CN1732273A - 指数扩增和线性扩增的联合扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明提供灵敏检测和定量核酸的方法和组合物。本发明进一步提供用于基因分型的方法和组合物。本发明的探针允许定点启动单链，双链多核苷酸以及焦磷酸盐(PPi)的扩增。本发明也提供检测单链末端产物的DNA酶介导的检测方法。

Description

指数扩增和线性扩增的联合扩增
发明背景
本发明涉及核酸扩增和检测领域。更具体的，本发明提供扩增(即，产生多个拷贝)核酸分子和检测扩增序列的方法、组合物以及试剂盒，其包括定点起始(target initiated)的核酸聚合反应，链式反应级联和DNA酶介导的检测。
已经发展了许多允许基于扩增进行灵敏的核酸检测的方法。它们分为两类，靶扩增或信号放大。靶扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)，以及链置换扩增(SDA)。信号放大技术包括分支DNA(bDNA)、杂交捕获、裂解酶(侵入物鉴定)，以及通过替代标签的扩增测量核酸靶。滚环扩增(RCA)是进行靶扩增或信号扩大的方法。(Birkenneyer和Mushahwar，J.VirologicalMethods，35：117-126(1991)；Landegren，Trends Genetics，9：199-202(1993)；Schweitzer和Kingsmore，Current opinion in Biotechnology，12：21-27(2001)。
PCR方法仍是最广泛使用的DNA扩增和定量的方法。然而，PCR总体上有一些本领域技术公知的局限，如需要昂贵的热循环仪、容易污染、定量困难，不同DNAs的扩增效率不同，以及有限的多重扩增(multiplexing)。
当前测定生物样品中mRNA/cDNA水平的定量分布的技术包括使用cDNA阵列(Schena等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，91：10614-10619(1994))或者高密度寡核苷酸阵列(Lockhart等，Nature Biotechnology，14：1675-1680(1996))。就Schena等使用的cDNA阵列而言，检测阵列的每一单元中的单种分子需要存在至少100,000个结合的靶分子。就Lockhart等使用的DNA芯片阵列而言，杂交RNA的检测限度为2000个分子的数量级。
单核苷酸多态性(SNPs)是相当复杂性状和药物基因组研究(pharmacogenomic study)的基础。然而，大量SNPs的分析已经强调需要同样简单、耐用以及可分级计量(scalability)的廉价SNP基因分型方法。总的说来，目前的方法需要预扩增基因组DNA，随后用等位基因鉴别方法，如DNA裂解、连接、单个碱基延伸或者杂交进行SNP基因分型。目前的方法受到费用、不精确、样品DNA的损耗，或者缺乏可分级计量性的限制(Faruqi等.BMC Genomics(2001)2：4)。因此，需要一种既灵敏而又能定量的核酸检测方法。
因此，所公开的本发明的一个目的是提供一种检测低浓度核酸的方法。
所公开的本发明的另一个目的是提供测定样品中存在的特异性靶核酸序列数量的方法，其中测得的信号数量与样品中靶序列的数量成比例，其中测得的不同靶序列信号比率基本上与样品中存在的不同靶序列数量的比率相匹配。
所公开的本发明的另一个目的是提供一种检测靶核酸序列的存在的方法，所述序列代表靶遗传元件的单个等位基因。
所公开的本发明的另一个目的是提供一种高通量SNP基因分型、检测核苷酸甲基化、以及不同基因剪接的方法。
所公开的本发明的另一个目的是提供一种通过DNA酶介导的RNA或DNA-RNA嵌合底物裂解检测终产物的方法。
发明概要
本发明公开了扩增和检测核酸的组合物和方法。本发明的方法使用特殊设计的寡核苷酸探针，称为“扩增重复模板”(ART)探针。扩增是通过的指数扩增和线性扩增的联合扩增(combined exponential and linearamplitication，CELA)完成，其允许产生大量拷贝的单链终产物(SSEP)，双链终产物以及焦磷酸(PPi)。
ART探针分子是单链或者是部分双链的线形或环状核酸，其包括：靶互补部分、模板部分、至少一个酶作用部分、以及带有或没有3′端阻滞部分。ART探针可包括使探针的一个或一些部分成为双链的辅助引物。ART探针可包括反义DNA酶或者反义RNA酶。ART探针可能不包括所有的部分，并可能包括另外的部分。
酶作用部分可包括RNA聚合酶启动子。酶作用部分可包括RNA酶H作用序列。酶作用部分可包括核酸酶消化位点，当形成双链时，其支持对探针的相反链的消化。核酸酶消化位点可包括修饰的核苷酸，从而探针的消化位点抗核酸酶切割而未修饰的反向链则对切割敏感。修饰的核苷酸可包括硫代磷酸键。
酶作用部分可包括RNA酶H作用序列和RNA聚合酶启动子的组合，或者RNA酶H作用序列和核酸酶消化位点的组合，或者核酸酶消化位点与RNA聚合酶启动子的组合，或者一个以上核酸酶消化位点的组合。
核酸酶消化位点可包括具有限制性内切酶识别序列和切割位点的限制性酶切位点。限制性酶切位点可包括IIS型限制性酶切位点。优选的是IIS型限制性酶切位点的酶切割位点位于靶互补部分上。更优选SNP基因分型、甲基化分析、剪接分析所用的IIS型限制性酶切位点对应于SNP或者突变位点、甲基化核苷酸、或者基因剪接位点。IIS型限制性酶切位点可以是FokI位点。
探针可包括辅助引物，其中辅助引物包含至少一个与探针的一部分互补或基本上互补的部分。辅助引物可包含3′端阻滞部分，因此辅助引物的3′端不能被DNA聚合酶延伸。辅助引物也可不包含3′端阻滞部分，因此辅助引物3′端可被DNA聚合酶延伸。
辅助引物可包含与含有或不含侧翼序列的探针的酶作用部分或者酶作用部分中的一部分互补的序列，因此辅助引物和探针之间的杂交使酶作用部分形成双链或者部分形成双链。辅助引物可包含可延伸并且与探针的酶作用部分之一的3′序列互补的3′端序列。辅助引物的3′端序列可以是2到15个核苷酸长，优选3到10个核苷酸，或者甚至优选4到8个核苷酸。
辅助引物可进一步包含靶互补部分，其中与辅助引物互补的靶区域邻近或基本上邻近与探针互补的靶区域。辅助引物可包含3′和5′靶互补部分，其中与探针互补的靶区域位于与辅助引物互补的靶区域的中间，且邻近或者基本上邻近与辅助引物互补的靶区域。
探针的靶互补部分可包括与感兴趣的靶区域互补或者基本上互补的序列，其中探针的靶互补部分与感兴趣的靶区域杂交，形成双链，因此探针的一个或一个以上酶作用部分或者其中一部分是部分地或者全部有功能。
探针的酶作用部分、靶互补部分以及模板部分可以相互重叠或者可以有一部分嵌在其它部分中。
探针的靶互补部分和/或酶作用部分和/或模板部分可包括经修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸抗核酸酶裂解。在一些实施方案中，当靶是RNA和/或单链末端产物(SSEP)是RNA，以及在反应中使用RNA酶H时，优选靶互补部分和/或酶作用部分和/或模板部分包括嵌合RNA和DNA。靶或者SSEP RNA与ART探针退火后，双链RNA/RNA部分抗RNA酶H裂解，结果靶或者SSEP RNA不被完全消化，而RNA/DNA部分上的RNA则被消化，消化的RNA的3′端可用做延伸起始点。也优选修饰ART探针上的RNA部分，使得其不被任何核酸酶消化。修饰的核苷酸可含有硫代磷酸键。
探针的模板部分可包括同方向上的两个完全相同或者几乎完全相同的序列，其中这两个完全相同或者几乎完全相同的序列可被至少一种酶作用部分分离，其可包含RNA聚合酶启动子或者限制性内切酶位点。环状探针可包含一个模板部分，其它部分嵌入其中。
在一些实施方案中，当应用DNA酶介导的检测时，优选模板部分包含与DNA酶互补的催化失活的反义序列。优选DNA酶可以是10-23或者8-17脱氧核酶(DNAzymes)。
探针3’端阻滞部分可以是化学部分，其使探针的3’端不能被DNA聚合酶延伸。可将探针和/或辅助引物的任何末端被附着到固相载体上。
一种检测样品中感兴趣的靶核酸序列或多个靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：(a)在合适的杂交条件下，将探针或一系列探针与核酸样品接触，其中探针的靶互补部分或者探针和辅助引物两者的靶互补部分与靶序列杂交成为双链，因此探针的一个或一个以上酶作用部分或者其中一部分是部分地或者全部有功能；(b)使探针的所有酶作用部分形成双链，并且完全有功能；(c)处理包含双链酶作用部分的探针以产生单链末端产物(SSEP)；(d)将SSEP与游离探针退火，使探针的所有酶作用部分形成双链并完全有功能；(e)重复步骤(c)和(d)，因此将探针转化成双链或者部分双链的形式，重复产生SSEP的多拷贝；以及(f)直接或者间接检测这样产生的末端产物：双链末端产物、SSEP和焦磷酸(PPi)。可在单个反应或者分开的反应中完成该方法的所有步骤。
在一些实施方案中，当靶核酸是RNA且步骤(a)使酶作用部分之一，RNA酶H消化位点形成双链并有功能；其中步骤(b)包括：用RNA酶H消化RNA链，使用探针作为模板，通过DNA聚合酶延伸经部分消化的链的3’端，因此探针上的所有其它酶作用部分形成双链且有功能。探针上的其它酶作用部分可包含限制性酶切位点或者RNA聚合酶启动子或者限制性酶切位点和RNA聚合酶启动子两者。
在另一个实施方案中，使经过部分消化的链的3’端延伸可进一步包括通过DNA聚合酶或者其它链置换因子进行链置换。
在一些实施方案中，当酶作用部分之一是限制性位点且位于探针的靶互补部分，并且步骤(a)使限制位点形成双链并完全有功能时，步骤(b)包括：通过限制性内切酶在限制位点消化探针的相反链，使用探针作为模板通过DNA聚合酶使经消化的链的3’端延伸，因此探针上的所有其它酶作用部分形成双链并有功能。在所述探针上的其它酶作用部分可包含其它限制位点、RNA聚合酶启动子或者限制位点和RNA聚合酶启动子两者。或者，所述限制位点可以是探针上的唯一酶作用部分。在另一个实施方案中，使经消化的链的3’端延伸可进一步包括通过DNA聚合酶或其它链置换因子进行链置换。
在一些实施方案中，当酶作用部分之一是IIS型限制性内切酶位点，其切割位点在探针的靶互补部分，识别位点在探针的靶互补部分的任一侧，以及步骤(a)使探针的靶互补部分形成双链，因此形成IIS型限制性位点的功能性切割位点时，步骤(b)包括：将辅助引物和探针退火，使IIS型限制性位点的识别序列形成双链。在一个实施方案中，使辅助引物和探针退火并使IIS型限制性位点的识别序列形成双链的步骤包括：辅助引物直接与含有或不含侧翼序列的IIS型限制性酶识别序列退火，因此形成IIS型限制位点的双链识别序列。在另一个实施方案中，使辅助引物和探针退火并使IIS型限制性位点的识别序列形成双链的步骤包括：辅助引物的3’端序列和IIS型限制性识别序列的3’侧序列退火，使用探针作为模板通过DNA聚合酶延伸辅助引物的3’端序列，因此形成IIS型限制位点的双链识别序列。
在一些实施方案中，当探针的靶互补部分与靶序列的游离3’端杂交时，步骤(b)包括：使用探针作为模板，通过DNA聚合酶延伸靶序列的游离3’端，因此探针上的其它酶作用部分形成双链并有功能。
在一些实施方案中，当探针的酶作用部分包含限制性位点时，步骤(c)包括：通过限制性内切酶在限制性位点消化探针的相反链，通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端，重复消化和延伸，因此产生SSEP DNA的多个拷贝。在另一个实施方案中，使经消化的链的3’端延伸可进一步包括通过DNA聚合酶或者其它链置换因子进行链置换。
在一些实施方案中，当探针的酶作用部分包含RNA聚合酶启动子时，步骤(c)包括：通过RNA聚合酶作用于RNA聚合酶启动子进行转录，重复该转录，因此产生SSEP RNA的多个拷贝。
在一些实施方案中，当探针的酶作用部分包含限制位点和RNA聚合酶启动子两者时，步骤(c)包括：通过限制性内切酶在限制位点消化探针的相反链、通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端、重复消化和延伸，产生SSEP DNA的多个拷贝，以及重复由RNA聚合酶作用于RNA聚合酶启动子而进行的转录，产生SSEP RNA的多个拷贝。在其它实施方案中，延伸经消化的链的3’端可进一步包括通过DNA聚合酶或者其它链置换因子进行链置换。
在一些实施方案中，当SSEP是RNA分子或RNA分子或者是DNA和RNA分子两者时，步骤(d)包括：将SSEP和游离探针的序列部分退火，使用游离探针作为模板延伸SSEP的3’端，因此探针的所有酶作用部分形成双链并有功能。
在一些实施方案中，当SSEP是RNA分子时，步骤(d)包括：将SSEP和游离探针的序列部分退火、通过RNA酶H消化SSEP、使用游离探针作为模板延伸经部分消化的SSEP的3’端，因此所有酶作用部分形成双链并有功能。
在一些实施方案中，当探针是环状分子时，SSEP RNA或DNA的序列包括一个或者多个与探针互补的序列单位，步骤(d)包括：将SSEP与游离探针的全部或部分退火，因此酶作用部分形成双链并有功能。
在一些实施方案中，当模板部分包括反义DNA酶时，该方法产生单链有功能的有义DNA酶的多个拷贝，检测单链末端产物的步骤(f)包括：在反应中包括RNA或者DNA-RNA嵌合的报告底物，其中RNA或者DNA-RNA嵌合的报告底物包括掺入脱氧核酶切割位点任一侧的荧光共振能量转移荧光团，通过有义DNA酶切割报告底物，因此报告底物的切割产生荧光信号的增加。
本发明也提供检测感兴趣的靶核酸序列或者多个靶核酸序列的试剂盒，该试剂盒包括：一套或多套探针、辅助引物、检测底物、限制性内切酶、RNA聚合酶、RNA酶H、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、NTPs、其它试剂和说明书。
附图的简要描述
图1是各种扩增重复模板(ART)探针实例的图。如所示显示靶序列；如在探针的最初几个图表中，通过各种图形代表探针的各个部分、修饰区和辅助引物，其应当被认为在其余的探针图中具有相似的含义。
图2是CELA反应实例的图。在图2A中显示使用线性探针的CELA，在图2B中显示使用环状探针的CELA。靶核酸与ART探针的靶互补部分杂交。ART探针上的靶链被核酸酶消化。通过DNA聚合酶延伸经消化的链，因此下游酶作用部分，如果有的话，形成双链。随后的重复聚合之后，产生多个SSEP拷贝，其然后和游离的ART探针退火，引发新的聚合，产生新的SSEP。然后检测最终的末端产物，双链多核苷酸、单链SSEP和PPI。
图3是各种扩增重复模板(ART)探针实例的图。如图所示显示靶RNA序列和探针的各个部分。
图4是CELA反应实例的图。图4A中显示使用线性探针的CELA，图4B显示使用环状探针的CELA。靶RNA序列与ART探针的靶互补部分杂交。双链RNA/DNA杂交体上的RNA链被RNA酶H部分地消化。通过DNA聚合酶延伸经部分消化的链，因此下游酶作用部分，如果有的话，形成双链。随后的重复聚合之后，产生多个SSEP拷贝，其然后和游离的ART探针退火，引发新的聚合，产生新的SSEP。接着检测最终的末端产物，双链多核苷酸、单链SSEP和PPI。
图5是各种ART探针实例的图。ART探针包含RNA聚合酶启动子序列。
图6是CELA反应实例的图。图6A中显示使用线性探针的CELA，图6B中显示使用环状探针的CELA。靶RNA或者DNA序列与ART探针的靶互补部分杂交；ART探针包括RNA聚合酶启动子序列。双链RNA/DNA或者DNA/DNA杂交体上的靶链通过酶促消化。DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端。一旦启动子序列形成双链，RNA聚合酶作用于启动子，产生多拷贝RNA转录物，即，SSEP RNA序列，其接着和游离的ART探针退火，引发新的延伸，产生新的SSEP。然后检测最终的末端产物：双链多核苷酸、单链SSEP和PPI。
图7是ART探针实例的图。ART探针包括IIS型限制位点作为酶作用部分之一。
图8是用于基因分型SNPs的CELA反应实例的图。图8A中显示使用线性探针的CELA，图8B中显示使用环状探针的CELA。靶RNA或者DNA序列与ART探针的靶互补部分进行等位基因特异性杂交，而辅助引物与ART探针和靶区域两者退火，所述靶区域邻近ART探针的杂交区。在图8A中，使用ART探针为模板，通过DNA聚合酶延伸辅助引物的3’端，因此产生双链功能性IIS型限制性识别位点。在图8B中，通过辅助引物和ART探针之间的杂交产生双链功能性IIS型限制性识别位点。通过IIS型限制性内切酶(例如Fok1)消化ART探针的双链靶互补部分上的靶链，ART探针链由于修饰的核苷酸而抗切割。通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端。经过随后的反复消化和延伸，产生多拷贝SSEP，其然后和游离的ART探针退火，引发新的延伸、消化、以及产生新的SSEP。然后检测最终的末端产物，双链多核苷酸、单链SSEP和PPI。
图9显示检测方法的实例。
图10是脱氧核酶介导的单链末端产物(SSEP)检测的实例图。ART探针的模板部分包括脱氧核酶的互补(反义)序列，例如10-23脱氧核酶。在CELA反应期间，产生含有活性(有义)脱氧核酶拷贝的SSEP。DNA酶结合RNA或者DNA-RNA嵌合报告底物，其含有在脱氧核酶切割位点的任一侧上结合的荧光共振能量转移荧光团。这种报告底物的切割产生荧光的增加，其指示靶起始的单链SSEP的成功扩增。
图11是显示ART探针序列、其靶序列β肌动蛋白基因、以及反应终产物结构的图；细节在实施例1中描述。用斜体标注的碱基是Hinc II和NaeI的识别位点，有下划线的碱基是模板序列。“S”表示有硫代磷酸键。
图12是实施例1的反应产物的凝胶电泳结果。
图13是显示含有FokI位点的ART探针序列，辅助引物序列和靶序列的图；细节在实施例2中描述。
图14是显示含有T7RNA聚合酶启动子的ART探针序列，和其靶序列的图；细节在实施例3中描述。
图15是显示环状ART探针序列、辅助引物序列和靶序列的图；细节在
实施例4中描述。
发明详述
图1，3，5，7，11，13，14和15中显示各种探针的实例。它们不应当被认为是限制，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可制备任何变体。
下面概括本发明方法的一个实例(图2)。
图2A中显示使用线性探针的CELA反应，图2B中显示使用环状探针的CELA反应。靶核酸与ART探针的靶互补部分杂交。酶作用部分位于靶互补部分上。酶作用部分可以是任何核酸酶消化位点，当形成双链时，其支持对所述探针相反链的消化。在这个实施例中核酸酶消化位点是限制性酶切位点并且可被修饰。或者，核酸酶消化位点是产生切口的限制性酶切位点，其不需要对探针上的核苷酸进行修饰。通过限制性内切酶消化ART探针上的靶链。通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端，因此下游酶作用部分，如果有的话，形成双链。消化和延伸重复进行多次；该过程产生单链末端产物(SSEP)的多个拷贝。在图2A中所示的反应实例中，探针是线性分子，SSEP与探针限制性位点的5’序列，包括探针的5’模板部分序列以及一部分靶互补部分序列互补。因为探针的3’模板部分和5’模板部分包含完全相同或者几乎完全相同的序列，SSEP的3’端与3’模板部分互补。SSEP和游离探针的3’模板部分退火，并通过DNA聚合酶延伸，因此形成双链ART探针，引发重复消化和延伸。在图2B中显示的反应的实例中，探针是环状分子，SSEP与ART探针的整个序列互补。SSEP和游离ART探针完全或者部分退火，并通过DNA聚合酶延伸，因此形成双链ART探针，引发重复消化和延伸。优选可通过具有链置换活性或者含有其它链置换因子的DNA聚合酶延伸SSEP的3’端或者经消化的链的3’端。然后检测最终的末端产物，双链多核苷酸、SSEP和PPi。
因为所有试剂在单个试管中，所有上述步骤可同时进行，各个步骤之间没有明显的界线。只要存在未和SSEP杂交的游离ART，扩增仍然是指数性质的。一旦所有的ARTs与SSEP杂交，扩增可能是线性的。反应将累积双链多核苷酸、单链SSEP和PPi，它们可带有标签并被检测。
下面概括本发明方法的另一个实例(图4)。
图4A中显示使用线性探针的CELA反应，图4B中显示使用环状探针的CELA反应。靶RNA序列与ART探针的靶互补部分杂交。在这个实施例中，探针的靶互补部分也是酶作用部分-RNA酶H消化位点。靶互补部分的3’部分是由可包括硫代磷酸键的核糖核苷酸构成。通过RNA酶H消化双链RNA/RNA杂交体上的靶RNA链，而双链RNA/RNA杂交体上的靶RNA链抗RNA酶H消化。通过DNA聚合酶延伸经部分消化的靶RNA链的3’端，因此下游酶作用部分，如果有的话，形成双链。在这个实施例中，下游酶作用部分可包含RNA聚合酶启动子或者限制性酶切位点。当下游酶作用部分是限制性酶切位点时，该反应接下来的步骤与第一个实例中所描述的步骤(图2)相同。当下游酶作用部分是RNA聚合酶启动子，该反应接下来的步骤与接下来的实例中所描述的步骤(图6)相同。
下面概括本发明方法的另一个实例(图6)。
在图6A中显示使用线性探针的CELA反应，在图6B中显示使用环状探针的CELA反应。ART探针的酶作用部分之一包含RNA聚合酶启动子。靶RNA或者DNA序列与ART探针的靶互补部分杂交。通过核酸酶消化ART探针的双链RNA/DNA或者DNA/DNA杂交体上的靶链，所述酶可以是限制性酶或者RNA酶H。通过DNA聚合酶延伸经消化或者部分消化的链的3’端，因此下游酶作用部分，RNA聚合酶启动子，形成双链并完全有功能。RNA聚合酶作用于该启动子产生多拷贝RNA转录物，即SSEP RNA序列。在图6A中，探针是线性分子，SSEP RNA与探针的5’模板部分序列互补。因为探针的3’模板部分和5’模板部分包含完全相同或者几乎完全相同的序列，SSEP的3’端与3’模板部分互补。SSEP和游离探针的3’模板部分退火并通过DNA聚合酶延伸，因此形成双链ART探针，引发SSEP RNA的重复转录。在图2B中，探针是环状分子；SSEP可包含一个或者多个序列单位，其中的每一个与ART探针的全部序列互补。SSEP RNA和游离的ART探针完全或者部分退火，通过DNA聚合酶延伸SSEP的3’端，因此形成双链ART探针，引发SSEP RNA的重复转录。或者，SSEP RNA和游离ART探针完全或者部分退火，然后被RNA酶H部分地消化，通过DNA聚合酶延伸经部分消化的SSEP的3’端，因此形成双链ART探针，引发SSEPRNA的重复转录。如果线性或者环状ART探针包含限制性位点和RNA聚合酶启动子两者、且反应包括相应的限制性内切酶和RNA聚合酶，该反应可产生SSEP RNA和SSEP DNA两者，接着可引发重复延伸和消化，以及重复转录。优选可通过具有链置换活性或者包含其它链置换因子的DNA聚合酶延伸SSEP的3’端或者经消化的链的3’端。在环状ART探针包括RNA酶H作用位点和RNA聚合酶启动子以及反应包括相应的RNA酶H和RNA聚合酶的实例中，包含与ART探针的整个序列互补的一个或者多个序列单位的SSEP RNA和游离ART探针完全或者部分地退火，然后通过RNA酶H部分地消化，通过DNA聚合酶延伸经部分消化的SSEP的3’端。如果DNA聚合酶具有链置换活性，使用环状探针作为模板进行的延伸和链置换可产生长单链末端产物，其包括多个序列单位，每一个都与探针的整个序列互补。长单链末端产物和游离探针退火，因此可形成双链RNA聚合酶启动子，其引发SSEP RNA的重复转录。然后SSEP RNA和游离ART探针退火且引发进一步的链延伸、置换和转录。接着检测最终的末端产物：双链末端产物、单链末端产物和PPi。
下面概括本发明方法的另一个实例(图8)。
在图8A中显示使用线性探针的CELA反应，在图8B中显示使用环状探针的CELA反应。ART探针包括IIS型限制性酶切位点，其识别位点在靶互补部分的3’侧(图8A)或靶互补部分的5’侧(图8B)，其切割位点在靶互补部分。IIS型限制性内切酶的切割位点对应于靶链的3’SNP核苷酸，而探针上的切割位点经过修饰并且抗切割。左手侧的ART探针包括与等位基因1的序列相匹配的靶互补部分；右手侧的ART探针包括与等位基因2的序列相匹配的靶互补部分(图8A)。靶RNA或者DNA序列与ART探针的靶互补部分发生等位基因特异性杂交，而辅助引物与ART探针和靶序列两者退火。与辅助引物杂交的靶区域邻近或者基本上邻近与ART探针杂交的靶区域。与IIS型限制位点的3’序列杂交的辅助引物3’端序列(图8A)较短，可包括2-15个核苷酸，优选包含3-10个核苷酸，或者更优选包含4-8个核苷酸。在图8A中，使用ART探针作为模板通过DNA聚合酶延伸辅助引物的3’端，因此产生双链有功能的IIS型限制性识别位点。在图8B中，通过辅助引物和ART探针之间的杂交产生双链有功能的IIS型限制性识别位点。通过IIS型限制性内切酶(如FokI)消化ART探针的双链靶互补部分的靶链，而ART探针链由于修饰的核苷酸而抗切割。使用ART探针作为模板通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端。消化和延伸重复多次，因此产生多个单链末端产物(SSEP)拷贝。在图8A中，探针是线性分子，SSEP与探针的限制性消化位点的5’序列，包括探针的5’模板部分序列和部分靶互补部分序列互补。因为探针的3’和5’模板部分包括完全相同或者几乎完全相同的序列，SSEP的3’端与3’模板部分互补。SSEP和游离探针的3’模板部分退火并通过DNA聚合酶延伸，因此形成双链ART探针，引发重复消化和延伸。在图8B中，探针是环状分子，SSEP与ART探针的整个序列互补。SSEP和游离ART探针完全或者部分地退火并通过DNA聚合酶延伸，因此形成双链ART探针，引发重复消化和延伸。优选可通过具有链置换活性或含有其它链置换因子的DNA聚合酶延伸SSEP的3’端或经消化的链的3’端。因为等位基因特异性ART探针包括不同的模板部分，因此由等位基因特异性ART探针产生的SSEP是不同的，并且可通过检测方法区别。优选的检测方法是使用在接下来的实例中描述的SSEP DNA酶。
下面概括本发明通过DNA酶介导检测单链末端产物-SSEP的方法的实例(图10)：
ART探针的模板部分包括脱氧核酶，例如10-23DNA脱氧核酶的互补(反义)序列。在CELA反应期间，产生含有脱氧核酶活性(有义)拷贝的SSEP。DNA酶结合RNA或者DNA-RNA嵌合报告底物，其含有掺入脱氧核酶切割位点任何一侧的荧光共振能量转移荧光团。该报告底物的切割产生荧光的增加，从而指示SSEP的成功扩增。
I材料
A.靶序列
靶序列是与ART探针和辅助引物杂交的目标，也是起始扩增和检测的目标，它可以是任何核酸。靶序列可以是任何RNA、cDNA、基因组DNA、导致疾病的微生物DNA、任何病毒DNA、RNA等。靶序列也可以是经化学试剂、各种酶以及物理暴露处理的DNA，RNA。
B.扩增重复模板(ART)探针
扩增重复模板(ART)探针是单链或部分双链的线性或者环状核酸分子，通常含有20到2000个的核苷酸，优选约30到300个核苷酸，最优选约40到150个核苷酸。ART探针的一些部分有特定的功能，使ART可用于指数扩增和线性扩增的联合扩增(CELA)。ART探针可包括靶互补部分、模板部分、酶作用部分、含有或者不含3’端阻滞部分。ART探针可包括使探针的一部分成为双链的辅助引物。ART探针可包括反义DNA酶或者反义RNA酶。ART探针可不包括所有的部分，也可包括额外的部分。
1.靶互补部分
探针的靶互补部分可以是支持靶互补部分和靶序列之间特异性稳定杂交的任何长度。为此，优选9到90个核苷酸长的靶互补部分，最优选15到40个核苷酸长。
探针的靶互补部分与感兴趣的靶区互补或者基本上互补。所选的感兴趣的靶区域可以是任何期望的序列，其可包括SNP位点、突变序列、甲基化位点、剪接位点、限制性位点、以及感兴趣的任何具体序列。
在靶和探针之间的特异性杂交之后，探针的靶互补部分形成双链。探针的靶互补部分与感兴趣的靶区杂交，因此所述探针的酶作用部分中的一个或多个或者其一部分变得部分或全部有功能。一些实施方案中，与探针的靶互补部分杂交的耙区通过作用于探针的酶作用部分的消化试剂消化或者切开。在另一个实施方案中，探针的靶互补部分与靶序列的游离的3’端杂交，其使用所述的探针作为模板通过DNA聚合酶延伸，因此探针上的其它酶作用部分形成双链并有功能。
2.酶作用部分
ART探针包括至少一个酶作用部分。酶作用部分通常有以下特性：(a)当是单链时，通常没有功能，当是完全双链或者部分双链时，完全或者部分有功能；(b)它支持核酸双螺旋中的一条链的消化(例如RNA酶H消化位点)，或者支持重复消化和延伸(例如限制性酶切位点)，或者支持重复聚合(例如RNA聚合酶启动子)。ART探针可能通常需要包括至少一个支持重复消化和延伸的酶作用部分，或者需要包括一个支持消化的酶作用部分以及另一个支持重复聚合的酶作用部分。酶作用部分可包括，但是不限于，限制性酶切位点、RNA酶H消化位点、其它核酸酶消化位点、以及RNA聚合酶启动子序列。酶作用部分可包括RNA酶H作用序列和RNA聚合酶启动子的组合，或者RNA酶H作用序列和核酸酶消化位点的组合，或者核酸酶消化点和RNA聚合酶启动子的组合，或者一个以上核酸酶消化位点的组合。酶作用部分可包括所提到的酶或者其它有相似活性的酶的序列的任何其它组合。
酶作用部分可位于探针的任何位置，例如在靶互补部分之内，或者在靶互补部分的任一侧，或者在模板部分。
如果酶作用部分包括核酸酶消化位点，可修饰探针的核酸酶消化位点的核苷酸使得探针抗核酸酶消化，而探针的相反链则对消化敏感。可使用修饰核苷酸使核苷酸抗核酸酶切割的任何方法，例如核苷酸之间的硫代磷酸键、甲基化的核苷酸。优选硫代磷酸化的核苷酸。或者，如果酶作用部分包括切口限制酶切位点，例如N.Bpu10I位点、N.BstSE位点，探针序列上的核苷酸修饰不是必需的。
在一些实施方案中，酶作用部分包括限制性位点(图1和图2)。限制性位点具有限制性酶识别序列和切割位点。ART探针上的限制性切割位点可包括修饰的核苷酸以至于探针抗核酸酶消化。ART探针可包括一个或者一个以上位于靶互补部分内或在靶互补部分的任何一侧的限制性酶切位点。
在一些实施方案中，ART探针包括IIS型限制性酶切位点作为酶作用部分之一(图1D，IE，1J，1K，1L和图7)。因为IIS型酶切掉远离限制性识别位点的数个碱基，切割位点可以或者优选位于探针的靶互补部分。修饰探针靶互补部分切割位点的核苷酸以阻滞对探针的切割。为了进行SNP基因分型，优选靶分子上的消化位点也是SNP或者突变位点，优选IIS型限制性酶在SNP核苷酸或者突变核苷酸的3’侧切割。为了检测核苷酸甲基化，优选靶分子上的消化位点也是甲基化位点。
为了有功能，探针的IIS型限制性酶切位点必须转换成双链形式，这是指其识别位点和切割位点两者。在CELA反应开始时，靶通过和探针的特异性杂交开始扩增。这种杂交产生IIS型限制性内切酶的双链切割位点。在反应的同一阶段，IIS型限制性识别位点通过下列方法形成双链。首先，IIS型限制性识别序列与辅助引物杂交(图1D，IE，IJ，1K，1L，图7A，7C，7D，7F，7G，7H，7I，7J)，因此形成双链。其次，辅助引物的靶互补序列与邻近ART探针杂交区的靶区杂交(图7B，7E)，而辅助引物的3’端序列和IIS型限制性识别位点的3’序列退火。使用探针作为模板通过DNA聚合酶延伸辅助引物的3’端；因此形成有功能的双链IIS型限制性识别位点。
在一些实施方案中，当靶序列是RNA时，在CELA反应的开始，靶RNA通过与探针特异性的杂交开始扩增(图3，4)。这种杂交产生双链特异性核糖核酸酶的双链有功能的酶作用部分序列。例如，RNA/DNA双链上的靶RNA序列可在各种非特异性位点被R NA酶H消化。在一个实施方案中，靶互补部分的一部分(优选3’部分序列)可由RNA产生(图3D，3E，3F)。靶RNA序列和ART探针的靶互补部分之间的杂交形成具有RNA/DNA杂交体的部分和具有RNA/RNA杂交体的部分。RNA/RNA杂交体上的靶RNA抗RNA酶H切割，因此靶RNA并未被RNA酶H完全消化。这种方法使RNA序列的一部分保持完整，结果可通过DNA聚合酶延伸经消化的RNA的3’端。也优选修饰ART探针上的RNA部分以便其不被任何核酸酶消化。修饰的核苷酸可包括硫代磷酸键。
在一些实施方案中，酶作用部分之一是RNA聚合酶启动子序列(图5，6)。RNA聚合酶启动子包括被RNA聚合酶识别的启动子序列和位于模板部分和启动子序列之间的转录起始区。启动子可以是任何适合的RNA聚合酶的启动子。RNA聚合酶启动子的实例是大肠杆菌(E.coli)和噬菌体T7，T3和SP6的聚合酶。优选RNA聚合酶是噬菌体来源的RNA聚合酶，尤其是T7聚合酶。因为启动子序列通常是被特异性RNA聚合酶识别，应当用ART探针启动子部分的关连聚合酶进行转录性扩增。启动子序列可位于探针的任何部位。如果探针是线性的，优选启动子紧邻靶互补部分并且其取向可促进向ART探针的5’端进行的转录。
3.模板部分
ART探针包括至少一个模板部分。如果ART探针是线性分子，优选两个包括完全相同或者几乎完全相同序列的模板部分。如果ART探针是环状分子，整个ART探针作为模板，这样ART探针可被认为包括一个模板，其中嵌入其它功能部分。模板部分可具有任何期望的长度。模板部分作为产生多个SSEP拷贝的模板以及作为SSEP退火的模板。为此，优选模板部分的长度为6到300个核苷酸，最优选模板部分长15到150个核苷酸。模板部分可具有任何期望的序列。总之，选择模板部分的序列使得其既不与核苷酸样品中的任何序列明显相似，也不与CELA反应中的其它ART探针的任何序列明显相似。
在一些实施方案中，模板部分可与靶互补部分重叠(图1F，图3C，3D，图5B，5C)。总的来说，对于线性探针，两个模板部分之间至少有一个酶作用部分，其可包括RNA聚合酶启动子或者限制性位点。ART探针3’区中的模板部分称作3’模板部分；ART探针5’端中的模板部分称作5’模板部分。5’模板部分通常位于ART探针的5’最末端。3’模板部分可位于任何部位，例如在靶互补部分的任何一侧(图1B，1C，1D，IE，1G)，或者是位于靶互补部分内(图1F)。
在一些实施方案中(图10，图11)，当使用DNA酶检测单链末端产物(SSEP)时，ART探针包括与活性DNA酶(例如10-23脱氧核酶、8-17脱氧核酶或者其它脱氧核酶)互补的催化失活反义DNA酶序列。如果探针是线性分子，反义DNA酶序列优选位于5’模板部分中或者含有或者不含周围部分序列的模板部分。如果探针是环状分子，反义DNA酶序列可存在于探针的任何位置。在一些实施方案中，当SSEP是被设计作为RNA酶的RNA分子时，ART探针可包括在探针的模板部分中的反义RNA酶。
4.3’端阻滞部分
优选ART探针被位于其3’末端的封闭基团阻滞，或者该探针是环状分子(图1H，1I，1J，1K，1L，图3F，图5E，图7E，7F，7G，7H，7I，7J)，结果其不能被聚合酶延伸。可通过现有技术中任何已知的方法阻滞ART探针3’端。封闭基团是可添加到核酸上抑制核酸聚合酶催化的核酸聚合的化学部分。封闭基团典型地位于由核苷酸或其衍生物构成的ART3’末端。通过将封闭基团附着到末端3’OH，在聚合反应中3’OH基不再能够接受三磷酸核苷。
可添加很多不同的基团来阻滞探针序列的3’端。这样基团的实例包括磷酸基、烷基、非核苷酸接头、硫代磷酸、烷二醇残基、肽核酸、以及缺少3’OH的核苷酸衍生物(例如，虫草菌素(cordycepin))。
也可将ART探针的3’端附着到固相载体如载玻片、尼龙膜、塑料材料上，使得CELA反应可在固相载体上完成。
5.ART探针的其它部分
在一些实施方案中，ART探针可包括掺入引物的5’或3’末端或者内部的一个或者多个部分，它们允许与标签结合的产物通过亲和分离而与未结合的部分分离。优选的捕获部分是那些能与关连配体特异性相互作用的部分。例如，捕获部分可包括生物素、地高辛配基(digoxigenin)等。捕获基团的其它实例包括配体、受体、抗体、半抗原、酶、能够被抗体或者适体识别的化学基团。也可将捕获部分固定在任何期望的基质上。期望基质的实例包括，例如颗粒、珠、磁珠、光学诱捕珠、微量滴定板、载玻片、纸、试验条、凝胶、其它基质、硝酸纤维素、尼龙。例如，当捕获部分是生物素时，基质可包括链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，将ART探针或者一套ART探针附着在固相载体上，优选将ART探针的3’端附着在固相载体上。固相载体可包括能与寡核苷酸偶联的任何固相材料。这包括如丙烯酰胺、纤维素、硝酸纤维素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯，聚环氧乙烷、聚硅酸盐、聚碳酸酯、特氟隆(teflon)、碳氟化合物、尼龙、硅橡胶、聚酐、聚羟基乙酸(polyglycolic acid)、聚乳酸、聚原酸酯(polyorthoesters)、polypropylfirmerate、胶原、糖胺聚糖、以及聚氨基酸等材料。固态基质可具有任何有用的形式，包括薄胶片(film)或薄膜(membrane)、珠、瓶子、盘子、纤维、针织纤维、成型聚合体、颗粒以及微粒。固相载体的优选形式是载玻片。
固定在固态基质上的ART探针允许捕获特异性靶分子和固态检测器上的扩增。这种捕获提供绘制基因表达图谱以及检测多个靶的便捷方法。例如，可将对多个不同的靶序列特异的ART探针的3’端固定在载玻片上，每个固定在不同的点上。当样品中存在与具体ART探针相应的靶序列时，在对应于该ART探针的点发生靶序列特异性末端产物扩增。
已有成熟的将寡核苷酸固定到固相基质上的方法。使用公认的偶联方法可将ART探针偶联到基质上。例如，Pease等Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11)：5022-5026(1994)和Khrapko等，Mol Biol(Mosk)(USSR)25：718-730(1991)描述了合适的附着方法。Stimpson等，Proc Natl Acad Sci.USA92：6379-6383(1995)描述了在酪蛋白包被的载玻片上固定3’氨基寡核苷酸的方法。Guo等，Nucleic Acids Res，22：5456-5465(1994)描述了将寡核苷酸附着到固相基质上的优选方法。
6.辅助引物
ART探针可包括辅助引物，其包括至少一部分与所述探针的一部分互补或基本上互补(图1D，1E，1J，1K，1L，图7)。辅助引物可包括3’端阻滞部分，因此所述辅助引物的3’端不能被DNA聚合酶延伸(图1J，1K，1L，7A，7G)。辅助引物也可以不包括3’端阻滞部分，因此所述辅助引物的3’端可被DNA聚合酶延伸(图7B)。
辅助引物可包括与含有或不含侧翼序列的探针酶作用部分互补或者与探针酶作用部分的一部分互补的序列，因此所述辅助引物和所述探针之间的杂交使酶作用部分形成双链或者部分形成双链(图1D，1E，1J，1K，1L，7A，7C，7D，7F，7G，7H，7I，7J)。与探针的酶作用部分或者部分酶作用部分互补的辅助引物的序列可以是支持探针和辅助引物之间的杂交并使酶作用部分有功能或者部分有功能的任何长度。
辅助引物可包括可延伸并且与探针的酶作用部分之一的3’序列互补的3’端序列。辅助引物和探针之间杂交，以及通过DNA聚合酶延伸所述辅助引物的3’端，使酶作用部分形成双链并完全有功能，或者部分有功能(图7B，7E)。与探针酶作用部分之一的3’序列互补的辅助引物3’端序列长2到15个核苷酸，或者优选3到10个核苷酸，甚至优选4到8个核苷酸。
辅助引物可进一步包括至少一个靶互补部分，其与所述探针互补的靶区邻近或基本上邻近的靶区杂交(图1J，1K，7A-G)。辅助引物的靶互补部分可以是支持辅助引物和靶序列之间特异性和稳定性杂交的任何长度。为此，优选辅助引物的靶互补部分长9到60个核苷酸，最优选长15到40个核苷酸。
辅助引物可包括3’和5’靶互补部分。与ART探针互补的靶区位于与辅助引物互补的靶区中部，且邻近或基本上邻近与辅助引物互补的靶区(图7H-J)。
辅助引物可包括与ART探针的任何部分互补的其它序列(图1K，1L)。辅助引物可包括不与ART探针的任何部分互补的其它序列(图7J)。
辅助引物可以是任何长度，只要其能与ART探针和/或靶序列有效杂交。辅助引物可包括任何期望的核苷酸修饰。
C.检测标签
为了有助于使用CELA对扩增的核酸进行检测和定量，可将检测标签直接掺入到扩增的核酸中或者可偶联到检测分子上。如在此所使用的，检测标签是可与扩增核酸直接地或间接地结合的任何分子，其直接地或间接地导致可测量的、可检测的信号。本领域技术人员已知许多掺入到核酸中或者与核酸或抗体探针偶联的这样的标签。适于在CELA中使用的检测标签的实例是放射性同位素、荧光分子、磷光性(phosphorescent)分子、酶、抗体，以及配体。
合适荧光标签的实例包括但不局限于荧光素(FITC)、5，6-羧甲基荧光素、德克萨斯红(Texas red)、硝基苯基-2-氧杂-1，3-二唑-4-基(nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)(NBD)、香豆素、丹磺酰氯(dansyl chloride)、罗丹明(rhodamine)、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylinodole)(DAPI)，以及花菁染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。优选的荧光标签是荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基酯(5-carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimide ester))和罗丹明(5，6-四甲基罗丹明)。优选的组合多色编码(combinatorial multicolorcoding)的荧光标签是FITC以及花菁染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。这些荧光素的吸收和发射的最大波长分别是：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm：672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)以及Cy7(755nm；778nm)，因此允许它们同时检测。荧光标签可从各种商业来源获得，包括Molecular Probes、Eugene、Oreg.和ResearchOrganics、Cleveland、Ohio。
标记核苷酸是检测标签的优选形式，因为它们能在合成期间直接掺入到CELA的产物中。能被掺入到扩增的DNA或者RNA中的检测标签的实例包括核苷酸类似物，如溴脱氧尿苷(BrdUrd)(Hoy和Schimke，MutationResearch 290：217-230(1993))，BrUTP(Wansick等，J.Cell Biology 122：283-293(1993))以及用生物素修饰的核苷酸(Langer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6633(1981))或者用合适的半抗原如地高辛配基修饰的核苷酸(Kerldiof，Anal.Biochem.205：359-364(1992))。合适的荧光素标记的核苷酸是荧光素-异硫氰酸-dUTP、花菁-3-dUTP和花菁-5-dUTP(Yu等，Nucleic AcidsRes，22：3226-3232(1994)。对于DNA来说，优选的核苷酸类似物检测标签是BrdUrd(BURD三磷酸，Sigma)，对于RNA来说，优选的核苷酸类似物检测标签是生物素-16-尿苷-5’-三磷酸(生物素-16-dUTP，BocbringherManngeim)。可将荧光素、Cy3和Cy5连接到dUTP上进行直接标记。Cy3.5和Cy7可用作抗生物素蛋白或者抗地高辛配基的偶联物用于生物素或者地高辛配基所标记的探针的二次检测。
掺入到扩增核酸内的检测标签，如生物素，可随后使用现有技术中公知的敏感方法检测。例如，生物素可使用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶偶联物(Tropix，Inc)检测，其结合到生物素上，随后通过合适底物(例如化学发光底物CSPD：3-(4甲氧基螺[1，2，-二氧杂环丁烷-3-2’-(5’-氯)三环[3，3，1，13，7]癸烷]-4苯基磷酸二钠(disodium，3-(4methoxyspiro-[1，2，-dioxetane-3-2’-(5’-chloro)tricyclo[3，3，1，1，sup.3，7]decane]-4-yl)phenyl phosphate)；Tropix Inc)的化学发光进行检测。
用于检测扩增的RNA的优选检测标签是吖啶鎓(acridimium)-酯-标记的DNA探针(GenProbe，Inc，根据Arnold等，Clinical Chemistry35：1588-1594(1989)描述的方法)。吖啶鎓-酯-标记的检测探针允许不经洗涤而检测扩增的RNA，因为未杂交的探针可被碱破坏(Arnold等(1989))。
也把结合这些检测标签中的两种或多种的分子看作检测标签。已知检测标签中的任何一种可与所公开的探针、标签和方法一起用于标记和检测使用所公开的方法扩增的核酸。检测和测量由检测标签所产生的信号的方法对于本领域技术人员来说也是已知的。例如，可通过闪烁计数或者直接观察来检测放射性同位素；可用荧光分光光度计检测荧光分子；可用分光光度计或者用照相机直接观察来检测磷光分子；可通过检测或观察酶催化的反应的产物来检测酶；可通过检测与抗体偶联的第二检测标签来检测抗体。这样的方法可直接用于公开的扩增和检测方法。如在此使用的，检测分子是与扩增核酸相互作用以及与一种或者多种检测标签偶联的分子。
D.报告底物
报告底物分子可以是含有掺入脱氧核酶切割位点任一侧的荧光共振能量转移荧光团的RNA或者DNA-RNA嵌合体(Santoro等，Biochemstry1998，37，13330-13342)。可在任何期望部位将任何荧光团和任何淬灭剂掺入到报告底物中。一个实例是在5’端掺入报告物6-羧基荧光素(RAM)，在内部掺入淬灭剂6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)或者4-(4-二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(4-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid)(DABCYL)。可向3’端加入任何阻滞部分如3’磷酸基团以防止在反应期间通过DNA聚合酶引起的延伸。这种报告底物的切割产生荧光的增加，指示成功的扩增。
E.DNA聚合酶
对于指数扩增和线性扩增的联合扩增(CELA)，优选DNA聚合酶能够置换与模板链互补的链(称为链置换)，以及缺少5’到3’核酸外切酶活性。链置换对合成多个含有可能多于100个核苷酸，或者多于50个核苷酸的长序列的SSEP拷贝可能是必须的。然而，对于产生可能在3到50个核苷酸范围的短SSEP来说，链置换可能不是必须的。5’到3’核酸外切酶活性，如果存在，可能导致合成链的破坏。也优选在所公开的方法中使用的DNA聚合酶是高度持续的(highly processive)。优选的DNA聚合酶是噬菌体.phi.29DNA聚合酶(美国专利号5,198,543和5,001,050，Blanco等)、噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto等，Gene 84：247(1989))、噬菌体.phi.PRDI DNA聚合酶(Jung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8287(1987))、VENT.RTM.DNA聚合酶(Kong等，J.Biol.Chem.268：1965-1975(1993))、DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen等，Eru.J Biochem.45：623-627(1974))、T5 DNA聚合酶(Chatterjee等，Gene 97：13-19(1991))、PRD1 DNA聚合酶(Zhu和Ito，Biochim.Biophys.Acta.1219：267-276(1994))、修饰的T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson，J.Biol，Chem，262：15330-15333(1987)；Tabor和Richardson，J.Biol，Chem，264：6447-6458(1989)；测序酶TM.(U.S.Biochemicals))、T4 DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic，Curr.Biol.5：149-157(1995)、Bca聚合酶(Takara)和Bst聚合酶(NEB)。最优选.phi.29和Bst DNA聚合酶。
使用链置换因子，如解旋酶，可便于链置换。据认为任何可在链置换因子存在的情况下进行链置换的DNA聚合酶都适合在所公开的方法中使用，即使在缺乏这样的因子时，该DNA聚合酶不进行链置换也是如此。在CELA中有用的链置换因子包括，但不限于，BMRF1聚合酶副亚单位(accessory subunit)(Tsurumi等，J.Virology 67(12)：7648-7653(1993))、腺病毒DNA结合蛋白(Zijerveld和van der Vliet，J.Virology68(2)：1158-1164(1994))、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Bochmer和Lehman，J.Virology 67(2)：711-715(1993))；Skaliter和Lehman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(22)：10665-10669(1994))、单链DNA结合蛋白(SSB；Rigler和Romano，J.Biol.Chem.270：8910-8919(1995))、以及小牛胸腺解旋酶(Siegel等，J.Biol.Chem.267：13629-13635(1992))。
E.RNA聚合酶
能进行体外转录并且已经鉴定了其启动子序列的任何RNA聚合酶都可在所公开的CELA方法中使用。优选没有复杂要求的稳定的RNA聚合酶。最优选的是对具体启动子序列高度特异(Schenborn和Meirendorf，NucleicAcids Research 13：6223-6236(1985))的T7 RNA聚合酶(Davanloo等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 81：2035-2039(1984))和SP6 RNA聚合酶(Butler和Chamberlin，J.Biol.Chem.257：5772-5778(1982))。也优选具有这种特征的其它RNA聚合酶。因为启动子序列通常被特异的RNA聚合酶识别，因此ART探针应该含有能被所用的RNA聚合酶识别的启动子序列。很多启动子序列是已知的，可使用具有已鉴定的启动子序列的任何合适的RNA聚合酶。
F.限制性内切酶和核糖核酸酶
所公开的方法可使用限制性内切酶(也称作限制性核酸内切酶)切割双链核酸中的一条链。也可使用其它核酸切割试剂。优选的核酸切割试剂是那些以序列特异性方式切割核酸分子的试剂。许多限制性内切酶是已知的，可与所公开的方法一起使用。限制性内切酶通常有识别序列和切割位点。
在一些实施方案中，用核糖核酸酶消化与探针杂交的靶RNA。这样的核糖核酸酶消化在双链RNA-DNA杂交体上发现的RNA链。在本发明的实践中使用的这样核糖核酸酶的一个实例是RNA酶H。RNA酶H是一种RNA特异性的消化酶，其以非序列特异性的方式切割在DNA-RNA杂交体上发现的RNA。其它核糖核酸酶和酶可能适合切割或者部分消化RNA/DNA链的RNA，如Exo III和逆转录酶。
上面所描述的材料可以任何合适的组合包装成用于实施所公开方法的试剂盒。
II.方法
本发明提供允许进行指数扩增和线性扩增的联合扩增的专门设计的探针。探针是线性分子或者环状分子。
指数扩增和线性扩增的联合扩增(CELA)的起始依赖于靶序列和包括辅助引物的ART探针之间的特异性杂交。在具有靶序列的DNA或者RNA分子存在的情况下，ART探针的靶互补部分与靶序列杂交形成双链，其形成有功能的或者部分有功能的酶作用部分序列，允许靶序列通过DNA聚合酶延伸或者被消化试剂消化或部分消化，然后通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端，因此产生其它有功能的酶作用部分。随后的重复聚合产生单链末端产物(SSEP)的多个拷贝，其然后与游离ART探针退火、引发新的延伸，以及产生新的SSEP。
当个别ART探针产生多个SSEP拷贝时发生线性扩增。在与游离ART探针退火并引导产生新SSEP的SSEP重复复制过程中发生指数扩增。当在反应中有游离ART探针时，反应可联合指数和线性扩增；而所有ART分子与SSEP杂交形成双链后，线性扩增占优势。
在所公开的方法中核酸扩增后，可使用任何常规的检测系统如荧光标签检测、酶联检测系统、微阵列杂交、毛细管和凝胶电泳、荧光偏振、质谱分析法、荧光共振能量转移(FRET)、时间分辩荧光检测、电检测、以及发光检测，来检测和定量扩增的双链末端产物、单链末端产物(SSEP)和焦磷酸(PPI)。
本发明也提供使用脱氧核酶进行的检测方法。ART探针包含脱氧核酶互补(反义)序列。在扩增期间，产生含有脱氧核酶活性(有义)拷贝的单链末端产物，其切割在反应混合物中所包含的报告底物。
CELA反应的主要步骤描述如下。所有的步骤可作为单个反应在单个试管中完成，或者作为分开的反应在不同的试管中完成。优选单个反应方式。
A.靶特异性杂交
在适宜的杂交条件下，将ART探针或者一套ART探针或者ART探针和辅助引物的混合物与含有靶DNA、RNA或者二者的样品孵育，结果在ART探针或辅助引物的靶互补部分中形成双链DNA/DNA或者DNA/RNA杂交体，由此探针的酶作用部分之一变成部分或者完全有功能。如果酶作用部分之一是位于靶互补部分内的限制性位点，杂交使限制性位点形成双链因而有功能。如果酶作用序列之一是IIS型限制位点且切割位点位于靶互补部分内，杂交使限制性切割位点形成双链因此IIS型限制性位点部分有功能。如果酶作用序列之一是与靶互补部分重叠的RNA酶H作用序列，杂交使RNA酶H作用序列形成双链因而完全有功能。严格的杂交件允许随后的扩增依赖靶序列和ART探针之间的精确配对，结果可区别等位基因。
辅助引物，如果用在CELA反应中使用，可与靶和ART探针两者杂交，因此促进靶和探针之间的特异杂交。
B.使探针的所有酶作用部分形成双链而且完全有功能
在一些实施方案中，当靶核酸是RNA时，在步骤(A)中形成有功能的酶作用部分，RNA酶H消化位点(图3，4)。为了使探针的所有其它酶作用部分形成双链并完全有功能，这个步骤包括：通过RNA酶H消化RNA链，使用探针作为模板通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端，因此探针上的所有其它酶作用部分形成双链且有功能。探针上的其它酶作用部分可包括限制性位点或者RNA聚合酶启动子或者限制性位点和RNA聚合酶启动子两者。在其它实施方案中，使经部分消化的链的3’端延伸可进一步包括通过DNA聚合酶或者其它链置换因子进行链置换。
RNA酶H是RNA特异性消化酶，其以非序列特异性方式切割DNA/RNA杂交体上发现的RNA。为了防止RNA链的完全消化，ART的靶互补部分的一部分由RNA构成(图3D)，因此RNA/RNA杂交体抗RNA酶H的消化。
在一些实施方案中，当酶作用部分之一是限制性位点且位于ART探针的靶互补部分内时，步骤(A)使所述限制性位点完全有功能。为了使探针的所有其它酶作用部分形成双链且完全有功能，这个步骤包括消化所述探针的相反链并且使用探针作为模板通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端，因此探针上的所有其它酶作用部分形成双链并有功能。在所述探针上的其它酶作用部分可包括其它限制性位点、RNA聚合酶启动子或者限制性位点和RNA聚合酶启动子两者。或者，所述限制性位点是探针上的唯一的酶作用部分。在其它实施方案中，经消化的链的3’端的延伸可进一步包括通过DNA聚合酶或者其它链置换因子进行链置换。
在一些实施方案中，当酶作用部分之一是IIS型限制性位点时，IIS型限制性位点的切割位点在探针的靶互补部分上而且IIS型限制性位点的识别位点在探针的靶互补部分的任一侧，步骤(a)使探针的靶互补部分形成双链，由此形成IIS型限制性位点的功能性切割位点，步骤(b)包括：将辅助引物和探针退火，使IIS型限制性位点的识别序列形成双链。在一个实施方案中，辅助引物和探针退火并使IIS型限制性位点的识别序列形成双链的步骤包括：将辅助引物和含有或不含有侧翼序列的IIS型限制性内切酶识别序列直接退火，因此形成IIS型限制性位点的双链识别序列。在另一个实施方案中，辅助引物和探针退火并使IIS型限制性位点的识别序列形成双链的步骤包括：将辅助引物的3’端序列和IIS型限制性识别序列的3’序列退火，使用探针作为模板通过DNA聚合酶延伸辅助引物的3’端序列，因此形成IIS型限制性位点的双链识别序列。
为了进行基因分型，尤其是对SNPs基因分型或者核苷酸甲基化，靶特异性ART探针、辅助引物和IIS型限制性内切酶都包括在反应中(图8和图13)。使用IIS型限制性内切酶的优点是，用于分析的靶序列不必限于含有任何特异性序列，例如限制性内切酶位点。可在所有检测反应中使用通用的限制性内切酶。IIS型限制性识别位点通常位于ART探针的靶互补部分的任一侧(图1D和IE，7A，7B，7C和7D)，而IIS型限制性切割位点位于靶互补部分上。优选IIS型限制性切割SNP核苷酸的3’、突变核苷酸、甲基化核苷酸、剪接连接核苷酸、以及感兴趣的其它特异性核苷酸。IIS型限制性内切酶之一可以是FokI。FokI限制性内切酶在任何预定位点切割DNA，所述DNA含有寡脱氧核苷酸接头-引物，其通过ART探针和辅助引物退火或者ART探针模板上的辅助引物的延伸形成。ART的靶互补部分选择变性的靶DNA或者RNA上的互补序列，与之杂交形成双链切割位点。然而在FokI酶可切割靶链之前，ART上的单链FokI识别位点必须转化为有功能的双链DNA。这可通过辅助引物完成。在一些实施方案中，辅助引物和ART探针的靶互补部分与邻近位点的靶杂交，辅助引物和ART探针的一些部分互相杂交。在另外一些实施方案中，设计辅助引物和ART探针，使得它们仅仅在特异性靶存在时才互相退火。在靶序列存在时辅助引物和ART探针退火后，DNA聚合酶通过拷贝ART探针的模板部分而延伸辅助引物的3’端，产生双链有功能的FokI识别位点(图8和13)。
在本发明的一些具体实例中，当ART的靶互补部分与可以是任何来源的靶DNA或RNA分子的游离3’端杂交时，可直接使用ART探针做为模板通过DNA聚合酶延伸靶的3’端。因此，不需要消化靶链就形成了所有有功能的酶作用部分。
在一些CELA反应中，可通过下列因素获得高度特异性。首先，ART探针的靶互补部分和靶序列之间的靶特异性杂交提供了最初的特异性水平。其次，辅助引物和ART探针的退火和/或使用探针做为模板使辅助引物3’端延伸可能仅在存在将ART探针和辅助引物结合在一起的靶序列时发生。第三，如果偶然发生非靶特异性杂交，IIS型限制性内切酶(如果使用)不切割或者不能有效地切割切割位点上的错配，这样就不发生链式反应。最后，如果发生非靶特异性杂交和IIS型限制性内切酶的错配切割，那么由于错配的核苷酸，切口位点的3’端可能不能通过DNA聚合酶延伸。
C.处理含有双链酶作用部分的探针以至于产生单链末端产物(SSEP)
在一些实施方案中，当探针的酶作用包括限制性酶切位点时，步骤(c)包括：通过限制性内切酶在限制性位点消化探针的相反链，通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端，重复消化和延伸，因此产生多个SSEP DNA拷贝。在其它实施方案中，延伸经消化的链的3’端可进一步包括通过DNA聚合酶或其它链置换因子进行链置换。在材料部分中描述了合适的DNA聚合酶和限制性内切酶。
在一些实施方案中，当探针的酶作用部分包含RNA聚合酶启动子时，步骤(c)包括：重复进行通过RNA聚合酶作用于RNA聚合酶启动子上而发生的转录，由此产生多个SSEP RNA拷贝。
在一些实施方案中，当探针的酶作用部分包括限制位点和RNA聚合酶启动子两者时，步骤(c)包括：通过限制性内切酶在限制位点消化探针的相反链，通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3’端，重复消化和延伸，因此产生多个SSEP DNA拷贝，重复由RNA聚合酶作用于RNA聚合酶启动子而发生的转录，由此产生多个SSEP RNA拷贝。在其它实施方案中，延伸经消化的链的3’端可进一步包括通过DNA聚合酶或其它链置换因子进行链置换。
D.SSEP和游离探针退火并使所述探针的所有酶作用部分形成双链并完 全有功能
在一些实施方案中，当SSEP是DNA分子或RNA分子或者DNA和RNA分子两者时，步骤(d)包括：SSEP和游离探针的序列部分退火，使用游离探针做为模板，延伸SSEP的3′端，因此探针的所有酶作用部分形成双链并有功能。当探针是线性分子时，SSEP与包括5′模板部分序列的探针酶作用部分(例如限制性位点)之一的5′序列互补。因为探针的3′模板部分和5′模板部分包含完全相同或几乎完全相同的序列，SSEP的3′端与3′模板部分互补。SSEP和游离探针的3′模板部分退火并通过DNA聚合酶延伸，因此形成引发重复消化和延伸的双链ART探针。当探针是环状分子时，SSEP与ART探针的整个序列互补。SSEP和游离ART探针完全或部分退火并通过DNA聚合酶延伸，因此形成引发重复消化和延伸的双链ART探针。优选SSEP的3′端或经消化的链的3′端的延伸可通过具有链置换活性或含有其它链置换因子的DNA聚合酶进行。
在一些实施方案中，当SSEP是RNA分子时，步骤(d)包括：SSEP和游离探针的序列部分退火、通过RNA酶H消化SSEP、使用游离探针做为模板延伸经部分消化的SSEP的3′端，因此所有酶作用部分形成双链并有功能。
在一些实施方案中，当探针是环状分子时，SSEP的序列包括一个或一个以上与探针的整个序列互补的序列单位，步骤(d)包括：SSEP和游离探针的整体或部分退火，因此酶作用部分形成双链并有功能。
如果探针是线性分子，SSEP与探针的3′模板部分退火因此引发链反应。SSEP和探针的3′模板部分退火的可能性视不同的探针设计而不同。因为SSEP是从5′模板部分区产生，因此SSEP更倾向于和游离ART探针的5′模板部分而不是3′模板部分退火。然而，如果3′和5′模板部分序列完全相同，SSEP可与两部分同样地退火。在任何情况下，与3′模板部分退火的一小部分SSEP可能足以引发链反应级联。
如果探针是仅包括一个模板部分的环状分子，SSEP可包括一个或多个与全部环状ART探针互补的完全单位。因为SSEP与环状ART探针的完全互补，SSEP可立即和游离的环状ART探针退火，并可有效引发链反应。
E.重复步骤(C)和(D)，由此ART探针转换成双链或部分双链形式，并重 复产生多个SSEP拷贝
因为所有的试剂在单个试管中，所有的上述步骤可同时发生，步骤之间没有明显的边界。步骤C和D重复多次。只要有游离的ART探针，反应可保持指数扩增和线性扩增的联合扩增。一旦所有的ART探针与SSEP杂交，线性扩增可占优势。反应聚集可被标记和检测的双链多核苷酸、单链SSEP和焦磷酸。
F.检测
可使用任何常规的检测系统检测和定量扩增的双链末端产物、单链SSEP和焦磷酸。例如，可通过荧光检测、荧光偏振、荧光共振能量转移、质谱分析法、电检测、以及微阵列检测双链ARTs和单链SSEP。具体地，可通过结合双链特异性荧光染料SYBR绿来检测双链ARTs。在本发明中，如下面所概括的，通过脱氧核酶介导的切割来检测单链SSEP。产生的焦磷酸可被转化成ATP，所得ATP的浓度用萤火虫萤光素酶检测和定量(图9)。
可通过掺入标签部分来检测CELA产物，所述标签部分如荧光核苷酸、生物素化核苷酸、含有地高辛配基的核苷酸、或溴脱氧尿苷。
在一个绘制基因表达图谱的实施方案中，可使用微阵列检测系统。通过使用一系列不同的扩增重复模板(ART)探针进行多重CELA，每个ART探针携带为结合特异性靶基因而设计的不同靶互补部分，每个ART探针也携带为SSEP结合微阵列上的特异性寡核苷酸而设计的不同模板部分。只有那些能与其靶杂交的ART探针才能产生其特异性SSEP。在另一个绘制基因表达图谱的实施方案中，将ART探针点到微阵列上。在CELA反应期间，产生双链ART，并可使用各种检测系统检测和定量。检测系统之一是使用可实时监控的SYBR绿染色。
G.脱氧核酶介导的单链末端产物-SSEP的检测
本发明也利用脱氧核酶检测末端产物-单链SSEP(图10)。ART的模板部分包括DNA酶，例如10-23脱氧核酶的互补(反义)序列。在CELA反应期间，产生含有活性(有义)脱氧核酶拷贝的SSEP。DNA酶结合RNA或DNA-RNA嵌合报告底物，后者含有掺入脱氧核酶切割位点任一侧的荧光共振能量转移荧光团。这种报告底物的切割产生荧光增强，指示成功的CELA扩增。
实施例1
DNA和RNA分离。用标准方法从小鼠肝中分离出基因组DNA。根据供应商推荐的方法使用RNAzol B试剂(Biogenesis Ltd)从小鼠胸腺和脾脏中分离总RNA。通过使用mRNA分离试剂盒(Qiagen)从总RNA中进一步纯化Poly(A)+RNA。
寡核苷酸探针：ART探针及其靶序列β肌动蛋白基因示于图11。ART探针导5′- dCCGGAGACGTCGTTGTAGCTAGCCTGCGTCs AACAAGCCsGGCTTTGCACATG CCGGAGACGTCGTTGp-3′。斜体核苷酸是HincII(在第28到33之间)和NaeI(在第36到41之间)的识别位点，有下划线的核苷酸(3′和5′末端的15个碱基)是模板序列。“s”表示硫代磷酸键。“p”代表3′磷酸。底物探针是RNA/DNA嵌合寡核苷酸5′-dCCGGAGACGau GCGTCAp-3′，小写字母是RNA碱基。在5′末端第7核苷酸掺入6-羧基荧光素(FAM)，在5′末端第13核苷酸掺入淬灭剂4-(4-二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)。
CELA反应条件如下：50mM磷酸钾，pH7.6，7.5mM氯化镁，8％甘油，0.1mg/ml BSA，1000nM ART探针，各200nM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，100单位Hinc II限制性内切酶(New England Biolabs)，1单位exo-Klenow(New England Biolabs)，0.1单位RNA酶H(Gibco BRL)以及指定量的小鼠mRNA。对于每个样品，将除了Hinc II，Klenow和RNA酶H以外的所有试剂集中到微量离心管中，将样品在70℃加热3分钟，然后在室温平衡。然后加入单一等分的酶，将反应置于室温5分钟。然后将反应在37℃孵育指定的时间。对产物进行凝胶电泳或荧光检测。
使用相同的ART探针进行CELA实验，所述探针靶向基因组DNA来源和mRNA来源的小鼠β肌动蛋白基因。含有5ng小鼠mRNA的样品在不同的时间点进行CELA反应(图12A)。可在20分钟检测到双链末端产物，在60分钟内见到单链末端产物。含有不同量mRNA的样品进行60分钟CELA反应(图12B)。在含有10pg mRNA的反应中检测到双链产物。
末端产物之一-单链分子-是通过催化底物而检测到的脱氧核酶(图11)。这种DNA酶结合DNA-RNA嵌合报告底物，该底物含有掺入脱氧核酶切割位点任一侧的荧光共振能量转移荧光团。这种报告底物的切割产生荧光的增强，指示成功的CELA。
实施例2
寡核苷酸探针：ART探针、辅助引物及其靶序列示于图13。ART探针SNP-G对应于p450靶基因的C等位基因，具有5′CCGGAGACGTCGTTGTAGCTAGCCTGCGTCAGGATGCAGCAGCTTsTsCTTGAAGAGCAAACCGGAGACGTCGTTGp 3′序列。ART探针SNP-A对应于p450靶基因的T等位基因，具有5′CCGGAGACGTCGTTGTAGCTAGCCTGCGTCAGGATGCAGCAGCTTsTsCTTAAAGAGCAAACCGGAGACGTCGTTGp 3′序列。合成的靶寡核苷酸是：靶-C(TARGET-C)，具有5′CCGGTTTG CTCTTCAAGAAAGCTGTGCCCCAGAACACCAGAGp3′序列；靶-G(TARGET-G)，具有5′CCGGTTTGCTCTTTAAGAAAGCTGTGCCCCAGAACACCAGAGp3′序列。辅助引物具有5′CTCTGGTGTTCTGGGGCACTGCA3′序列。“s”表示硫代磷酸键。“p”代表3′磷酸。
CELA反应条件如下：50mM磷酸钾，pH7.6，7.5mM氯化镁，5％甘油，0.1mg/ml BSA，1000nM ART探针，各200nM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，50单位FokI限制性内切酶(New England Biolabs)，1单位exo-Klenow(NewEngland Biolabs)，10-100nM辅助引物，以及指定量的人DNA或靶寡核苷酸。对于每个样品，将除了FokI，Klenow以外的所有试剂集中到微量离心管内，将样品在95℃或70℃加热3分钟，接着在室温平衡。然后加入酶，将反应置于室温5分钟。接着将反应在37℃孵育指定时间。对产物进行凝胶电泳或荧光检测。
在CELA实验中使用以前通过其它方法进行SNP基因分型并且在p450基因座位的C等位基因处为纯合子的人DNA样品。当使用50ng基因组DNA时，凝胶电泳能在30分钟时检测出双链末端产物。特异性试验显示，当反应中缺乏DNA模板或辅助引物或者FokI或Klenow时，CELA反应不会发生。用合成的靶寡核苷酸进行灵敏度实验，CELA能够在3小时反应中检测到少至0.1amol的靶。SNP基因分型反应表明，等位特异性探针只与其对应的靶反应。
实施例3
寡核苷酸探针：在图14中举例说明ART探针及其靶序列。
ART-T7具有5′GCCGTAACGGCCGTACCTATAGTGAGTCGTATTAAGCCGGCTTTGCACsAsUsGsCsCsGsGCAAUGCCGp3序列。3′端的15个核苷酸(第49到63之间)是RNA核苷酸。第16到33之间的18个核苷酸是T7 RNA聚合酶启动子序列。在3′和5′两端的15个核苷酸是模板部分序列。靶互补部分序列是在第34到55核苷酸之间。“s”表示硫代磷酸键。“p”代表3′磷酸。
CELA反应条件如下：1x转录缓冲液，1000nM ART探针，各5μM的dATP，dCTP，dGTP和dTTP，各2mM的ATP，CTP，GTP和UTP，200单位T7 RNA聚合酶，0.1单位RNA酶H，1单位exo-Klenow(New EnglandBiolabs)，以及不同量的靶RNA。对于每个样品，将除了T7 RNA聚合酶，Klenow和RNA酶H以外的所有试剂集中到微量离心管内，将样品在70℃加热3分钟，然后在室温平衡。接着加入酶，将反应置于室温5分钟。然后将反应在37℃孵育指定的时间。对产物进行凝胶电泳或荧光检测。
在CELA实验中，用小鼠总RNA作模板。当反应中包括所有成分时，结果显示发生特异性CELA，并在1ng总RNA样品中检测到靶RNA。
实施例4
寡核苷酸探针：通过具有5′pGGATGCAGCAGCTTsTsCTTGAAGAGCAAACCGGAGACGTCGTTGTAGCTAG CCTGCGTCA 3′序列的线性寡核苷酸和具有5′CTCTGGTGTTCTGGGGCACTGCATCCTGACGCAGAAp3′序列的辅助引物之间的杂交，以及连接制备环状ART探针。所有其它寡核苷酸与实施例2中描述的相同。
CELA反应条件如实施例2中描述的条件，进行类似的实验。在凝胶电泳和在实时荧光检测中监控成功的CELA反应。
除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语与所公开的发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。尽管在本发明的实践或检验中可使用任何与这里所描述的那些相似或等同的方法和材料，但描述了优选的方法、设备和材料。这里将所有引用的出版物结合起来作为参考。
那些本领域的技术人员将会认识到，或者能够确定不超出常规的实验，使用许多与这里所描述的本发明的具体实施方案等同的实施方案。

Claims (57)

1.包含单链核酸或部分双链核酸的探针分子，其中所述探针包括：靶互补部分、模板部分、至少一个酶作用部分、有或无3′端阻滞部分。
2.根据权利要求1的探针，其中所述单链核酸或部分双链核酸是线性分子。
3.根据权利要求1的探针，其中所述单链核酸或部分双链核酸是环状分子。
4.根据权利要求1的探针，其中所述酶作用部分包括RNA聚合酶启动子。
5.根据权利要求1的探针，其中所述酶作用部分包括RNA酶H作用序列。
6.根据权利要求1的探针，其中所述酶作用部分包括核酸酶消化位点，其中当形成双链时，所述核酸酶消化位点支持消化所述探针的相反链。
7.根据权利要求6的探针，其中所述酶作用部分包括，RNA酶H作用序列和RNA聚合酶启动子的组合，或RNA酶H作用序列和所述核酸酶消化位点的组合，或者所述核酸酶消化位点和RNA聚合酶启动子的组合，或一个以上所述核酸酶消化位点的组合。
8.根据权利要求6的探针，其中所述核酸酶消化位点包括修饰的核苷酸，因此所述探针的消化位点抗核酸酶切割，未修饰的相反链对切割敏感。
9.根据权利要求8的探针，其中所述修饰的核苷酸包括硫代磷酸键，
10.根据权利要求6的探针，其中所述核酸酶消化位点包括具有限制性内切酶识别序列和切割位点的限制性位点。
11.根据权利要求10的探针，其中所述限制性位点包括IIS型限制性内切酶位点。
12.根据权利要求11的探针，其中所述IIS型限制性位点的酶切割位点位于靶互补部分。
13.根据权利要求12的探针，其中所述IIS型限制性内切酶切割位点相对应于SNP位点、突变核苷酸、甲基化核苷酸或剪接位点。
14.根据权利要求11的探针，其中所述IIS型限制性位点是Fok I位点。
15.根据权利要求1的探针，包括辅助引物，其中所述辅助引物包括至少一个与所述探针的一部分互补或基本上互补的部分。
16.根据权利要求15的探针，其中所述辅助引物包括3′端阻滞部分，因此所述辅助引物的3′端不能通过DNA聚合酶延伸。
17.根据权利要求15的探针，其中所述辅助引物不包括3′端阻滞部分，因此所述辅助引物的3′端可通过DNA聚合酶延伸。
18.根据权利要求15的探针，其中所述辅助引物包括与含有或不含侧翼序列的酶作用部分或者与所述探针的部分酶作用部分互补的序列，因此所述辅助引物和所述探针之间的杂交使酶作用部分形成双链或部分形成双链。
19.根据权利要求15的探针，其中所述辅助引物包括与所述探针的酶作用部分之一的3′序列互补的3′端序列。
20.根据权利要求15的探针，其中所述辅助引物进一步包括靶互补部分，其中与所述辅助引物互补的靶区邻近或基本上邻近与所述探针互补的靶区。
21.根据权利要求20的探针，其中所述辅助引物包括3′和5′靶互补部分，其中与所述探针互补的靶区位于与所述辅助引物互补的靶区中间，且邻近于或基本上邻近于与所述辅助引物互补的靶区。
22.根据权利要求1的探针，其中所述靶互补部分包括与感兴趣的靶区互补或基本上互补的序列，其中所述探针的所述靶互补部分与所述感兴趣的靶区杂交，形成双链，其中所述探针的一个或一个以上的酶作用部分或者一部分酶作用部分是部分地或完全地具有功能。
23.根据权利要求1的探针，其中所述探针的所述酶作用部分、所述靶互补部分和所述模板部分互相重叠或有一部分嵌入其它部分。
24.根据权利要求1的探针，其中所述探针的所述靶互补部分和/或所述酶作用部分和/或所述模板部分包括修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸抗核酸酶的切割。
25.根据权利要求1的探针，其中所述探针的所述靶互补部分和/或所述酶作用部分和/或所述模板部分包括嵌合RNA和DNA。
26.根据权利要求1的探针，其中所述模板部分包括两个完全相同或几乎完全相同的序列，其是通过至少一个酶作用部分分开。
27.根据权利要求26的探针，其中所述至少一个酶作用部分包括RNA聚合酶启动子。
28.根据权利要求26的探针，其中所述至少一个酶作用部分包括限制性内切酶位点。
29.根据权利要求3的探针，其中所述探针是环状探针，其中所述环状探针包括一个模板部分。
30.根据权利要求1的探针，其中所述探针包括在环状探针的任何部位或者在线性探针含有或不含周围部分序列的5′模板部分内与DNA酶互补的催化失活的反义序列。
31.根据权利要求30的探针，其中所述DNA酶是10-23脱氧核酶。
32.根据权利要求30的探针，其中所述DNA酶是8-17脱氧核酶。
33.根据权利要求1的探针，其中所述3′端阻滞部分是化学部分，其中探针的3′端不能通过DNA聚合酶延伸。
34.根据权利要求1的探针，其中所述探针和/或辅助引物的任何一端附着在固相支持物上。
35.一种检测样品中一个或多个感兴趣靶核酸序列的方法，该方法包括下列步骤：
(a)将根据前面权利要求中的任何一项的探针或一套探针在适当的杂交条件下与核酸样品接触，其中所述探针的靶互补部分或者所述探针和辅助引物两者的靶互补部分与靶序列杂交形成双链，其中所述探针的一个或一个以上的酶作用部分或者部分酶作用部分是部分地或完全地具有功能；
(b)使所述探针的所有酶作用部分形成双链，并完全有功能；
(c)处理含有双链酶作用部分的所述探针，以产生单链末端产物(SSEP)；
(d)将所述SSEP与游离探针退火，使所述探针的所有的酶作用部分形成双链，并完全有功能；
(e)重复步骤(c)和(d)，其中将所述探针转化为双链或部分双链形式，并重复产生所述SSEP的多个拷贝；和
(f)直接或间接检测所产生的末端产物：双链末端产物、SSEP和焦磷酸(PPi)。
36.根据权利要求35的方法，其中所述方法是在单个反应或在分开的反应中进行。
37.根据权利要求35的方法，其中所述靶核酸是RNA，所述步骤(a)使酶作用部分之一，RNA酶H的消化位点形成双链并有功能；其中所述步骤(b)包括：用RNA酶H消化RNA链，使用所述探针作为模板通过DNA聚合酶延伸经部分消化的链的3′端，其中所述探针的所有其它酶作用部分形成双链并有功能。
38.根据权利要求37的方法，其中所述延伸经部分消化的链的3′端的步骤进一步包括通过所述DNA聚合酶或其它链置换因子进行链置换。
39.根据权利要求37的方法，其中所述探针的所述其它酶作用部分包括限制性位点或RNA聚合酶启动子，或者限制性位点和RNA聚合酶启动子两者。
40.根据权利要求35的方法，其中所述酶作用部分之一是限制性位点且位于所述探针的靶互补部分，所述步骤(a)使所述限制性位点形成双链并完全有功能，其中所述步骤(b)包括：通过限制性内切酶在所述限制性位点消化所述探针的相反链，使用所述探针作为模板通过NDA聚合酶延伸经消化的链的3′端，其中所述探针的所有其它酶作用部分形成双链并有功能。
41.根据权利要求40的方法，其中所述延伸经消化的链的3′端的步骤进一步包括通过所述DNA聚合酶或其它链置换因子进行链置换。
42.根据权利要求40的方法，其中所述探针的所述其它酶作用部分包括限制性位点或RNA聚合酶启动子，或者限制性位点和RNA聚合酶启动子两者。
43.根据权利要求40的方法，其中所述限制性位点是所述探针的唯一酶作用部分。
44.根据权利要求35的方法，其中所述酶作用部分之一是IIS型限制性位点，其中所述IIS型限制性位点的切割位点位于所述探针的靶互补部分，所述IIS型限制性位点的识别位点位于所述探针靶互补部分的任一侧；其中步骤(a)使所述探针的靶互补部分形成双链，因此形成所述IIS型限制性位点的功能性切割位点；其中所述步骤(b)包括：辅助引物和所述探针退火，以及使所述IIS型限制性位点的所述识别序列形成双链。
45.根据权利要求44的方法，其中辅助引物和所述探针退火以及使所述IIS型限制性位点的所述识别序列形成双链包括：将所述辅助引物直接和含有或不含侧翼序列的所述IIS型限制性内切酶识别序列退火，因此形成所述IIS型限制性位点的双链识别序列。
46.根据权利要求44的方法，其中所述辅助引物和所述探针退火以及使所述IIS型限制性位点的所述识别序列形成双链包括：所述辅助引物的3′端序列和所述IIS型限制性识别序列的3′序列退火，使用所述探针作为模板通过DNA聚合酶延伸所述辅助引物的3′端序列，因此形成所述IIS型限制性位点的双链识别序列。
47.根据权利要求35的方法，其中在所述步骤(a)中所述探针的靶互补部分与靶序列的游离3′端杂交，所述步骤(b)包括：使用所述探针作为模板通过DNA聚合酶延伸靶序列的所述游离3′端，因此所述探针的其它酶作用部分形成双链并有功能。
48.根据权利要求35的方法，其中所述探针的所述酶作用部分包括限制性位点，所述步骤(c)包括：用限制性内切酶在所述限制性位点消化所述探针的相反链，通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3′端，重复所述消化和所述延伸，由此产生多个SSEP DNA拷贝。
49.根据权利要求48的方法，其中所述延伸经消化的链的3′端的步骤进一步包括通过所述DNA聚合酶或其它链置换因子进行链置换。
50.根据权利要求35的方法，其中所述探针的所述酶作用部分包括RNA聚合酶启动子，所述步骤(c)包括：重复由RNA聚合酶作用于所述RNA聚合酶启动子而进行的转录，由此产生多个SSEP RNA拷贝。
51.根据权利要求35的方法，其中所述探针的所述酶作用部分包括限制性位点和RNA聚合酶启动子两者，所述步骤(c)包括：通过限制性内切酶在所述限制性位点消化所述探针的相反链，通过DNA聚合酶延伸经消化的链的3′端，重复所述消化和所述延伸，由此产生多个SSEP DNA拷贝，重复由RNA聚合酶作用于所述RNA聚合酶启动子而进行的转录，由此产生多个SSEP RNA拷贝。
52.根据权利要求51的方法，其中所述延伸经消化的链的3′端的步骤进一步包括通过所述DNA聚合酶或其它链置换因子进行链置换。
53.根据权利要求35的方法，其中所述SSEP是DNA分子或RNA分子或者DNA和RNA分子两者，所述步骤(d)包括：所述SSEP和游离探针的序列部分退火，使用所述游离探针作为模板延伸所述SSEP的3′端，由此所述探针的所有的酶作用部分形成双链并有功能。
54.根据权利要求35的方法，其中所述SSEP是RNA分子，所述步骤(d)包括：所述SSEP和游离探针的序列部分退火，用RNA酶H消化所述SSEP，使用所述游离探针作为模板延伸经部分消化的SSEP 3′端，由此所有的酶作用部分形成双链并有功能。
55.根据权利要求35的方法，其中所述探针是环状分子，所述SSEP的序列包括一个或一个以上与所述探针互补的序列单位，步骤(d)包括：将所述SSEP和所述游离探针的全部或部分退火，由此所述酶作用部分形成双链和有功能。
56.根据权利要求35的方法，其中所述模板部分包括反义DNA酶，所述方法产生多个单链有功能的有义DNA酶拷贝，所述检测单链末端产物的步骤(f)包括：在反应中包括RNA或DNA-RNA嵌合报告底物，其中所述RNA或DNA-RNA嵌合报告底物包括掺入脱氧核酶切割位点任一侧的荧光共振能量转移荧光团、通过有义DNA酶切割所述报告底物，由此所述报告底物的切割产生荧光信号的增加。
57.用于检测样品中感兴趣的一或多个靶核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括：所述一套或多套探针、所述辅助引物、所述检测底物、所述限制性内切酶、所述RNA聚合酶、所述RNA酶H、所述DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、NTPs。
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