KR20050083871A

KR20050083871A - 조합된 지수 및 선형 증폭

Info

Publication number: KR20050083871A
Application number: KR1020057007577A
Authority: KR
Inventors: 구올량 푸
Original assignee: 구올량 푸
Priority date: 2002-10-29
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2005-08-26
Also published as: GB0230238D0; CN1732273A; WO2004059005A3; WO2004059005A2; US20070122804A1; AU2003276475B2; AU2009227902A1; AU2003276475A1; CA2504198A1; CN1732273B; JP2006504436A; EP1556521A2

Abstract

핵산의 감도있는 검출 및 정량화를 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 또한, 유전자형 분석을 위한 방법 및 조성물도 제공된다. 본 발명의 프로브는 단일 가닥, 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드 및 피로포스페이트(PPi)에 대한 표적 개시된 증폭을 허용한다. 단일 가닥의 최종 생성물을 검출하기 위한 DNA 효소 매개 검출 방법이 또한 제공된다.

Description

조합된 지수 및 선형 증폭 {COMBINED EXPONENTIAL AND LINEAR AMPLIFICATION}

본 발명은 핵산 증폭 및 검출의 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 핵산 분자를 증폭시키고 (즉, 다수의 복사체들을 생산하고), 증폭된 서열을 검출하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공하며, 이들은 표적 개시된 핵산 중합, 사슬 반응 캐스케이드 및 DNA 효소 매개 검출을 포함한다.

증폭에 기초한 감도있는 핵산 검출을 수행할 수 있도록 하는 수많은 방법들이 개발되었다. 그것은 표적 또는 신호 증폭 중 하나를 할 수 있도록 하는 2가지 부류로 분류된다. 표적 증폭 방법은 폴리머라제 사슬 반응(PCR), 리가제 사슬 반응(LCR), 자기-지속적 서열 복제(3 SR), 핵산 서열 기재의 증폭(NASBA), 및 가닥 치환 증폭(SDA)을 포함한다. 신호 증폭 기술은 분지형 DNA(bDNA), 혼성체 포획, 및 절단효소(인베이더(invader) 검정)를 포함하고, 대리 마커의 증폭에 의해 핵산 표적을 측정한다. 롤링 서클 증폭(RCA)은 표적 또는 신호 증폭 중 하나를 수행하는 방법이다 (Birkenneyer 및 Mushahwar, J. Virological Methods, 35:117-126 (1991); Landegren, Trends Genetics, 9:199-202 (1993); Schweitzer 및 Kingsmore, Current opinion in Biotechnology, 12 21-27 (2001)).

PCR 방법은 여전히 가장 광범위하게 사용되는 DNA 증폭 및 정량화 방법이다. 그러나, 일반적으로 PCR은 고가의 열 사이클러의 필요, 오염 용이성, 정량화의 곤란성, 상이한 DNA들에 대한 효율성이 상이한 증폭, 및 제한된 복합화와 같은 당업계에 공지된 수가지 제한점들을 가지고 있다.

생물학적 샘플에서의 mRNA/cDNA 수준의 정량적 프로파일링을 위한 현 기술은 cDNA 배열 (Schena 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91:10614-10619 (1994)) 또는 고밀도 올리고뉴클레오티드 배열 (Lockhart 등, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)) 중 하나의 사용을 포함한다. Schena 등에 의한 cDNA 배열의 경우, 배열의 각 요소에서의 단일 분자종의 검출은 100,000개 이상의 결합된 표적 분자의 존재를 필요로 한다. Lockhart 등에 의해 사용된 DNA 칩 배열의 경우, 혼성화된 RNA에 대한 검출 한도는 약 2000개 분자이다.

단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)은 강력한 복합 형질 및 약물유전적 연구의 기반이다. 그러나, 수많은 SNP의 분석은 동등 정도의 단순성, 강건성 및 확장성(scalability)의 저렴한 SNP 유전자형 분석 방법의 필요를 강조하였다. 일반적으로, 현 방법은 게놈 DNA의 사전증폭, 및 그에 이은 DNA 절단, 라이게이션, 단일 염기 신장 또는 혼성화와 같은 대립유전자 분별 방법을 이용한 SNP 유전자형 분석을 필요로 한다. 현 방법은 샘플 DNA의 비용, 부정확성, 소비, 또는 확장성의 결여 중 하나에 의해 제한된다 (Faruqi 등, BMC Genomics (2001) 2:4). 따라서, 민감하면서도 정량적인 핵산 검출 방법이 요망된다.

그러므로, 개시된 본 발명의 한 목적은, 저농도 핵산의 검출 방법을 제공하는 것이다.

개시된 본 발명의 다른 한 목적은, 샘플에 존재하는 특이적 표적 핵산 서열의 양을 결정하는 방법으로서, 측정된 신호 수가 샘플에서의 표적 서열의 양에 비례하고, 상이한 표적 서열에서 측정된 신호의 비가 샘플에 존재하는 상이한 표적 서열의 양의 비에 실질적으로 매칭하는 방법을 제공하는 것이다.

개시된 본 발명의 다른 한 목적은, 표적 유전적 요소의 개별적 대립유전자를 나타내는 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

개시된 본 발명의 다른 한 목적은, 고처리량의 SNP 유전자형 분석, 뉴클레오티드 메틸화의 검출 및 상이한 유전자 스플라이싱(splicing)을 위한 방법을 제공하는 것이다.

개시된 본 발명의 다른 한 목적은, RNA 또는 DNA-RNA 키메라 기질의 DNA 효소 매개 절단에 의한 최종 생성물 검출 방법을 제공하는 것이다.

발명의 개요

핵산의 증폭 및 검출을 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 본 발명의 방법은 "증폭 반복 주형"(ART) 프로브로 칭해지는 특수 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 증폭은 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP), 이중 가닥의 최종 생성물 및 피로포스페이트(PPi)의 수많은 복사체들을 생산할 수 있도록 하는 조합된 지수 및 선형 증폭(CELA)을 통해 달성된다.

ART 프로브 분자는 표적 상보적 부분, 주형 부분(들), 하나 이상의 효소 작용 부분을 포함하고, 3' 말단 블록 부분이 존재하거나 존재하지 않는 단일 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 선형 또는 원형 핵산이다. ART 프로브는 프로브의 일부 부분(들)이 이중 가닥이 되도록 하는 헬퍼 프라이머를 포함할 수 있다. ART 프로브는 안티센스 DNA 효소 또는 안티센스 RNA 효소를 포함할 수 있다. ART 프로브는 모든 부분들을 포함할 수 있고, 부가적인 부분을 포함할 수 있다.

효소 작용 부분은 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함할 수 있다. 효소 작용 부분은 RNase H 작용 서열을 포함할 수 있다. 효소 작용 부분은, 이중 가닥인 경우에 프로브의 반대측 가닥의 분해(digestion)를 보조하는 뉴클레아제 분해 부위를 포함할 수 있다. 뉴클레아제 분해 부위는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이로써 프로브 상의 분해 부위는 뉴클레아제 절단에 대해 내성을 가지게 되고, 반대측 변형되지 않은 가닥은 절단에 대해 민감하게 된다. 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결기를 포함할 수 있다.

효소 작용 부분은 RNase H 작용 서열 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 조합, 또는 RNase H 작용 서열 및 뉴클레아제 분해 부위의 조합, 또는 뉴클레아제 분해 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 조합, 또는 하나 초과의 뉴클레아제 분해 부위들의 조합을 포함할 수 있다.

뉴클레아제 분해 부위는 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위를 갖는 제한 부위를 포함할 수 있다. 제한 부위는 IIS형 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. IIS형 제한 부위의 효소 절단 부위가 표적 상보적 부분 상에 존재하는 것이 바람직하다. SNP 유전자형 분석, 메틸화 분석, 및 스플라이싱 분석을 위해, IIS형 제한 효소 절단 부위가 SNP 또는 돌연변이 부위, 메틸화 뉴클레오티드, 또는 유전자 스플라이싱 부위에 상응하는 것이 더욱 바람직하다. IIS형 제한 부위는 Fok I 부위일 수 있다.

프로브는 프로브의 부분에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적인 하나 이상의 부분을 포함하는 헬퍼 프라이머(들)를 포함할 수 있다. 헬퍼 프라이머는 3' 말단 블록킹 부분기를 포함할 수 있고, 이로써 헬퍼 프라이머의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하지 않다. 헬퍼 프라이머는 3' 말단 블록킹 부분기를 포함하지 않을 수 있고, 이로써 헬퍼 프라이머의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하다.

헬퍼 프라이머는 측부(flanking) 서열이 존재하거나 존재하지 않는 프로브의 효소 작용 부분(들) 또는 효소 작용 부분(들)의 일부에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있고, 이로써 헬퍼 프라이머 및 프로브 간의 혼성화는 효소 작용 부분(들)이 이중 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥이 되도록 한다. 헬퍼 프라이머는, 신장가능하고 프로브의 효소 작용 부분들 중 하나의 서열 3'에 대해 상보적인 3' 말단의 서열을 포함할 수 있다. 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열은 2 내지 15개 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 3 내지 10개 뉴클레오티드, 또는 더욱 더 바람직하게는 4 내지 8개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.

헬퍼 프라이머는 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역(들)이 프로브에 대해 상보적인 표적 영역에 인접하거나 실질적으로 인접하는 표적 상보적 부분(들)을 추가로 포함할 수 있다. 헬퍼 프라이머는, 프로브에 대해 상보적인 표적 영역이 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역의 중간에 위치하고, 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역에 인접하거나 실질적으로 인접하는 3' 및 5' 표적 상보적 부분을 포함할 수 있다.

프로브의 표적 상보적 부분은, 관심 표적 영역에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있고, 여기에서 프로브의 표적 상보적 부분이 관심 표적 영역에 혼성화하여 이중 가닥이 되며, 이로써 프로브의 효소 작용 부분(들)의 하나 또는 하나 초과 또는 일부가 부분적으로 또는 완전히 기능적으로 된다.

프로브의 효소 작용 부분(들), 표적 상보적 부분 및 주형 부분(들)은 상호 중첩되거나 한 부분이 다른 부분들에 삽입될 수 있다.

프로브의 표적 상보적 부분 및(또는) 효소 작용 부분(들) 및(또는) 주형 부분(들)은 뉴클레아제 절단에 대해 내성을 갖도록 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 표적이 RNA이고(이거나), 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)이 RNA이며, RNase H가 반응에 사용될 경우, 표적 상보적 부분 및(또는) 효소 작용 부분 및(또는) 주형 부분이 키메라 RNA 및 DNA를 포함하는 것이 바람직하다. 표적 또는 SSEP RNA를 ART 프로브에 어닐링시킨 후, 이중 가닥의 RNA/RNA 부분이 RNase H 절단에 대해 내성을 가지게 되어, 표적 또는 SSEP RNA가 완전히 분해 제거되지 않으며, 한편 RNA/DNA 부분 상의 RNA는 분해되고, 분해된 RNA의 3' 말단은 신장 개시 부위로 사용된다. 또한, ART 프로브 상의 RNA 부분이 어떠한 뉴클레아제에 의해서도 분해되지 않도록 변형되는 것도 바람직하다. 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결기를 포함할 수 있다.

프로브의 주형 부분은, RNA 폴리머라제 프로모터, 또는 제한 효소 부위를 포함할 수 있는 하나 이상의 효소 작용 부분에 의해 분리될 수 있는, 2개의 동일하거나 거의 동일한 서열을 동일 배향으로 포함할 수 있다. 원형 프로브는 다른 부분들이 안에 삽입되어 있는 하나의 주형 부분을 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, DNA 효소 매개 검출이 사용되는 경우, 주형 부분이 DNA 효소에 대해 상보적인 촉매 불활성 안티센스 서열을 포함하는 것이 바람직하다. DNA 효소가 10-23 또는 8-17 DNA 효소인 것이 바람직하다.

프로브의 3' 말단 블록 부분은 프로브의 3' 말단이 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하지 않도록 하는 화학적 부분기일 수 있다. 프로브 및(또는) 헬퍼 프라이머의 임의의 말단은 고체 지지체에 결합될 수 있다.

샘플에서 관심 표적 핵산 서열 또는 다수의 표적 핵산 서열들을 검출하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법이 제공된다: (a) 프로브 또는 한 세트의 프로브를 적당한 혼성화 조건하에 핵산 샘플과 접촉시키는 단계로서, 이때 프로브의 표적 상보적 부분 또는 프로브 및 헬퍼 프라이머의 표적 상보적 부분이 표적 서열(들)이 혼성화되어 이중 가닥이 되며, 이에 의해 프로브의 효소 작용 부분(들) 중 하나 또는 하나 초과 또는 일부가 부분적으로 또는 완전히 기능적이 되도록 함; (b) 프로브의 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 함; (c) 이중 가닥 효소 작용 부분(들)을 함유하는 프로브를 처리하여, 단일 가닥의 최종 생성물 (SSEP)을 생산함; (d) SSEP를 유리 프로브에 어닐링시키고, 프로브의 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 함; (e) (c) 및 (d)의 단계들을 반복함으로써, 프로브를 이중 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 형태로 전환시키고, SSEP의 다수의 복사체들을 반복 생산함; 및 (f) 이에 따라 생산된 최종 생성물, 즉 이중 가닥의 최종 생성물, SSEP 및 피로포스페이트(PPi)를 직접 또는 간접적으로 검출함. 이 방법의 모든 단계들은 단일 반응 또는 분리된 반응으로 수행될 수 있다.

일부 실시양태들에서, 표적 핵산이 RNA이고, 단계 (a)가 효소 작용 부분들 중 하나인, RNase H 분해 부위가 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 하는 경우, 단계 (b)는 RNA 가닥을 RNase H에 의해 분해하고, 부분적으로 분해된 가닥의 3' 말단을 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 이로써 프로브 상의 모든 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 되도록 함을 포함한다. 프로브 상의 다른 효소 작용 부분은 제한 부위 또는 RNA 폴리머라제 프로모터, 또는 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함할 수 있다.

다른 실시양태들에서, 부분적으로 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, 효소 작용 부분들 중 하나가 제한 부위이고, 프로브의 표적 상보적 부분에 위치하고, 단계 (a)는 제한 부위가 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 하는 경우, 단계 (b)는 제한 부위 상의 프로브의 반대측 가닥을 제한 효소에 의해 분해하고, 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시키며, 이로써 프로브 상의 모든 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 되도록 함을 포함한다. 상기 프로브 상의 다른 효소 작용 부분은 다른 제한 부위, RNA 폴리머라제 프로모터 또는, 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 제한 부위는 프로브 상의 유일한 작용 부분일 수 있다. 다른 실시양태들에서, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, 효소 작용 부분들 중 하나가, 프로브의 표적 상보적 부분 상의 절단 부위, 및 프로브 상의 표면 상보적 부분의 어느 한 측의 인식 부위를 갖는 IIS형 제한 효소 부위이고, 단계 (a)가 프로브의 표적 상보적 부분이 이중 가닥이 되도록 하고, 이로써 IIS형 제한 부위의 기능적 절단 부위를 형성하는 경우, 단계 (b)는 헬퍼 프라이머를 프로브에 어닐링시키고, IIS형 제한 부위의 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 함을 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 프라이머를 프로브에 어닐링시키고, IIS형 제한 부위의 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 함은, 측부 서열이 존재하거나 존재하지 않는 IIS형 제한 효소 인식 서열에 직접적으로 어닐링시키고, 이로써 IIS형 제한 부위의 이중 가닥의 인식 서열을 형성시킴으로 포함한다. 다른 한 실시양태에서, 헬퍼 프라이머를 프로브에 어닐링시키고, IIS형 제한 부위의 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 함은, 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열을 IIS형 제한 인식 서열의 서열 3'에 어닐링시키고, 프로브를 주형으로 이용하여, DNA 폴리머라제에 의해 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열을 신장시키며, 이로써 IIS형 제한 부위의 이중 가닥의 인식 서열을 형성시킴으로 포함한다.

일부 실시양태들에서, 프로브의 표적 상보적 부분이 표적 서열(들)의 유리 3' 말단(들)에 혼성화할 경우, 단계 (b)는 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 표적 서열(들)의 유리 3' 말단(들)을 신장시키고, 이로써 프로브 상의 다른 효소 작용 부분이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 되도록 함을 포함한다.

일부 실시양태들에서, 프로브의 효소 작용 부분이 제한 부위를 포함하는 경우, 단계 (c)는 제한 부위 상의 프로브의 반대측 가닥이 제한 효소에 의해 분해하고, 분해된 가닥의 3' 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 분해 및 신장을 반복하며, 이로써 SSEP DNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함한다. 다른 실시양태들에서, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, 프로브의 효소 작용 부분이 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 경우, 단계 (c)는 RNA 폴리머라제 프로모터에 대해 작용하는 RNA 폴리머라제에 의한 반복된 전사로써 SSEP RNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함한다.

일부 실시양태들에서, 프로브의 효소 작용 부분이 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함하는 경우, 단계 (c)는 제한 부위 상의 프로브의 반대측 가닥을 제한 효소에 의해 분해하고, 분해된 가닥의 3' 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 분해 및 신장을 반복하고, 이로써 SSEP DNA의 다수의 복사체들을 생산하며, RNA 폴리머라제 프로모터 상에 존재하는 RNA 폴리머라제에 의한 반복된 전사로써, SSEP RNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함한다. 다른 실시양태들에서, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, SSEP가 DNA 분자 또는 RNA 분자, 또는 DNA 및 RNA 분자인 경우, 단계 (d)는 SSEP를 유리 프로브의 서열 부분에 어닐링시키고, 유리 프로브를 주형으로 이용하여 SSEP의 3' 말단을 신장시키며, 이로써 프로브의 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함한다.

일부 실시양태들에서, SSEP가 RNA 분자인 경우, 단계 (d)는 SSEP를 유리 프로브의 서열 부분에 어닐링시키고, SSEP를 RNase H에 의해 분해시키며, 유리 프로브를 주형으로 이용하여 부분적으로 분해된 SSEP의 3' 말단을 신장시키며, 이로써 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함한다.

일부 실시양태들에서, 프로브가 원형 분자이고, SSEP RNA 또는 DNA의 서열이 프로브에 대해 상보적인 하나 또는 하나 초과의 서열 유닛을 포함하는 경우, 단계 (d)는 SSEP를 유리 프로브의 전체 또는 부분에 어닐링시키고, 이로써 효소 작용 부분이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함한다.

일부 실시양태들에서, 주형 부분이 안티센스 DNA 효소를 포함하고, 방법이 단일 가닥의 기능적 센스 DNA 효소의 다수의 복사체들을 생산하는 경우, 단일 가닥의 최종 생성물을 검출하는 단계 (f)는 반응에 RNA 또는 DNA-RNA 키메라 리포터 기질을 함유시키는 것을 포함하며, 여기에서 RNA 또는 DNA-RNA 키메라 리포터 기질은 센스 DNA 효소에 의해 리포터 기질을 절단하는 DNA 효소 절단 부위의 어느 한 측에 혼입된 형광 공진 에너지 전달 형광단을 포함하며, 이로써 리포터 기질의 절단은 형광 신호의 증가를 가져온다.

본 발명은 또한 관심 표적 핵산 서열 또는 다수의 표적 핵산 서열들을 검출하기 위한 키트로서, 한 세트 또는 다수 세트들의 프로브, 헬퍼 프라이머, 검출 기질, 제한 효소, RNA 폴리머라제, RNase H, DNA 폴리머라제, 완충액, dNTP, NTP, 다른 시약 및 지시사항을 포함하는 키트를 제공한다.

도 1은 각종 증폭 반복 주형(ART) 프로브의 예들의 다이어그램이다. 표적 서열이 표시된 바와 같이 나와 있고; 프로브의 각종 부분, 변형된 영역 및 헬퍼 프라이머는, 프로브의 첫 번째 수개의 다이어그램들에서 표시된 바와 같이 각종 도면들에 의해 나타내어지고, 이는 나머지 프로브 다이어그램들에서와 유사한 의미를 가지는 것으로 간주되어야 한다.

도 2는 CELA 반응의 예들의 다이어그램이다. 선형 프로브를 이용하는 CELA가 도 2A에 나와 있고, 원형 프로브를 이용하는 CELA가 도 2B에 나와 있다. 표적 핵산은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 혼성화된다. ART 프로브 상의 표적 가닥은 뉴클레아제에 의해 분해된다. 분해된 가닥은 DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 하류 효소 작용 부분이 존재하는 경우, 그것은 이중 가닥이 된다. 후속하는 반복된 중합에 이어서, SSEP의 다수의 복사체들이 생산되며, 이는 이어서, 유리 ART 프로브에 어닐링하며, 새 중합을 프라이밍하며, 새 SSEP를 생산한다. 이어서, 수득되는 최종 생성물, 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥의 SSEP 및 PPi에 대해 검출을 행한다.

도 3은 각종 증폭 반복 주형(ART) 프로브의 예들의 다이어그램이다. 프로브의 각종 부분들 및 표적 RNA 서열이 표시된 바와 같이 나타난다.

도 4는 CELA 반응의 예들의 다이어그램이다. 선형 프로브를 이용하는 CELA가 도 4A에 나와 있고, 원형 프로브를 이용하는 CELA가 도 4B에 나와 있다. 표적 RNA 서열은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 혼성화된다. 이중 가닥의 RNA/DNA 혼성체 상의 RNA 가닥은 RNase H에 의해 부분적으로 분해된다. 부분적으로 분해된 가닥은 DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 하류 효소 작용 부분이 있는 경우, 그것은 이중 가닥이 된다. 후속하는 반복된 중합에 이어서, SSEP의 다수의 복사체가 생산되며, 이는 이어서 유리 ART 프로브에 어닐링하고, 새 중합을 프라이밍하며, 새 SSEP를 생산한다. 이어서, 수득되는 최종 생성물, 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥의 SSEP 및 PPi에 대해 검출을 행한다.

도 5는 각종 ART 프로브들의 예들의 다이어그램이다. ART 프로브는 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함한다.

도 6은 CELA 반응의 예들의 다이어그램이다. 선형 프로브를 이용하는 CELA가 도 6A에 나와 있고, 원형 프로브를 이용하는 CELA가 도 6B에 나와 있다. 표적 RNA 또는 DNA 서열은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 혼성화되고; ART 프로브는 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함한다. 이중 가닥의 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 혼성체 상의 표적 가닥은 효소적 분해에 의해 분해된다. DNA 폴리머라제는 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킨다. 일단 프로모터 서열이 이중 가닥이 되면, RNA 폴리머라제가 프로모터에 대해 작용하여, RNA 전사체, 즉 SSEP RNA 서열의 다수의 복사체들을 생산하고, 이는 이어서 유리 ART 프로브에 어닐링하고, 새 중합을 프라이밍하며, 새 SSEP를 생산한다. 이어서, 수득되는 최종 생성물, 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥의 SSEP 및 PPi에 대해 검출을 행한다.

도 7은 ART 프로브의 예들의 다이어그램이다. ART 프로브는 효소 작용 부분들 중 하나인 IIS형 제한 부위를 포함한다.

도 8은 SNP의 유전자형 분석을 위한 CELA 반응의 예들의 다이어그램이다. 선형 프로브를 이용하는 CELA가 도 8A에 나와 있고, 원형 프로브를 이용하는 CELA가 도 8B에 나와 있다. 표적 RNA 또는 DNA 서열은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 대립유전자-특이적으로 혼성화되고, 한편 헬퍼-프라이머는 ART 프로브, 및 ART 프로브의 혼성화 영역에 인접하는 표적 영역의 양자 모두에 어닐링된다. 도 8A에서, ART 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 헬퍼-프라이머의 3' 말단이 신장되며, 이에 따라 이중 가닥의 기능적 IIS형 제한 인식 부위가 생성된다. 도 8B에서, 이중 가닥의 기능적 IIS형 제한 인식 부위가 헬퍼 프라이머 및 ART 프로브 간의 혼성화에 의해 생성된다. ART 프로브의 이중 가닥의 표적 상보적 부분 상의 표적 가닥이 IIS형 제한 효소에 의해 분해되고 (예를 들어, Fok I), 한편 ART 프로브 가닥은 변형된 뉴클레오티드로 인해 절단에 대해 내성을 가진다. 분해된 가닥의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장된다. 후속하는 반복된 분해 및 신장을 통해, SSEP의 다수의 복사체가 생산되고, 이는 이어서 유리 ART 프로브에 어닐링하고, 새 중합을 프라이밍하며, 새 SSEP를 생산한다. 이어서, 수득되는 최종 생성물, 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥의 SSEP 및 PPi에 대해 검출을 행한다.

도 9는 검출 방법의 예를 나타낸다.

도 10은 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)의 DNA 효소 매개 검출의 한 예의 다이어그램이다. ART 프로브의 주형 부분은 DNA 효소, 예를 들어 10-23 DNA 효소의 상보적 (안티센스) 서열을 포함한다. CELA 반응 동안, DNA 효소의 활성 (센스) 복사체를 포함하는 SSEP가 생성된다. DNA 효소는, DNA 효소 절단 부위의 어느 한 측에 혼입된 형광 공진 에너지 전달 형광단을 포함하는 RNA 또는 DNA-RNA 키메라 리포터 기질에 결합한다. 이 리포터 기질의 절단은 표적 개시된 단일 가닥의 SSEP의 성공적인 증폭을 가리키는 형광의 증가를 가져온다.

도 11은 ART 프로브 서열, 그것의 표적 서열 베타-악틴 유전자, 및 반응 최종 생성물의 구조를 나타내는 다이어그램이고; 그 상세 내용이 실시예 1에 나와있다. 이탤릭체 염기는 HincII 및 NaeI 인식 부위이고, 밑줄친 염기는 주형 서열이다. "s"는 포스포로티오에이트 연결기를 나타낸다.

도 12는 실시예 1의 반응 생성물의 겔 전기영동의 결과이다.

도 13은 Fok I 부위를 포함하는 ART 프로브 서열, 헬퍼 프라이머 서열 및 표적 서열을 나타내는 다이어그램이고; 그 상세 내용이 실시예 2에 나와있다.

도 14는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 ART 프로브 서열, 및 그것의 표적 서열을 나타내는 다이어그램이고; 그 상세 내용이 실시예 3에 나와있다.

도 15는 원형 ART 프로브 서열, 헬퍼 프라이머 서열 및 표적 서열을 나타내는 다이어그램이고; 그 상세 내용이 실시예 4에 나와있다.

각종 프로브들의 예가 도 1, 3, 5, 7, 11, 13, 14 및 15에 나와 있다. 그것들은 제한적으로 간주되어져서는 안되며, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않는 한, 어떠한 변형도 가해질 수 있다.

본 발명의 방법의 한 예가 이하에 나와 있다 (도 2).

선형 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 2A에 나와 있고, 원형의 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 2B에 나와 있다. 표적 핵산은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 혼성화된다. 효소 작용 부분은 표적 상보적 부분에 위치한다. 효소 작용 부분은 이중 가닥일 경우, 프로브의 반대측 가닥을 분해하는 것을 보조하는 임의의 뉴클레아제 분해 부위일 수 있다. 이 예에서, 뉴클레아제 분해 부위는 제한 부위이고, 변형될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 분해 부위는 프로브 상의 뉴클레오티드 변형이 필요하지 않은 틈내기(nicking) 제한 효소 부위이다. ART 프로브 상의 표적 가닥은 제한 효소에 의해 분해된다. 분해된 가닥의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장되고, 이에 따라 하류 효소 작용 부분이 있는 경우, 그것은 이중 가닥이 된다. 분해 및 신장이 다수회 반복되고; 그 공정은 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)의 다수의 복사체들을 생산한다. 프로브가 선형 분자인, 도 2A에 나와 있는 반응의 예에서, SSEP는 프로브의 표적 상보적 부분 서열의 부분 및 5' 주형 부분 서열을 포함하는 프로브의 제한 부위의 서열 5'에 대해 상보적이다. 프로브의 3' 주형 부분 및 5' 주형 부분이 동일하거나 거의 동일한 서열을 포함하기 때문에, SSEP의 3' 말단은 3' 주형 부분에 대해 상보적이다. SSEP는 유리 프로브의 3' 주형 부분에 어닐링하여, DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 반복된 분해 및 신장을 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. 프로브가 원형 분자인 도 2B에 나와 있는 반응의 예에서, SSEP는 ART 프로브의 전체 서열에 대해 상보적이다. SSEP는 유리 ART 프로브에 전부 또는 부분적으로 어닐링하여, DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 반복된 분해 및 신장을 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. SSEP의 3' 말단 또는 분해된 가닥의 3' 말단의 신장이, 가닥 치환 활성을 가지거나 다른 가닥 치환 인자들을 포함하는 DNA 폴리머라제에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 이어서, 수득되는 최종 생성물, 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드, SSEP 및 PPi에 대해 검출을 행한다.

모든 시약들이 단일 관 안에 있기 때문에, 상기 모든 단계들은 동시에 일어날 수 있고, 그 단계들 간에 분명한 경계가 없다. SSEP에 혼성화되지 않은 유리 ART가 있는 한, 증폭이 지수적으로 유지된다. 일단 모든 ART들이 SSEP에 혼성화하면, 증폭은 선형일 수 있다. 반응은 표지 및 검출될 수 있는 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥의 SSEP 및 PPi를 축적시킬 것이다.

본 발명의 방법의 다른 한 예가 이하에 나와 있다 (도 4).

선형 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 4A에 나와 있고, 원형의 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 4B에 나와 있다. 표적 RNA 서열은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 혼성화된다. 이 예에서, 프로브의 표적 상보적 부분은 또한 효소 작용 부분-RNase H 분해 부위이다. 표적 상보적 부분의 3' 부분은 포스포로티오에이트 연결기를 포함할 수 있는 리보뉴클레오티드에 의해 생성된다. 이중 가닥의 RNA/DNA 혼성체 상의 표적 RNA 가닥은 RNase H에 의해 분해되고, 반면 이중 가닥의 RNA/RNA 혼성체 상의 표적 RNA 가닥은 RNase H 분해에 대해 내성을 가진다. 부분적으로 분해된 표적 RNA 가닥의 3' 말단이 DNA 폴리머라제에 의해 신장되고, 이에 따라 하류 효소 작용 부분이 있는 경우, 그것은 이중 가닥이 된다. 이 예에서, 하류 효소 작용 부분은 RNA 폴리머라제 프로모터 또는 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 하류 효소 작용 부분이 제한 효소 부위인 경우, 반응의 다음 단계들은 첫 번째 예 (도 2)에 기재된 바와 동일하다. 하류 효소 작용 부분이 RNA 폴리머라제 프로모터인 경우, 반응의 다음 단계들은 다음 예 (도 6)에 기재된 것들과 동일하다.

본 발명의 방법의 다른 한 예가 이하에 나와 있다 (도 6).

선형 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 6A에 나와 있고, 원형의 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 6B에 나와 있다. ART 프로브의 효소 작용 부분들 중 하나는 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. 표적 RNA 또는 DNA 서열은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 혼성화된다. ART 프로브의 이중 가닥의 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 혼성체 상의 표적 가닥은 제한 효소 또는 RNase H일 수 있는 뉴클레아제에 의해 분해된다. 분해된 가닥 또는 부분적으로 분해된 가닥의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 하류 효소 작용 부분, RNA 폴리머라제 프로모터가 이중 가닥 형태 및 완전 기능적으로 된다. RNA 폴리머라제는 프로모터에 대해 작용하고, RNA 전사체, 즉 SSEP RNA 서열의 다수의 복사체들을 생산한다. 도 6A에서, 프로브는 선형 분자이고, SSEP RNA는 프로브의 5' 주형 부분 서열에 대해 상보적이다. 프로브의 3' 주형 부분 및 5' 주형 부분은 동일하거나 거의 동일한 서열을 포함하기 때문에, SSEP의 3' 말단이 3' 주형 부분에 대해 상보적이다. SSEP는 유리 프로브의 3' 주형 부분에 어닐링하여, DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 SSEP RNA의 반복된 전사를 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. 도 2B에서, 프로브는 원형 분자이고; SSEP는 각기 ART 프로브의 전체 서열에 대해 상보적인 하나 이상의 서열 유닛을 포함할 수 있다. SSEP RNA는 전부 또는 부분적으로 유리 ART 프로브에 어닐링하고, SSEP의 3' 말단이 DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 SSEP RNA의 반복된 전사를 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. 대안적으로, SSEP RNA는 전부 또는 부분적으로 유리 ART 프로브에 어닐링하고, 이어서 RNase H에 의해 부분적으로 분해되며, 부분적으로 분해된 SSEP의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 SSEP RNA의 반복된 전사를 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. 선형 또는 원형의 ART 프로브가 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터를 모두 포함하고, 반응이 상응하는 제한 효소 및 RNA 폴리머라제를 포함하는 경우, 반응은 SSEP RNA 및 SSEP DNA를 생성시키며, 이는 이어서 반복된 신장 및 분해, 및 반복된 전사를 촉발할 수 있다. SSEP의 3' 말단 또는 분해된 가닥의 3' 말단의 신장은 가닥 치환 활성을 가지거나 다른 가닥 치환 인자들을 포함하는 DNA 폴리머라제에 의해 수행되는 것이 바람직하다. RNase H 작용 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자를 모두 포함하고, 반응이 상응하는 RNase H 및 RNA 폴리머라제를 포함하는 원형 ART 프로브의 경우, ART 프로브의 전체 서열에 대해 상보적인 하나 이상의 서열 유닛을 포함하는 SSEP RNA는 전부 또는 부분적으로 유리 ART 프로브에 어닐링한 후, RNase H에 의해 부분적으로 분해되며, 부분적으로 분해된 SSEP의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장된다. DNA 폴리머라제가 가닥 치환 활성을 가지는 경우, 원형 프로브를 주형으로 사용하는 신장 및 가닥 치환은 각기 프로브의 전체 서열에 대해 상보적인 다수의 서열 유닛을 포함하는 긴 단일 가닥의 최종 생성물을 생성시킬 수 있다. 긴 단일 가닥의 최종 생성물은 유리 프로브에 어닐링하고, 이에 따라 SSEP RNA의 반복된 전사를 촉발하는 이중 가닥의 RNA 폴리머라제 프로모터가 형성될 수 있다. 이어서, SSEP RNA는 유리 ART 프로브에 어닐링하고, 가닥 신장, 치환 및 전사를 추가로 촉발한다. 이어서, 수득되는 최종 생성물, 즉 이중 가닥의 최종 생성물, 단일 가닥의 최종 생성물 및 PPi에 대해 검출을 행한다.

본 발명의 방법의 다른 한 예가 하기에 나와 있다 (도 8).

선형 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 8A에 나와 있고, 원형 프로브를 이용하는 CELA 반응이 도 8B에 나와 있다. ART 프로브는 표적 상보적 부분의 3' 측 (도 8A) 또는 표적 상보적 부분의 5'측 (도 8B)의 인식 부위 및 표적 상보적 부분의 그것의 절단 부위를 갖는 IIS형 제한 부위를 포함한다. IIS형 제한 효소의 절단 부위는 표적 가닥의 3' SNP 뉴클레오티드에 상응하고, 반면 프로브 상의 절단 부위가 변형되고 절단에 대해 내성을 가진다. 좌측의 ART 프로브는 대립유전자 1의 서열에 매칭하는 표적 상보적 부분을 포함하고; 우측편의 ART 프로브는 대립유전자 2의 서열에 매칭하는 표적 상보적 부분을 포함한다 (도 8A). 표적 RNA 또는 DNA 서열은 ART 프로브의 표적 상보적 부분에 대립유전자-특이적으로 혼성화되고, 한편 헬퍼-프라이머는 ART 프로브 및 표적 서열의 양자 모두에 어닐링한다. 헬퍼 프라이머에 혼성화된 표적 영역은 ART 프로브에 혼성화된 표적 영역에 인접하거나 실질적으로 인접한다. IIS형 제한 부위의 서열 3'에 혼성화하는 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열 (도 8A)은 짧고, 2 내지 15개 뉴클레오티드, 바람직하게 3 내지 10개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 4 내지 8개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 도 8A에서, ART 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 헬퍼-프라이머의 3' 말단이 신장되며, 이에 따라 이중 가닥의 기능적 IIS형 제한 인식 부위가 생성된다. 도 8B에서, 이중 가닥의 기능적 IIS형 제한 인식 부위가 헬퍼 프라이머 및 ART 프로브 간의 혼성화에 의해 생성된다. ART 프로브의 이중 가닥의 표적 상보적 부분 상의 표적 가닥은 IIS형 제한 효소 (예를 들어, Fok I)에 의해 분해되고, 한편 ART 프로브 가닥은 변형된 뉴클레오티드로 인해 절단에 대해 내성을 가진다. 분해된 가닥의 3' 말단은 ART 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장된다. 분해 및 신장은 다수회 반복되며, 이에 따라 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)의 다수의 복사체들을 생산한다. 도 8A에서, 프로브가 선형 분자이고, SSEP가 프로브의 표적 상보적 부분 서열의 부분 및 5' 주형 부분 서열을 포함하는, 프로브의 제한 분해 부위의 서열 5'에 대해 상보적이다. 프로브의 3' 주형 부분 및 5' 주형 부분이 동일하거나 거의 동일한 서열을 포함하기 때문에, SSEP의 3' 말단이 3' 주형 부분에 대해 상보적이다. SSEP는 유리 프로브의 3' 주형 부분에 어닐링하고, DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 반복된 분해 및 신장을 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. 도 8B에서, 프로브는 원형 분자이고, SSEP는 ART 프로브의 전체 서열에 대해 상보적이다. SSEP는 전부 또는 부분적으로 유리 ART 프로브에 어닐링하고, DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 반복된 분해 및 신장을 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. SSEP의 3' 말단 또는 분해된 가닥의 3' 말단의 신장이 가닥 치환 활성을 가지거나 다른 가닥 치환 인자들을 포함하는 DNA 폴리머라제에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 대립유전자-특이적 ART 프로브가 상이한 주형 부분을 포함하기 때문에, 대립유전자-특이적 ART 프로브에 의해 생산된 SSEP는 상이하며, 검출 방법에 의해 분별될 수 있다. 한 바람직한 검출 방법은 다음 예에서 기술되는 SSEP DNA 효소의 사용이다.

단일 가닥의 최종 생성물-SSEP의 DNA 효소 매개 검출을 위한 본 발명의 방법의 한 예가 하기에 나와 있다 (도 10).

ART 프로브의 주형 부분은 DNA 효소, 예를 들어 10-23 DNA 효소의 상보적 (안티센스) 서열을 포함한다. CELA 반응 동안, DNA 효소의 활성 (센스) 복사체를 포함하는 SSEP가 생성된다. DNA 효소는 DNA 효소 절단 부위의 어느 한 측에 혼입된 형광 공진 에너지 전달 형광단을 포함하는 RNA 또는 DNA-RNA 키메라 리포터 기질에 결합한다. 이 리포터 기질의 절단은 SSEP의 성공적인 증폭을 가리키는 형광의 증가를 가져온다.

I. 물질

A. 표적 서열

ART 프로브 및 헬퍼 프라이머에 대한 혼성화, 및 증폭 및 검출의 개시의 목적인 표적 서열은 임의의 핵산일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 발병 미생물 DNA, 임의의 바이러스 DNA, RNA 등일 수 있다. 표적 서열은 또한 화학적 시약, 각종 효소 및 물리적 노출에 의해 처리된 DNA, RNA일 수도 있다.

B. 증폭 반복 주형(ART) 프로브

증폭 반복 주형(ART) 프로브는 일반적으로 20 내지 2000개 뉴클레오티드, 바람직하게 약 30 내지 300개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 약 40 내지 150개 뉴클레오티드를 포함하는, 단일 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 선형 또는 원형의 핵산 분자이다. ART 프로브의 부분은 조합된 지수 및 선형 증폭(CELA)에 유용한 ART를 생성시키는 특이적 기능을 가진다. ART 프로브는 3' 말단 블록 부분이 존재하거나 존재하지 않는, 표적 상보적 부분, 주형 부분, 효소 작용 부분을 포함할 수 있다. ART 프로브는 프로브의 일부 부분을 이중 가닥으로 만드는 헬퍼 프라이머를 포함할 수 있다. ART 프로브는 안티센스 DNA 효소 또는 안티센스 RNA 효소를 포함할 수 있다. ART 프로브는 모든 부분들을 포함하지 않을 수 있고, 부가적 부분들을 포함할 수 있다.

1. 표적 상보적 부분

프로브의 표적 상보적 부분은 표적 상보적 부분 및 표적 서열 간의 특이적이고 안정한 혼성화를 보조하는 임의의 길이일 수 있다. 이 목적을 위해, 표적 상보적 부분에 있어 9 내지 90개 뉴클레오티드의 길이가 바람직하고, 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이가 가장 바람직하다.

프로브의 표적 상보적 부분은 관심 표적 영역에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적이다. 선택된 관심 표적 영역은, SNP 부위, 돌연변이 서열, 메틸화 부위, 스플라이싱 부위, 제한 부위, 및 임의의 특별한 관심 서열을 포함할 수 있는 임의의 바람직한 서열일 수 있다.

프로브의 표적 상보적 부분은 표적 및 프로브 간의 특이적 혼성화 후에 이중 가닥이 된다. 프로브의 표적 상보적 부분은 관심 표적 영역에 특이적 혼성화되고, 이로써 상기 프로브의 효소 작용 부분(들) 중 하나 또는 하나 초과 또는 일부가 부분적으로 또는 완전히 기능적이 된다. 일부 실시양태들에서, 프로브의 표적 상보적 부분에 혼성화하는 표적 영역은 프로브의 효소 작용 부분에 작용하는 분해제에 의해 분해되거나 틈이 생기게 된다. 다른 한 실시양태에서, 프로브의 표적 상보적 부분은 표적 서열(들)의 유리 3' 말단(들)에 혼성화하며, 이는 상기 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장되고, 이로써 프로브 상의 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 된다.

2. 효소 작용 부분

ART 프로브는 하나 이상의 효소 작용 부분을 포함한다. 효소 작용 부분은 일반적으로 하기 성질들을 가진다: (a) 그것이 단일 가닥일 경우, 주로 비기능적이고, 이중 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 경우, 전부 또는 부분적으로 기능적으로 된다; (b) 그것이 핵산 중복 부위, 예를 들어 RNase H 분해 부위의 하나의 가닥의 분해를 보조하거나, 예를 들어 제한 효소 부위의 반복된 분해 및 신장을 보조하거나, 예를 들어 RNA 폴리머라제 프로모터의 반복된 중합을 보조한다. ART 프로브는 주로 반복된 분해 및 신장을 보조하는 하나 이상의 효소 작용 부분을 포함하는 것을 필요로 하거나, 분해를 보조하는 하나의 효소 작용 부분, 및 반복된 중합을 보조하는 다른 한 효소 작용 부분을 포함하는 것을 필요로 할 수 있다. 효소 작용 부분은, 비제한적으로 제한 효소 부위, RNase H 분해 부위, 다른 뉴클레아제 분해 부위, 및 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 효소 작용 부분은 RNase H 작용 서열 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 조합, 또는 RNase H 작용 서열 및 뉴클레아제 분해 부위의 조합, 또는 뉴클레아제 분해 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 조합, 또는 하나 초과의 뉴클레아제 분해 부위들의 조합을 포함할 수 있다. 효소 작용 부분은 언급된 효소, 또는 유사한 활성을 갖는 다른 효소를 위한 서열들의 임의의 다른 조합을 포함할 수 있다.

효소 작용 부분은, 예를 들어 표적 상보적 부분 내에, 또는 표적 상보적 부분의 한 측에, 또는 주형 부분 상에서 프로브의 임의의 부위에 위치할 수 있다.

효소 작용 부분이 뉴클레아제 분해 부위를 포함하는 경우, 프로브의 뉴클레아제 분해 부위 상의 뉴클레오티드는 프로브가 뉴클레아제 분해에 대해 내성이 되고, 반면 프로브의 반대측 가닥은 분해에 대해 민감하도록 변형될 수 있다. 하기 뉴클레오티드가 뉴클레아제 절단에 대해 내성을 갖도록, 뉴클레오티드의 변형을 위한 임의의 수단, 예를 들어 뉴클레오티드들, 메틸화된 뉴클레오티드들 간의 포스포로티오에이트 연결기를 사용할 수 있다. 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드가 바람직하다. 대안적으로, 효소 작용 부분이 손상 제한 효소 부위, 예를 들어 N. Bpu1OI 부위, N. BstSE 부위를 포함하는 경우, 프로브 서열 상의 뉴클레오티드 변형이 필요하지 않다.

일부 실시양태들에서, 효소 작용 부분은 제한 부위(들)를 포함한다(도 1 및 2). 제한 부위는 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위를 가진다. ART 프로브 상의 제한 절단 부위는 프로브가 뉴클레아제 분해에 대해 내성을 가지도록 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. ART 프로브는 표적 상보적 부분 내에, 또는 표적 상보적 부분의 어느 한 측에 위치할 수 있는 하나 또는 하나 초과의 제한 부위를 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, ART 프로브는 효소 작용 부분들 중 하나로서 IIS형 제한 효소 부위를 포함한다 (도 1D, 1E, 1J, 1K, 1L 및 도 7). IIS형 효소가 제한 인식 부위에서 수개의 염기들을 절단 제거하기 때문에, 절단 부위는 프로브의 표적 상보적 부분에 위치할 수 있거나 위치하는 것이 바람직하다. 프로브의 표적 상보적 부분의 절단 부위 상의 뉴클레오티드(들)는 프로브의 절단을 막기 위해 변형된다. SNP 유전자형 분석을 위해, 표적 분자 상의 분해 부위는 또한 SNP 또는 돌연변이 부위인 것이 바람직하고, 바람직하게 IIS형 제한 효소가 SNP 뉴클레오티드 또는 돌연변이 뉴클레오티드의 3'에서 절단한다. 뉴클레오티드 메틸화의 검출을 위해, 표적 분자 상의 분해 부위가 또한 메틸화 부위인 것이 바람직하다.

기능적으로 되기 위해, 프로브의 IIS형 제한 부위는 그것의 인식 및 절단 부위의 양자 모두에 있어 이중 가닥의 형태로 전환되어야 한다. CELA 반응의 초기에, 표적은 프로브에 대한 특이적 혼성화를 통해 증폭을 개시한다. 이 혼성화는 IIS형 제한 효소를 위한 이중 가닥의 절단 부위를 생성한다.

반응의 동일 단계에서, IIS형 제한 인식 부위는 하기 방식을 통해 이중 가닥으로 된다. 첫 번째로, IIS형 제한 인식 서열은 헬퍼 프라이머에 혼성화되며 (도 1D, 1E, 1J, 1K, 1L, 도 7A, 7C, 7D, 7F, 7G, 7H, 7I, 7J), 이에 따라 이중 가닥으로 된다. 두 번째로, 헬퍼 프라이머의 표적 상보적 서열은 ART 프로브의 혼성화 영역에 인접하는 표적 영역에 혼성화하고 (도 7B, 7E), 한편 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열은 IIS형 제한 인식 부위의 서열 3'에 결합한다. 헬퍼 프라이머의 3' 말단은 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 기능적 이중 가닥의 IIS형 제한 인식 부위가 형성된다.

일부 실시양태들에서, 표적 서열이 RNA인 경우, CELA 반응의 초기에, 표적 RNA는 프로브에 대한 특이적 혼성화를 통해 증폭을 개시한다 (도 3, 4). 이 혼성화는 이중 가닥 특이적 리보뉴클레아제에 대한 이중 가닥의 기능적 효소 작용 부분 서열을 생성시킨다. 예를 들어, RNA/DNA 중복 부위 상의 표적 RNA 서열은 각종 비특이적 부위들에서의 RNase H에 의해 분해될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 상보적 부분의 일부 (바람직하게는 3' 부분 서열)는 RNA에 의해 생성될 수 있다 (도 3D, 3E, 3F). ART 프로브의 표적 상보적 부분 및 표적 RNA 서열 간의 혼성화는 RNA/DNA 혼성체를 갖는 부분, 및 RNA/RNA 혼성체를 갖는 부분을 형성한다. RNA/RNA 혼성체 상의 표적 RNA는 RNase H 절단에 대해 내성을 가지고, 이에 따라 표적 RNA는 RNase H에 의해 완전히 분해 제거되지 않는다. 이 방법은RNA 서열의 부분을 비변형 상태로 유지시키고, 이로써 분해된 RNA의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하다. ART 프로브 상의 RNA 부분은 어떠한 뉴클레아제에 의해서도 분해되지 않도록 변형되는 것도 또한 바람직하다. 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결기를 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, 효소 작용 부분들 중 하나는 RNA 폴리머라제 프로모터 서열이다 (도 5, 6). RNA 폴리머라제 프로모터는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 서열, 및 주형 부분 및 프로모터의 서열 사이에 위치하는 전사 개시 영역을 포함한다. 프로모터는 임의의 적당한 RNA 폴리머라제를 위한 프로모터일 수 있다. RNA 폴리머라제의 예는 E. 콜라이(E. coli) 및 박테리오파지 T7, T3 및 SP6으로부터의 폴리머라제이다. 바람직하게, RNA 폴리머라제는 박테리오파지-유래의 RNA 폴리머라제, 특히 T7 폴리머라제이다. 프로모터 서열은 일반적으로 특이적 RNA 폴리머라제에 의해 인식되기 때문에, ART 프로브의 프로모터 부분을 위한 동족 폴리머라제가 전사적 증폭을 위해 사용되어져야 한다. 프로모터 서열은 프로브 내의 임의의 부위에 위치할 수 있다. 프로브가 선형인 경우, 프로모터가 표적 상보적 부분에 바로 인접하고, ART 프로브의 5' 말단으로의 전사를 촉진하도록 배향되는 것이 바람직하다.

3. 주형 부분

ART 프로브는 하나 이상의 주형 부분을 포함한다. ART 프로브가 선형 분자인 경우, 동일하거나 거의 동일한 서열을 포함하는 2개의 주형 부분이 바람직하다. ART 프로브가 원형 분자인 경우, 전체 ART 프로브가 주형으로 작용하고, 이로써 ART 프로브는 하나의 주형 및 그 주형 내에 삽입되는 다른 기능적 부분을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 주형 부분은 임의의 원하는 길이를 가질 수 있다. 주형 부분은 SSEP의 다수의 복사체들을 형성시키기 위한 주형으로서, 또한 SSEP 결합을 위한 주형으로서 작용한다. 이 목적을 위해, 주형 부분을 위한 6 내지 300개의 뉴클레오티드의 길이가 바람직하고, 15 내지 150개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 주형 부분이 가장 바람직하다. 주형 부분은 임의의 원하는 서열을 가질 수 있다. 일반적으로, 주형 부분의 서열은, 그것이 핵산 샘플 내의 임의의 서열에 대해서도, 또한 CELA 반응에서 다른 ART 프로브의 임의의 서열에 대해서도 상당히 유사하지 않도록 선택될 수 있다.

일부 실시양태들에서, 주형 부분은 표적 상보적 부분과 중첩될 수 있다 (도 1F, 도 3C, 3D, 도 5B, 5C). 일반적으로, 주형 부분들 사이의 선형 프로브에 있어서, RNA 폴리머라제 프로모터 또는 제한 부위를 포함할 수 있는 하나 이상의 효소 작용 부분이 있다. ART 프로브의 3' 영역에서의 주형 부분은 3' 주형 부분으로 칭해지고; ART 프로브의 5' 말단에서의 주형 부분은 5' 주형 부분으로 칭해진다. 5' 주형 부분은 ART 프로브의 가장 5' 말단인 부위에 위치한다. 3' 주형 부분은 예를 들어 표적 상보적 부분에 어느 한 측에 (도 1B, 1C, 1D, 1E, 1G), 또는 표적 상보적 부분 이내에서 (도 1F) 임의의 부위에 위치할 수 있다.

일부 실시양태들에서 (도 10, 도 11), DNA 효소가 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)을 검출하는데 사용되는 경우, ART 프로브는 활성 DNA 효소, 예를 들어 10-23 DNA 효소, 8-17 DNA 효소 또는 다른 DNA 효소에 대해 상보적인 촉매 활성 안티센스 DNA 효소 서열에서 포함된다. 프로브가 선형 분자인 경우, 안티센스 DNA 효소 서열은 바람직하게 주변 부분 서열이 존재하거나 존재하지 않는 주형 부분 또는 5' 주형 부분에 위치한다. 프로브가 원형 분자인 경우, 안티센스 DNA 효소 서열은 프로브의 임의의 부위에 존재할 수 있다. 일부 실시양태들에서, SSEP가 RNA 효소가 되도록 설계된 RNA 분자인 경우, ART 프로브는 프로브의 주형 부분에 안티센스 RNA 효소를 포함할 수 있다.

4. 3' 말단 블록 부분

ART 프로브가 그것의 3' 말단에서 블록킹기에 의해 블록킹되거나, 원형 분자이어서 (도 1H, 1I, 1J, 1K, 1L, 도 3F, 도 5E, 도 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7J) 폴리머라제에 의해 신장가능하지 않는 것이 바람직하다. ART 프로브의 3' 말단의 블록킹화는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 블록킹기는 핵산 폴리머라제에 의해 촉매되는 핵산 중합을 억제하도록 핵산에 첨가될 수 있는 화학적 부분기이다. 블록킹기는 전형적으로 뉴클레오티드 또는 그것의 유도체로 구성되는 ART의 말단부의 3' 말단에 위치한다. 블록킹기를 말단 3' OH에 결합시킴으로써, 3' OH기는 중합 반응에서 뉴클레오시드 트리포스페이트를 수용하기 위해 더 이상 유용하지 않다.

수많은 상이한 기들이 프로브 서열의 3' 말단을 블록킹하기 위해 첨가될 수 있다. 그러한 기의 예는 포스페이트기, 알킬기, 비뉴클레오티드 링커, 포스포로티오에이트, 알칸-디올 잔기, 펩티드 핵산, 및 3' OH 결여 뉴클레오티드 유도체 (예컨대, 코르디세핀)를 포함한다.

ART 프로브의 3' 말단은 또한, CELA 반응이 고체 지지체 상에 수행될 수 있도록 하기 위해, 고체 지지체, 예컨대 유리 슬라이드, 나일론막, 플라스틱 물질에 결합할 수 있다.

5. ART 프로브의 다른 부분기

특정 실시양태들에서, ART 프로브는 비연합 부분으로부터 표지와 연합된 생성물을 친화성 분리하도록 하는 프라이머의 내부에, 또는 5' 또는 3' 말단에 혼입된 하나 이상의 부분기를 포함할 수 있다. 바람직한 포획 부분기는 동족 리간드와 특이적으로 상호작용할 수 있는 부분기들이다. 예를 들어, 포획 부분기는 바이오틴, 디곡시게닌(digoxigenin) 등을 포함할 수 있다. 포획기의 다른 예들은 리간드, 수용체, 항체, 합텐, 효소, 항체나 앱타머에 의해 인식가능한 화학적 기를 포함한다. 포획 부분기는 임의의 원하는 기질 상에 고정화될 수 있다. 원하는 기질의 예는, 예컨대 입자, 비이드, 자기 비이드, 광학 트랩 비이드, 마이크로티터플레이트, 유리 슬라이드, 종이, 테스트 스트립, 겔, 기타 매트릭스, 니트로셀룰로스, 나일론을 포함한다. 예를 들어, 포획 부분기가 바이오틴인 경우, 기질은 스트렙트아비딘을 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, ART 프로브 또는 한 세트의 ART 프로브들은 고체 지지체 상에 결합하고, 바람직하게 ART 프로브의 3' 말단은 고체 지지체 상에 결합된다. 고체 지지체는 올리고뉴클레오티드가 커플링될 수 있는 임의의 고체 물질을 포함할 수 있다. 이는 아크릴아미드, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 유리, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리실리케이트, 폴리카르보네이트, 테플론, 플루오로카본, 나일론, 규소 고무, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리오르토에스테르, 폴리프로필피르머레이트, 콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 폴리아미노산과 같은 물질을 포함한다. 고체 상태의 기질은 얇은 필름 또는 막, 비이드, 병, 접시, 섬유, 직물 섬유, 형상화된 중합체, 입자 및 미세립자를 포함하는 임의의 유용한 형태를 가질 수 있다. 고체 지지체를 위한 바람직한 형태는 유리 슬라이드이다.

고체 상태의 기질 상에 고정화된 ART 프로브는 특이적 표적 분자의 포획, 및 고체 상태의 검출기 상의 증폭을 허용한다. 그러한 포획은 유전자 발현 프로파일링 및 다수의 표적의 검출을 위한 편리한 수단을 제공한다. 예를 들어, 다수의 상이한 표적 서열에 대해 특이적인 ART 프로브의 3' 말단은, 각기 상이한 점에서, 유리 슬라이드 상에 고정화될 수 있다. 표적 서열에 대해 특이적인 최종 생성물의 증폭은, 상응하는 표적 서열이 샘플에 존재하는 ART 프로브에 상응하는 그 점들에서만 일어날 것이다.

올리고뉴클레오티드의 고체 상태의 기질에의 고정화 방법이 잘 구축되어 있다. ART 프로브는 구축된 커플링 방법들을 이용하여 기질에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 적당한 결합 방법들이 [Pease 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (11):5022-5026 (1994), 및 Khrapko 등, Mol Biol (Mosk) (USSR) 25: 718-730 (1991)]에 기재되어 있다. 카제인-코팅 슬라이드 상의 3'-아민 올리고뉴클레오티드의 고정화 방법이, [Stimpson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383 (1995)]에 기재되어 있다. A preferred method of attaching 올리고뉴클레오티드를 고체 상태의 기질에 결합시키는 바람직한 방법이 [Guo 등, Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994)]에 기재되어 있다.

6. 헬퍼 프라이머

ART 프로브는 상기 프로브의 일부분에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적인 하나 이상의 부분을 포함하는 헬퍼 프라이머(들)를 포함할 수 있다 (도 1D, 1E, 1J, 1K, 1L, 도 7). 헬퍼 프라이머는 3' 말단 블록킹 부분기를 포함할 수 있고, 이로써 상기 헬퍼 프라이머의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하지 않다 (도 1J, 1K, 1L, 7A, 7G). 헬퍼 프라이머는 3' 말단 블록킹 부분기를 포함하지 않을 수 있고, 이로써 상기 헬퍼 프라이머의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하다 (도 7B).

헬퍼 프라이머는 측부 서열이 존재하거나 존재하지 않는 효소 작용 부분(들), 또는 프로브의 효소 작용 부분(들)의 일부에 대해 상보적인 서열을 포함할 수 있고, 이로써 상기 헬퍼 프라이머 및 상기 프로브 간의 혼성화는 효소 작용 부분(들)을 이중 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥이 되도록 한다 (도 1D, 1E, 1J, 1K, 1L, 7A, 7C, 7D, 7F, 7G, 7H, 7I, 7J). 프로브의 효소 작용 부분(들), 또는 효소 작용 부분(들)의 일부에 대해 상보적인 헬퍼 프라이머상의 서열은, 프로브 및 헬퍼 프라이머 간의 혼성화를 보조하고 효소 작용 부분(들)이 기능적이거나 부분적으로 기능적이 되도록 하는 임의의 길이일 수 있다.

헬퍼 프라이머는 신장가능하고, 프로브의 효소 작용 부분들 중 하나의 서열 3'에 대해 상보적인 3' 말단의 서열을 포함할 수 있다. 헬퍼 프라이머 및 프로브 간의 혼성화, 및 DNA 폴리머라제에 의한 상기 헬퍼 프라이머의 3' 말단의 신장은 효소 작용 부분이 이중 가닥 형태 및 완전 기능적 또는 부분 기능적이 되도록 한다 (도 7B, 7E). 프로브의 효소 작용 부분들 중 하나의 서열 3'에 대해 상보적인 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열은 2 내지 15개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 3 내지 10개 뉴클레오티드, 또는 더욱 바람직하게는 4 내지 8개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.

헬퍼 프라이머는 상기 프로브에 상보적인 표적 영역에 인접하거나 실질적으로 인접하는 표적 영역에 혼성화하는 하나 이상의 표적 상보적 부분을 추가로 포함할 수 있다 (도 1J, 1K, 7A-G). 헬퍼 프라이머의 표적 상보적 부분은 헬퍼 프라이머 및 표적 서열 간의 특이적이고 안정한 혼성화를 보조하는 임의의 길이일 수 있다. 이 목적을 위해, 헬퍼 프라이머의 표적 상보적 부분에 있어 9 내지 60개 뉴클레오티드의 길이가 바람직하고, 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이가 가장 바람직하다.

헬퍼 프라이머는 3' 및 5' 표적 상보적 부분을 모두 포함할 수 있다. ART 프로브에 대해 상보적인 표적 영역은 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역의 중간에 위치하고, 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역에 인접하거나 실질적으로 인접한다 (도 7H-J).

헬퍼 프라이머는 ART 프로브의 임의의 부분에 대해 상보적인 다른 서열을 포함할 수 있다 (도 1K, 1L). 헬퍼 프라이머는 ART 프로브의 임의의 부분에 대해 상보적이지 않을 수 있는 다른 서열을 포함할 수 있다 (도 7J).

헬퍼 프라이머는 ART 프로브 및(또는) 표적 서열에 효율적으로 혼성화하는 한, 임의의 길이를 가질 수 있다. 헬퍼 프라이머는 임의의 원하는 뉴클레오티드 변형을 포함할 수 있다.

C. 검출 표지

CELA를 이용하여 증폭된 핵산의 검출 및 정량화를 돕기 위해, 검출 표지가 증폭된 핵산에 직접적으로 혼입될 수 있거나, 검출 분자에 커플링될 수 있다. 본원에 사용되는 검출 표지는 증폭된 핵산과 직접 또는 간접적으로 연합될 수 있고, 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 초래하는 임의의 분자이다. 핵산으로의 혼입 또는 핵산 또는 항체 프로브에의 커플링을 위한 많은 상기 표지들이 당업자에게 공지되어 있다. CELA에 사용하기에 적당한 검출 표지의 예는 방사선활성의 동위원소, 형광 분자, 인광성 분자, 효소, 항체 및 리간드이다.

적당한 형광 표지의 예는 비제한적으로 플루오레신(FITC), 5,6-카르복시메틸 플루오레신, 텍사스 레드, 니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일(NBD), 쿠마린, 단실 클로라이드, 로다민, 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 및 시아닌 염료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7을 포함한다. 바람직한 형광 표지는 플루오레신 (5-카르복시플루오레신-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 및 로다민 (5,6-테트라메틸 로다민)이다. 조합의 다색 코딩을 위한 바람직한 형광 표지는 FITC 및 시아닌 염료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7이다. 이 플루오르에 대한 각각의 흡수 및 방출 최대값은 FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm; 568 nm), Cy3.5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm: 672 nm), Cy5.5 (682 nm; 703 nm) 및 Cy7 (755 nm; 778 nm)이고, 이는 그것의 자동적 검출을 허용한다. 형광 표지는 [Molecular Molecule Probes, Eugene, Oreg. 및 Research Organics, 미국 오하이오주 클레브랜드 소재]를 비롯한 다양한 상업 출처들로부터 수득될 수 있다.

표지 뉴클레오티드는, 합성 동안에 CELA의 생성물로 직접적으로 혼입될 수 있기 때문에, 바람직한 형태의 검출 표지이다. 증폭된 DNA 또는 RNA에 혼입될 수 있는 검출 표지의 예는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 BrdUrd (Hoy 및 Schimke, Mutation Research 290: 217-230 (1993)), BrUTP (Wansick 등, J. Cell Biology 122:283-293 (1993)), 및 바이오틴으로 변형된 뉴클레오티드 (Langer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633 (1981))이나, 디옥시게닌과 같은 적당한 합탄으로 변형된 뉴클레오티드 (Kerlhof, Anal. BioChem. 205:359-364 (1992))를 포함한다. 적당한 형광-표지 뉴클레오티드는 플루오레신-이소티오시아네이트-dUTP, 시아닌-3-dUTP 및 시아닌-5-dUTP이다 (Yu 등, Nucleic Acids Res., 22:3226-3232(1994))이다. DNA를 위한 바람직한 뉴클레오티드 유사 검출 표지는 BrdUrd (BUDR 트리포스페이트, 시그마(Sigma))이고, RNA를 위한 바람직한 뉴클레오티드 유사 검출 표지는 바이오틴-16-유리딘-5'-트리포스페이트(바이오틴-16-dUTP, 베링거 만하임(Boebringher Mannheim))이다. 플루오레신, Cy3 및 Cy5는 직접적 표지를 위해 dUTP에 연결될 수 있다. Cy3.5 및 Cy7은 아비딘, 또는 디곡시게닌 표지 프로브의 2차 검출을 위한 바이오틴- 또는 항-디곡시게닌 접합체로서 이용가능하다.

바이오틴과 같은 증폭된 핵산으로 혼입되는 검출 표지는, 후속하여 당업계에 공지된 감도있는 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 바이오틴은, 바이오틴에 결합된 후 적당한 기질 (예를 들어, 화학발광 기질 CSPD: 이나트륨, 3-(4-메톡시스피로-[1,2-디옥세탄-3-2'-(5'-클로로)트리클로로[3.3.1.1.sup.3,7]데칸]-4-일)페닐 포스페이트; 트로픽스 인코포레이션(Tropix, Inc.))의 화학발광에 의해 검출되는, 스트렙트아비딘-알칼리성 포스페이트 접합체(트로픽스 인코포레이션)를 이용하여 검출될 수 있다.

증폭된 RNA의 검출에 사용하기에 바람직한 검출 표지는 아크리디늄-에스테르-표지 DNA 표지(겐프로브 인코포레이션(GenProbe, Inc.), Arnold 등, Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989)에 기재된 바와 같음)이다. 아크리디늄-에스테르-표지 검출 프로브는, 비혼성화된 프로브가 알칼리에 의해 파괴될 수 있으므로 세척 없이 증폭된 RNA를 검출할 수 있도록 한다 (Arnold 등 (1989)).

이 검출 표지들 중 2개 이상을 조합하는 분자는 또한 검출 표지로 간주된다. 공지된 검출 표지들 중 임의의 것은 개시된 본 프로브, 택, 및 개시된 본 방법을 이용하여 증폭된 핵산의 표지 및 검출을 위한 방법을 이용하여 사용될 수 있다. 검출 표지에 의해 형성된 신호를 검출 및 측정하는 방법이 또한 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 방사성의 동위원소는 섬광 계측 또는 직접적 시각화에 의해 검출될 수 있고; 형광 분자는 형광 분광광도계로 검출될 수 있으며; 인광성 분자는 분광광도계로 검출되거나 카메라에 의해 직접적으로 시각화될 수 있고; 효소는 효소에 의해 촉매된 반응 생성물의 검출 또는 시각화에 의해 검출될 수 있으며; 항체는 항체에 커플링된 2차 검출 표지를 검출함으로써 검출될 수 있다. 그러한 방법은 증폭 및 검출의 개시된 본 방법에서 직접적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 검출 분자는 증폭된 핵산과 상호작용하고, 하나 이상의 검출 표지가 커플링된 분자이다.

D. 리포터 기질

리포터 기질 분자는 DNA 효소 절단 부위의 어느 한 측에 혼입된 형광 공진 에너지 전달 형광단를 포함하는RNA 또는 DNA-RNA 키메라일 수 있다 (Santoro 등, Biochemstry 1998, 37, 13330-13342). 임의의 형광단 및 임의의 켄쳐(quencher)이 임의의 원하는 부위에서 리포터 기질로 혼입될 수 있다. 한 예는, 리포터 6-카르복시플루오레신(RAM)이 5' 말단에서 혼입되고, 켄쳐 6-카르복시테트라메틸로다민(TAMRA) 또는 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산[다비실(DABCYL)]이 내부에 혼입되는 것이다. 3' 포스페이트기와 같은 임의의 블록킹 부분기가 3' 말단에 첨가되어, 반응 동안에 DNA 폴리머라제에 의한 신장을 막을 수 있다. 이 리포터 기질의 절단은 성공적인 증폭을 가리키는 형광의 증가를 가져온다.

E. DNA 폴리머라제

조합된 지수 및 선형 증폭(CELA)을 위해, DNA 폴리머라제가 주형 가닥에 상보적인 가닥을 치환 (일명, 가닥 치환)할 수 있고, 5'에서 3'으로의 엑소뉴클레아제 활성이 결여되는 것이 바람직하다. 가닥 치환은 100개 초과의 뉴클레오티드 또는 50개 초과의 뉴클레오티드일 수 있는 서열 길이를 갖는 SSEP의 다수의 복사체의 합성을 초래할 수 있다. 그러나, 3 내지 50개 뉴클레오티드 범위일 수 있는 짧은 SSEP의 생성을 위해, 가닥 치환이 필요하지 않을 수 있다. 5'에서 3'로의 엑소뉴클레아제 활성이 존재하는 경우, 합성된 가닥의 파괴를 초래할 수 있다. 개시된 본 방법에 사용하기 위한 DNA 폴리머라제가 매우 가공적인 것도 또한 바람직하다. 바람직한 DNA 폴리머라제는 박테리오파지. phi.29 DNA 폴리머라제 (U.S. 특허 제5,198,543호 및 제5,001,050호, Blanco 등), 파지 M2 DNA 폴리머라제 (Matsumoto 등, Gene 84:247 (1989)), 파지 .phi.PRD1 DNA 폴리머라제 (Jung 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8287 (1987)), VENT.RTM. DNA 폴리머라제 (Kong 등, J. Biol. Chem. 268:1965-1975 (1993)), DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편(Klenow fragment) (Jacobsen 등, Eur. J BioChem. 45:623-627 (1974)), T5 DNA 폴리머라제 (Chatterjee 등, Gene 97:13-19 (1991)), PRD1 DNA 폴리머라제 (Zhu 및 Ito, Biochim. Biophys. Acta. 1219:267-276 (1994)), 변형된 T7 DNA 폴리머라제 (Tabor 및 Richardson, J. Biol. Chem. 262:15330-15333 (1987); Tabor 및 Richardson, J. Biol. Chem. 264:6447-6458 (1989); 시쿼나제(Sequenase).TM. [U.S. 바이오케미칼즈(U.S. Biochemicals)], T4 DNA 폴리머라제 전효소 (Kaboord 및 Benkovic, Curr. Biol. 5:149-157(1995)), Bca 폴리머라제(Takara) 및 Bst 폴리머라제 (NEB)..phi.29 및 Bst DNA 폴리머라제가 가장 바람직하다.

가닥 치환은 가닥 치환 인자, 예컨대 헬리카제의 사용을 통해 용이해질 수 있다. 가닥 치환 인자의 존재 하에 가닥 치환을 수행할 수 있는 임의의 DNA 폴리머라제가, DNA 폴리머라제가 그러한 인자의 부재 하에서 가닥 치환을 수행하지 않을지라도, 개시된 본 방법에 사용하기에 적당한 것으로 간주된다. CELA에 유용한 가닥 치환 인자는 비제한적으로 BMRF1 폴리머라제 부속 서브유닛 (Tsurumi 등, J. Virology 67(12):7648-7653, (1993)), 아데노바이러스 DNA-결합 단백질 (Zijderveld 및 van der Vliet, J. Virology 68(2):1158-1164 (1994)), 단순포진 바이러스성 단백질 ICP8 (Boehmer 및 Lehman, J. Virology 67(2):711-715 (1993); Skaliter 및 Lehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22):10665-10669 (1994)), 단일 가닥의 DNA 결합 단백질 (SSB; Rigler 및 Romano, J. Biol. Chem. 270:8910-8919 (1995)), 및 송아지 흉선 헬리카제 (Siegel 등, J. Biol. Chem. 267:13629-13635 (1992))을 포함한다.

E. RNA 폴리머라제

생체외 전사를 수행할 수 있고, 프로모터 서열이 동정된 임의의 RNA 폴리머라제가 개시된 본 CELA 방법에 사용될 수 있다. 복잡한 요건이 없는 안정한 RNA 폴리머라제가 바람직하다. 가장 바람직한 것은 T7 RNA 폴리머라제 (Davanloo 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2035-2039 (1984)), 및 특별한 프로모터 서열 (Schenborn 및 Meirendorf, Nucleic Acids Research 13:6223-6236 (1985))에 대해 매우 특이적인 SP6 RNA 폴리머라제 (Butler 및 Chamberlin, J. Biol. Chem. 257:5772-5778 (1982))이다. 이 특성을 갖는 다른 RNA 폴리머라제도 또한 바람직하다. 프로모터 서열이 일반적으로 특이적 RNA 폴리머라제에 의해 인식되기 때문에, ART 프로브는 사용되는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열을 포함하여야 한다. 수많은 프로모터 서열들이 공지되어 있고, 동정된 프로모터 서열을 갖는 임의의 적당한 RNA 폴리머라제가 사용될 수 있다.

F. 제한 효소 및 리보뉴클레아제

개시된 본 방법은 이중 가닥 핵산의 하나의 가닥을 절단하기 위한 제한 효소 (제한 엔도뉴클레아제라고도 함)를 사용할 수 있다. 다른 핵산 절단제가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 핵산 절단제는 서열-특이적 방식으로 핵산 분자를 절단하는 것이다. 많은 제한 효소들이 공지되어 있고, 개시된 본 방법과 함께 사용될 수 있다. 제한 효소는 일반적으로 인식 서열 및 절단 부위를 가진다.

일부 실시양태들에서, 프로브에 혼성화된 표적 RNA의 분해는 리보뉴클레아제로 수행된다. 그러한 리보뉴클레아제는 이중 가닥의 RNA/DNA 혼성체 상에 발견되는 RNA 가닥을 분해한다. 본 발명의 수행에 유용한 그러한 리보뉴클레아제의 예는 RNase H이다. RNase H는 비서열-특이적 방식으로, DNA/RNA 혼성체 상에서 발견되는 RNA를 절단하는 RNA 특이적 분해 효소이다. 다른 리보뉴클레아제 및 효소는 Exo III 및 역전사효소와 같이, RNA/DNA 가닥으로부터의 RNA를 틈내기하거나 부분적으로 분해하기에 적당할 수 있다.

상기 기술된 물질들은 개시된 본 방법을 수행하는데 유용한 키트로서 임의의 적당한 조합으로 함께 포장될 수 있다.

II. 방법

본 발명은 조합된 지수 및 선형 증폭을 위해 특별히 설계된 프로브를 제공한다. 프로브는 선형 분자 또는 원형 분자 중 하나이다.

조합된 지수 및 선형 증폭(CELA)의 개시는 표적 서열, 및 헬퍼 프라이머를 포함하는 ART 프로브 간의 특이적 혼성화에 의존한다. 표적 서열을 갖는 DNA 또는 RNA 분자의 존재 하에서, ART 프로브의 표적 상보적 부분은 표적 서열에 혼성화하여, 이중 가닥이 되며, 이는 기능적 또는 부분 기능적인 효소 작용 부분 서열을 형성하며, 표적 서열이 DNA 폴리머라제에 의해 신장되거나, 분해제에 의해 분해되거나 부분적으로 분해된 후, 분해된 가닥의 3' 말단은 DNA 폴리머라제에 의해 신장되도록 하며, 이에 따라 다른 기능적 효소 작용 부분을 생성시킨다. 후속하는 반복된 중합은 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)의 다수의 복사체들을 형성시키고, 이는 이어서 유리 ART 프로브에 어닐링하여, 새 신장을 프라이밍하며, 새 SSEP를 생성시킨다.

선형의 증폭은 개별적 ART 프로브가 SSEP의 다수의 복사체들을 생성시킬 때 일어난다. 지수 증폭은 유리 ART 프로브에 어닐링되어, 새 SSEP 생성을 프라이밍하는 SSEP의 반복된 복제 중에 일어난다. 반응에 유리 ART 프로브가 있는 경우, 반응은 지수적이고 선형인 증폭을 조합할 수 있고; 한편 모든 ART 분자들이 SSEP에 혼성화하여, 이중 가닥으로 되며, 선형의 증폭이 우세하다.

개시된 본 방법에서의 핵산 증폭에 이어, 증폭된 이중 가닥의 최종 생성물, 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP) 및 피로포스페이트(PPi)가 통상적 검출 시스템들 중 임의의 것, 예컨대 형광 표지의 검출, 효소-연결 검출 시스템, 마이크로어레이 혼성화, 모세관 및 겔 전기영동, 형광 분극화, 질량 분석, 형광 공진 에너지 전달(FRET), 시간차 형광 검출, 전기 검출 및 발광 검출을 이용하여 검출 및 정량화될 수 있다.

본 발명은 또한 DNA 효소를 이용하는 검출 방법을 제공한다. ART 프로브는 DNA 효소의 상보적 (안티센스) 서열을 포함한다. 증폭 중에, 반응 혼합물에 포함된 리포터 기질을 절단하는 DNA 효소의 활성 (센스) 복사체를 포함하는 단일 가닥의 최종 생성물이 생성된다.

CELA 반응의 주요 단계들은 하기와 같이 설명된다. 모든 단계들은 단일 반응으로서 단일 관에서 수행될 수 있거나, 분리된 반응으로서 상이한 관들에서 수행될 수 있다. 단일 반응 형식이 바람직하다.

A. 표적 특이적 혼성화

ART 프로브 또는 한 세트의 ART 프로브들, 또는 ART 프로브 및 헬퍼 프라이머의 혼합물을 적당한 혼성화 조건하에서, 표적 DNA, RNA, 또는 양자 모두를 포함하는 샘플과 함께 배양하여, 헬퍼 프라이머 또는 ART 프로브의 표적 상보적 부분에서 이중 가닥의 DNA/DNA 또는 RNA/DNA 혼성체가 형성되고, 이로써 프로브의 효소 작용 부분들 중 하나가 부분적으로 또는 완전히 기능적이 되도록 한다. 효소 작용 부분들 중 하나가 표적 상보적 부분 내에 위치한 제한 부위인 경우, 혼성화는 제한 부위를 이중 가닥이 되도록 하고, 이에 따라 기능적으로 되도록 한다. 효소 작용 서열들 중 하나가 그 절단 부위가 표적 상보적 부분 내에 위치하는 IIS형 제한 부위인 경우, 혼성화는 제한 절단 부위가 이중 가닥이 되도록 하고, 이에 따라 IIS형 제한 부위가 부분적으로 기능적으로 된다. 효소 작용 서열들 중 하나가 표적 상보적 부분과 중첩되는 RNase H 작용 서열인 경우, 혼성화는 RNase H 작용 서열이 이중 가닥이 되도록 하고, 이에 따라 완전 기능적으로 된다. 엄격한 혼성화 조건은 표적 서열 및 ART 프로브 간의 완벽한 매치에 의존하도록 하며, 대립유전자 구별이 달성될 수 있게 된다.

헬퍼 프라이머는, CELA 반응에 사용될 경우, 표적 및 ART 프로브의 양자 모두에 혼성화될 수 있고, 이에 따라 표적 및 프로브 간의 특이적 혼성화가 용이해진다.

B. 프로브의 모든 효소 작용 부분이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함

일부 실시양태들에서, 표적 핵산이 RNA인 경우, 단계 (A)에서, 기능적 효소 작용 부분, 즉 RNase H 분해 부위가 형성된다 (도 3, 4). 프로브의 다른 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 하기 위해, 이 단계는 RNase H에 의해 RNA 가닥을 분해하고, 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시키며, 이로써 프로브 상의 모든 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 되도록 함을 포함한다. 프로브 상의 다른 효소 작용 부분들은 제한 부위 또는 RNA 폴리머라제 프로모터, 또는 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함할 수 있다. 다른 실시양태들에서, 부분적으로 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다.

RNase H는 비서열-특이적 방식으로 DNA/RNA 혼성체에서 발견되는 RNA를 절단하는 RNA 특이적 분해 효소이다. RNA 가닥의 완전한 분해 제거를 막기 위해, ART의 표적 상보적 부분의 일부분을 RNA에 의해 생성시키고 (도 3D), 이에 따라 RNA/RNA 혼성체는 RNase H에 의한 분해에 대해 내성을 가진다.

일부 실시양태들에서, 효소 작용 부분들 중 하나는 제한 부위이고, ART 프로브의 표적 상보적 부분 이내에 위치하는 경우, 단계 (A)는 상기 제한 부위가 완전 기능적이 되도록 한다. 프로브의 모든 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 하기 위해, 이 단계는 상기 프로브의 반대측 가닥을 분해하고, 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장하며, 이로써, 프로브 상의 모든 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 되도록 함을 포함한다. 상기 프로브 상의 다른 효소 작용 부분은 다른 제한 부위 또는 RNA 폴리머라제 프로모터, 또는 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 제한 부위는 프로브 상의 유일한 효소 작용 부분이다. 다른 실시양태들에서, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태들에서, 효소 작용 부분들 중 하나가 프로브의 표적 상보적 부분 상의 IIS형 제한 부위의 절단 부위, 및 그 프로브의 표적 상보적 부분의 어느 한 측의 IIS형 제한 부위의 인식 부위를 갖는 IIS형 제한 부위이고, 단계 (a)가 프로브의 표적 상보적 부분이 이중 가닥이 되도록 하며, 이로써 IIS형 제한 부위의 기능적 절단 부위가 형성되는 경우, 단계 (b)는 헬퍼 프라이머를 프로브에 어닐링시키고, IIS형 제한 부위의 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 프라이머를 프로브에 어닐링시키고, IIS형 제한 부위의 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 함은, 헬퍼 프라이머를 측부 서열이 존재하거나 존재하지 않는 IIS형 제한 효소 인식 서열에 직접적으로 어닐링시키고, 이로써 IIS형 제한 부위의 이중 가닥의 인식 서열을 형성시킴을 포함한다. 다른 한 실시양태에서, 헬퍼 프라이머를 프로브에 어닐링시키고, IIS형 제한 부위의 인식 서열을 이중 가닥으로 함은, 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열을 IIS형 제한 인식 서열의 서열 3'에 어닐링시키고, 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열을 DNA 폴리머라제에 의해 프로브를 주형으로 사용하여 신장시키며, 이로써 IIS형 제한 부위의 이중 가닥의 인식 서열을 형성시킴을 포함한다.

유전자형 분석, 특히 SNP 또는 뉴클레오티드 메틸화의 유전자형 분석을 위해, 표적 특이적 ART 프로브, 헬퍼 프라이머 및 IIS형 제한 효소가 반응물에 포함된다 (도 8 및 도 13). IIS형 제한 효소의 사용 이점은, 분석하기 위한 표적 서열이 임의의 특이적 서열, 예를 들어 제한 효소 부위를 포함하도록 제한될 필요가 없다는 것이다. 보편적 제한 효소가 모든 검출 반응들에서 사용될 수 있다. IIS형 제한 인식 부위는 주로 ART 프로브의 표적 상보적 부분의 어느 한 측에 위치하고 (도 1D 및 1E, 7A, 7B, 7C 및 7D), 한편 IIS형 제한 절단 부위는 표적 상보적 부분에 위치한다. IIS형 제한이 SNP 뉴클레오티드, 돌연변이 뉴클레오티드, 메틸화 뉴클레오티드, 스플라이싱 결합 뉴클레오티드 및 다른 특이적 관심 뉴클레오티드의 3'을 절단하는 것이 바람직하다. IIS형 제한 효소들 중 하나는 Fok I일 수 있다. Fok I 제한 효소는 ART 프로브 및 헬퍼 프라이머의 어닐링, 또는 ART 프로브 주형 상의 헬퍼 프라이머의 신장에 의해 형성되는 올리고데옥시뉴클레오티드 어댑터-프라이머로 임의의 소정의 부위에서 DNA를 절단한다. ART의 표적 상보적 부분은 표적 변성된 DNA 또는 RNA 상의 상보적 서열을 선택하고, 그것과 혼성화하여 이중 가닥의 절단 부위를 형성한다. 그러나 Fok I 효소가 표적 가닥을 절단할 수 있기 전에, ART 상의 단일 가닥의 Fok I 인식 부위는 기능적 이중 가닥의 DNA로 전환되어야 한다. 이는 헬퍼 프라이머에 의해 달성된다. 일부 실시양태들에서, ART 프로브 및 헬퍼 프라이머의 표적 상보적 부분들이 인접하는 부위에서 표적에 혼성화하고, 헬퍼 프라이머 및 ART 프로브의 일부 부분들이 상호 혼성화한다. 일부 다른 실시양태들에서, 헬퍼 프라이머 및 ART 프로브는, 특이적 표적의 존재 하에서만 상호 어닐링하도록 설계된다. 헬퍼 프라이머가 표적 서열의 존재 하에 ART 프로브에 어닐링한 후, DNA 폴리머라제가 ART 프로브의 주형 부분을 복사함으로써 헬퍼 프라이머의 3' 말단을 신장시키며, 이로써 이중 가닥의 기능적 Fok I 인식 부위를 생성시킨다 (도 8 및 13).

본 발명의 일부 실시양태들에서, ART의 표적 상보적 부분들이 임의의 원으로부터 비롯될 수 있는 표적 DNA 또는 RNA 분자의 유리 3' 말단에 혼성화하는 경우, ART 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 표적의 3' 말단이 직접적으로 신장가능하다. 이에 따라, 모든 기능적 효소 작용 부분들이 표적 가닥을 분해할 필요없이 형성된다.

일부 CELA 반응들에서, 높은 특이성은 하기 인자들에 의해 달성될 수 있다. 먼저, 표적 서열 및 ART 프로브의 표적 상보적 부분들 간의 표적 특이적 혼성화는 첫 번째 수준의 특이성을 제공한다. 두 번째로, 헬퍼 프라이머의 ART 프로브에 대한 어닐링, 및(또는) 프로브를 주형으로 이용한 헬퍼 프라이머의 3' 말단의 신장이, ART 프로브 및 헬퍼 프라이머를 함께 합하는, 표적 서열의 존재 하에서만 일어날 수 있다. 세 번째로, 경우에 따라 비-표적-특이적 혼성화가 일어나는 경우, IIS형 제한 효소는 (사용될 경우) 절단 부위에서 미스매치를 절단하지 않거나 비효율적으로 절단하여, 사슬 반응이 일어나지 않는다. 마지막으로, 비-표적-특이적 혼성화, 및 IIS형 제한 효소에 의한 미스매치 절단이 일어날 경우, 미스매치 뉴클레오티드로 인해, 틈내기 부위의 3' 말단이 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하지 않을 수 있다.

C. 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)의 생성을 위한, 이중 가닥의 효소 작용 부분(들)을 포함하는 프로브의 처리

일부 실시양태들에서, 프로브의 효소 작용 부분이 제한 부위를 포함하는 경우, 단계 (c)는 제한 부위 상의 프로브의 반대측 가닥을 제한 효소로 분해하고, 분해된 가닥의 3' 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 분해 및 신장을 반복하고, 이로써 SSEP DNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함한다. 다른 실시양태들에서, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다. 적당한 DNA 폴리머라제 및 제한 효소가 [물질] 단락에 기술된다.

일부 실시양태들에서, 프로브의 효소 작용 부분이 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 경우, 단계 (c)는 RNA 폴리머라제 프로모터에 대해 작용하는 RNA 폴리머라제에 의한 반복된 전사로써, SSEP RNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함한다.

일부 실시양태들에서, 프로브의 효소 작용 부분이 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함하는 경우, 단계 (c)는 제한 부위 상의 프로브의 반대측 가닥을 제한 효소에 의해 분해하고, 분해된 가닥의 3' 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 분해 및 신장을 반복하고, 이로써 SSEP DNA의 다수의 복사체들을 생산하며, RNA 폴리머라제 프로모터에 대해 작용하는 RNA 폴리머라제에 의한 반복된 전사로써, SSEP RNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함한다. 다른 실시양태들에서, 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시킴은 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의해 가닥을 치환함을 추가로 포함할 수 있다.

D. SSEP를 유리 프로브에 어닐링시킴, 및 상기 프로브의 모든 효소 작용 부분의 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 함.

일부 실시양태들에서, SSEP가 DNA 분자 또는 RNA 분자, 또는 DNA 및 RNA 분자인 경우, 단계 (d)는 SSEP를 유리 프로브의 서열 부분에 어닐링시키고, 유리 프로브를 주형으로 이용하여 SSEP의 3' 말단을 신장시키며, 이로써 프로브의 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 되도록 함을 포함한다. 프로브가 선형 분자인 경우, SSEP는, 5' 주형 부분 서열을 포함하는 프로브의 (예를 들어, 제한 부위인) 효소 작용 부분들 중 하나의 서열 5'에 대해 상보적이다. 프로브의 3' 주형 부분 및 5' 주형 부분이 동일하거나 거의 동일한 서열을 포함하기 때문에, SSEP의 3' 말단은 3' 주형 부분에 대해 상보적이다. SSEP는 유리 프로브의 3' 주형 부분에 어닐링하고, DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 반복된 분해 및 신장을 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. 프로브가 원형 분자인 경우, SSEP는 ART 프로브의 전체 서열에 대해 상보적이다. SSEP는 전부 또는 부분적으로 유리 ART 프로브에 어닐링하고, DNA 폴리머라제에 의해 신장되며, 이에 따라 반복된 분해 및 신장을 촉발하는 이중 가닥의 ART 프로브가 형성된다. SSEP의 3' 말단 또는 분해된 가닥의 3' 말단의 신장이 가닥 치환 활성을 가지거나 다른 가닥 치환 인자들을 포함하는 DNA 폴리머라제에 의해 수행되는 것이 바람직하다.

일부 실시양태들에서, 프로브가 원형 분자인 경우, SSEP의 서열은 프로브의 전체 서열에 대해 상보적인 하나 또는 하나 초과의 서열 유닛을 포함하고, 단계 (d)는 SSEP를 유리 프로브의 전체 또는 부분에 어닐링시키고, 이로써 효소 작용 부분이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함한다.

프로브가 선형 분자인 경우, SSEP가 프로브의 3' 주형 부분에 어닐링하고, 이에 따라 사슬 반응을 촉발한다. SSEP의 프로브의 3' 주형 부분으로의 어닐링 가능성은, 상이한 프로브 설계에 따라 변화한다. SSEP가 5' 주형 부분 영역으로부터 생산되기 때문에, SSEP는 더욱 바람직하게는 유리 ART 프로브의 3' 주형 부분보다, 5' 주형 부분에 어닐링할 수 있다. 그러나, 3 및 5' 주형 부분 서열이 일치하는 경우, SSEP는 양 부분들에 동등하게 어닐링할 수 있다. 어느 경우에서도, 3' 주형 부분에 어닐링하는 작은 분율의 SSEP가 사슬 반응 캐스케이드를 촉발하는 충분할 수 있다.

프로브가 단지 하나의 주형 부분만을 포함하는 원형 분자인 경우, SSEP가 전체 원형 ART 프로브에 대해 상보적인 하나 이상의 전체 유닛을 포함할 수 있다. SSEP의 원형 ART 프로브에 대한 완전한 상보성으로 인해, SSEP는 즉시적으로 유리 원형 ART 프로브에 어닐링할 수 있고, 사슬 반응을 효율적으로 촉발할 수 있다.

E. 단계 (C) 및 (D)를 반복함으로써 ART 프로브를 이중 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 형태로 전환시키고, SSEP의 다수의 복사체들을 반복 생산함.

모든 시약들이 단일 관 안에 있기 때문에, 상기 모든 단계들이 동시에 일어날 수 있고, 단계들 간에 분명한 경계가 없다. 단계 C 및 D는 다수회 반복된다. 유리 ART 프로브가 있는 한, 반응은 조합된 지수 및 선형 증폭으로 유지된다. 일단 모든 ART 프로브들이 SSEP에 혼성화하면, 선형의 증폭이 우세할 수 있다. 반응은 표지 및 검출될 수 있는 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥의 SSEP 및 PPi를 축적한다.

F. 검출

증폭된 이중 가닥의 최종 생성물, 단일 가닥의 SSEP 및 PPi는 통상적 검출 시스템들 중 임의의 것을 이용하여 검출 및 정량화될 수 있다. 예를 들어, 이중 가닥의 ART 및 단일 가닥의 SSEP는 형광 검출, 형광 분극화, 형광 공진 에너지 전달, 질량분석, 전기 검출 및 마이크로어레이를 이용하여 검출될 수 있다. 구체적으로, 이중 가닥의 ART는 이중 가닥 특이적 형광 염료 SYBR 그린을 어닐링시킴으로써 검출될 수 있다. 본 발명에서, 단일 가닥의 SSEP은 하기 나와 있는 DNA 효소 매개 절단에 의해 검출된다. 생성된 PPi는 ATP로 전환될 수 있고, 수득되는 ATP 농도는 반딧불 루시페라제로 검출 및 정량화될 수 있다 (도 9).

CELA 생성물은 표지 부분기, 예컨대 형광 뉴클레오티드, 바이오티닐화 뉴클레오티드, 디옥시게닌-함유의 뉴클레오티드 또는 브로모데옥시우리딘을 혼입함으로써 검출될 수 있다.

유전자 발현 프로파일링을 위한 한 실시양태에서, 마이크로어레이 검출 시스템이 사용될 수 있다. CELA 는 한 세트의 상이한 증폭 반복 주형(ART) 프로브를 이용함으로써 복합화되며, 상기 각 ART 프로브는 특이적 표적 유전자에 어닐링하기 위해 설계된 상이한 표적 상보적 부분을 담지하고, 상기 각 ART 프로브는 또한 마이크로어레이 상의 특이적 올리고뉴클레오티드에 어닐링하는 SSEP를 위해 설계된 상이한 주형 부분을 담지한다. 표적에 혼성화할 수 있는 그 ART 프로브만이 그것의 특이적 SSEP를 생성시킨다. 유전자 발현 프로파일링을 위한 다른 한 실시양태에서, ART 프로브를 마이크로어레이 상에 찍는다. CELA 반응 중에, 이중 가닥의 ART가 생성되며, 각종 검출 시스템들을 이용하여 검출 및 정량화될 수 있다. 검출 시스템들 중 하나는 실시간으로 모니터링될 수 있는 SYBR 그린 염색을 이용하는 것이다.

G. 단일 가닥의 최종 생성물-SSEP의 DNA 효소 매개 검출

본 발명은 또한 최종 생성물-단일 가닥의 SSEP의 검출을 위해 DNA 효소를 이용한다 (도 10). ART의 주형 부분은 DNA 효소, 예를 들어 10-23 DNA 효소의 상보적 (안티센스) 서열을 포함한다. CELA 반응 중에, DNA 효소의 활성 (센스) 복사체를 포함하는 SSEP가 생성된다. DNA 효소는 DNA 효소의 어느 한 측에 혼입된 형광 공진 에너지 전달 형광단을 함유하는 RNA 또는 DNA-RNA 키메라 리포터 기질을 결합시킨다. 이 리포터 기질의 절단은 성공적인 CELA 증폭을 가리키는 형광의 증가를 가져온다.

실시예 1

DNA 및 RNA 단리. 게놈 DNA를 표준 방법을 이용하여 생 마우스로부터 단리하였다. 총 RNA는 공급자에 의해 권장되는 RNAzol B 시약 [바이오게네시스 사(Biogenesis Ltd.)]을 이용하여, 마우스 흉선 및 비장으로부터 단리하였다. 폴리(Poly) (A) + RNA를 mRNA 단리 키트 [키아겐(Qiagen)]를 이용하여, 총 RNA로부터 추가 정제하였다.

올리고뉴클레오티드 프로브: ART 프로브 및 그것의 표적 서열 베타-악틴 유전자가 도 11에서 지도 상에 나와 있다. ART 프로브는 5'-dCCGGAGACGTCGTTGTAGCTAGCCTGCGTCsAACAAGCCsGGCTTTGCACATGCCGGAGACGTCGTTGp-3'이다. 이탤릭체의 뉴클레오티드는 HincII (28 ~ 33) 및 NaeI(36 ~ 41) 인식 부위이고, 밑줄친 뉴클레오티드 (3' 및 5' 말단의 15개 염기)는 주형 서열이다. "s"는 포스포로티오에이트 연결기를 나타낸다. "p"는 3' 포스페이트를 나타낸다. 기질 프로브는 RNA/DNA 키메라올리고뉴클레오티드 5'-dCCGGAGACGauGCGTCAp-3'이고, 그 아래의 경우는 RNA 염기이다. 6-카르복시플루오레신 (FAM)이 뉴클레오티드 7에 혼입되고, 켄쳐 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(다비실)이 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 13에 혼입된다.

CELA 반응 조건은 하기와 같다: 50 mM 칼륨 포스페이트, pH 7.6, 7.5 mM MgCl₂, 8% 글리세롤, 0.1 mg/ml BSA, 1000 nM ART 프로브, 각기 200 nM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 100 유닛 HincII 제한 효소 [뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)], 1 유닛 엑소-클로노우(exo-Klenow) (뉴잉글랜드 바이오랩스), 0.1 유닛 RNase H [기브코(Gibco) BRL] 및 지정된 양의 마우스 mRNA. 각 샘플에 있어, HincII, 클레노우 및 RNase H를 제외한 모든 시약들을 미세원심분리관에 조합하여, 샘플을 70℃에서 3분간 가열한 후, 실온에서 평형화시켰다. 이어서, 효소를 단일 분취량으로 첨가하여, 반응물을 실온에서 5분간 방치하였다. 이어서, 반응물을 37℃에서 지정된 시간동안 배양하였다. 생성물에 겔 전기영동 또는 형광 검출을 행하였다.

CELA 실험을 게놈 DNA 및 mRNA의 양자 모두로부터의 동일한 ART 프로브 표적화 마우스 베타-악틴 유전자를 이용하여 수행하였다. 5 ng 마우스 mRNA를 포함하는 샘플에 상이한 시점들에서 CELA 반응을 행하였다 (도 12A). 이중 가닥의 최종 생성물이 20 분 후에 검출될 수 있고, 단일 가닥의 최종 생성물이 60분 후에 관찰된다. 상이한 양의 mRNA를 포함하는 샘플은 60분동안 반응을 행하였다 (도 12B). 이중 가닥의 생성물은 10 pg mRNA을 포함하는 반응에서 검출된다.

최종 생성물-단일 가닥의 분자 중 하나는 기질을 촉매화함으로써 검출된 DNA 효소이다 (도 11). DNA 효소는 DNA 효소 절단 부위의 어느 한 측에 혼입된 형광 공진 에너지 전달 형광단을 포함하는 DNA-RNA 키메라 리포터 기질을 결합시킨다. 이 리포터 기질의 절단은 성공적인 CELA을 가리키는 형광의 증가를 가져온다.

실시예 2

올리고뉴클레오티드 프로브: ART 프로브, 헬퍼 프라이머 및 그것의 표적 서열이 도 13에서 지도 상에 나와 있다. p450 표적 유전자의 C 대립유전자에 상응하는 ART 프로브 SNP-G는 5' CCGGAGACGTCGTTGTAGCTAGCCTGCGTCAGGATGCAGC AGCTTsTsCTTGAAGAGCAAACCGGAGACGTCGTTGp 3'의 서열을 가진다. p450 표적 유전자의 T 대립유전자에 상응하는 ART 프로브 SNP-A는 5' CCGGAGACGTCGTTGTAGCTAGCCTGCGTCAGGATGCAGCAGCTTsTsCTTAAAGAGCAAACCGGAGACGTCGTTGp 3'의 서열을 가진다. 합성 표적 올리고는 하기와 같다: 표적-C는 5' CCGGTTTGCTCTTCAAGAAAGCTGTGCCCCAGAACACCAGAGp3'의 서열을 가지고; 표적-G는 5' CCGGTTTGCTCTTTAAGAAAGCTGTGCCCCAGAACACCAGAGp3'의 서열을 가진다. 헬퍼 프라이머는 5' CTCTGGTGTTCTGGGGCACTGCA3'의 서열을 가진다. "s"는 포스포로티오에이트 연결기를 나타낸다. "p"는 3' 포스페이트를 나타낸다.

CELA 반응 조건은 하기와 같다: 50 mM 칼륨 포스페이트, pH 7.6, 7.5 mM MgCl₂, 5% 글리세롤, 0.1 mg/ml BSA, 1000 nM ART 프로브, 각기 200 nM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 50 유닛 Fok I 제한 효소 (뉴잉글랜드 바이오랩스), 1 유닛 엑소-클레노우 (뉴잉글랜드 바이오랩스), 10 내지 lOO nM 헬퍼 프라이머, 및 지정된 양의 인간 DNA 또는 표적 올리고. 각 샘플에 있어서, Fok I, 클레노우를 제외한 모든 시약들을 미세원심분리관에 조합하여, 샘플을 95℃ 또는 70℃에서 3분간 가열한 후, 실온에서 평형화시켰다. 이어서, 효소를 첨가하고, 반응물을 실온에서 5분간 방치하였다. 이어서, 반응물을 37℃에서 지정된 시간동안 배양하였다. 생성물에 겔 전기영동 또는 형광 검출을 행하였다.

다른 방법에 의해 미리 SNP 유전자형 분석되고, p450 유전자 위치의 C 대립유전자에서 동형접합성인 인간 DNA 샘플을 CELA 실험에서 사용하였다. 겔 전기영동은 50 ng 게놈 DNA를 이용할 때, 30분에서 이중 가닥의 최종 생성물을 검출할 수 있었다. 특이성 시험은, DNA 주형 또는 헬퍼 프라이머 또는 Fok I 또는 클레노우가 반응에 부재할 때 CELA 반응이 일어나지 않았음을 보여주었다. 합성 표적 올리고뉴클레오티드를 감도 시험에 사용하였고, CELA가 3시간 반응에서 0.1 mol로 낮은 표적을 검출할 수 있었다. SNP 유전자형 분석 반응은 대립유전자 특이적 프로브만이 그것의 상응하는 표적과 반응하였음을 보여주었다.

실시예 3

올리고뉴클레오티드 프로브: ART 프로브 및 그것의 표적 서열이 도 14에 설명된다.

ART-T7은 5' GCCGTAACGGCCGTACCTATAGTGAGTCGTATTAAGCCGGCTTTGCACsAsUsGsCsCs GsGCAAUGCCGp3'의 서열을 가진다. 3' 말단의 15개 뉴클레오티드 (49 ~ 63)는 RNA 뉴클레오티드이다. 16 ~ 33 사이의 18개 뉴클레오티드는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열이다. 3' 및 5' 말단의 15 뉴클레오티드는 주형 부분 서열이다. 표적 상보적 부분 서열이 34 내지 55 뉴클레오티드의 사이에 있다. "s"는 포스포로티오에이트 연결기를 나타낸다. "p"는 3' 포스페이트를 나타낸다.

CELA 반응 조건은 하기와 같다: 1 × 전사 완충액, 1000 nM ART 프로브, 각기 5 uM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 각기 2 mM의 ATP, CTP, GTP 및 TP, 200 유닛 T7 RNA 폴리머라제, 0.1 유닛 RNase H, 1 유닛 엑소-클레노우 (뉴잉글랜드 바이오랩스), 및 변화하는 양의 표적 RNA. 각 샘플에 있어서, T7 RNA 폴리머라제, 클레노우 및 RNase H를 제외한 모든 시약들을 미세원심분리관에 조합하여, 샘플을 70℃에서 3분간 가열한 후, 실온에서 평형화시켰다. 이어서, 효소를 첨가하였고, 반응물을 실온에서 5분간 방치하였다. 이어서, 반응물을 지정된 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 생성물에 겔 전기영동 또는 형광 검출을 행하였다.

총 마우스 RNA를 CELA 실험에서 주형으로 사용하였다. 결과는 모든 성분들이 반응물에 포함되고, 1 ng 총 RNA 샘플에서 표적 RNA가 검출될 때, CELA이 특이적으로 일어났음을 보여주었다.

실시예 4

올리고뉴클레오티드 프로브: 서열 5' pGGATGCAGCAGCTTsTsCTTGAAGAGC AAACCGGAGACGTCGTTGTAGCTAGCCTGCGTCA 3'을 갖는 선형의 올리고뉴클레오티드, 및 서열 5' CTCTGGTGTTCTGGGGCACTGCATCCTGACGCAGAAp3'을 갖는 헬퍼 프라이머 간의 혼성화, 및 라이게이션에 의해 원형 ART 프로브를 생산하였다. 모든 다른 올리고뉴클레오티드들은 실시예 2에 기재된 바와 같다.

CELA 반응 조건은 실시예 2에 기재된 바와 같았고, 유사한 실험을 행하였다. 성공적인 CELA 반응을 겔 전기영동 및 실시간 형광 검출로 모니터링하였다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 용어 및 과학 용어들은 개시된 본 발명이 속하는 당업계 숙련가에 의해 통상적으로 이해되어 지는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 기재된 바와 같다. 본원에 인용된 모든 공보들은 본원에 참고로 인용된다.

당업자는 통상적 실험만을 이용하는 것으로도, 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 많은 동등 사항들을 이용하는 것을 인지하거나, 그것을 확인할 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> FU, GUOLIANG <120> COMBINED EXPONENTIAL AND LINEAR AMPLIFICATION <130> 27.1.83814 <140> PCT/GB03/04794 <141> 2003-11-05 <150> GB0230238.8 <151> 2002-12-28 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 ccggagacgt cgttgtagct agcctgcgtc aacaagccgg ctttgcacat gccggagacg 60 tcgttg 66 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> RNA nucleotides <400> 2 ccggagacga ugcgtca 17 <210> 3 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 ccggagacgt cgttgtagct agcctgcgtc aggatgcagc agctttcttg aagagcaaac 60 cggagacgtc gttg 74 <210> 4 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 ccggagacgt cgttgtagct agcctgcgtc aggatgcagc agctttctta aagagcaaac 60 cggagacgtc gttg 74 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 ccggtttgct cttcaagaaa gctgtgcccc agaacaccag ag 42 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 ccggtttgct ctttaagaaa gctgtgcccc agaacaccag ag 42 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 ctctggtgtt ctggggcact gca 23 <210> 8 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16)..(33) <223> T7 RNA polymerase promoter <220> <221> misc_feature <222> (49)..(63) <223> RNA nucleotides <400> 8 gccgtaacgg ccgtacctat agtgagtcgt attaagccgg ctttgcacau gccggcaaug 60 ccg 63 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 ggatgcagca gctttcttga agagcaaacc ggagacgtcg ttgtagctag cctgcgtca 59 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 ctctggtgtt ctggggcact gcatcctgac gcagaa 36

Claims

표적 상보적 부분, 주형 부분, 하나 이상의 효소 작용 부분을 포함하고 3' 말단 블록 부분이 존재하거나 존재하지 않으며 단일 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 핵산을 포함하는 프로브 분자.
제1항에 있어서, 단일 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 핵산이 선형 분자인 프로브.
제1항에 있어서, 단일 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥인 핵산이 원형 분자인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 효소 작용 부분이 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 효소 작용 부분이 RNase H 작용 서열을 포함하는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 효소 작용 부분이, 이중 가닥인 경우에 상기 프로브의 반대측 가닥의 분해(digestion)를 보조하는 뉴클레아제 분해 부위를 포함하는 프로브.
제6항에 있어서, 상기 효소 작용 부분이 RNase H 작용 서열 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 조합, 또는 RNase H 작용 서열 및 상기 뉴클레아제 분해 부위의 조합, 또는 상기 뉴클레아제 분해 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 조합, 또는 하나 초과의 상기 뉴클레아제 분해 부위들의 조합을 포함하는 프로브.
제6항에 있어서, 상기 뉴클레아제 분해 부위가 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 이로써 프로브 상의 상기 분해 부위가 뉴클레아제 절단에 대해 내성을 가지고, 반대측 변형되지 않은 가닥이 절단에 대해 민감하게 되는 프로브.
제8항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결기를 포함하는 프로브.
제6항에 있어서, 상기 뉴클레아제 분해 부위가 제한 효소 인식 서열 및 절단 부위를 갖는 제한 부위를 포함하는 프로브.
제10항에 있어서, 상기 제한 부위가 IIS형 제한 효소 부위를 포함하는 프로브.
제11항에 있어서, 상기 IIS형 제한 부위의 효소 절단 부위가 표적 상보적 부분에 위치하는 프로브.
제12항에 있어서, 상기 IIS형 제한 효소 절단 부위가 SNP 부위, 돌연변이 뉴클레오티드, 메틸화 뉴클레오티드 또는 스플라이싱(splicing) 부위에 상응하는 프로브.
제11항에 있어서, 상기 IIS형 제한 부위가 Fok I 부위인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브의 일부분에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적인 하나 이상의 부분을 함유하는 헬퍼 프라이머(들)를 포함하는 프로브.
제15항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머가 3' 말단 블록킹 부분기를 포함하고, 이로써 상기 헬퍼 프라이머의 3' 말단이 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하지 않는 프로브.
제15항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머가 3' 말단 블록킹 부분기를 포함하지 않고, 이로써 상기 헬퍼 프라이머의 3' 말단이 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능한 프로브.
제15항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머가 측부 서열이 존재하거나 존재하지 않는 효소 작용 부분(들)에, 또는 상기 프로브의 효소 작용 부분(들)의 일부에 상보적인 서열을 포함하고, 이로써 상기 헬퍼 프라이머 및 상기 프로브 간의 혼성화가 효소 작용 부분(들)이 이중 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥이 되도록 하는 프로브.
제15항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머가 상기 프로브의 효소 작용 부분들 중 하나의 서열 3'에 대해 상보적인 3' 말단의 서열을 포함하는 프로브.
제15항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머가 표적 상보적 부분(들)을 추가로 포함하고, 이 때 상기 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역(들)이 상기 프로브에 상보적인 표적 영역에 인접하거나 실질적으로 인접하는 프로브.
제20항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머가 3' 및 5' 표적 상보적 부분을 포함하고, 이 때 상기 프로브에 대해 상보적인 표적 영역이 상기 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역의 중간에 위치하고, 상기 헬퍼 프라이머에 대해 상보적인 표적 영역에 인접하거나 실질적으로 인접하는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 표적 상보적 부분이 관심 표적 영역에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열을 포함하고, 이로써 상기 프로브의 상기 표적 상보적 부분이 상기 관심 표적 영역과 혼성화하여 이중 가닥이 되며, 이로써 상기 프로브의 효소 작용 부분(들) 중 하나 또는 하나 초과 또는 일부가 부분적으로 또는 완전히 기능적으로 되는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브의 상기 효소 작용 부분(들), 상기 표적 상보적 부분 및 상기 주형 부분(들)이 상호 중첩되거나, 한 부분이 다른 부분에 삽입되어 있는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브의 상기 표적 상보적 부분 및(또는) 상기 효소 작용 부분(들) 및(또는) 상기 주형 부분(들)이 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 이로써 변형된 뉴클레오티드가 뉴클레아제 절단에 대해 내성을 갖게 되는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브의 상기 표적 상보적 부분 및(또는) 상기 효소 작용 부분(들) 및(또는) 상기 주형 부분(들)이 키메라 RNA 및 DNA를 포함하는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 주형 부분이 하나 이상의 효소 작용 부분에 의해 분리된 2개의 동일하거나 거의 동일한 서열을 포함하는 프로브.
제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 효소 작용 부분이 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 프로브.
제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 효소 작용 부분이 제한 효소 부위를 포함하는 프로브.
제3항에 있어서, 상기 프로브가 하나의 주형 부분을 포함하는 원형 프로브인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브가 원형 프로브인 경우에는 임의의 부위에 또는 상기 프로브가 선형 프로브인 경우에는 주변 부분 서열이 존재하거나 존재하지 않는 5' 주형 부분 내에 DNA 효소에 대해 상보적인 촉매 불활성 안티센스 서열을 포함하는 프로브.
제30항에 있어서, 상기 DNA 효소가 10-23 DNA 효소인 프로브.
제30항에 있어서, 상기 DNA 효소가 8-17 DNA 효소인 프로브.
제1항에 있어서, 상기 3' 말단 블록 부분이 화학적 부분기이고, 이로써 프로브의 3' 말단이 DNA 폴리머라제에 의해 신장가능하지 않는 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브 및(또는) 헬퍼 프라이머의 임의의 말단이 고체 지지체 상에 결합된 프로브.
샘플에서 관심 표적 핵산 서열 또는 다수의 표적 핵산 서열들을 검출하는 방법으로서,

(a) 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 프로브 또는 한 세트의 프로브들을 적당한 혼성화 조건하에서 핵산 샘플과 접촉시키고, 여기에서 상기 프로브의 표적 상보적 부분 또는 상기 프로브 및 헬퍼 프라이머의 표적 상보적 부분이 표적 서열(들)을 혼성화하여 이중 가닥이 되며, 이로써 상기 프로브의 효소 작용 부분(들) 중 하나 또는 하나 초과 또는 일부가 부분적으로 또는 완전히 기능적이 되도록 함;

(b) 상기 프로브의 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 함;

(c) 이중 가닥 효소 작용 부분(들)을 함유하는 상기 프로브를 처리하여, 단일 가닥의 최종 생성물(SSEP)을 생산함;

(d) 상기 SSEP를 유리 프로브에 어닐링시키고, 상기 프로브의 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 함;

(e) (c) 및 (d)의 단계들을 반복함으로써, 상기 프로브를 이중 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥의 형태로 전환시키고, 상기 SSEP의 다수의 복사체들을 반복 생산함; 및

(f) 이에 따라 생산된 최종 생성물, 즉 이중 가닥의 최종 생성물, SSEP 및 피로포스페이트(PPi)를 직접 또는 간접적으로 검출함

의 단계들을 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 방법이 단일 반응 또는 분리된 반응들로 수행되는 방법.
제35항에 있어서, 상기 표적 핵산이 RNA이고, 상기 단계 (a)가 효소 작용 부분의 하나인 RNase H 분해 부위를 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 하고, 상기 단계 (b)가 RNA 가닥을 RNase H에 의해 분해하고, 부분적으로 분해된 가닥의 3' 말단을 상기 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 이로써 상기 프로브 상의 모든 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적으로 되도록 함을 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 부분적으로 분해된 가닥의 3' 말단의 신장이 상기 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의한 가닥의 치환을 추가로 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 프로브 상의 상기 다른 효소 작용 부분이 제한 부위 또는 RNA 폴리머라제 프로모터, 또는 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 효소 작용 부분들 중 하나가 제한 부위이고, 상기 프로브의 표적 상보적 부분에 위치하며, 상기 단계 (a)는 상기 제한 부위가 이중 가닥 형태 및 완전 기능적이 되도록 하며, 상기 단계 (b)는 상기 제한 부위 상의 상기 프로브의 반대측 가닥을 제한 효소에 의해 분해하고, 상기 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 분해된 가닥의 3' 말단을 신장시키며, 이로써 상기 프로브 상의 모든 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 분해된 가닥의 3' 말단의 신장이 상기 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의한 가닥의 치환을 추가로 포함하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 프로브 상의 상기 다른 효소 작용 부분이 제한 부위 또는 RNA 폴리머라제 프로모터, 또는 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 제한 부위가 상기 프로브 상의 유일한 효소 작용 부분인 방법.
제35항에 있어서, 상기 효소 작용 부분들 중 하나가 IIS형 제한 부위이고, 상기 IIS형 제한 부위의 절단 부위가 상기 프로브의 표적 상보적 부분에 위치하며, 상기 IIS형 제한 부위의 인식 부위가 상기 프로브의 표적 상보적 부분의 어느 한 측에 위치하고; 단계 (a)는 상기 프로브의 표적 상보적 부분이 이중 가닥이 되도록 하고, 이로써 상기 IIS형 제한 부위의 기능적 절단 부위를 형성시키며; 상기 단계 (b)는 헬퍼 프라이머를 상기 프로브에 어닐링시키고, 상기 IIS형 제한 부위의 상기 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 함을 포함하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머를 상기 프로브에 어닐링시키고, 상기 IIS형 제한 부위의 상기 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 함이, 상기 헬퍼 프라이머를 측부 서열이 존재하거나 존재하지 않는 상기 IIS형 제한 효소 인식 서열에 직접적으로 어닐링시키고, 이로써 상기 IIS형 제한 부위의 이중 가닥의 인식 서열을 형성시킴을 포함하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 헬퍼 프라이머를 상기 프로브에 어닐링시키고, 상기 IIS형 제한 부위의 상기 인식 서열이 이중 가닥이 되도록 함이, 상기 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열을 상기 IIS형 제한 인식 서열의 서열 3'에 어닐링시키고, 상기 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 상기 헬퍼 프라이머의 3' 말단 서열을 신장시키며, 이로써 상기 IIS형 제한 부위의 이중 가닥 인식 서열을 형성시킴을 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 단계 (a)에서, 상기 프로브의 표적 상보적 부분이 표적 서열(들)의 유리 3' 말단(들)에 혼성화하며, 상기 단계 (b)가 표적 서열(들)의 상기 유리 3' 말단(들)을 상기 프로브를 주형으로 이용하여 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 이로써 상기 프로브 상의 다른 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 프로브의 상기 효소 작용 부분이 제한 부위를 포함하고, 상기 단계 (c)는 상기 제한 부위 상의 상기 프로브의 반대측 가닥을 제한 효소에 의해 분해하고, 분해된 가닥의 3' 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 상기 분해 및 상기 신장을 반복하고, 이로써 SSEP DNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함하는 방법.
제48항에 있어서, 상기 분해된 가닥의 3' 말단의 신장이 상기 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의한 가닥의 치환을 추가로 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 프로브의 상기 효소 작용 부분이 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하고, 상기 단계 (c)는 상기 RNA 폴리머라제 프로모터에 대해 작용하는 RNA 폴리머라제에 의한 반복된 전사로써 SSEP RNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 프로브의 상기 효소 작용 부분이 제한 부위 및 RNA 폴리머라제 프로모터의 양자 모두를 포함하고, 상기 단계 (c)는 상기 제한 부위 상의 상기 프로브의 반대측 가닥을 제한 효소에 의해 분해하고, 분해된 가닥의 3' 말단을 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키며, 상기 분해 및 상기 신장을 반복하고, 이로써 SSEP DNA의 다수의 복사체들을 생성시키고, 상기 RNA 폴리머라제 프로모터에 대해 작용하는 RNA 폴리머라제에 의한 반복된 전사로써 SSEP RNA의 다수의 복사체들을 생산함을 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 상기 분해된 가닥의 3' 말단의 신장이 상기 DNA 폴리머라제 또는 다른 가닥 치환 인자들에 의한 가닥의 치환을 추가로 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 SSEP가 DNA 분자 또는 RNA 분자, 또는 DNA 및 RNA 분자이고, 상기 단계 (d)는 상기 SSEP를 유리 프로브의 서열 부분에 어닐링시키고, 상기 SSEP의 3' 말단을 상기 유리 프로브를 주형으로 이용하여 신장시키며, 이로써 상기 프로브 상의 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 SSEP가 RNA 분자이고, 상기 단계 (d)는 상기 SSEP를 유리 프로브의 서열 부분에 어닐링시키고, 상기 SSEP를 RNase H에 의해 분해시키며, 부분적으로 분해된 SSEP의 3' 말단을 상기 유리 프로브를 주형으로 이용하여 신장시키고, 이로써 모든 효소 작용 부분들이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 프로브가 원형 분자이고, 상기 SSEP의 서열이 상기 프로브에 대해 상보적인 하나 또는 하나 초과의 서열 유닛을 포함하고, 단계 (d)는 상기 SSEP를 상기 유리 프로브의 전체 또는 부분에 어닐링시키고, 이로써 상기 효소 작용 부분이 이중 가닥 형태 및 기능적이 되도록 함을 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 주형 부분이 안티센스 DNA 효소를 포함하고, 상기 방법이 단일 가닥의 기능적 센스 DNA 효소의 다수의 복사체들을 생산하며, 단일 가닥의 최종 생성물을 제거하는 상기 단계 (f)는 DNA 효소 절단 부위의 어느 한 측에 혼입된 형광 공진 에너지 전달 형광단을 포함하는 RNA 또는 DNA-RNA 키메라 리포터 기질을 반응물에 포함하고, 상기 리포터 기질을 센스 DNA효소에 의해 절단하며, 이로써 상기 리포터 기질의 절단이 형광 신호의 증가를 가져오도록 하는 것을 포함하는 방법.
샘플에서 관심 표적 핵산 서열 또는 다수의 표적 핵산 서열들을 검출하는데 사용하기 위한 키트로서, 상기 한 세트 또는 세트들의 프로브, 상기 헬퍼 프라이머, 상기 검출 기질, 상기 제한 효소, 상기 RNA 폴리머라제, 상기 RNase H, 상기 DNA 폴리머라제, 완충액, dNTP, NTP를 포함하는 키트.