリダイズ
する配列は、異なる配列である。別の実施形態では、プ
ロモーターおよびハイブリダイズする配列は、配列同一
性において重複する。なお別の実施形態では、プロモー
ターおよびハイブリダイズする配列は、同じ配列であ
り、従って、ＰＴＯ中の同じ位置に存在する。プライマ
ー伸長産物に対するＰＴＯのハイブリダイゼーション
が、突出部（置換されたプライマー伸長産物にハイブリ
ダイズしない、代表的にはプロプロモーター配列の全て
または一部を含む、ＰＴＯの５’末端）を含む二重鎖を
もたらす実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、突出部
をフィルインして、適切なＲＮＡポリメラーゼによる転
写をもたらし得る二本鎖プロモーターを作製する。
【０１８４】テンプレートＤＮＡの転写を可能にするプ
ロモーター配列は当該分野で公知であり、そして上記で
考察されている。好ましくは、プロモーター配列は、用
いられる特定のＲＮＡポリメラーゼの最適な転写活性を
提供するように選択される。このような選択のための基
準、すなわち、特定のＲＮＡポリメラーゼによって特に
好まれる特定のプロモーター配列もまた、当該分野で公
知である。例えば、Ｔ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼおよびＳＰ６による転写のためのプロモーターの配
列は、当該分野で公知である。このプロモーター配列
は、原核生物供給源または真核生物供給源由来であり得
る。
【０１８５】いくつかの実施形態では、ＰＴＯは、プロ
プロモーター配列と、プライマー伸長産物の３’末端に
ハイブリダイズし得る部分との間に介在配列を含む。介
在配列の適切な長さは、経験的に決定され得、そして少
なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１５ヌク
レオチドであり得る。介在配列の適切な配列同一性もま
た、経験的に決定され得、そして配列は、必ずしもそう
でないが、好ましくは、この配列がない場合と比較して
増幅程度を増強するように設計される。１つの実施形態
では、介在配列は、用いられたＲＮＡポリメラーゼによ
る増強された（またはより最適な）転写を提供するよう
に設計された配列である。一般に、この配列は、標的核
酸に関連していない（すなわち、この配列は実質的にハ
イブリダイズしない）。より最適な転写は、上記の配列
に作動可能に連結されたプロモーターからのポリメラー
ゼの転写活性が、このようには連結されていないプロモ
ーターからのポリメラーゼの転写活性よりも大きい場合
に生じる。最適な転写のための配列の必要条件は一般
に、種々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについて以
前に記載された通りに（例えば、米国特許第５７６６８
４９号および同第５６５４１４２号においてのように）
当該分野で公知であり、そしてまた経験的に決定され得
る。
【０１８６】別の実施形態では、ＰＴＯは、プロプロモ
ーター（ｐｒｏｐｒｏｍｏｔｅｒ）配列に対して５’側
の配列を含む（すなわち、ＰＴＯは、プロプロモーター
配列に対して５’側に位置づけられたさらなるヌクレオ
チド（これは、転写調節配列であっても、転写調節配列
でなくても良い）を含む）。一般的に、配列はプライマ
ー伸長産物に対してハイブリダイズ可能ではないが、そ
の必要はない。
【０１８７】１つの実施形態では、ＰＴＯは、核酸伸長
のためのプライマーとして効率的に機能し得ない。ＰＴ
Ｏのプライマー機能をブロックする技術としては、ＤＮ
ＡポリメラーゼによるＰＴＯの３’末端へのヌクレオチ
ドの付加を妨げる任意の技術が挙げられる。このような
技術は当該分野において公知であり、例えば、３’ヒド
ロキシル基の置換もしくは改変、またはＤＮＡポリメラ
ーゼによるヌクレオチドの付加を固定（ａｎｃｈｏｒｉ
ｎｇ）し得ないＰＴＯの最も３’側の位置への改変ヌク
レオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）の取り込
みが挙げられる。標識または低分子（これは、特異的結
合対のメンバー（例えば、ビオチン）である）を使用し
て、３’末端をブロックすることもまた可能である。
【０１８８】置換されたプライマー伸長産物にハイブリ
ダイズするＰＴＯの部分の長さは、好ましくは、約５〜
約５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１０〜約４０
ヌクレオチド、さらにより好ましくは約１５〜約３５ヌ
クレオチド、そして最も好ましくは、約２０〜３０ヌク
レオチドである。いくつかの実施形態では、ハイブリダ
イズする部分は、少なくともほぼ、以下：３、５、１
０、１５、２０のいずれかであり；そしてほぼ、以下：
３０、４０、５０、６０のいずれかより小さい。ハイブ
リダイズする部分の相補性は、標的核酸上のその意図さ
れる結合配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５
％、より好ましくは、少なくとも約５０％、さらにより
好ましくは、少なくとも約７５％、そして最も好ましく
は、少なくとも約９０％である。
【０１８９】（ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアー
ゼ、およびＲＮＡポリメラーゼ）本発明の増幅方法は、
以下の酵素を使用する：ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌク
レアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ））、
そして必要に応じて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼ。
【０１９０】本発明の方法および組成物における使用の
ためのＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従う複合
プライマーの伸長をもたらし得る。従って、好ましいポ
リメラーゼは、少なくとも主にデオキシヌクレオチドか
ら構成される核酸テンプレートに沿って、核酸プライマ
ーを伸長し得るポリメラーゼである。ポリメラーゼは、
置換鎖が結合するポリヌクレオチドから、核酸鎖を置換
し得るべきであり、そして一般的に、より高い鎖置換能
力（すなわち、等しい鎖置換能力を有さない他のポリメ
ラーゼと比較して）をポリメラーゼが示すことが好まし
い。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、核酸鎖にハイ
ブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末端に結合す
る高い親和性を有する。好ましくは、ＤＮＡポリメラー
ゼは、実質的なニック形成（ｎｉｃｋｉｎｇ）活性を有
さない。好ましくは、ポリメラーゼは、プライマーの分
解、プライマー伸長ポリヌクレオチドの終結を最少化す
るために、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をほとん
ど有さないか、または全く有さない。一般的に、このエ
キソヌクレアーゼ活性は、ｐＨ、塩濃度、テンプレート
が二本鎖であるかまたは一本鎖であるかなど（これらは
すべて、当業者に周知である）のような因子に依存す
る。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異
ＤＮＡポリメラーゼは、当該分野において公知であり、
そして本明細書中に記載された増幅方法に適切である。
本発明の方法および組成物における使用に適切なＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、米国特許第５６４８２１１号お
よび同第５７４４３１２号に開示されたＤＮＡポリメラ
ーゼが挙げられ、これには、ｅｘｏ-Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｅｘｏ-Ｄｅｅ
ｐＶｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）、Ｂｓｔ（ＢｉｏＲａｄ）、ｅｘｏ-Ｐｆｕ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）、配列
決定グレードのＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、およびｔｈ
ｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙ
ｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ由来の熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼが、ポリメラ
ーゼとプライマー伸長産物の５’末端との間の接触発生
率の少なくとも約２５％、より好ましくは、少なくとも
約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約７５％、
そして最も好ましくは少なくとも約９０％で、テンプレ
ート核酸からプライマー伸長産物を置換することが好ま
しい。いくつかの実施形態では、鎖置換活性を有する熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。このよう
なポリメラーゼは、米国特許第５７４４３１２（およ
び、その中で引用された参考文献）に記載されるよう
に、当該分野において公知である。好ましくは、ＤＮＡ
ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性をほとんど
有さないか、または全く有さない。
【０１９１】本発明の方法および組成物における使用の
ためのリボヌクレアーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ドにおいてリボヌクレオチドを切断し得る。好ましく
は、リボヌクレアーゼは、切断されるべきリボヌクレオ
チドに隣接するヌクレオチドの正体および型に関わら
ず、リボヌクレオチドを切断する。リボヌクレアーゼ
が、配列の正体とは独立して切断することが好ましい。
本発明の方法および組成物に適切なリボヌクレアーゼの
例は、当該分野において周知であり、これはリボヌクレ
アーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）を含む。
【０１９２】本発明の方法および組成物における使用の
ためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、当該分野に
おいて公知である。真核生物ポリメラーゼまたは原核生
物ポリメラーゼのいずれかが使用され得る。例として
は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが挙
げられる。一般的に、選択されたＲＮＡポリメラーゼ
は、本明細書中に記載されるようなＴＳＯまたはＰＴＯ
によって与えられるプロモーター配列から転写し得る。
一般的に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ポリメ
ラーゼであり、これは、好ましくは、プロモーター領域
が二重鎖である限り一本鎖ＤＮＡテンプレートから転写
し得る。
【０１９３】一般的に、本発明の方法および組成物に含
まれる使用される酵素は、この方法および組成物の核酸
成分の実質的な分解を生じるべきではない。
【０１９４】（反応条件および検出）本発明の方法を実
施するために適切な反応媒体および条件は、本発明の方
法に従って核酸増幅を可能にする媒体および条件であ
る。このような媒体および条件は、当業者に公知であ
り、そして種々の刊行物（例えば、米国特許第５，６７
９，５１２号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／４２６１
８）に記載されている。例えば、緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩
衝液であり得るが、他の緩衝液もまた、その緩衝液成分
が本発明の方法の酵素成分に対して非阻害性である限
り、使用され得る。ｐＨは、好ましくは、約５〜約１
１、より好ましくは、約６〜約１０、さらにより好まし
くは、約７〜約９、そして最も好ましくは、約７．５〜
約８．５である。反応媒体はまた、約０．０１〜約１０
ｍＭ、そして最も好ましくは、約１〜５ｍＭの範囲内で
ある遊離イオン最終濃度で、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の
ような二価金属イオンを含み得る。反応媒体はまた、媒
体の総イオン強度に寄与する他の塩（例えば、ＫＣｌ）
を含み得る。例えば、ＫＣｌのような塩の範囲は、好ま
しくは、約０〜約１００ｍＭ、より好ましくは、約０〜
約７５ｍＭ、そして最も好ましくは、約０〜約５０ｍＭ
である。反応媒体はさらに、増幅反応の実行に影響を及
ぼし得るが、本方法の酵素成分の活性に対して不可欠で
はない添加剤をさらに含み得る。このような添加剤とし
ては、タンパク質（例えば、ＢＳＡ）、および非イオン
性界面活性剤（例えば、ＮＰ４０またはＴｒｉｔｏｎ）
が挙げられる。酵素活性を維持し得る試薬（例えば、Ｄ
ＴＴ）もまた、含まれ得る。このような試薬は、当該分
野において公知である。適切な場合には、本方法におい
て使用されるＲＮアーゼの活性を阻害しないＲＮアーゼ
インヒビター（例えば、Ｒｎａｓｉｎｅ）もまた含まれ
得る。本発明の方法の任意の局面が、同一温度または変
動する温度で生じ得る。好ましくは、反応は等温で行わ
れ、これにより熱サイクルプロセスの煩わしさを回避す
る。増幅反応は、テンプレートポリヌクレオチドへの本
発明のオリゴヌクレオチド（プライマー、ＴＳＯ、ブロ
ッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）配列、および／またはＰＴ
Ｏ）のハイブリダイゼーションを可能にし、かつ使用さ
れる酵素の活性を実質的に阻害しない温度で実施され
る。温度は、好ましくは、約２５℃〜約８５℃、より好
ましくは、約３０℃〜約７５℃、そして最も好ましく
は、約３７℃〜約７０℃の範囲であり得る。ＲＮＡ転写
を含むいくつかの実施形態では、転写工程のための温度
は、先行工程のための温度よりも低い。これらの実施形
態では、転写工程の温度は、好ましくは、約２５℃〜約
８５℃、より好ましくは、約３０℃〜約７５℃、そして
最も好ましくは、約３７℃〜約７０℃の範囲であり得
る。
【０１９５】本発明の方法においてプライマー伸長産物
の合成のために使用され得るヌクレオチドおよび／また
はヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシリボヌクレ
オシド三リン酸）は、好ましくは、約５０〜約２５００
μＭ、より好ましくは、約１００〜約２０００μＭ、さ
らにより好ましくは、約５００〜約１７００μＭ、そし
て最も好ましくは、約８００〜約１５００μＭの量で提
供される。いくつかの実施形態では、プライマー伸長鎖
において存在することにより、鎖の置換を増強する（例
えば、従来のＡＴ、ＣＧ塩基対合より弱い塩基対合を引
き起こすことによる）ヌクレオチドまたはヌクレオチド
アナログが含まれる。このようなヌクレオチドまたはヌ
クレオチドアナログとしては、デオキシイノシンおよび
他の改変塩基が挙げられ、これらのすべてが、当該分野
において公知である。本発明の方法において、ＲＮＡ転
写物の合成のために使用され得る、ヌクレオチドおよび
／またはアナログ（例えば、リボヌクレオシド三リン
酸）は、好ましくは、約０．２５〜約６ｍＭ、より好ま
しくは、約０．５〜約５ｍＭ、さらにより好ましくは、
約０．７５〜約４ｍＭ、そして最も好ましくは約１〜約
３ｍＭの量で与えられる。
【０１９６】本発明の増幅反応のオリゴヌクレオチド成
分は、一般的に、増幅される標的核酸配列の数よりも多
い。これらのオリゴヌクレオチド成分は、標的核酸の量
の、ほぼ以下のいずれかの倍数または少なくともほぼ以
下のいずれかの倍数で与えられ得る：１０倍、１０
２倍、１０４倍、１０６倍、１０８倍、１０１０倍、１
０ １２倍。複合プライマー、ＴＳＯ、ＰＴＯおよびブロ
ッカー配列は各々、ほぼ以下のいずれかの濃度または少
なくともほぼ以下のいずれかの濃度で与えられ得る：５
０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２５
００ｎＭ、５０００ｎＭ。
【０１９７】１つの実施形態では、前述の成分は、増幅
プロセスの開始時に同時に添加される。別の実施形態で
は、成分は、増幅反応により要求および／または許容さ
れるように、増幅プロセスの間の適切な時点よりも前ま
たは後に任意の順序で添加される。このような時点（こ
のいくつかを、以下に示す）は、当業者によって容易に
同定され得る。本発明の方法に従う核酸増幅に使用され
る酵素は、当業者に公知のそれらの熱安定性および／ま
たは他の考慮事項によって決定されるように、核酸変性
工程の前、変性工程後、あるいは標的ＤＮＡへのプライ
マーおよび／またはブロッカー配列のハイブリダイゼー
ション後のいずれかで、反応混合物に添加され得る。
【０１９８】増幅反応は、種々の時点で停止され得、そ
してその後の時点で再開され得る。この時点は、当業者
によって容易に同定され得る。反応を停止させる方法
は、当該分野において公知であり、これには例えば、酵
素活性を阻害する温度に反応混合物を冷却することが挙
げられる。反応を再開させる方法もまた、当該分野にお
いて公知であり、これには例えば、酵素活性を許容する
温度に反応混合物の温度を上昇させることが挙げられ
る。いくつかの実施形態では、反応の１以上の成分を、
反応の再開前、再開時、または再開後に補充する。ある
いは、反応を、中断させることなく、進行させ得る（す
なわち、開始から終了まで）。
【０１９９】増幅産物の検出は、標的配列の存在を示
す。定量的分析もまた、可能である。直接的および間接
的な検出方法（定量を含む）は、当該分野において周知
である。例えば、標的配列を含む未知の量のポリヌクレ
オチドを含有する試験サンプルから増幅された産物の量
を、その標的配列を含む既知の量のポリヌクレオチドを
有する参照サンプルの増幅産物に対して比較することに
よって、試験サンプル中の標的配列の量を決定し得る。
本発明の増幅方法はまた、標的核酸の配列変化の分析お
よび配列決定に拡張され得る。さらに、検出は、例え
ば、ＲＮＡ増幅産物由来の翻訳産物を試験することによ
って、達成され得る。
【０２００】（本発明の増幅方法）以下は、本発明の増
幅方法の例である。上記に提供された一般的説明を考慮
して、種々の他の実施形態が実施され得ることが理解さ
れる。例えば、複合プライマーを使用する工程について
の参照は、本明細書中に記載された任意の複合プライマ
ーが使用され得ることを意味する。
【０２０１】本発明の１つの局面では、標的ヌクレオチ
ド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を増幅する方
法を提供する。この方法では、等温線形核酸配列増幅が
達成される。別の局面では、標的ポリヌクレオチド配列
を増幅する方法であって、増幅産物がセンスＲＮＡであ
る、方法が提供される。この方法は、時折、本明細書中
では、「増強型」線形増幅方法という。１つの実施形態
では、ＴＳＯに基づく、増強型の等温線形核酸配列増幅
方法が提供される（本明細書中以降、「方法１」）。別
の実施形態では、ブロッカー配列およびＰＴＯに基づ
く、増強型の等温線形核酸配列増幅方法が提供される
（本明細書中以降、「方法２」）。
【０２０２】（相補的ＤＮＡ産物を生じる、線形核酸配
列増幅）転写と関連付けられない場合、本発明の増幅方
法は、標的核酸配列の等温線形増幅を提供する。この方
法は、単一の複合プライマーを利用する。１つの実施形
態では、この方法はまた、終結配列（例えば、方法２に
おいて記載されるようなブロッカー配列、または方法１
において記載されるようなＴＳＯ）を使用する。方法１
および２を、以下に記載する。線形増幅が転写と関連付
けられない限り、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにつ
いてのプロモーター配列を含む複合体の形成へと導く成
分および工程は、含まれない。
【０２０３】終結配列（使用される場合、ＴＳＯまたは
ブロッカー配列成分のいずれか）を、規定された３’末
端の産物を生成するために添加する。いくつかの実施形
態では、プライマー結合部位の５’側の、テンプレート
における天然の配列が核酸重合化を阻害し、その結果、
プライマー伸長の終結が達成される。このような天然の
配列は、当該分野において公知である（例えば、ＧＣリ
ッチ配列）か、または実験的に決定され得る。終結配列
の使用は、プライマー伸長の規定された末端を提供する
ようにゲノムＤＮＡを増幅する場合に、特に有益であ
る。この特徴が所望されない場合、本発明の方法に従う
等温線形増幅は、終結配列なしで実施され得る。等温線
形増幅はさらに、２つの酵素（ＤＮＡポリメラーゼおよ
びリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ））を利用
する。本発明の線形等温核酸増幅の図式的説明を、図１
Ａ〜Ｃに示す。
【０２０４】以下に記載される方法１および２と同様
に、線形増幅方法を、一本鎖ＤＮＡ標的を増幅するよう
に設計する。増幅される標的がｄｓ ＤＮＡである場
合、標的を最初に変性して、一本鎖標的を生成する。標
的変性は、当該分野において公知の方法（例えば、熱ま
たはアルカリ処理）を使用して実施され得る。標的が一
本鎖ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはウイルス性ＲＮ
Ａ）である場合、標的を最初に、当該分野において公知
の方法によって転写して、ｃＤＮＡ標的を生成する。
【０２０５】図１Ａ〜Ｃに示されるように、本発明の線
形等温増幅方法は、以下ならびに図２Ａ〜Ｃおよび図３
Ａ〜Ｄに記載される、増強型線形増幅方法（方法１およ
び２）の開始工程と類似の工程を包含する。標的核酸
を、上記のような、複合プライマー、ＤＮＡポリメラー
ゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）、およ
び必要に応じて、ブロッカー配列成分またはＴＳＯと組
み合わせる。１つの実施形態では、各増幅反応は、１つ
の同一配列の複合プライマーを含む。別の実施形態で
は、各増幅反応は、複合プライマー改変体の混合物を含
み、ここでこの改変体は、相同であるが非同一の２以上
の配列を表し、そしてここですべてが、同一の標的核酸
配列にハイブリダイズし得る。相補性は、好ましくは、
少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約７
５％、そして最も好ましくは、少なくとも約９０％であ
る。この実施形態の利点は、異なる目的配列を、プライ
マー伸長産物中に導入する能力を含む。さらに別の実施
形態では、各増幅反応は、複合プライマーの混合物を含
み、ここでこのプライマーは、相同性が低いかまたは相
同性が全くない２以上の非同一配列を表し、そしてここ
でこのプライマーは、異なる標的核酸配列、または同一
の標的核酸鎖に沿った異なる部位に対して優先的にハイ
ブリダイズする。この実施形態の利点は、単一の増幅反
応における複数の標的核酸種の増幅を通した、標的核酸
の多重検出および／または分析を含む。
【０２０６】図１Ａ〜Ｃは、終結配列を含む実施形態を
例示する。複合プライマーおよび終結配列（ＴＳＯまた
はブロッカー配列成分）は、標的の同一鎖にハイブリダ
イズして、３分子（ｔｒｉ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）複合
体であるＸＸ（図１Ａ〜Ｃ）を形成する。複合プライマ
ーの３’末端は、ポリメラーゼによって、ＴＳＯまたは
ブロッカー配列成分のハイブリダイズする部位まで、標
的鎖に沿って伸長し、複合体ＸＸＩ（図１Ａ〜Ｃ）を生
成する。リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）
は、複合体ＸＸＩ（図１Ａ〜Ｃ）の伸長されたプライマ
ーのＲＮＡ（一般的に、５’ＲＮＡ）部分を切断して、
複合体ＸＸＩＩ（図１Ａ〜Ｃ）を生成する。第２の複合
プライマーは、ＲＮＡ（一般的に、５’ＲＮＡ）部分の
ハイブリダイゼーションによって複合体ＸＸＩＩ（図１
Ａ〜Ｃ）に結合して、複合体ＸＸＩＩＩ（図１Ａ〜Ｃ）
を生成する。次いで、結合した複合プライマーの遊離
３’部分は、プライマー伸長産物の５’末端を置換し、
そして標的にハイブリダイズして、複合体ＸＸＩＶ（図
１Ａ〜Ｃ）を形成する。標的への複合プライマーの３’
末端のハイブリダイゼーションは、一般的に、プライマ
ー伸長産物の５’末端のハイブリダイゼーションよりも
有利である。なぜなら、プライマーのハイブリダイズし
た３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼの結合部位であり、
次いで、これは、標的に沿ってプライマーの３’末端を
伸長させるからである。プライマー伸長は、第１のプラ
イマー伸長産物の置換を生じさせて、複合体ＸＸＶ（図
１Ａ〜Ｃ）を生成する。このプロセスを繰り返して、複
数の一本鎖ＤＮＡ置換産物を生成する。この産物は、一
般的に、標的配列に対して相補的である。
【０２０７】等温線形増幅方法の一本鎖ＤＮＡ（すなわ
ち、置換されたプライマー伸長産物）は、当該分野にお
いて公知の多くの任意の検出方法によって、容易に検出
可能である。一本鎖核酸分子の検出に適切な種々の均質
または不均質検出方法が、以前に記載されており、これ
には、ゲル電気泳動におけるサイズおよび／または移動
特性による同定、あるいは配列特異的プローブへのハイ
ブリダイゼーションによる同定が挙げられる。
【０２０８】増幅産物の検出は、標的配列の存在を示
す。定量的分析もまた、可能である。例えば、標的配列
を含む未知の量のポリヌクレオチドを含有する試験サン
プルから増幅された産物の量を、その標的配列を含む既
知の量のポリヌクレオチドを有する参照サンプルの増幅
産物に対して比較することによって、試験サンプル中の
標的配列の量を決定し得る。本発明の増幅方法はまた、
標的核酸の配列変化の分析および配列決定に拡張され得
る。
【０２０９】テンプレートポリヌクレオチドの各コピー
の少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも約１
００個、少なくとも約１０００個、少なくとも約１０５
個、少なくとも約１０７個、少なくとも約１０９個、少
なくとも約１０１２個の相補的コピーの生成が期待され
得、従って、テンプレートポリヌクレオチドの各コピー
に関して、少なくとも１倍、少なくとも１０倍、少なく
とも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも約１
０５倍、少なくとも約１０７倍、少なくとも約１０
９倍、少なくとも約１０１２倍の増強へと導かれる。
【０２１０】（センスＲＮＡ産物を生じる、増強型線形
増幅）本発明はまた、標的ポリヌクレオチド配列を増幅
する方法を提供し、ここで、増幅される産物は、センス
配列（すなわち、標的と同じ配列）を含むＲＮＡであ
る。方法１に従う標的核酸の増幅（これは、標的および
テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）関
連部分を含む固有の中間増幅産物の生成を生じる）によ
って、転写への線形増幅のカップリングを提供する。テ
ンプレートスイッチオリゴヌクレオチドおよび置換され
たプライマー伸長産物のハイブリダイゼーションによっ
て形成される複合体は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写
の基質であり、これは、開始標的配列と同じセンスのＲ
ＮＡ産物を生成する。同様に、方法２に従う核酸標的の
増幅は、置換されたプライマー伸長産物の形成を生じ、
これは、プロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド
にハイブリダイズした場合に複合体を形成し、この複合
体は、ＲＮＡポリメラーゼの基質である。方法１におけ
るように、このプロセスは、転写への線形増幅のカップ
リングを生じる。各プライマー伸長産物由来の、好まし
くは、少なくとも約１個、より好ましくは、少なくとも
約５０個、さらにより好ましくは、少なくとも約７５
個、なおより好ましくは、少なくとも約１００個、そし
て最も好ましくは、少なくとも約１０００個のＲＮＡ転
写産物の生成が期待され、従って、非転写関連増幅方法
に関して、好ましくは、少なくとも約１倍、より好まし
くは、少なくとも約５０倍、さらにより好ましくは、少
なくとも約７５倍、なおより好ましくは、少なくとも約
１００倍、そして最も好ましくは、少なくとも約１００
０倍の増強へと導かれる。
【０２１１】以下は、２つの例示的方法である。
【０２１２】（方法１−ＴＳＯに基づく増強型線形核酸
増幅）１つの実施形態では、本発明のＴＳＯに基づく線
形増幅方法は、プライマー伸長産物からの転写と関連し
て、増強型核酸増幅を提供する。この新規な増幅方法
（方法１）の図式的説明を、図２Ａ〜Ｃに示す。
【０２１３】本発明のＴＳＯに基づく核酸増幅方法は、
上記のような単一の複合プライマーを使用する。本発明
の増幅方法において使用される第２のオリゴヌクレオチ
ドは、また上記に記載されたような、テンプレートスイ
ッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）である。本発明の増
幅方法は、以下の酵素を使用する：ＤＮＡポリメラー
ゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）、およ
びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。増幅される核酸標
的は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＲＮＡ標的の増
幅は、当該分野において公知のような、最初のｃＤＮＡ
合成を必要とする。
【０２１４】本発明の新たなＴＳＯに基づく増強型線形
増幅方法は、標的ＤＮＡ配列に対して相同（すなわち、
センス）である複数コピーのＲＮＡ産物を生成し得る。
【０２１５】一本鎖標的核酸は、当該分野において公知
のような、核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅に
適切な反応媒体中で、複合プライマー、ＴＳＯオリゴヌ
クレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ
（例えば、ＲＮアーゼＨ）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
ラーゼ、およびヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌ
クレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびリボヌクレオシ
ド三リン酸（ｒｉｂｏｎｕｃｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ）（ｒＮＴＰ））と混合される。適切な
反応媒体および条件は、上記の通りである。１つの実施
形態では、転写を、先行工程の温度とは異なる温度（一
般的には、より低い）で実施する。別の実施形態では、
この方法のすべての工程を、等温で実施する。
【０２１６】１つの実施形態では、各増幅反応は、１つ
の同一配列の複合プライマーを含む。別の実施形態で
は、各増幅反応は、複合プライマー改変体の混合物を含
み、ここでこの改変体は、相同であるが非同一性の２以
上の配列を表し、そしてここですべてが、同一の標的核
酸配列にハイブリダイズし得る。相同性（配列同一性）
は、好ましくは、少なくとも約５０％、より好ましく
は、少なくとも約７５％、そして最も好ましくは、少な
くとも約９０％である。この実施形態の利点は、異なる
目的配列を、プライマー伸長産物中に導入する能力を含
む。さらに別の実施形態では、各増幅反応は、複合プラ
イマーの混合物を含み、ここでこのプライマーは、相同
性が低いかまたは相同性が全くない２以上の非同一配列
を表し、そしてここでこのプライマーは、異なる標的核
酸配列、または同一の標的核酸鎖に沿った異なる部位に
対して優先的にハイブリダイズする。この実施形態の利
点は、単一の増幅反応における複数の標的核酸種の増幅
を通した、標的核酸の多重検出および／または分析を含
む。
【０２１７】１つの実施形態において、ＴＳＯは、終結
配列として機能し、そしてプロプロモーター配列を提供
する。別の実施形態において、ＴＳＯは、プロプロモー
ター配列を含まない。この実施形態において、プロプロ
モーター配列は、プロプロモーターを含みかつプライマ
ー伸長産物の３’部分にハイブリダイズし得、そのプラ
イマー伸長産物の転写が生じ得るようにする、別のオリ
ゴヌクレオチド（例えば、ＰＴＯ）により、別々に提供
される。
【０２１８】次いで、単一の複合プライマーおよびＴＳ
Ｏが、増幅される核酸の同じ鎖にハイブリダイズする。
その２つのオリゴヌクレオチドは、標的核酸変性工程の
前に、核酸標的を含むと疑われるサンプルに添加され得
る。その標的鎖へのこの２つのオリゴヌクレオチドのハ
イブリダイゼーションは、３分子（ｔｒｉ ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ）複合体Ｉ（図２Ａ〜Ｃ）の形成を生じる。
【０２１９】ＤＮＡポリメラーゼが、プライマー伸長を
実行する。そのプライマーは、複合体Ｉ（図２Ａ〜Ｃ）
の標的核酸鎖に沿って、ＴＳＯハイブリダイゼーション
の部位まで伸長される。その標的鎖からＴＳＯの５’非
ハイブリダイズ部分へのテンプレートスイッチ、そして
ＴＳＯテンプレートに沿ったさらなるプライマー伸長
が、３分子複合体ＩＩの形成を生じる。最後は、標的核
酸、ＴＳＯおよび最初のプライマー伸長産物を含む。そ
の最初のプライマー伸長産物は、標的依存性部分（すな
わち、標的核酸と相補的な配列）およびＴＳＯ依存性部
分（すなわち、ＴＳＯの非ハイブリダイズ部分と相補的
な配列）の両方を含む、独特のＤＮＡである。
【０２２０】複合体ＩＩ（図２Ａ〜Ｃ）は、ＲＮＡポリ
メラーゼおよびリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ
Ｈ）の両方についての基質である。ＤＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼは、複合体ＩＩの機能的ｄｓプロモーター
に結合し、そして最初のプライマー伸長産物を転写し
て、センスＲＮＡ産物ＩＩＩ（図２Ａ〜Ｃ）を生成す
る。ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ鎖の分解に特
異的なリボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）は、
複合体ＩＩにおけるプライマー伸長産物の５’部分を分
解して、３分子複合体ＩＶを形成する。
【０２２１】遊離の複合プライマーが、複合体ＩＶ（図
２Ａ〜Ｃ）中の標的核酸のプライマー相補的部位にハイ
ブリダイズする。このハイブリダイゼーションは、複合
体Ｖ（図２Ａ〜Ｃ）の形成を生じ、この複合体Ｖにおい
て、プライマーのＲＮＡ部分（一般には５’ＲＮＡ部
分）のみが、標的鎖にハイブリダイズしている。部分的
にハイブリダイズするプライマーの３’ＤＮＡ部分によ
るプライマー伸長産物の最も５’側部分の置換は、複合
体ＶＩ（図２Ａ〜Ｃ）の形成を生じ、この複合体ＶＩ
は、ＤＮＡポリメラーゼの基質である。標的鎖（ＶＩ
Ｉ；図２Ａ〜Ｃ）に沿ってのプライマーの伸長は、その
複合体からの最初のプライマー伸長産物の置換を生じ
る。反復されるプライマー伸長および鎖置換は、標的核
酸と少なくとも実質的に相補的なポリヌクレオチドの複
数のコピーの生成を生じる。
【０２２２】上記のように生成されたプライマー伸長産
物は、プロプロモーター配列を含むＴＳＯが提供される
実施形態において、転写のためのテンプレートとして使
用される。置換されたプライマー伸長産物（ＶＩＩＩ；
図２Ａ〜Ｃ）は、遊離のＴＳＯオリゴヌクレオチドにハ
イブリダイズして、部分的二重鎖ＩＸ（図２Ａ〜Ｃ）を
形成する。複合体（二重鎖）ＩＸは、一端に二本鎖部分
を含み、そしてそれぞれプライマー伸長産物およびＴＳ
Ｏに由来する、２つの非相補的一本鎖を含む。この部分
的二重鎖の二本鎖部分は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼのための完全に機能的な二本鎖プロモーターを含
む。最後は、この部分的二重鎖ＩＸのプロモーターに結
合し、そしてプライマー伸長産物を転写して、センスＲ
ＮＡ産物Ｘ（図２Ａ〜Ｃ）の複数のコピーを形成する。
【０２２３】上記の増幅の産物は、均質（ｈｏｍｏｇｅ
ｎｏｕｓ）検出方法または不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ
ｅｏｕｓ）検出方法（ゲル電気泳動におけるサイズ特性
および／もしくは移動度特性による同定、または配列特
異的プローブに対するハイブリダイゼーションによる同
定を含む）のいずれかにより、検出され得る。その増幅
産物の検出は、標的核酸の存在を示す。定量的分析もま
た、可能である。例えば、標的配列を含む未知の量のポ
リヌクレオチドを含む試験サンプルから増幅された産物
の量を、標的配列を含む既知の量のポリヌクレオチドを
有する参照サンプルの増幅産物と比較することにより、
その試験サンプル中の標的配列の量が決定され得る。こ
の新規な増幅方法を、標的核酸の配列変化の分析および
配列決定にさらに拡張することもまた、下記のように、
可能である。
【０２２４】（方法２−ブロッカー配列に基づく、増強
型核酸増幅）別の実施形態において、本発明のブロッカ
ー配列に基づく線形増幅方法は、プライマー伸長産物か
らの転写に関連して、増強型核酸増幅を提供する。テン
プレートスイッチ工程を含まないこの代替的な増強型線
形増幅（方法２）が、図３Ａ〜Ｄに示される。
【０２２５】方法２は、上記のような、方法１において
のような、単一の複合プライマーを利用し、上記のよう
な、その単一プライマーと同じ標的核酸鎖上の配列にさ
らにハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオ
チドもしくはオリゴヌクレオチドアナログのいずれかで
あるブロッカー配列成分を利用し、そして上記のよう
な、置換された伸長産物の３’末端にハイブリダイズす
ることができる（そして好ましくは相補的な）３’部分
とＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについてのプロモー
ターの配列をその５’末端に含む５’部分とを含む、第
３のオリゴヌクレオチド（プロモーターテンプレート
（ＰＴＯ））を利用する。上記のＴＳＯにおいてのよう
に、プロモーター配列にすぐ隣接する配列は、本発明の
方法に従う増幅において使用されるＲＮＡポリメラーゼ
により、好ましくは最適の転写活性を提供するように設
計される。そのブロッカー配列成分は、単一プライマー
のハイブリダイゼーションの部位に対して、標的の５’
末端に向かって上流に位置する部位で、標的配列にハイ
ブリダイズするように設計される。代替的に記述しそし
て上記したように、ブロッカー配列は、プライマー伸長
産物の３’末端と相補的な標的配列中の位置の５’側に
ある標的核酸配列のセグメントにハイブリダイズする。
そのブロッカー配列は、標的に対するブロッカーハイブ
リダイゼーションの部位で、プライマー伸長をブロック
するに十分に高い親和性で結合する。この特徴は、その
ポリメラーゼによるプライマー伸長について強力な停止
を提供し、そしてそのプライマー伸長産物の３’末端を
規定する。
【０２２６】方法１におけるように、方法２に従う増幅
についての標的核酸は、一本鎖ＤＮＡである。標的核酸
がｄｓＤＮＡである場合、標的は、まず、変性により一
本鎖にされる。そのｄｓＤＮＡ標的の変性は、加熱また
は当該分野で公知の他の任意の方法（例えば、アルカリ
処理）により実行され得る。標的核酸がＲＮＡ（例え
ば、ｍＲＮＡ）である場合、標的はまず、当該分野で公
知の方法により逆転写されてｃＤＮＡを生成し、次いで
このｃＤＮＡが、本発明の方法に従って増幅される。
【０２２７】その一本鎖核酸標的は、方法１について記
載されたように、単一の複合プライマー、ブロッカー成
分、プロプロモーターテンプレート（ＰＴＯ）、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ
Ｈ）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびヌクレ
オチド（例えば、ＮＴＰ（例えば、ｄＮＴＰおよびｒＮ
ＴＰ））と組み合わされる。適切な反応媒体および反応
条件は、上記の通りである。１つの実施形態において、
その転写は、前の工程の温度と異なる温度（前の工程の
温度よりも一般に低い）で実施される。別の実施形態に
おいて、この方法の工程すべては、等温で実施される。
【０２２８】１つの実施形態において、各増幅反応は、
１つの同一の配列の複合プライマーを含む。別の実施形
態において、各増幅反応は、複合プライマー改変体の混
合物を含み、その混合物において、その改変体は、相同
だが同一でない２つ以上の配列を示し、そしてすべて
が、同じ標的核酸配列にハイブリダイズ可能である。そ
の相同性（配列同一性）は、好ましくは少なくとも約５
０％であり、より好ましくは少なくとも約７５％であ
り、そして最も好ましくは少なくとも約９０％である。
この実施形態の利点は、異なる目的配列をプライマー伸
長産物中に導入する能力を包含する。なお別の実施形態
において、各増幅反応は、複合プライマーの混合物を含
み、この混合物において、そのプライマーは、相同性が
低いかもしくはない同一でない２つ以上の配列を示し、
そしてそのプライマーは、異なる標的核酸配列もしくは
同じ標的核酸鎖に沿った異なる部位に、優先的にハイブ
リダイズする。この実施形態の利点は、単一の増幅反応
における、複数の標的核酸種の増幅を介する、標的核酸
の多重検出および／または多重分析を包含する。
【０２２９】その単一複合プライマーおよびブロッカー
配列成分は、同じ標的鎖にハイブリダイズして、３分子
複合体を形成する。そのプライマーは、標的に沿って、
ブロッカー配列のハイブリダイゼーションの部位まで伸
長され、複合体ＸＩＩ（図３Ａ〜Ｄ）を形成する。
【０２３０】方法１におけるように、リボヌクレアーゼ
（例えば、ＲＮアーゼＨ）が、複合体ＸＩＩの単一複合
プライマーのＲＮＡ部分（一般に５’ＲＮＡ部分）を切
断して、複合体ＸＩＩＩ（図３Ａ〜Ｄ）を形成する。上
記のように、この酵素は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
のＲＮＡ鎖を切断することに特異的であり、かつ一本鎖
ＲＮＡを消化しない。従って、このリボヌクレアーゼ
は、遊離の複合プライマーを分解しない。図３Ａ〜Ｄに
示されるような以下の工程、プライマーハイブリダイゼ
ーション（ＸＩＶ）、複合プライマーの３’ＤＮＡ部分
によるプライマー伸長産物の５’末端の置換（ＸＶ）、
プライマー伸長および最初のプライマー伸長産物の置換
（ＸＶＩ）は、方法１におけるように進行して、置換さ
れた伸長産物（ＸＶＩＩ）の複数のコピーを生じる。方
法１の置換産物と異なり、ＸＶＩＩは、標的配列と完全
に相補的であり、かつ標的と相補的でない３’末端部分
を含まない。反復されるプライマー伸長および鎖置換
は、標的核酸と相補的なポリヌクレオチドの複数のコピ
ーの生成を生じる。
【０２３１】プロモーターテンプレートオリゴヌクレオ
チド（ＰＴＯ）は、置換された伸長産物に結合して、置
換されたプライマー伸長産物の３’末端に対するプロプ
ロモーターテンプレートの３’末端部分（Ａ）のハイブ
リダイゼーションによって、複合体ＸＶＩＩＩ（図３Ａ
〜Ｄ）を形成する。上記のように、ＰＴＯの３’末端
は、ブロックされてもよいし、またはブロックされてい
なくてもよい。プロプロモーターテンプレートの３’末
端がブロックされていない場合、テンプレートは、置換
されたプライマー伸長産物に沿って伸長される。その置
換された産物の３’末端は、ハイブリダイズしたプロプ
ロモーターテンプレートのＢ部分（図３Ａ〜Ｄを参照の
こと）に沿って、ヌクレオチド（ＤＮＡ）ポリメラーゼ
により伸長されて、複合体ＸＩＸを形成し、この複合体
ＸＩＸは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより利用
され得るｄｓプロモーター配列をその一端に含む。複合
体ＸＩＸは、３’末端がポリメラーゼによる伸長につい
てブロックされている、プロモーターテンプレートのハ
イブリダイゼーション産物として、図３Ａ〜Ｄに示され
る。あるいは、プロモーターテンプレートの３’末端が
ブロックされていない場合、置換されたプライマー伸長
産物に沿った３’末端の伸長が、完全な二重鎖複合体の
形成を生じる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、複
合体ＸＩＸの伸長された置換されたプライマー伸長産物
を、両方の形態（ＲＮＡポリメラーゼの選択は、ｄｓＤ
ＮＡテンプレートおよび／またはｓｓＤＮＡテンプレー
トから転写するその能力を考慮しなければならない）、
すなわち、部分的二重鎖形態または完全に二本鎖の二重
鎖形態のいずれかの複合体において、転写する。一本鎖
ＲＮＡ産物の複数のコピーが、この転写工程により生成
される。
【０２３２】上記の増幅の産物は、均質（ｈｏｍｏｇｅ
ｎｏｕｓ）検出方法または不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎ
ｅｏｕｓ）検出方法（ゲル電気泳動におけるサイズ特性
および／もしくは移動度特性による同定、または配列特
異的プローブに対するハイブリダイゼーションによる同
定を含む）のいずれかにより、検出され得る。その増幅
産物の検出は、標的核酸の存在を示す。定量的分析もま
た、可能である。例えば、標的配列を含む未知の量のポ
リヌクレオチドを含む試験サンプルから増幅された産物
の量を、標的配列を含む既知の量のポリヌクレオチドを
有する参照サンプルの増幅産物と比較することにより、
その試験サンプル中の標的配列の量が決定され得る。本
発明の増幅方法はまた、以下で考察されるように、標的
核酸の配列変化の分析および配列決定に拡張され得る。
【０２３３】（本発明の増幅方法および組成物を用いた
方法）本発明の方法および組成物は、種々の目的のため
に使用され得る。例示の目的のために、配列決定方法、
遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）（核酸変異検
出）方法、本発明の方法によって作製された増幅核酸産
物を使用したマイクロアレイ調製の方法、および核酸配
列を特徴付ける方法が記載される。
【０２３４】（本発明の線形増幅方法を使用した、規定
された核酸標的の等温配列決定）本発明の線形等温増幅
方法は、例えば、規定された核酸標的配列の配列決定に
ついて有用である。この配列決定プロセスは、本明細書
中で記載される増幅方法について記載されるように行わ
れる。本発明に従った増幅方法について使用される天然
のデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）のよ
うなヌクレオチドに加えて、配列決定反応混合物もま
た、適切なヌクレオチド３リン酸アナログを含み、この
アナログは、標識されていてもよいし、未標識でもよ
く、プライマー伸長産物への取り込みの際に、ヌクレオ
チド重合の終結をもたらす。このようなアナログは、他
の配列決定方法において一般に使用され、そして当該分
野で周知である（例えば、ジデオキシリボヌクレオチ
ド）。これらは、例えば蛍光色素または放射性同位体で
標識され得る。この標識はまた、質量分光学に適切な標
識であり得る。この標識はまた、特定の結合対のメンバ
ーである低分子であり得、そして特定の結合対の他のメ
ンバーと結合対の最後のメンバー（例えば、それぞれ、
ビオチンおよびストレプトアビジン）との結合後に検出
され得る。そして、結合対の最後のメンバーは、比色定
量分析、蛍光測定法または化学ルミネセンスのような方
法によって検出され得る検出可能なシグナルの生成を触
媒する酵素に結合体化されている。すべての上記の例
は、当該分野で周知である。これらは、ポリメラーゼに
よってプライマー伸長産物に取り込まれ、そして標的配
列に沿ったさらなる伸長の停止に役立つ。得られた短縮
型伸長産物が標識される。蓄積された複数の置換された
プライマー伸長産物は、各々のアナログの取り込み部位
に従って長さが異なり、これは、標的配列上の相補的な
ヌクレオチドの種々の配列位置を示す。
【０２３５】配列情報の解明のための反応産物の分析
は、当該分野で公知の任意の種々の方法を使用して行わ
れ得る。このような方法としては、ゲル電気泳動および
適切なスキャナを用いた標識されたバンドの検出、配列
決定ゲル電気泳動およびリン光による放射性標識された
バンドの直接的な検出（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤ
ｙｎａｍｉｃｓリーダー）、反応において使用される標
識に特異的な検出器に適合したキャピラリー電気泳動な
どが挙げられる。この標識はまた、結合タンパク質に対
するリガンドであり得、これは、結合タンパク質に結合
体化した酵素と組み合わせて標識の検出について使用さ
れる（例えば、ビオチン標識化チェーンターミネーター
および酵素に結合体化したストレプトアビジン）。この
標識は、酵素の酵素活性によって検出され、これは、検
出可能なシグナルを生成する。当該分野で公知の他の配
列決定方法と同様に、４つのヌクレオチド型（Ａ、Ｃ、
Ｇ、Ｔ）についての配列決定反応は、単一の反応容器中
で行われるか、または別々の反応容器中で行われるかの
いずれかである（各々、４つのヌクレオチド型のうちの
１つを示す）。使用されるべき方法の選択は、当業者に
容易に明らかな実際的斟酌（例えば、使用されるヌクレ
オチド３リン酸アナログおよび／または標識）に依存す
る。従って、例えば、各々のアナログが区別されて標識
される場合、配列決定反応は、単一の容器中で行われ得
る。本発明の方法に従った配列決定分析の最適な実行の
ための試薬および反応条件の選択についての斟酌は、他
の以前に記載された配列決定方法についての斟酌と類似
する。この試薬および反応条件は、本発明の線形核酸増
幅方法について上記に記載されたような試薬および反応
条件であるべきである。
【０２３６】（本発明の増強型線形増幅方法（方法１お
よび２）を使用した、規定された核酸標的の等温配列決
定）転写に基づいた配列決定は、例えば、Ｓａｓａｋｉ
ら、ＰＮＡＳ、９５：３４５５−３４６０、１９９８に
おいて以前に記載された。ＲＮＡ転写物への取り込みの
際に、増強型線形増幅方法についての反応混合物におい
てｒＮＴＰ重合の終結をもたらすｒＮＴＰアナログ（こ
れは、標識されていてもよいし、未標識でもよい）を含
むことは、短縮型ＲＮＡ産物の産生となり、これは、こ
のアナログの取り込み部位におけるＲＮＡポリメラーゼ
のブロックに起因する。適切なｒＮＴＰアナログは、当
該分野で公知である。最後は、使用される方法（方法１
または方法２）に従って、関連した複合体における置換
された伸長産物上の相補的ヌクレオチドの反対に取り込
まれる。
【０２３７】配列情報の解明のための反応産物の分析
は、当該分野で公知のような種々の方法のうちの任意の
１つを用いて行われる。このような方法は、本発明の
（非増強）線形増幅方法を使用した、規定された核酸標
的の配列決定についての上記の方法を含む。
【０２３８】（本発明の増幅方法を利用した、ＲＮＡ部
分に基づく等温変異検出）本発明の等温増幅方法におけ
る使用のための複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）プライマー
の独特の性質は、標的核酸配列における規定された変異
の検出または多型部位（例えば、ＳＮＰ）の検出のため
の等温方法についての基礎を提供する。この方法は、遺
伝子型決定、薬物耐性を導く変異の検出などに有用であ
る。これらの方法は、テンプレート鎖中の領域における
配列の特徴付けに適用でき、このテンプレート鎖は、一
般的に、複合プライマーのＲＮＡ部分にハイブリダイズ
する（それ故、「規定された」変異（これは、その位置
に関して規定される）を参照する言及）。
【０２３９】本発明の方法に適切な標的核酸配列は、ｓ
ｓＤＮＡである。しかし、ｄｓＤＮＡ標的またはＲＮＡ
標的からのｓｓＤＮＡ標的の調製は、上記のように、そ
して当該分野で公知のように行われ得る。
【０２４０】本発明の方法の１つの実施形態を、図４に
概略的に例示する。この実施形態において、複合プライ
マーのＲＮＡ部分は、試験標的核酸の配列に相補的であ
るように設計され、この配列において、配列変化の存在
が疑われる。言い換えると、このプライマーは、参照配
列（例えば、野生型配列）に相補的な配列を含むＲＮＡ
部分を含み、この参照配列に対して、試験標的核酸にお
ける配列が比較されるべきである。いくつかの実施形態
において、この変化した配列（すなわち、配列変化を含
む配列）および参照配列は、対立遺伝子である。この配
列変化は、単一ヌクレオチドの置換、欠失または挿入で
あり得る。配列変化の部位を、図４においてＸで概略的
に印を付ける。
【０２４１】別の実施形態において、この複合プライマ
ーのＲＮＡ部分は、試験標的核酸中に存在することが疑
われる変化した配列に相補的であるように設計される。
いいかえると、このプライマーは、試験標的核酸に相補
的であり、それ故、参照配列（例えば、野生型配列）に
相補的でない配列を含むＲＮＡ部分を含み、この参照配
列に対して、試験標的核酸における配列が比較されるべ
きである。いくつかの実施形態において、この変化した
配列（すなわち、配列変化を含む配列）および参照配列
は、対立遺伝子である。
【０２４２】この複合プライマーのＲＮＡ部分（一般的
には、５’ＲＮＡ部分）は、既知の正常な野生型配列ま
たは既知の変異体もしくは多型の遺伝子型に相補的な配
列を含む。一般的には、ミスマッチが存在する場合（す
なわち、プライマーが、変異した配列を有し、そして標
的が、変異した配列を有さないか、またはそれらの逆）
と比較して、標的核酸配列がプライマーのＲＮＡ部分に
相補的な配列を含む場合に、適切な複合プライマーは、
プライマーが標的核酸に優先的にハイブリダイズするこ
とを可能にするＲＮＡ部分を含み、ここで、この標的核
酸は、結合したプライマー伸長産物を有し、そしてその
５’ＲＮＡ部分は切断されている。図４に示されるよう
に、配列変化の存在は、一般的には、増幅の初期段階を
妨げない。この複合プライマーは、標的配列にハイブリ
ダイズして第１の３分子複合体を形成し、そして伸長す
る。次いで、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ
Ｈ）は、この複合体の伸長したプライマーのＲＮＡ部分
を切断する。ミスマッチの塩基対の存在が、ＲＮＡ／Ｄ
ＮＡハイブリッドの切断パターンに影響を及ぼすようで
あるが、それにもかかわらず、切断は生じるようであ
る。５’ＲＮＡ部分のハイブリダイゼーションによる複
合体への複合プライマーの結合の次の段階は、ミスマッ
チによって阻害（ｉｎｈｉｂｉｔ）される、好ましく
は、妨げられる（ｐｒｅｖｅｎｔ）。この効果は、ハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドの大きさおよび反応
条件のストリンジェンシーのような因子に依存する。こ
れらの因子は、当該分野で周知かつ慣用的な技術に従っ
て、複合プライマーの設計において斟酌される。ミスマ
ッチが、この複合プライマーのＲＮＡ部分の切断を阻害
し、それ故、標的配列の増幅を妨げることもまた可能で
ある。別の可能性は、ミスマッチが、プライマーのＲＮ
Ａ部分のより低い切断効率となり、それ故、増幅産物の
より少ない、より低い増幅効率または産生効率となるこ
とである。この複合プライマーが増幅のこの段階で標的
にハイブリダイズできないために、増幅産物の複数のコ
ピーの、プライマー伸長鎖置換および産生のさらなる段
階が妨げられる。本発明の方法による変異の検出が、プ
ライマー伸長産物の非存在もしくは存在、または蓄積し
たプライマー伸長産物量の定量的比較に基づき得ること
が理解される。例えば、この複合プライマーが参照配列
（例えば、野生型）を含む場合、標的鎖における変異の
存在は、検出可能な増幅産物を導かないかもしれない；
あるいは、検出可能な産物を導くかもしれないが、変異
を有さないテンプレート鎖から産生された産物よりも少
ない。
【０２４３】この複合プライマーが、ＲＮＡ部分、一般
的には５’ＲＮＡ部分（これは、変異体の遺伝子型に完
全に相補的である）を含む場合、正常な遺伝子型である
配列の増幅は妨げられるが、変異体の遺伝子型標的は増
幅される。従ってこの場合、複数のコピーの増幅産物の
検出および／または定量的決定は、変異体の遺伝子型の
標的配列の存在を示す。例えば、目的の核酸サンプルま
たは野生型配列を有する標的核酸の参照サンプルのいず
れかを含む並行反応が行われ得る。野生型配列を有する
標的核酸の参照サンプルを含む反応と比較して、目的の
核酸サンプルを含む反応におけるより多くのプライマー
伸長産物の蓄積は、目的のサンプルにおける変異体の遺
伝子型の存在を示す。あるいは、この複合プライマー
が、試験標的の正常な遺伝子型配列に完全に相補的な
５’ＲＮＡ配列を含む場合、変異体の遺伝子型の標的配
列の増幅が妨げられ、そして増幅産物の検出および／ま
たは定量的決定が、正常な遺伝子型を示す。
【０２４４】本発明の任意の増幅方法は、上記のよう
に、変異体の検出に適切である。
【０２４５】（本発明の増幅方法を利用した３’ヌクレ
オチドに基づいた等温変異検出）この方法において、複
合プライマーの最も３’側のヌクレオチドの相補性を使
用して、変異配列の存在または非存在を特徴付ける。標
的核酸への複合プライマーの最も３’側のヌクレオチド
のハイブリダイゼーションは、プライマー伸長に必要と
される。従って、産物の増幅は、標的核酸が、複合プラ
イマーの最も３’側のヌクレオチドによって規定される
配列を含むことを示す。一方、産物の増幅の減少または
非存在は、標的核酸が、複合プライマーの最も３’側の
ヌクレオチドに対する塩基相補性を少なくとも含む配列
変化を含むことを示す。配列の欠如は、最も３’側のヌ
クレオチドによって規定される配列を含む配列セグメン
トの点変異、単一のヌクレオチド多型、挿入または欠失
に起因し得る。
【０２４６】１つの実施形態において、（例えば、対立
性に起因して）改変体のヌクレオチド位置における種々
の配列に対応する最も３’側のヌクレオチドを有するよ
うに設計された遺伝子型特異的プライマーは、本発明の
方法に従って、増幅について使用される。増幅産物の存
在は、標的核酸が、使用される特定のプライマーの最も
３’側のヌクレオチドによって規定される配列を含むこ
とを示す。（使用される特定のプライマーの最も３’側
のヌクレオチドによって規定される配列を有する参照核
酸と比較した）増幅産物の非存在または欠如は、標的核
酸が、使用される特定のプライマーの最も３’側のヌク
レオチドによって規定される配列を含まないことを示
す。
【０２４７】（本発明の増幅方法を利用した一本鎖高次
構造多型に基づいた変異検出）本発明の方法に従って作
製されたＤＮＡ増幅産物またはＲＮＡ増幅産物はまた、
以下で議論されるように、配列変化部以外は標的核酸配
列に同一な参照核酸配列と比較したとき、標的核酸配列
における任意の変化の検出についての分析に適切であ
る。
【０２４８】以前に記載された線形核酸増幅方法（ＤＮ
Ａ）および増強型線形増幅方法（ＲＮＡ）の産物は、一
本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰまたはｒＳＳＣＰ）に基づ
いた変異検出に適切である。新規の増幅方法のＲＮＡ産
物が、さらなる増幅のための基質ではない限りでは、新
規の方法に従った配列増幅は、一本鎖産物における二次
構造を減少させる因子の存在を必要としない。他者によ
って記載される転写に基づいた増幅方法は、二次構造を
減少させる因子（例えば、ＤＭＳＯ）の存在下で行われ
る。従って、本発明の増強型線形増幅方法が、一本鎖高
次構造多型を検出するための適切な手段（例えば、特定
の配列特徴の存在または参照核酸と比較した場合の試験
核酸における任意の差異の存在の解明のための一本鎖Ｒ
ＮＡ産物の特定の移動性パターンの同定についての電気
泳動分離方法）に直接関連し得ることが予期される。
【０２４９】ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動
に基づいた方法は、種々の一本鎖高次構造の異性体の検
出および分析について使用され得る。あるいはまた、配
列依存性二次構造を認識するヌクレアーゼを使用した一
本鎖ＤＮＡ産物またはＲＮＡ産物の切断は、配列特異的
高次構造多型の決定に有用であり得るようである。この
ようなヌクレアーゼは、当該分野で公知である（例え
ば、Ｃｌｅａｖａｓｅアッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖ
ｅ））。この電気泳動方法は、高スループット変異検出
方法または高スループット遺伝子型決定検出方法に潜在
的により適切である。
【０２５０】所定の核酸配列についての配列特異的電気
泳動パターンの決定は、試験配列の特異的な対立遺伝子
の検出に有用である。さらに、種々の対立遺伝子につい
ての電気泳動移動度パターンが良好に識別され得、それ
故、ヘテロ接合体遺伝子型または複数の対立遺伝子につ
いて必要とされるように、単一のゲノムＤＮＡサンプル
における２つの対立遺伝子の検出を可能にすることが予
期される。試験核酸配列における任意の変化（例えば、
塩基の置換、挿入または欠失）は、この方法を使用して
検出され得る。この方法は、特定の１塩基多型（ＳＮ
Ｐ）の検出および新規のＳＮＰの発見に有用であること
が予期される。
【０２５１】（核酸のマイクロアレイの調製方法）以前
に記載された線形核酸増幅方法（ＤＮＡ）および増強型
線形増幅方法（ＲＮＡ）の産物の一本鎖の性質は、増幅
産物を含むマイクロアレイの調製に特に適切である。
【０２５２】固体基材（例えば、ガラススライド）へ核
酸を付着させるためのいくつかの技術は、当該分野で周
知である。１つの方法は、増幅された核酸に、固体基質
に付着し得る部分（例えば、アミン基、アミン基の誘導
体または正電荷を有する別の基）を含む改変塩基または
アナログを取り込むことである。次いで、この増幅産物
を、固体基材（例えば、ガラススライド）と接触させ、
このガラススライドは、増幅産物上に存在する反応性基
と共有結合を形成し、そしてこのガラススライドに共有
結合するようになる、アルデヒドまたは別の反応性基で
コーティングされる。他の方法（例えば、アミノプロピ
ル（ｐｒｏｐｒｙｌ）シリカン表面化学を使用した方
法）はまた、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｔ．ｃｏｒｎ
ｉｎｇ．ｃｏｍおよびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａ
ｎｄｏｒｄ．ｅｃｕ／ｐｂｒｏｗｎ１で開示されるよう
に、当該分野で公知である。
【０２５３】後に反応性基に変換され得るプライマーへ
の基の付着もまた、当該分野で公知の方法を使用して可
能である。複合プライマーのヌクレオチドへの任意の付
着は、線形増幅方法の一本鎖ＤＮＡ産物の一部となり、
次いでこれは、マイクロアレイの固体表面へ付着し得
る。
【０２５４】本発明の方法の増幅産物は、例えば、使用
される技術によって必要および／または許可されるよう
に、固体基材への付着の前または後に、フラグメントへ
の切断を介してまたは検出可能な標識の付着によって、
さらに改変され得る。
【０２５５】（核酸の特徴付け）本発明の方法によって
得られた増幅産物は、さらなる特徴付けを特に実行可能
にする。これは、この産物が一本鎖であることが少しは
原因である。この増幅産物（ＤＮＡまたはＲＮＡのいず
れか）は、当該分野で公知のプローブハイブリダイゼー
ション技術（例えば、サザンブロッティングおよびノー
ザンブロッティング）を使用して分析され得る。この増
幅産物はまた、この産物をオリゴヌクレオチドプローブ
を含むマイクロアレイと接触させることによって分析さ
れ得る。プローブの正体は、この増幅産物の配列の正体
の特徴付け、従って、テンプレート核酸を含むことが疑
われるサンプル中に存在するこのテンプレート核酸の正
体の外挿による特徴付けを提供する。
【０２５６】（本発明の組成物およびキット）本発明は
また、本明細書中に記載される方法において使用される
組成物およびキットを提供する。この組成物は、本明細
書中に記載される任意の成分、反応混合物および／また
は中間体、ならびに任意の組み合わせであり得る。例え
ば、本発明は、複合プライマーを含む組成物を提供し、
ここで、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分および３’
ＤＮＡ部分を含む。別の例において、本発明は、複合プ
ライマーを含む組成物を提供し、ここで、この複合プラ
イマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を
含む。１つの実施形態において、このＲＮＡ部分は、Ｄ
ＮＡ部分に隣接する。別の例において、本発明は、複合
プライマーを含む組成物を提供し、ここで、この複合プ
ライマーは、少なくとも１つの介在ＲＮＡ部分を有する
５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部分を含む。他の
例において、本発明は、複合プライマーを含む組成物を
提供し、この複合プライマーは、核酸マイクロアレイの
調製において使用される固体基材への複合プライマーを
含むポリヌクレオチドの付着を果たし得る部分の付着に
よってさらに誘導体化される。いくつかの実施形態にお
いて、この複合プライマーは、正に荷電した部分（例え
ば、アミン）の付着によってさらに誘導体化される。他
の実施形態において、本発明は、ＴＳＯ（すなわち、テ
ンプレートへの結合を増強する１つ以上の改変を含むＴ
ＳＯを含む、本明細書中に記載される任意のＴＳＯ実施
形態）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態に
おいて、この組成物は、複合プライマーおよび終結配列
を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、プロ
プロモーター配列（例えば、ＴＳＯまたはＰＴＯ（すな
わち、本明細書中に記載される任意のこれらの実施形
態））を含むポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、
そして複合プライマーおよび／またはブロッカー配列を
さらに含み得る。いくつかの実施形態において、本発明
は、ブロッカー配列（すなわち、改変を伴うブロッカー
配列を含む、本明細書中に記載される任意の実施形態）
を含む組成物を提供する。
【０２５７】他の実施形態において、本発明は、（ａ）
複合プライマー；ならびに（ｂ）終結配列を含む組成物
を提供し、ここで、この複合プライマーは、ＲＮＡ部分
および３’ＤＮＡ部分を含む（いくつかの実施形態にお
いて、このＲＮＡ部分は、ＤＮＡ部分に隣接する）。い
くつかの実施形態において、この終結配列は、ＴＳＯで
ある。他の実施形態において、この終結配列は、ブロッ
キング配列である。いくつかの実施形態において、この
複合プライマーは、５’−ＲＮＡ部分および３’−ＤＮ
Ａ部分を含む（特定の実施形態において、このＲＮＡ部
分は、ＤＮＡ部分に隣接する）。他の実施形態におい
て、この複合プライマーは、少なくとも１つの介在ＲＮ
Ａ部分とともに５’−ＤＮＡ部分および３’−ＤＮＡ部
分を含む。いくつかの実施形態において、この組成物
は、（ａ）複合プライマー；（ｂ）終結配列を含むポリ
ヌクレオチド；（ｃ）プロプロモーター配列を含むポリ
ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、こ
のプロプロモーター配列は、ＰＴＯによって提供され
る。他の実施形態において、このプロプロモーター配列
は、ＴＳＯによって提供される。任意の上記の組成物
は、本明細書中に記載されるテンプレート（これは、標
的配列を含む）ならびに／または任意の酵素（例えば、
ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨおよび／もしくはＲ
ＮＡポリメラーゼ）をさらに含み得る。この組成物は、
一般的には、水性形態で存在し、好ましくは適切な緩衝
液中に存在する。
【０２５８】本発明はまた、本明細書中に記載される増
幅産物を含む組成物を提供する。従って、本発明は、標
的配列のコピーであるＤＮＡ（アンチセンス）分子また
はＲＮＡ（センス）分子の集団を提供し、これらの分子
は、本明細書中に記載される任意の方法によって産生さ
れる。
【０２５９】この組成物は、一般的には、適切な媒体中
に存在するが、凍結乾燥形態で存在し得る。適切な媒体
としては、水性媒体（例えば、純水または緩衝液）が挙
げられるがこれに限定されない。
【０２６０】本発明は、本発明の方法を実施するための
キットを提供する。従って、種々のキットが、適切なパ
ッケージで提供される。このキットは、本明細書中に記
載される任意の１つ以上の用途について使用され得、従
って、任意の１つ以上の以下の用途についての指示書を
含み得る；ヌクレオチド配列の増幅；増幅されたポリヌ
クレオチドの配列決定；および増幅されたポリヌクレオ
チドにおける配列変異の検出。
【０２６１】本発明のキットは、本明細書中に記載され
る任意の組み合わせの成分を含む１つ以上の容器を含
み、そして以下は、このようなキットの例である。キッ
トは、本明細書中に記載される任意の複合プライマーを
含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、２
つ以上の複合プライマーを含み、この複合プライマー
は、別々にパッケージされていてもよいし、されていな
くてもよい。他の実施形態において、キットは、複合プ
ライマーおよび終結配列（本明細書中に記載される任意
の複合プライマーおよび終結配列）を含む。キットは、
複合プライマー、終結配列を含むポリヌクレオチドおよ
びプロプロモーター配列（これは、ＰＴＯまたはＴＳＯ
であり得る）を含むポリヌクレオチドを含み得る。この
複合プライマーは、標識されていてもよいし、未標識で
もよい。キットはまた、必要に応じて、本明細書中に記
載される任意の１つ以上の酵素、ならびにデオキシヌク
レオシド３リン酸および／またはリボヌクレオシド３リ
ン酸を含み得る。キットはまた、１つ以上の適切な緩衝
液（本明細書中に記載されるような）を含み得る。核酸
配列決定に有用なキットは、必要に応じて、プライマー
伸長産物への取り込みの際にヌクレオチド重合の終結を
果たす、標識されたかまたは未標識のヌクレオチドアナ
ログを含み得る。キットにおける１つ以上の試薬は、乾
燥粉末（通常は凍結乾燥される（賦形剤を含む））とし
て提供され得、この粉末は、溶解の際に本明細書中に記
載される任意の方法を行うに適切な濃度を有する試薬溶
液に備える。各々の成分は、別々の容器にパッケージさ
れ得るか、またはいくつかの成分は、交差反応および貯
蔵寿命を可能にする１つの容器において組み合わされ得
る。
【０２６２】本発明のキットは、必要に応じて、一組の
指示書、一般的には書面の指示書を含み得るが、指示書
を含む電子格納媒体（例えば、磁気ディスケットまたは
光学ディスク）もまた条件に合い、これは、意図された
核酸増幅のため、ならびに／または、適切な場合、核酸
配列決定および配列変異の検出のような目的のためにこ
の増幅産物を使用するための本発明の方法の成分の使用
に関連する。このキットとともに含まれる指示書は、一
般的には、本発明の方法の実施に必要な試薬（キットに
含まれようと含まれまいと）、このキットの使用方法に
ついての指示および／または適切な反応条件に関する情
報を含む。
【０２６３】このキットの成分は、任意の簡便で適切な
パッケージング中にパッケージされ得る。この成分は、
別々にパッケージされ得るか、または１つ以上の組み合
わせでパッケージされ得る。キットが、本発明の増強型
線形増幅方法の実施のために提供される場合、ＲＮＡポ
リメラーゼ（もし含まれれば）は、好ましくは、転写段
階の前の段階において使用される成分とは別々に提供さ
れる。
【０２６４】このキットにおける種々の成分の相対量
は、広範に変化して、本明細書中に開示される方法を実
施するために生じるのが必要な反応を実質的に最適化す
る試薬濃度に備え得、そして／または任意のアッセイの
感受性をさらに最適化し得る。
【０２６５】本発明はまた、本明細書中に記載される方
法を果たすためのシステムを提供する。これらのシステ
ムは、上記で議論された成分の種々の組み合わせを含
む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、
以下を含む標的ポリヌクレオチド配列を産生する（また
は、標的ポリヌクレオチド配列を増幅する）に適切なシ
ステムを提供する：（ａ）複合プライマー（本明細書中
に記載される任意の複合プライマー）、（ｂ）ＤＮＡポ
リメラーゼ；および（ｃ）リボヌクレアーゼ。いくつか
の実施形態において、このシステムは、終結配列（本明
細書中に記載される任意の終結配列）を含むポリヌクレ
オチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、こ
のシステムは、プロプロモーター配列（これは、ＰＴＯ
またはＴＳＯであり得る）を含むポリヌクレオチドおよ
びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。任意
のシステムの実施形態はまた、本明細書中に記載される
ようなテンプレート（標的）配列を含み得る。
【０２６６】本発明はまた、本明細書中に記載される成
分の種々の組み合わせを含む反応混合物（または、反応
混合物を含む組成物）を提供する。いくつかの実施形態
において、本発明は、（ａ）ポリヌクレオチドテンプレ
ート；（ｂ）３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む複
合プライマー；ならびに（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを含
む反応混合物を提供する。本明細書中に記載されるよう
に、３’ＤＮＡ部分に隣接する５’ＲＮＡ部分を含む複
合プライマーを含めて、任意の複合プライマー（または
複数の複合プライマー）が、反応混合物中に存在し得
る。この反応混合物はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ドからＲＮＡを切断する酵素（例えば、ＲＮアーゼＨ）
をさらに含み得る。本発明の反応混合物はまた、本明細
書中に記載される終結配列を含む任意のポリヌクレオチ
ドを含み得る。反応混合物の別の例は、（ａ）置換され
たプライマー伸長産物（そしてそれ自体、複合プライマ
ーの３’ＤＮＡ部分に相補的な配列をその５’末端に含
むが、複合プライマーのＲＮＡ部分に相補的な配列は含
まない）；（ｂ）プロプロモーター配列（例えば、ＰＴ
Ｏ）を含むポリヌクレオチド；および（ｃ）ＲＮＡポリ
メラーゼである。他の反応混合物は、本明細書中に記載
され、そして本発明によって包含される。
【０２６７】本発明はまた、本明細書中に記載される任
意の複合体（これは、本明細書中に記載される方法にお
ける中間体である）を含む組成物を含む。この複合体
を、図１〜４に概略的に示す。例として、本発明の１つ
の複合体は、（ａ）テンプレート鎖；および（ｂ）複合
プライマーを含む複合体であり、この複合プライマー
は、３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む。この複合
プライマーは、３’ＤＮＡ部分に対して５’側であり、
そして３’’ＤＮＡ部分に隣接するＲＮＡ部分を有し得
る。この複合体は、終結配列（例えば、ＴＳＯまたはブ
ロッカー配列）を含むポリヌクレオチドをさらに含み得
る。この複合体はまた、プロプロモーター（例えば、Ｐ
ＴＯ）を含むポリヌクレオチドを含み得る。
【０２６８】以下の実施例は、本発明の例示のために提
供され、本発明を限定するものではない。
【０２６９】
【実施例】（実施例１：一般的方法）本実施例に記載さ
れる一般的方法はまた、本明細書中に提供される他の実
施例において利用される。
【０２７０】（緩衝液）本実施例を通して使用された緩
衝液を、以下の材料を用いて作製する。
【０２７１】ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡＴＢＥ緩衝液：８９
ｍＭ Ｔｒｉｓベース、８９ｍＭ ホウ酸、２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ８．３ ＦＸ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＳＯ４、ｐＨ９．０、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、
０．１％ ＮＰ−４０（１つのキメラプライマー、ＤＮ
ＡポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨを用いた等温線形増
幅）。
【０２７２】配列増幅を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．５、６．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ
ｄＡＴＰ、１．０ｍＭ ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、０．８ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＩＴＰ
（ｄＮＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍから）、０〜６％ ＤＭ
ＳＯ、０〜８％ グリセロール、０〜１００μｇ／ｍｌ
アセチル化ＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔ
Ｘ）、０．６単位／μｌ組換えリボヌクレアーゼインヒ
ビター（ｒＲＮａｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓ
ｏｎ、ＷＩ）、０．５〜５μＭ 複合プライマーＩＡ０
０５および１００〜２００ｎＭ プロモーター−テンプ
レートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃを含
む１５μｌの反応物中で行った。複合プライマーＩＡ０
０５は、配列：ＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵＣＣＡＧＴ
ＧＴ（配列番号１）を有する２０マーのプライマーであ
る。プロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド
（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃは、配列：ｇｇＡＡＴＴＣＴＡ
ＡＴＡＣｇＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡｇｇｇＡｇＡｇＣｇｇ
ＴＡＣｇＣＴｇＡＴＣＡＡＡｇＡＴＣＣｇＴｇ−ビオチ
ン（配列番号１２）を有する５５マーのオリゴヌクレオ
チドである。
【０２７３】反応物を、２つの酵素を除くすべての成分
を用いて組み立てた。プログラム可能なサーマルサイク
ラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ）における１０秒間の７０℃または９９℃までの
加熱後、この反応混合物を、個々の実施例に記載される
ように、５５℃、６０℃または６５℃まで冷却した。よ
り低い温度が達成されたら、０．０５〜０．２４単位の
ＲＮアーゼＨ（希釈液／保存溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、３０％ グリセロール；Ｈｙｂ
ｒｉｄａｓｅ耐熱性ＲＮアーゼＨ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩを
使用して、５Ｕ／μｌのストック溶液から希釈される）
および１．０〜５．０単位のＢｃａ ＤＮＡポリメラー
ゼ（２Ｕ／μｌ；Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
Ｉ）を添加した。この反応物を、３０分間５５℃〜６５
℃でインキュベートした。インキュベーションの終わり
に、反応物を４℃に冷却した。反応物を、ＲＮＡ転写段
階が所望されるまで４℃のままにし得る。
【０２７４】（線形増幅ｓｓＤＮＡ産物のＲＮＡ転写に
よる増強型線形増幅）ＲＮＡ転写を、２．５μｌの上記
の線形増幅反応混合物ならびに４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．５、７０ｍＭ ＫＣｌ、５．０ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１０μｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、３ｍＭ 各ｒＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、Ｇ
ＴＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、７．５％ ＤＭＳＯ、１単
位／μｌ ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉ
ｓｏｎ、ＷＩ）および２０単位のＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を含む１０
μｌの反応物中で、３７℃で３時間行った。
【０２７５】（ＤＮＡテンプレート）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ
１２のＪ遺伝子領域由来の配列を、いくつかの以下の実
施例についてのＤＮＡテンプレートとして選択した。３
つのＤＮＡテンプレートを、これらの実験について使用
した：合成ＤＮＡ標的（ＩＡ０１３）、ＰＣＲ増幅によ
って産生された第１の一本鎖ＤＮＡ（３５１塩基）テン
プレートおよびＥ．ｃｏｌｉのＫ１２株由来のゲノムＤ
ＮＡ（実施例４に記載される調製物）。合成ＤＮＡ標的
ＩＡ０１３は、以下：
【０２７６】
【化１】 を含む。スペーサー１８は、ポリオキシエチレンスペー
サーをいう。これらを、１００ｂｐのｓｓＤＮＡ産物と
比較してその移動度を遅らせるためにこのオリゴに添加
した。ＰＣＲ増幅によって産生された前述の第１の一本
鎖ＤＮＡ（３５１塩基）テンプレートの配列は、以下で
ある：
【０２７７】
【化２】 ここで、ＰＣＲプライマーは太字かつ下線を引かれ、そ
して複合プライマーは太字であり、ＲＮＡ部分は斜体で
ある。
【０２７８】（ＰＣＲ増幅産物からのｓｓＤＮＡ標的の
調製）等温線形増幅のための一本鎖ＤＮＡテンプレート
を、プライマーＩＡ００６およびＩＡ００４を用いて、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ遺伝子の３５１ｂｐセグメントのＰＣ
Ｒ増幅によって調製した。プライマーＩＡ００６は、配
列：ＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡｇＡＴＣＣＧＴ
（配列番号１６）を有する２３マーである。プライマー
ＩＡ００４は、配列：ＣＧＣＡＴＡＣＧＧＡＡＴＡＧＣ
ＴＴＡＣＣＧＧＴＣＴ（配列番号１５）を有する２６マ
ーである。ＰＣＲを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐ
Ｈ９．０、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％
ＮＰ−４０、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００μＭ 各
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ）、５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、４００ｎ
Ｍ プライマーＩＡ００６、４００ｎＭ ５’−リン酸
−プライマーＩＡ００４および０．２μｌのＥ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２株の粗溶解産物を含む１００μｌの反応物中
で行った。改変「タッチダウンＰＣＲ」プロトコルを、
以下のパラメータで使用した：９５℃で５秒間、６８℃
で１分間を５サイクル；９４℃で５秒間、６０℃で３０
秒間、７２℃で１分間を５サイクル；９４℃で５秒間、
５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル；７
２℃で１５分間。次いで無期限に４℃で保持した。プラ
イマーＩＡ００４を、５’−リン酸を用いて合成し、λ
エキソヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｎｄａｓｅキット、Ｎｏ
ｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）による消化からセ
ンス鎖を保護した。このＳｔｒａｎｄａｓｅ消化を、製
造業者の推奨に従って行った。手短に言えば、上記のよ
うに調製されたＰＣＲ産物を、１／１０容量の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．２）および０．６容量のイソプロ
パノールの添加によって反応混合物から沈殿させ、−２
０℃まで１時間冷却し、そして３０分間微量遠心分離機
において最大速度で遠心分離した。このＤＮＡペレット
を、７５％エタノールで１回洗浄し、次いで、８０μｌ
の水中での再懸濁の前に手短に空気乾燥した。濃度を、
２６０ｎｍのＯ．Ｄ．から評価し、そして６０単位のλ
エキソヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｎｄａｓｅ、Ｎｏｖａｇ
ｅｎ）を添加した。消化を、３７℃で２０分間進行さ
せ、次いで、反応物を１０分間７５℃に加熱し、そして
４℃まで冷却した。インキュベーションを、プログラム
可能なサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９６０
０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において行った。残っ
たＤＮＡを、製造業者の推奨する手順に従って、Ｑｉａ
Ｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ
Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃ
Ａ）を使用し、そしてキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅ
ｎｃｉａ、ＣＡ）とともに提供される緩衝液を使用して
精製した。手短に言えば、１０容量のＢｕｆｆｅｒ Ｐ
Ｎ（Ｑｉａｇｅｎ）をサンプルに添加した。次いで、総
量を、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムに適用し、そして遠心
分離した（微量遠心分離機において、６０００ｒｐｍで
１分間）。濾液を捨て、そしてカラムを５００μｌのＢ
ｕｆｆｅｒ ＰＥ（Ｑｉａｇｅｎ）で２回洗浄した。次
いで、カラムを、最大速度で３分間の遠心分離によって
完全に乾燥した。ＤＮＡを、５０μｌのＢｕｆｆｅｒ
ＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）（Ｑ
ｉａｇｅｎ）において溶出した。濃度を、２６０ｎｍの
ＯＤから、約２．５×１０１２コピー／５μｌであると
評価した。ゲル分析により、有意なｄｓＤＮＡ（全体の
半分未満）が残ったが、濃度の誤差は、２倍未満である
ことが示された。ＤＮＡを、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒで１０
１０コピー／５μｌまで希釈した。系列希釈を、必要に
応じて、１０１０コピーストック溶液から調製した。
Ｏ．Ｄ．測定に基づいた濃度を、限界希釈ＰＣＲ分析に
よって確認した。
【０２７９】（ゲル電気泳動）増幅産物を、Ｎｏｖｅｘ
電気泳動装置（ＥＩ９００１−ＸＣｅｌｌ ＩＩ Ｍｉ
ｎｉ Ｃｅｌｌ、Ｎｏｖｅｘ）において、１×ＴＢＥ
Ｂｕｆｆｅｒ（８９ｍＭ Ｔｒｉｓベース、８９ｍＭ
ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中、Ｎｏｖｅ
ｘ成形済み４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；パーツ
番号ＥＣ６２２５５）上で電気泳動的に分離した。線形
増幅または転写（増強型線形増幅）からの反応混合物
（５μｌ）を、１μｌの６×Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（４０％ スクロース、０．２５％
ブロモフェノールブルー、０．２５％ キシレンシアノ
ール）と混合し、そしてサンプル全体を、各々のウェル
に直ちにロードした。すべてのサンプルがゲルに入るま
で、ゲルを約５分間２５０Ｖに供し、そして電圧を４５
分間１７５Ｖに下げた。ゲルを、プラスチックプレート
の間から取り出し、そして１×ＴＢＥ Ｂｕｆｆｅｒ
（８９ｍＭ Ｔｒｉｓベース、８９ｍＭ ホウ酸、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の０．５μｇ／ｍｌ臭化
エチジウムにおいて染色した。ｄｓＤＮＡ分子サイズマ
ーカー（Ｈｉ−Ｌｏ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｉｏｎ
ｅｘｕｓ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を、各ゲル
の泳動について１レーン含めた。このマーカーは、以下
のサイズの１６種のフラグメントを含む：５０ｂｐ、１
００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５０
０ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、１４００ｂｐ、１
５５０ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂ
ｐ、６０００ｂｐ、８０００ｂｐおよび１００００ｂ
ｐ。代表的には、５０〜２０００ｂｐが、使用されるゲ
ル上で分離され得る。
【０２８０】（ハイブリダイゼーション）ハイブリダイ
ゼーション実施例についてのオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ｓｓＤＮＡ産物についてはＩＡ０１０；ｓｓＲＮＡ
産物についてはＩＡ０１４）を、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、
Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（ア
デノシン５’−［γ−３２Ｐ］３リン酸、トリエチルア
ンモニウム塩、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ、ＮＪ；ＰＢ１０２１８、＞５０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）を使用して５’末端を標識し
た。プライマーＩＡ０１０は、配列：ＡＴＧＴＣＡＴＧ
ＧＴＣＡＴＧＧＴＣＧＴＧＴ（配列番号１３）を有する
２１マーである。プライマーＩＡ０１４は、配列：ＣＴ
ＣＡＡＣＡＣＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＴ
ＧＴＴＧ（配列番号１４）を有する３１マーである。標
識化反応物（総容量５０μｌ）は、７０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ２、５ｍＭ
ＤＴＴ、１μｇ オリゴ（プライマーＩＡ０１０につい
ては１４７ｐｍｏｌ；プライマーＩＡ０１４については
１０１ｐｍｏｌ）、２５０μＣｉ γ−３２Ｐ−ＡＴＰ
および３０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含ん
だ。インキュベーションを３７℃で３０分間行い、その
後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍ
ｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、
ＣＡ）を使用して、取り込まれなかったヌクレオチドを
除去した。崩壊率（ｃｐｍ）を、１μｌの標識オリゴの
Ｃｈｅｒｅｎｋｏｖ計数によって、Ｐａｃｋａｒｄ Ｍ
ｉｎａｘｉ Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ ４０００ Ｓｅｒｉｅ
ｓ液体シンチレーションカウンターにおいて決定した。
【０２８１】ハイブリダイゼーションを、３０μｌの反
応物において行った。産物ＤＮＡ（またはＲＮＡ）（１
０μｌ）を、２０μｌのプローブミックスに添加した。
反応物は、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０６ｃｐｍの
プローブ（１４．３日の半減期を使用して、崩壊につい
て補正する）を含んだ。１５秒間の６５℃までの加熱
後、ハイブリダイゼーションを、４２℃で３０分間進行
させ、その後、４℃に冷却した。これらの段階を、熱せ
られたカバーを有するプログラム可能なサーマルサイク
ラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ）において行った。ハイブリダイゼーション反応
物の総容量を、１５０Ｖで３時間、１×ＴＢＥ Ｂｕｆ
ｆｅｒ（８９ｍＭ Ｔｒｉｓベース、８９ｍＭ ホウ
酸、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中、１０％ポリアク
リルアミドゲルにおいて電気泳動した。ゲルを、ガラス
プレートから取り出し、ラップ中に包み、そしてオート
ラジオグラフィーフィルム（ＢｉｏＭａｘ ＭＲ、Ｋｏ
ｄａｋ）に−２０℃で一晩（約１６時間）、２枚の増感
スクリーンとともに曝露した。
【０２８２】（実施例２：等温線形増幅）１つの複合プ
ライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨおよびＴ
ＳＯまたはブロッカーを使用した等温線形増幅を行っ
た。上記のようなすべての反応成分を含む反応混合物、
ならびに重要な試薬（例えば、複合プライマー、ＲＮア
ーゼＨまたはＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐａｎｖｅ
ｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））のうちの１つを含まな
い反応混合物を、１０１０コピーの合成ｓｓＤＮＡ標的
（ＩＡ０１０−実施例１に列挙された配列）でスパイク
した。すべての試薬を含み、そして標的ｓｓＤＮＡを含
まないネガティブコントロールの反応物もまた含めた。
標的ＤＮＡ配列の等温線形増幅を、上記のように行っ
た。標的の変性を７０℃で行い、そして等温増幅を６５
℃で行った。
【０２８３】増幅産物を、ゲル電気泳動によって分離し
た（図５）（第１レーン：分子量ラダー；レーン番号１
〜４：それぞれ、ＤＮＡなし、プライマーなし、ＲＮア
ーゼＨなし、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼなし；レーン
５：すべての成分を含む）。増幅産物は、プライマー、
ＲＮアーゼＨまたはＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼを含ま
ない反応混合物において検出されなかった。
【０２８４】図６（レーン１〜４：それぞれ、ＤＮＡな
し、プライマーなし、ＲＮアーゼＨなし、ＤＮＡポリメ
ラーゼなし；レーン５：すべての成分を含む）に示され
るように、線形増幅方法のｓｓＤＮＡ産物に対するプロ
ーブＩＡ０１０ハイブリダイゼーションおよびオートラ
ジオグラフィーは、増幅産物の正体を証明した。この実
験における合成オリゴヌクレオチド標的の線形増幅を、
非ブロックプロモーター−テンプレートオリゴヌクレオ
チド（ＩＡ０１５ｂ）を用いて行った。プロモーター−
テンプレートオリゴヌクレオチドＩＡ０１５ｂは、配
列：ＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ
ＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧ
ＡＴＣＣＧＴＧ（配列番号１１）を有する５５マーであ
る。この増幅反応について使用される増幅反応の標準的
な反応物成分は、上記で与えられたとおりである。初期
変性段階を、７０℃で１０秒間行った。この反応物を６
５℃に冷却し、そしてこの温度で３０分間さらにインキ
ュベートし、その後、ＢｃａポリメラーゼおよびＲＮア
ーゼＨを添加した。ハイブリダイゼーションは、コント
ロール反応（ＤＮＡなし、プライマーなし、ＲＮアーゼ
Ｈなし、Ｂｃａなし）において検出されなかった。
【０２８５】（実施例３：プロモーター−テンプレート
オリゴヌクレオチドに結び付いた等温線形増幅および転
写）プロモーター−テンプレートオリゴヌクレオチド
（ＰＴＯ）は、２つの必須の配列モチーフを含む：Ｔ７
プロモーター配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＡｇＧＡＧ（配列番号２０））およびｓ
ｓＤＮＡテンプレートに相補的な配列。ＰＴＯの４つの
バージョンを設計した（ＩＡ０１２、ＩＡ０１２ｂ、Ｉ
Ａ０１５、ＩＡ０１５ｂ）。ＩＡ０１２ ＰＴＯは６７
マーであり、そして以下の配列を有する：
【０２８６】
【化３】 ＩＡ０１２ ＰＴＯは、コアＴ７プロモーターに加えて
２つの配列を含む：プロモーターと標的ＤＮＡ相補的配
列との間の、５’−伸長部（５’−ＧＧＡＡＴＴＣ（配
列番号２１））およびスペーサー（５’−ＡＴＣＧＡＧ
ＴＡＧＣＴＣ（配列番号２２））。ＩＡ０１５は、より
短いＰＴＯ（４８マー）であり、５’−伸長部およびス
ペーサーの両方を欠失する。ＩＡ０１５ ＰＴＯは、配
列：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ
ＧＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＴＧ
（配列番号１０）を有する。ＩＡ０１２ｂ ＰＴＯは、
スペーサーを含むが、伸長部を含まない６０マーであ
る。ＩＡ０１２ｂ ＰＴＯは、配列：ＴＡＡＴＡＣＧＡ
ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＧ
ＣＴＣＣＧＧＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧ
ＴＧ（配列番号９）を有する。ＩＡ０１５ｂは、伸長部
を含むが、スペーサーを含まない。ＩＡ０１５ｂの配列
は、実施例２に開示される。キメラオリゴヌクレオチド
ＩＡ００５、ＩＡ０１９およびＩＡ０２０以外のすべて
のプライマーを、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
ｏｆ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）によって合成し、そ
してＰＡＧＥ精製した。
【０２８７】この増幅方法についての一般的概略図を、
図２Ａ〜Ｃに例示する。ＩＡ０１２、ＩＡ０１２ｂ、Ｉ
Ａ０１５およびＩＡ０１５ｂがｓｓＤＮＡテンプレート
をＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対する基質に変換する能力
を、合成オリゴ産物（ＩＡ００９）と各々のＰＴＯとの
間で形成された重複伸長産物の転写後に産生されたＲＮ
Ａ量を比較することによって評価した。合成オリゴ産物
ＩＡ００９は、以下の配列を有する１００マーである：
【０２８８】
【化４】 重複伸長を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．
５、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ 各ｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１００ｎＭＩＡ
００９、１００ｎＭ ＰＴＯおよび１単位のＢｃａ Ｄ
ＮＡポリメラーゼを含む１５μｌの反応物において行っ
た。反応物を、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼを含まずに
構成し、９５℃に加熱し、次いで１０分間にわたって６
０℃に冷却した。ＤＮＡポリメラーゼの添加後、反応物
を、６０℃で３０分間インキュベートした。反応混合物
の一部（２．５μｌ）を、標準的なＲＮＡ転写反応混合
物に添加し、そして転写反応物を、ゲル電気泳動によっ
て評価した。
【０２８９】図７（レーン１：分子量ラダー；レーン２
〜５：それぞれ、ＩＡ０１２、ＩＡ０１２ｂ、ＩＡ０１
５、ＩＡ０１５ｂ由来の重複伸長産物；レーン６〜１
３：それぞれ、ＩＡ０１２、ＩＡ０１２ｂ、ＩＡ０１
５、ＩＡ０１５ｂ、ＩＡ０１２、ＩＡ０１２ｂ、ＩＡ０
１５、ＩＡ０１５ｂ由来のＲＮＡ）に示されるように、
有意により多くのＲＮＡが、ＩＡ０１２またはＩＡ０１
２ｂのいずれかを用いて産生された転写基質よりも、よ
り短いＰＴＯ（ＩＡ０１５、ＩＡ０１５ｂ）を用いて産
生された転写基質によって産生された。５’−伸長部を
含むが、スペーサー（ＩＡ０１５ｂ）を含まないＰＴＯ
は、明白に、より高い収率のＲＮＡを産生した。しか
し、あらゆる場合において、複数の産物が、主要なＲＮ
Ａバンドに加えて現れた。ＩＡ０１５ｂと同じ配列を有
するが、遊離の３’−ＯＨを排除する３’−ブロッキン
グ基（ビオチン）を有する第５のＰＴＯを設計し、３’
をブロックされたＰＴＯの改良された性能を実証した。
ＰＴＯの遊離の３’−ＯＨのブロッキングは、機能的プ
ロモーター配列の増幅産物への非特異的取り込みを開始
する能力を排除し、転写産物の非特異的作製を導く。増
強等温線形増幅における３’をブロックされたＰＴＯお
よびブロックされないＰＴＯの性能を、標準的な条件を
使用して、合成オリゴヌクレオチド標的の増幅から評価
した。３’をブロックされたＰＴＯ（ＩＡ０１５ｃ）
は、図８（レーン１：分子量ラダー；レーン２、９：Ｄ
ＮＡなし、３０分；レーン３、１０：ＤＮＡなし、１時
間；レーン４、１１：ＤＮＡなし、２時間；レーン５、
１２：１０１０コピーのＩＡ０１３、３０分；レーン
６、１３：１０１０コピーのＩＡ０１３、１時間；レー
ン７、１４：１０１０コピーのＩＡ０１３、２時間；レ
ーン８、１５：１０１１コピーのＩＡ０１３、３０分；
反応物１〜７はブロックされなかった（ＩＡ０１５
ｂ）、反応物８〜１５は、ブロックされた（ＩＡ０１５
ｃ））に示されるように、ＩＡ０１５ｂと同等の収率の
特異的ＲＮＡを産生したが、有意により低いバックグラ
ンドを有した。ネガティブコントロール反応物（ＤＮＡ
テンプレートを含まない）および１０１０コピーのオリ
ゴ標的（ＩＡ０１３）を含む反応物を、５５℃での３０
分間、１時間または２時間の鎖置換によって増幅し、Ｉ
Ａ０１５ｂまたはＩＡ０１５ｃのいずれかは、この鎖置
換反応に含められた。３’−ＯＨがブロックされない場
合、非特異的ＲＮＡは、あらゆる反応において産生さ
れ、そして特異的ＲＮＡバンドの同定を不明確にした。
対照的に、ブロックされたＰＴＯは、主として単一のＲ
ＮＡ産物を産生した。
【０２９０】（実施例４：等温増強型線形増幅による
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡのＪ遺伝子配列の増幅）ＤＮ
Ａを、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ−ＮａＣｌ培地中で一晩増殖し
た２５ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＡＴＣＣ １０７
９８）から単離した。ゲノムＤＮＡを、製造業者の推奨
する手順に従って、リゾチーム消化およびカオトロピッ
クな（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）溶解溶液（Ｂａｃｔｏｚ
ｏｌ Ｋｉｔ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）における
可溶化によって単離した。手短に言えば、細菌を、６０
００×ｇで５分間の遠心分離によって収集した。細胞ペ
レットを、Ｂａｃｔｏｚｙｍｅ消化緩衝液中に再懸濁
し、そして５０℃で３０分間インキュベートした。得ら
れた溶解産物は、未消化の細胞の可視な凝集塊を何ら含
まず、消化の終わりに透明であった。溶解産物を、４容
量のＤＮａｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、Ｏ
Ｈ）と混合し、そして１５分間室温でインキュベートし
た。ＤＮＡを、０．６容量の氷冷エタノールの添加によ
って溶液から沈殿させた。５分間の室温でのインキュベ
ーション後、沈殿したＤＮＡを、微量遠心分離機におけ
る最大速度で５分間の遠心分離によって収集した。この
ＤＮＡペレットを、７５％のエタノールで洗浄し、再び
遠心分離し、そして頻繁に撹拌しながら５０℃〜５５℃
で３０分間加熱することにより、１．５ｍｌのＴＥＢｕ
ｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、
１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。得られた溶液を、
２２ゲージの注射針に繰り返し通し、ＤＮＡを剪断し、
そして溶液の粘度を減少した。ＤＮＡを、１／１０容量
の５Ｍ 酢酸アンモニウムおよび３容量の氷冷エタノー
ルの添加によって再び沈殿させた（ＥＰＩ００５−３
５）。−２０℃、１時間のインキュベーション後、ＤＮ
Ａを、微量遠心分離機における最大速度での遠心分離に
よって収集した。このペレットを、７５％のエタノール
で洗浄し、再び遠心分離し、そして１５０μｌのＴＥ
Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁した。ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒにお
ける２つの希釈液を、Ｏ．Ｄ．測定（Ｂｅｃｋｍａｎ
ＤＵ６４０分光光度計）のために調製し、５０μｇ／ｍ
ｌのｄｓＤＮＡが、２６０ｎｍでのＯ．Ｄ．値１を示す
と仮定することによってＤＮＡ濃度を算出した。２つの
希釈物のＤＮＡ濃度は、２４．２μｇ／１０μｌおよび
２４．６μｇ／１０μｌであった。これらの２つの測定
値の平均（２４．４μｇ／１０μｌ）は、約２．５×１
０９ゲノムコピー／５μｌ（５ｆｇのＥ．ｃｏｌｉゲノ
ムＤＮＡ＝１コピー）に対応する。
【０２９１】（等温増強型線形増幅）ＤＮＡを、ＴＥ
Ｂｕｆｆｅｒにおいて、１０９、１０８または１０７コ
ピー／５μｌに系列希釈し、そして５分間９５℃まで加
熱することにより変性し、その後、氷上で急冷した。一
本鎖テンプレートＤＮＡをまた、１０９コピー／５μｌ
に希釈した。反応物を、ＤＮＡなし、１０７コピーのゲ
ノムＤＮＡを含む、１０８コピーのゲノムＤＮＡを含
む、１０９コピーのゲノムＤＮＡを含む、または２．５
×１０９コピーのゲノムＤＮＡを含むように組み立て
た。
【０２９２】増幅を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．５、６．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ｄＡ
ＴＰ、１．０ｍＭ ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ ｄＴＴＰ、
０．８ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＩＴＰ（ｄＮＴ
ＰはＡｍｅｒｓｈａｍから）、６％ ＤＭＳＯ、８％
グリセロール、１００μｇ／ｍｌ アセチル化ＢＳＡ
（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、０．６単位／
μｌ 組換えリボヌクレアーゼインヒビター（ｒＲＮａ
ｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、５
μＭ 複合プライマーＩＡ００５（実施例１に開示され
る配列）、２００ｎＭ プロモーター−テンプレートオ
リゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃ（実施例１に
開示される配列）を含む１５μｌの反応物において行っ
た。反応物を、２つの酵素を除くすべての成分を用いて
組み立てた。プログラム可能なサーマルサイクラー（Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
における１０秒間の９９℃までの加熱後、反応物を、６
０℃で３０分間インキュベートした。６０℃に到達した
ら、０．６μｌのＲＮアーゼＨ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ８．５、３０％ グリセロールにおける５
Ｕ／μｌのストック溶液から希釈した０．０５単位）、
Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および１．０
μｌ ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ（２．０単位、Ｐａｎ
ｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加した。６０℃
でのインキュベーションの終わりに、反応物を４℃に冷
却した。５．０μｌ容量の鎖置換産物を、各ＲＮＡ転写
反応物（総容量２０μｌ）に添加した。ＲＮＡ転写を、
標準的な条件を使用し、そして反応物容量を２０μｌに
スケールアップして行い、直接的なゲル分析に十分な物
質（５μｌ）およびプローブハイブリダイゼーションに
十分な物質（１０μｌ）を提供した。
【０２９３】規定された一本鎖合成標的の増幅とは異な
り、本発明の方法に従ったゲノムＤＮＡの増幅は、規定
された３’末端を有するｓｓＤＮＡ産物の形成のために
規定された停止の形成を必要とする。プライマー伸長に
ついての規定された停止の形成は、ブロッカーによって
達成され得、このブロッカーは、標的鎖上の規定された
部位にハイブリダイズし、そしてポリメラーゼによって
置換されることができない。あるいは、本実施例のよう
に、プライマー部位の上流のＧＣリッチ配列は、プライ
マー伸長についての停止地点を提供し、それ故、規定さ
れた３’末端を有するｓｓＤＮＡ産物の形成を導いた。
【０２９４】本発明の増強等温線形増幅方法によるゲノ
ムＤＮＡの規定された配列の首尾良い増幅を、図９（レ
ーン１：ＤＮＡなし；レーン２：１０７コピーのＥ．ｃ
ｏｌｉゲノムＤＮＡ；レーン３：空き；レーン４：１０
８コピーのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ）に示す。このｓ
ｓＲＮＡ産物は、特定のオリゴヌクレオチドプローブに
ハイブリダイズすることが示される。
【０２９５】（実施例５：増強等温線形増幅の性能に対
するプライマー設計の効果の評価）本発明の増幅方法に
おける３つの複合プライマーの各々の性能を評価した。
等温線形増幅を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．５、６．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ、１．０ｍＭ ｄＣＴＰ、１．０ｍＭ ｄＴＴＰ、
０．８ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＩＴＰ（ｄＮＴ
ＰはＡｍｅｒｓｈａｍから）、６％ ＤＭＳＯ、８％
グリセロール、１００μｇ／ｍｌ アセチル化ＢＳＡ
（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、０．６単位／
μｌ 組換えリボヌクレアーゼインヒビター（ｒＲＮａ
ｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、５
μＭ 複合プライマー、２００ｎＭ プロモーター−テ
ンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＩＡ０１５Ｃ
を含む１５μｌの反応物において行った。ＰＴＯ ＩＡ
０１５Ｃの配列を実施例１に開示する。複合プライマー
ＩＡ００５の配列（２０マー）を実施例１に開示する。
英数字の名称を有する他の複合プライマー配列は、以下
の通りである： ＩＡ０１９（２０マー） ＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣＵ
ＣＣＡＧＴＧＴ（配列番号２） ＩＡ０２０（２１マー） ＧＡＣＧＧＡＵＧＣＧＧＵＣ
ＵＣＣＡＧＴＧＴ（配列番号３） 英数字の名称を有さない４つの他の複合プライマー配列
を使用した。これらの配列は、それぞれ以下の通りであ
る：
【０２９６】
【化５】 これらの複合プライマーを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）によ
って合成した。オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分を、酸
不安定性の２’−オルトエステル保護基（２’−ビス
（アセトキシエトキシ）−メチルエーテルまたは「２’
−ＡＣＥ」（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１１８２０−１１８２
１（１９９８）およびＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ． Ａ
ｄｖａｎｃｅｄ ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏ
ｅｓｔｅｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＲＮＡ ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（印刷
中）））とともに５’−シリル保護基を使用して合成し
た。プライマーを、ＰＡＧＥ精製した。
【０２９７】反応物を、２つの酵素を除くすべての成分
を用いて組み立てた。プログラム可能なサーマルサイク
ラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ）における１０秒間の７０℃までの加熱後、反応
物を、５５℃〜６５℃まで冷却した。より低い温度を達
成したら、０．０５単位のＲＮアーゼＨ（希釈液／保存
溶液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、３０
％ グリセロール；Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ耐熱性ＲＮアー
ゼＨ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩを使用して、５Ｕ／μｌのス
トック溶液から希釈される）および２．０単位のＢｃａ
ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ；Ｐａｎｖｅｒａ、
Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加した。この反応物を、３
０分間５５℃〜６５℃でインキュベートした。インキュ
ベーションの終わりに、反応物を、ＲＮＡ転写まで４℃
に冷却した。ＲＮＡ転写を、２．５μｌの上記の線形増
幅反応物ならびに４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．５、７０ｍＭ ＫＣｌ、５．０ｍＭ ＤＴＴ、１２
ｍＭ ＭｇＣｌ２、１１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、３ｍＭ
各ｒＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）、７．５％ ＤＭＳＯ、１単位／μｌ ｒ
ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
Ｉ）および２０単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む１０μｌの
反応物において、３７℃で３時間行った。
【０２９８】各々の複合プライマーを用いて作製された
増強型線形増幅の産物を、図１０（レーン１：分子量ラ
ダー；レーン１、２：ＩＡ０１５、６０℃；レーン３、
４：ＩＡ０１９、５５℃；レーン５、６：ＩＡ０１９、
６０℃；レーン７、８：ＩＡ０１９、６５℃；レーン
９、１０：ＩＡ０２０、５５℃；レーン１１、１２：Ｉ
Ａ０２０、６０℃；レーン１３、１４：ＩＡ０２０、６
５℃）に示されるように、ゲル電気泳動によって分離し
た。複合プライマーは、標的鎖上の同じ部位でハイブリ
ダイズするように設計され、そして３’末端のデオキシ
ヌクレオチドの数が異なった。最も高い収率のＲＮＡ産
物は、プライマーＩＡ０２０を用いて産生され、次い
で、ＩＡ００５およびＩＡ０１９を用いて同程度に産生
された。他の４つの複合プライマーは、より少ないＲＮ
Ａ産物をもたらした。等温線形増幅段階についての最適
温度は、期待されるように、異なるプライマーについて
異なった。
【０２９９】（実施例６：線形増幅方法を用いた核酸標
的の等温配列決定）分析されるべき核酸配列を、第一に
その供給源から単離する。本実施例において使用される
供給源の非限定的な例は、動物、植物、細菌、ウイル
ス、酵母または真菌である。核酸（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）の供給源が、動物組織由来の場合、この組織を、均
質化するかまたは超音波処理するか、あるいは単一の細
胞を結合組織から分離し得る何らかの力に供する。ＤＮ
ＡおよびＲＮＡ、特にｍＲＮＡの分解を妨げ、そして組
織を扱う間のゲノムＤＮＡの剪断を妨げるように注意す
る。動物細胞はまた、商業的供給源（すなわち、Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ）または非営利的供給源（すなわち、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ（ＡＴＣＣ））から得られ得る。所望される核酸の形
態に依存して、ゲノムＤＮＡ、総ＲＮＡまたはｍＲＮＡ
を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出において見出される標準
的なプロトコルに従って単離し得る。植物細胞から核酸
を単離するためのプロトコルはまた、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、前出において見出され得る。核酸の供給源
が、非哺乳動物供給源（例えば、細菌、酵母、真菌また
はウイルス）由来である場合、わずかに異なるプロトコ
ルが使用され、核酸を単離する。細菌、酵母、真菌およ
びウイルスについてのこれらのプロトコルは、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋらまたはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて
見出され得る。
【０３００】規定された標的核酸配列の増幅を、本明細
書中に記載されるように、等温線形増幅について記載さ
れるように行う。約１０２〜１０１２コピーを、テンプ
レートについて使用する。増幅方法について使用される
天然のデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）
に加えて、配列決定反応混合物は、標識された３リン酸
アナログを含む。各々のアナログが独自に標識される場
合、４つすべてが、同じ反応チューブに添加され得る。
そうでなければ、各々のヌクレオチドアナログが同じ標
識で標識される場合、この配列決定反応は４つの異なる
反応チューブにおいて行われ、ここで、各々の反応混合
物は、ヌクレオチドアナログのうちの１つを含む。これ
らのアナログは、ポリメラーゼによってプライマー伸長
産物に取り込まれ、そして標的配列に沿ったさらなる伸
長の停止に役立つ。得られた短縮型伸長産物は標識され
る。この蓄積した複数の置換されたプライマー伸長産物
は、各々のアナログの取り込み部位に従って長さが異な
り、これは、標的配列上の相補的ヌクレオチドの種々の
配列位置を示す。配列情報の解明のための反応産物の分
析は、産物をゲルに泳動することによって行われ得る。
あるいは、他の分析方法が同様に使用され得る。他の配
列決定方法と同様に、配列決定反応は、単一の反応容器
または別々の反応容器のいずれかにおいて行われる。使
用されるべき方法の選択は、使用されるヌクレオチド３
リン酸アナログに依存する。従って、各々のアナログが
区別をつけて標識される場合、この配列決定反応は、単
一の容器において行われ得る。本発明の方法に従った配
列決定分析の最適な実行のための試薬および反応条件の
選択についての斟酌は、以前に記載された他の方法につ
いての斟酌と類似する。
【０３０１】伸長ターミネーターの特異的取り込みに従
って大きさが異なる複数のプライマー伸長産物を、当該
分野で公知の任意の種々の方法を使用してサイズ分離す
る。各々のターミネーターアナログとともに産生される
複数のプライマー伸長産物のプロフィールは、試験核酸
配列のヌクレオチド配列を示す。
【０３０２】（実施例７：増強増幅を使用した核酸標的
の配列決定）規定された標的核酸配列の増幅を、本明細
書中に記載されるように、転写を伴う等温線形増幅につ
いて記載されるように行う。ＴＳＯまたはＰＴＯのいず
れかの使用を使用して、プロトプロモーター（ｐｒｏｔ
ｏｐｒｏｍｏｔｅｒ）配列を等温線形増幅の産物に付加
し得る。本発明に従った増強型線形増幅方法について使
用される天然のリボヌクレオチド３リン酸（ｒＲＴＰ）
に加えて、配列決定反応混合物はまた、適切な標識化３
リン酸アナログを含み、このアナログは、当該分野で公
知の他の配列決定方法において一般に使用される。これ
らは、ＲＮＡポリメラーゼによって伸長産物に取り込ま
れ、そして標的配列に沿ったさらなる伸長の停止に役立
つ。この得られた短縮型伸長産物は標識される。蓄積さ
れた複数の置換された伸長産物は、各々のアナログの取
り込み部位に従って長さが異なり、これは、標的配列上
の相補的ヌクレオチドの種々の配列位置を示す。配列情
報の解明のための反応産物の分析は、上記の配列決定の
実施例において述べられたように行われ得る。
【０３０３】（実施例８：等温増強型線形増幅および遺
伝子型特異的複合プライマーを用いた遺伝子型決定）ゲ
ノムＤＮＡを、以前の実施例に記載された方法を使用し
て、または当業者に公知の他の手段によって試験細胞か
ら単離する。異なる生物（細菌、ウイルス、真菌、酵
母、植物および動物を含むがこれらに限定されない）を
遺伝子型決定する。遺伝子型特異的プライマーは、特定
の核酸配列のうちの１つの遺伝子型にハイブリダイズす
る３’末端ヌクレオチドを含むように設計されるか、ま
たは対応する（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）遺伝子型にハ
イブリダイズするように設計されるかのいずれかであ
る。特定の遺伝子型を決定する配列バリエーションは、
点変異、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失な
どであり得る。
【０３０４】規定された標的核酸配列の増幅を、上記の
実施例において、ゲノムＥ．ｃｏｌｉ配列の増幅につい
て記載されるように行う。遺伝子型特異的プライマーお
よびプルーフリーディング活性を欠くＤＮＡポリメラー
ゼを使用して、増幅産物の作製は、規定された遺伝子型
の標的配列の存在を示す。標的核酸配列へのプライマー
の３’末端のハイブリダイゼーションを妨げる配列バリ
エーションは、増幅を妨げる。増幅産物は、一本鎖核酸
配列の検出についての種々の方法のうちのいずれか１つ
によって検出され、この方法は、当該分野で公知であ
る。例えば、増幅産物への特定の標識化オリゴヌクレオ
チドプローブのハイブリダイゼーションは、ゲル電気泳
動によって検出される。
【０３０５】二倍体細胞の遺伝子型決定が必要とされる
場合（例えば、ホモ接合体の遺伝子型またはヘテロ接合
体の遺伝子型の決定）、特定のプライマー（これは、野
生型および変異体遺伝子型、またはある遺伝子型および
他の遺伝子型のいずれかについて設計される）を使用し
て、特定の核酸標的配列の増幅を実行することが可能で
ある。特定のプライマーを使用した増幅反応は、別々の
反応容器において行われる。ただ１つの反応チューブに
おける増幅産物またはより少ない増幅産物の検出は、ホ
モ接合体の遺伝子型（すなわち、野生型のホモ接合体ま
たは変異体のホモ接合体のいずれか）を示す。両方の増
幅反応における増幅産物の検出は、ヘテロ接合体の遺伝
子型を示す。
【０３０６】（実施例９：増幅方法を利用したＲＮＡ部
分に基づく等温変異検出）本明細書中に開示される等温
増幅方法は、標的核酸配列における規定された変異また
は多型部位（例えば、ＳＮＰ）の検出のために使用され
る。この方法は、遺伝子型決定または薬物耐性を導く変
異の検出のために使用される。標的核酸配列は、一本鎖
（ｓｓ）ＤＮＡである。一本鎖ＤＮＡ標的は、本明細書
中に記載される等温増幅方法を使用して、二本鎖ＤＮＡ
標的またはＲＮＡ標的から調製される。
【０３０７】図４に示されるように、野生型ＤＮＡ配列
に相補的な複合プライマーを、精査される対立遺伝子内
部に変異を有するか、または変異を有することが疑われ
るｓｓＤＮＡ標的と組み合わせて使用する。約１０２〜
約１０１２コピーのｓｓＤＮＡ標的および約０．０５〜
５μＭの複合プライマーを使用する。配列変化の存在は
増幅の初期段階を妨げず、それによって、この複合プラ
イマーは、標的配列にハイブリダイズし、第１の３分子
複合体を形成し、そして伸長産物が作製される。次い
で、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＨ）は、複合体の伸
長したプライマーのＲＮＡ部分を切断する。ＲＮアーゼ
Ｈによる複合プライマーのＲＮＡ部分またはプライマー
伸長産物の切断は、ミスマッチの存在によって影響を及
ぼされる。これは、切断を妨げ得るか、切断パターンを
変化し得るか、または切断効率を減少させ得る。５’Ｒ
ＮＡ部分のハイブリダイゼーションによる複合体への複
合プライマーの結合の次の段階は、上記の理由のために
ミスマッチによって阻害される。複合プライマーが標的
にハイブリダイズできないために、さらなる段階のプラ
イマー伸長鎖置換および複数のコピーの増幅産物の産生
が妨げられる。増幅産物またはその欠如は、ゲル電気泳
動または他の同等の手段によって可視化される。
【０３０８】プライマーハイブリダイゼーションの阻害
に寄与する因子は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドの大きさおよび反応条件のストリンジェンシーを含
む。これらの因子は、当該分野において周知かつ慣用的
な技術に従って、複合プライマーの設計において斟酌さ
れる。
【０３０９】変異したＤＮＡ配列に相補的である複合プ
ライマーをまた、上記の等温増幅方法において、野生型
ｓｓＤＮＡ標的と組み合わせて使用する。この場合、プ
ライマーは標的ＤＮＡに結合し、そして伸長を受ける。
しかし、ＲＮアーゼＨでの処理後、ヌクレオチドミスマ
ッチのために、より多くのプライマーは野生型ＤＮＡに
結合できない。それ故、増幅産物はほとんどからまった
く作製されない。この増幅産物またはその欠如は、ゲル
電気泳動または他の同等の手段によって可視化される。
【０３１０】目的の核酸サンプルまたは野生型配列を有
する標的核酸の参照サンプルのいずれかを含む並行反応
をまた行う。野生型配列を有する標的核酸の参照サンプ
ルを含む反応と比較して、目的の核酸サンプルを含む反
応におけるより多くのプライマー伸長産物の蓄積は、目
的のサンプルにおける変異体の遺伝子型の存在を示す。
あるいは、この複合プライマーが、試験標的の正常な遺
伝子型配列に完全に相補的な５’ＲＮＡ配列を含む場
合、変異体の遺伝子型の標的配列の増幅が妨げられ、そ
して増幅産物の検出および／または定量的決定が、正常
な遺伝子型を示す。
【０３１１】（実施例１０：等温増幅方法および遺伝子
型特異的プローブハイブリダイゼーションを用いた遺伝
子型決定）ハイブリダイゼーションによる配列決定のた
めの方法は、以前の実施例に記載される。特異的プロー
ブのハイブリダイゼーションによる配列の正体の決定
は、本発明の方法によって作製された増幅産物が一本鎖
であり、そして特定のプローブのハイブリダイゼーショ
ンにおける使用に容易に利用可能である限りでは、本発
明の等温方法を使用して特に有利である。規定された遺
伝子型に特異的なプローブは、当該分野で公知の方法を
使用して設計される。ある遺伝子型の増幅によって作製
され、他の遺伝子型の増幅によっては産生されない増幅
産物への選択的プローブハイブリダイゼーションを支持
するハイブリダイゼーション基準を決定することが可能
である。１ヌクレオチドと同じくらい小さな配列バリエ
ーションは、プローブハイブリダイゼーションを妨げ得
る。以下の因子は、ハイブリダイゼーション基準につい
て斟酌される：プローブ長、ハイブリダイゼーション反
応の温度および緩衝液組成（特に、二価のイオン濃
度）。分析に使用されるプローブは、溶液中に存在し得
るか、または固体表面に付着され得る。さらに、このプ
ローブは、特定の結合対のメンバーに直接標識され得る
かまたは付着され得、それ故、直接的または間接的に標
識され得る特定の結合対の別のメンバーに特異的に結合
し得る。
【０３１２】ゲノムＤＮＡを、当該分野で公知の方法に
よって、または上記の実施例に記載されるように、試験
サンプルから単離する。試験ＤＮＡを、記載される増幅
成分、標的特異的キメラプライマーおよびプロプロモー
ター配列（例えば、ＰＴＯ）と組み合わせる。この組み
合わせは、本明細書中に記載されるようなインキュベー
ション条件に供され、一本鎖ＲＮＡ増幅産物を作製す
る。遺伝子型特異的プローブへの増幅産物のハイブリダ
イゼーションを、溶液中、または付着した遺伝子型特異
的プローブを有する固相において行う。増強等温線形増
幅方法の産物は一本鎖なので、この産物は、理想的に
は、固相（例えば、ガラススライド）への付着に適し、
空間的に分離された特異的プローブのアレイ（すなわ
ち、遺伝子チップ）を作製する。あるいは、固相は、特
異的プローブが付着している粒子を含む。増幅産物への
プローブハイブリダイゼーションの検出を、例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、前出において開示される、当該分野
で公知の種々の方法によって行う。特異的プローブは標
識され、そしてハイブリダイゼーションに起因した標識
のスペクトル性質の変化を、コンピュータアルゴリズム
によって検出および記録する。
【０３１３】増幅産物への特異的プローブのハイブリダ
イゼーションに起因した粒子の会合をまた、プローブハ
イブリダイゼーションの検出について使用する。標識さ
れた増幅産物が作製され、そして固体表面に固定化され
たプローブへの産物のハイブリダイゼーションを、コン
ピュータアルゴリズムによって検出および記録する。標
識された増幅産物の作製を、ｒＮＴＰアナログ（これは
標識される）による４つのｒＮＴＰのうちの１つの置換
による転写段階の間に、標識されたｒＮＴＰの取り込み
によって行う。この標識は、色素または低分子（例え
ば、ビオチン）であり、次いでこれは、特異的結合実体
（例えば、標識されたストレプトアビジン）への結合に
よって検出される。固体表面上でプローブハイブリダイ
ゼーションを検出するための方法は、当該分野で公知で
ある。
【０３１４】（実施例１１：ｒＳＳＣＰ（ＲＮＡ一本鎖
高次構造多型）による遺伝子型決定）遺伝子型決定を、
本明細書中に記載される方法を使用した特異的標的核酸
配列の増幅によって、そして一本鎖ＲＮＡ産物の電気泳
動のバンドパターンの決定によって行い、このバンドパ
ターンは、一本鎖高次構造を反映する。配列変化の検出
のためのＳＳＣＰの使用は、広範に使用される。遺伝子
型特異的一本鎖高次構造を、サンプルをゲル電気泳動ま
たはキャピラリー電気泳動に供することによって決定す
る。本発明の方法に従った標的核酸配列の増幅による一
本鎖産物の作製は、増幅方法をｒＳＳＣＰ分析と組み合
わせることによって、この方法を遺伝子型決定に特に適
切にする。
【０３１５】精製された試験ゲノムＤＮＡを、上記のよ
うな本発明の増幅方法の成分ならびに標的特異的複合プ
ライマーおよびプロプロモーター配列（例えば、ＰＴ
Ｏ）と組み合わせる。この組み合わせを、標的配列の等
温増幅についての条件に供する。増幅産物を含む反応混
合物を、当該分野で公知の機器および条件を使用して、
ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動のいずれかに
供する。増幅産物の電気泳動のバンドパターンを決定す
る。オリゴヌクレオチド産物の可視化を、色素インター
カレーターを含めることによって達成する。増幅産物の
電気泳動パターンを、既知の遺伝子型の細胞から得られ
た標的核酸配列の増幅によって作製された増幅産物のパ
ターンと比較する。電気泳動の移動度のパターンの任意
の変化は、配列変異性を示す。本発明の増幅方法とｒＳ
ＳＣＰとの組み合わせは、規定された標的配列の配列多
型の発見および以前に規定された遺伝子型の検出の両方
についての簡単な方法を提供する。既知の核酸配列また
は規定された遺伝子型の電気泳動パターンを、あらかじ
め決定し得、そして試験ＤＮＡの増幅産物によって作製
されるパターンを、遺伝子型決定のために既知のパター
ンと比較する。
【０３１６】
【発明の効果】本発明により、遺伝子用量の正確な定量
に有用であり、熱サイクリングを必要とせず、そして単
一のプライマーのみしか必要としない、改良された核酸
増幅法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、一本鎖複合プライマー等温線形増
幅工程の図示である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、一本鎖複合プライマー等温線形増
幅工程の図示である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、一本鎖複合プライマー等温線形増
幅工程の図示である。
【図２Ａ】図２Ａは、テンプレートスイッチオリゴヌク
レオチド配列を使用した、転写を含む、増強型一本鎖プ
ライマー等温線形核酸増幅工程の図示である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、テンプレートスイッチオリゴヌク
レオチド配列を使用した、転写を含む、増強型一本鎖プ
ライマー等温線形核酸増幅工程の図示である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、テンプレートスイッチオリゴヌク
レオチド配列を使用した、転写を含む、増強型一本鎖プ
ライマー等温線形核酸増幅工程の図示である。
【図３Ａ】図３Ａは、ブロッカー配列成分を使用した、
転写を含む、増強型一本鎖複合プライマーの等温線形核
酸増幅工程の図示である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ブロッカー配列成分を使用した、
転写を含む、増強型一本鎖複合プライマーの等温線形核
酸増幅工程の図示である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ブロッカー配列成分を使用した、
転写を含む、増強型一本鎖複合プライマーの等温線形核
酸増幅工程の図示である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ブロッカー配列成分を使用した、
転写を含む、増強型一本鎖複合プライマーの等温線形核
酸増幅工程の図示である。
【図４Ａ】図４Ａは、一本鎖プライマー等温線形増幅工
程を使用するテンプレート配列における変異の検出の図
示である。「Ｘ」は、複合プライマーのＲＮＡ部分と相
補的な部位での、標的ＤＮＡ上の変異を示す。示された
ように、標的核酸の増幅は変異が存在する場合に、ブロ
ックされる。
【図４Ｂ】図４Ｂは、一本鎖プライマー等温線形増幅工
程を使用するテンプレート配列における変異の検出の図
示である。「Ｘ」は、複合プライマーのＲＮＡ部分と相
補的な部位での、標的ＤＮＡ上の変異を示す。示された
ように、標的核酸の増幅は変異が存在する場合に、ブロ
ックされる。
【図５】図５は、合成ＤＮＡ標的の線形等温増幅産物の
ＰＡＧＥゲル（臭化エチジウムで染色した）を示す。
【図６】図６は、特異的プローブとＤＮＡ増幅産物との
ハイブリダイゼーションのＰＡＧＥ分析のオートラジオ
グラムを示す。
【図７】図７は、重複伸長から生成したｓｓＲＮＡ転写
産物の有効性を比較したＰＡＧＥゲル（臭化エチジウム
で染色した）を示す。
【図８】図８は、３’ブロックしたＰＴＯを含む、およ
び３’ブロックしたＰＴＯなしの等温線形増幅のＰＡＧ
Ｅゲル（臭化エチジウムで染色した）比較を示す。
【図９】図９は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡからのＪ遺
伝子配列の等温線形増幅により生成した増幅産物とハイ
ブリダイズしたプローブのオートラジオグラムを示す。
【図１０】図１０は、３つの異なる設計の複合プライマ
ーを用いて生成された線形等温増幅ＲＮＡ産物のＰＡＧ
Ｅゲル（臭化エチジウムで染色した）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 HA08 HA11 HA12 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR50 QR55 QR82 QS25 QS34 QS36

Claims (64)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的ポリヌクレオチド配列と相補的なポ
    リヌクレオチド配列を増幅するための方法であって、以
    下： （ａ）該標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを複
    合プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、該
    複合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を含
    む、工程； （ｂ）必要に応じて、終結ポリヌクレオチド配列を含む
    ポリヌクレオチドを、該テンプレートへの該複合プライ
    マーのハイブリダイゼーションに対して５’側にある該
    テンプレートの領域にハイブリダイズさせる工程； （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて該複合プライマーを
    伸長させる工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
    る酵素を用いて、該アニールした複合プライマーのＲＮ
    Ａ部分を切断して、別の複合プライマーが該テンプレー
    トにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマー伸
    長を反復し得るようにする工程であって、それにより該
    標的配列の相補的配列の複数のコピーが生成される、工
    程、を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 標的ポリヌクレオチド配列を増幅するた
    めの方法であって、以下： （ａ）該標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを、
    複合プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、
    該複合プライマーがＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を
    含む、工程； （ｂ）終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
    ドを、該テンプレートへの該複合プライマーのハイブリ
    ダイゼーションに対して５’側にある該テンプレートの
    領域にハイブリダイズさせる工程； （ｃ）該複合プライマーをＤＮＡポリメラーゼを用いて
    伸長させる工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
    る酵素を用いて、該アニールした複合プライマーのＲＮ
    Ａ部分を切断して、別の複合プライマーが該テンプレー
    トにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマー伸
    長を反復して置換されたプライマー伸長産物を生成し得
    るようにする工程； （ｅ）プロプロモーターと該置換されたプライマー伸長
    産物にハイブリダイズする領域とを含むポリヌクレオチ
    ドを、ＲＮＡポリメラーゼにより転写が生じるのを可能
    にする条件下でハイブリダイズさせ、該置換されたプラ
    イマー伸長産物と相補的な配列を含むＲＮＡ転写物が生
    成されるようにする工程であって、それにより該標的配
    列の複数のコピーが生成される、工程、を包含する、方
    法。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、前記複合プライマーのＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮ
    Ａ部分に対して５’側にある、方法。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、前記
    ５’ＲＮＡ部分が前記３’ＤＮＡ部分に隣接する、方
    法。
  5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、複数の複合プライマーが使用される、方法。
  6. 【請求項６】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、前記終結配列を含むポリヌクレオチドが、テンプレ
    ートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）である、方
    法。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、前記Ｔ
    ＳＯが、前記テンプレートにハイブリダイズする領域に
    おいて改変を含み、所定のセットの条件下で、該ＴＳＯ
    が、該改変を含まないＴＳＯと比較した場合に、より緊
    密に該領域に結合する、方法。
  8. 【請求項８】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、前記終結配列を含むポリヌクレオチドが、ブロッキ
    ング配列である、方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、前記ブ
    ロッキング配列が、前記テンプレートにハイブリダイズ
    する領域において改変を含み、所定のセットの条件下
    で、該ブロッキング配列が、該改変を含まないブロッキ
    ング配列と比較した場合に、より緊密に該領域に結合す
    る、方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、前記ＲＮＡを切断する酵素が、ＲＮアーゼＨであ
    る、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項２に記載の方法であって、前記
    プロプロモーターと前記置換されたプライマー伸長産物
    にハイブリダイズする領域とを含むポリヌクレオチド
    が、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳ
    Ｏ）である、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項２に記載の方法であって、前記
    プロプロモーターを含むポリヌクレオチドが、前記置換
    されたプライマー伸長産物にハイブリダイズする領域を
    ３’末端に含み、それにより置換されたプライマー伸長
    産物のＤＮＡポリメラーゼ伸長が、転写を生じる二本鎖
    プロモーターを生成する、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、前
    記プロプロモーターを含むポリヌクレオチドが、プロプ
    ロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）
    である、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、工程（ａ）および（ｂ）がどちらの順序でも実施さ
    れる、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、工程（ａ）および（ｂ）が同時に実施される、方
    法。
  16. 【請求項１６】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が同時に実施され
    る、方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、工程（ａ）および（ｂ）が工程（ｃ）の前に実施さ
    れる、方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１または２に記載の方法であっ
    て、工程すべてが同時に実施される、方法。
  19. 【請求項１９】 標的ヌクレオチド配列を配列決定する
    方法であって、以下： （ａ）該標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを複
    合プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、該
    複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を
    含む、工程； （ｂ）必要に応じて、終結ポリヌクレオチド配列を含む
    ポリヌクレオチドを、該テンプレートへの該複合プライ
    マーのハイブリダイゼーションに対して５’側にある該
    テンプレートの領域にハイブリダイズさせる工程； （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼならびにｄＮＴＰとｄＮＴＰ
    アナログとの混合物を用いて、該複合プライマーを終結
    部位へと伸長させて、プライマー伸長がｄＮＴＰアナロ
    グの取り込みの際に終結するようにする、工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
    る酵素を用いて、該アニールした複合プライマーのＲＮ
    Ａ部分を切断して、別の複合プライマーが該テンプレー
    トにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマー伸
    長を反復し得るようにする工程であって、それにより該
    標的配列の相補的配列の種々の長さの複数のコピーが生
    成される、工程； （ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の産物を分析して配列を決定
    する工程、を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 標的ヌクレオチド配列を配列決定する
    方法であって、以下： （ａ）該標的配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートを複
    合プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、該
    複合プライマーが、ＲＮＡ部分および３’ＤＮＡ部分を
    含む、工程； （ｂ）終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
    ドを、該テンプレートへの該複合プライマーのハイブリ
    ダイゼーションに対して５’側にある該テンプレートの
    領域にハイブリダイズさせる工程； （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて該複合プライマーを
    伸長させる工程； （ｄ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断す
    る酵素を用いて、該アニールした複合プライマーのＲＮ
    Ａ部分を切断して、別の複合プライマーが該テンプレー
    トにハイブリダイズし得かつ鎖置換によりプライマー伸
    長を反復して置換されたプライマー伸長産物を生成し得
    るようにする工程； （ｅ）プロプロモーターと該置換されたプライマー伸長
    産物にハイブリダイズする領域とを含むポリヌクレオチ
    ドを、ｒＮＴＰとｒＮＴＰアナログとの混合物を使用し
    て、ＲＮＡポリメラーゼにより該伸長産物から転写が生
    じるような条件下で、ハイブリダイズさせ、該置換され
    たプライマー伸長産物と相補的な配列を含むＲＮＡ転写
    物が生成されるようにし、そして転写がｒＮＴＰアナロ
    グの取り込みの際に終結するようにする工程であって、
    それにより該標的配列の種々の長さの複数のコピーが生
    成される、工程； （ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）の産物を分析して配列を決定
    する工程、を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記複合プライマーのＲＮＡ部分が前
    記３’ＤＮＡ部分に対して５’側にある、請求項１９ま
    たは２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記５’ＲＮＡ部分が前記３’ＤＮＡ
    部分に隣接している、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 標的ポリヌクレオチド中の目的の配列
    を特徴付ける方法であって、該方法は、請求項１または
    ２に記載の方法であって、前記複合プライマーのＲＮＡ
    部分の配列が既知である方法を実行する工程を包含し、
    そしてここで、（ａ）該複合プライマーのＲＮＡ部分と
    相補的な領域を含む参照テンプレートからの増幅産物の
    量と比較して検出可能に少ない、前記テンプレートから
    の増幅産物の生成は、該標的ポリヌクレオチドが、該複
    合プライマーのＲＮＡ部分と相補的な配列を含まずかつ
    該複合プライマーのＲＮＡ部分と相補的な配列に対する
    配列改変体であることを示すか；または（ｂ）該複合プ
    ライマーのＲＮＡ部分と相補的な領域を含まない参照テ
    ンプレートからの増幅産物の量と比較して検出可能に多
    い、前記テンプレートからの増幅産物の生成は、該標的
    ポリヌクレオチドが、該複合プライマーのＲＮＡ部分と
    相補的な配列を含みかつ該複合プライマーのＲＮＡ部分
    と相補的な配列に対する配列改変体ではないことを示
    す、方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、前
    記複合プライマーのＲＮＡ部分の配列が野生型配列を含
    み、そして前記目的の配列が、該野生型配列の存在また
    は非存在を決定することにおいて特徴付けられる、方
    法。
  25. 【請求項２５】 請求項２３に記載の方法であって、前
    記複合プライマーのＲＮＡ部分の配列が変異配列を含
    み、そして前記目的の配列が、該変異配列の存在または
    非存在を決定することにおいて特徴付けられる、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２３に記載の方法であって、前
    記複合プライマーのＲＮＡ部分の配列が対立遺伝子配列
    を含み、そして前記目的の配列が、該対立遺伝子配列の
    存在または非存在を決定することにおいて特徴付けられ
    る、方法。
  27. 【請求項２７】 標的ポリヌクレオチドにおける変異を
    検出する方法であって、（ａ）請求項１または２に記載
    の方法を実行する工程；および（ｂ）一本鎖高次構造に
    ついて該方法の増幅産物を分析する工程、を包含し、参
    照一本鎖ポリヌクレオチドと比較した場合の高次構造に
    おける差異が、該標的ポリヌクレオチドにおける変異を
    示す、方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２３に記載の方法であって、前
    記複合プライマーのＲＮＡ部分が前記３’ＤＮＡ部分に
    対して５’側にある、方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の方法であって、前
    記５’ＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に隣接してい
    る、方法。
  30. 【請求項３０】 マイクロアレイを作製する方法であっ
    て、（ａ）請求項１または２に記載の増幅方法を実行す
    る工程；および（ｂ）該増幅産物のマイクロアレイを作
    製するために固体基材上に該増幅産物を付着させる工
    程、を包含する、方法。
  31. 【請求項３１】 複合プライマーを含む組成物であっ
    て、該複合プライマーが３’ＤＮＡ部分および５’ＲＮ
    Ａ部分を含む、組成物。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載の組成物であって、
    前記５’ＲＮＡ部分が前記３’ＤＮＡ部分に隣接してい
    る、組成物。
  33. 【請求項３３】 請求項３１に記載の組成物であって、
    前記５’ＲＮＡ部分が約５〜約２０ヌクレオチドであ
    り、そして前記３’ＤＮＡ部分が約５〜約１５ヌクレオ
    チドである、組成物。
  34. 【請求項３４】 ＴＳＯを含む組成物であって、該ＴＳ
    Ｏは、テンプレートにハイブリダイズする領域における
    改変を含み、所定のセットの条件下で、該ＴＳＯは、該
    改変を含まないＴＳＯと比較した場合により緊密に該領
    域に結合する、組成物。
  35. 【請求項３５】 請求項３１に記載の複合プライマーお
    よび請求項３４に記載のＴＳＯを含む、組成物。
  36. 【請求項３６】 請求項３１に記載の複合プライマーお
    よびブロッキング配列を含む、組成物。
  37. 【請求項３７】 請求項３１に記載の複合プライマーお
    よびプロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド
    （ＰＴＯ）を含む、組成物。
  38. 【請求項３８】 （ａ）テンプレート鎖と（ｂ）複合プ
    ライマーとの複合体を含む、組成物であって、該複合プ
    ライマーが３’ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を含む、組
    成物。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の組成物であって、
    前記ＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分の５’側にあり
    かつ隣接している、組成物。
  40. 【請求項４０】 請求項３９に記載の組成物であって、
    前記複合体がさらに終結配列を含む、組成物。
  41. 【請求項４１】 請求項４０に記載の組成物であって、
    前記終結配列がＴＳＯである、組成物。
  42. 【請求項４２】 請求項４０に記載の組成物であって、
    前記終結配列がブロッキング配列である、組成物。
  43. 【請求項４３】 反応混合物であって、（ａ）ポリヌク
    レオチドテンプレート；（ｂ）３’ＤＮＡ部分とＲＮＡ
    部分とを含む、複合プライマー；ならびに（ｃ）ＤＮＡ
    ポリメラーゼを含む、反応混合物。
  44. 【請求項４４】 前記複合プライマーが、前記３’ＤＮ
    Ａ部分に隣接する５’ＲＮＡ部分を含む、請求項４３に
    記載の反応混合物。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の反応混合物であっ
    て、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する
    酵素をさらに含む、反応混合物。
  46. 【請求項４６】 請求項４５に記載の反応混合物であっ
    て、前記酵素がＲＮアーゼＨである、反応混合物。
  47. 【請求項４７】 請求項４４に記載の反応混合物であっ
    て、終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    をさらに含む、反応混合物。
  48. 【請求項４８】 請求項４７に記載の反応混合物であっ
    て、プロプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに
    含む、反応混合物。
  49. 【請求項４９】 請求項４８に記載の反応混合物であっ
    て、前記プロプロモーターを含むポリヌクレオチドがＴ
    ＳＯである、反応混合物。
  50. 【請求項５０】 請求項４８に記載の反応混合物であっ
    て、前記プロプロモーターを含むポリヌクレオチドが、
    プロプロモーターテンプレートオリゴヌクレオチド（Ｐ
    ＴＯ）である、反応混合物。
  51. 【請求項５１】 標的ポリヌクレオチド配列の増幅のた
    めのキットであって、３’ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを
    含む、複合プライマーを備える、キット。
  52. 【請求項５２】 請求項５１に記載のキットであって、
    前記ＲＮＡ部分が、前記３’ＤＮＡ部分に対して５’側
    にある、キット。
  53. 【請求項５３】 請求項５２に記載のキットであって、
    前記５’ＲＮＡ部分が前記３’ＤＮＡ部分に隣接してい
    る、キット。
  54. 【請求項５４】 請求項５１に記載のキットであって、
    終結ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさ
    らに備える、キット。
  55. 【請求項５５】 請求項５４に記載のキットであって、
    前記終結ポリヌクレオチド配列がＴＳＯである、キッ
    ト。
  56. 【請求項５６】 請求項５４に記載のキットであって、
    前記終結ポリヌクレオチド配列がブロッカー配列であ
    る、キット。
  57. 【請求項５７】 請求項５１に記載のキットであって、
    プロプロモーターを含むポリヌクレオチドをさらに備え
    る、キット。
  58. 【請求項５８】 請求項５７に記載のキットであって、
    前記プロプロモーターを含むポリヌクレオチドがＴＳＯ
    である、キット。
  59. 【請求項５９】 請求項５７に記載のキットであって、
    前記プロプロモーターを含むポリヌクレオチドがＰＴＯ
    である、キット。
  60. 【請求項６０】 請求項５１に記載のキットであって、
    ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素
    をさらに備える、キット。
  61. 【請求項６１】 請求項６０に記載のキットであって、
    前記酵素がＲＮアーゼＨである、キット。
  62. 【請求項６２】 標的ポリヌクレオチド配列またはその
    相補体を増幅するためのシステムであって、（ａ）３’
    ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含む、複合プライマー；
    （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに（ｃ）ＲＮＡ／Ｄ
    ＮＡハイブリッドからＲＮＡを切断する酵素、を含む、
    システム。
  63. 【請求項６３】 請求項６２に記載のシステムであっ
    て、前記酵素がＲＮアーゼＨである、システム。
  64. 【請求項６４】 請求項６２または６３に記載のシステ
    ムであって、前記複合プライマーが、前記３’ＤＮＡ部
    分に隣接する５’ＲＮＡ部分を含む、システム。
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