CN112322723B - 一种评估他克莫司药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法 - Google Patents

一种评估他克莫司药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于肾移植术后血清药物浓度监测领域，公开了一种评估他克莫司药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法。具体指通过检测与他克莫司代谢相关的两个重要基因CYP3A5和POR上五个SNP位点(CYP3A5 rs15524、CYP3A5 rs4646453、POR rs2286822、POR rs1135612、POR rs1057868)的基因型，预测他克莫司在患者体内的代谢情况，从而为个体化设计他克莫司初始服用剂量提供用药指导。

Description

一种评估他克莫司药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及肾移植术后血清药物代谢状态的监测。具体地，涉及一种评估他克莫司药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法。
背景技术
他克莫司是肾移植术后最为常用的免疫抑制剂之一，但其有效浓度范围狭窄，并且在不同患者之间存在巨大药物代谢动力学差异，复杂的药物代谢会导致肾移植术后急慢性排异和移植肾毒性在内的一系列并发症，因此他克莫司的临床应用一直受到很大的限制。
目前，血清药物浓度监测正广泛应用于他克莫司使用中的个体化浓度监测，用以在维持足够的治疗量的他克莫司血清药物浓度的同时最大程度地降低他克莫司的副反应。
现有的血清药物浓度监测，一般采用色谱法，对血液样本中与血浆蛋白结合或血浆中游离的药物在全血中的浓度进行检测。该检测方法快速简便，能够有效检测当前血样中药物浓度。但具有滞后性，只能在患者服用一定标准化的起始剂量后，检测其血清药物浓度，再依据检测浓度，调整药物使用量。然而，由于他克莫司相关的代谢酶在人体内的表达情况具有较大的个体差异，即使给予用公斤体重校正过的相同的起始他克莫司计量，仍有一部分肾移植术后患者可能会仅仅维持一个较低的血清药物浓度，导致体内他克莫司达到稳定治疗浓度的时间延迟，从而使患者承受更大的急性排异风险，或是血清药物浓度过高，引起移植肾急性中毒反应。故目前急需一种可以在患者服药前预测患者药物代谢情况的方法，从而个体化设计他克莫司初始服用剂量，减少患者调整他克莫司用量以达到最佳治疗浓度的时间，更好的治疗患者。
CYP3A5和POR是他克莫司在体内代谢相关的两个重要基因，相关位点的不同类型决定了他克莫司的代谢状态。因此，测得相关位点的基因型，能够判断对他克莫司在患者体内的代谢状态。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)被称为“第三代DNA遗传标记”，具有分布密集、数量庞大、频率高、属二态性标记、存在相对稳定的特点，被认为是应用前景最好的遗传标记物。因此，通过检测他克莫司相关代谢基因的SNP位点，得到患者的基因型，可有效而稳定地在肾移植术前预测他克莫司在受者体内的代谢状态。
发明内容
1.要解决的问题
患者肾移植术后血清中他克莫司药物浓度调整到达稳态需要一定时间，因此有较高的排异或肾小管药物中毒风险。而现有的血清药物浓度检测方法存在滞后性，且个体代谢差异大，因此，亟需一种可以在患者服药前预测患者药物代谢情况的检测方法，从而个体化设计他克莫司初始服用剂量，减少患者调整他克莫司用量以达到最佳治疗浓度的时间。
2.技术方案
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
CYP3A5和POR是他克莫司代谢相关的两个重要基因，如图3-图4所示，这2个基因上五个SNP位点(CYP3A5 rs15524、CYP3A5 rs4646453、POR rs2286822、POR rs1135612、PORrs1057868，SNP位点信息见表1)的突变，能够揭示了他克莫司在患者体内的代谢情况。各位点可能的基因型如表2所示。
表1 SNP位点的基本信息
Figure BDA0002779775930000021
表2 SNP各位点可能的基因型
Figure BDA0002779775930000022
本发明提供了一种检测CYP3A5、POR两个基因上的五个SNP位点(CYP3A5 rs15524、CYP3A5 rs4646453、POR rs2286822、POR rs1135612、POR rs1057868)的引物组，五个SNP位点的PCR引物(由正向和反向引物构成)序列见表3。
表3.PCR引物序列
Figure BDA0002779775930000031
本发明提供一种基于上述引物组的五个位点的快速检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)总RNA提取试剂；(2)PCR扩增试剂；(3)测序试剂。
其中，
(1)总RNA提取试剂包括：Trizol、乙醇、异丙醇、去离子甲酰胺；
(2)PCR扩增试剂包括：TaKaRa PCR扩增试剂盒中试剂；
(3)测序试剂包括：上述五个SNP位点的PCR引物组、dNTP、PCR buffer、Taq酶。内参(G3PD)特异性引物、焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)水、双蒸水等。
本发明提供了一种利用上述试剂盒检测他克莫司代谢相关基因多态性的方法，具体操作步骤如下：
步骤1.血标本总RNA的提取：
(1)取2ml全血标本，加入1mL Trizol，冰浴中快速混合后转至1.5mL的离心管中，冰上静置5min；
(2)加入0.2mL氯仿，用手剧烈摇15秒混匀，15-30℃孵育2-3min后，于4℃12000rpm离心15分钟，取上层水相于一新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀后15-30℃静置10min；
(3)12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用现配的75％乙醇洗涤，4℃7500rpm离心5min；
(4)弃上清，室温干燥沉淀，干燥后加入30-60μL的去离子甲酰胺以溶解RNA，-70℃保存。
步骤2.cDNA的合成：
(1)在0.5mL的微量离心管中，加入上述提取的总RNA约1～5μg，并补充适量体积的焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)水，使离心管中液体的总体积达到11μL。后在微量离心管中加10微摩尔(Micromole，μM)Oligo(dT)12～18μL，轻轻震荡混匀并在室温下离心；
(2)将上述微量离心管中的液体置于70℃环境下加热10min，立即将微量离心管转移并插入到0℃环境中冷却至少1min；
(3)向上述离心管中按比例加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μL；
25毫摩尔/升(Mmol/L，mM)MgCl2 2μL
10mM dNTPmix 1μL
0.1摩尔(Mole，M)DTT 2μL
将上述液体轻轻震荡混匀后于室温下离心，后置于42℃环境下孵育2～5min；
(4)向上述离心管中加入SuperscriptⅡ液体1μL，后转移至42℃水浴环境中孵育50min；
(5)后将上述离心管转移并置于70℃环境下加热15min，以终止上述孵育反应；
(6)将上述离心管转移至冰中，并加入RNase H液体1μL，转移至37℃环境下孵育20min，以达到降解残留RNA的目的，最终转移至-20℃环境下保存待用；
步骤3.目的基因PCR扩增
(1)取0.5mL的PCR管，并依据以下试剂浓度加入相应液体至PCR管中：
第一链cDNA 2μL
上游引物【10皮摩尔(Picomole，pM)】2μL
下游引物【10皮摩尔(Picomole，pM)】2μL
dNTP(2mM)4μL
10×PCR buffer 5μL
Taq酶(2μ/μL)1μL
(2)向PCR管中加入适量的双蒸水，使PCR管中液体的总体积达50μL。后轻轻震荡混匀，并置于室温下离心；
(3)依据实验具体要求设定相应的PCR程序，并在适当的温度参数下扩增28～32个循环。此外，为了保证实验结果的可靠程度及准确性，在PCR扩增目的基因过程中加入一对内参(G3PD)的特异性引物，并扩增G3PD DNA，以将其作为PCR检测中的对照组。
步骤4.基因型结果分析
对步骤3中的扩增片段进行测序，获得基因型。
优选地，选用软件对测序结果进行分析，更优选地，通过htSNPer1.0软件分析。
本发明还提供了一种他克莫司药物代谢状态的评估方法，包括：
步骤1：确认五个位点CYP3A5 rs15524、CYP3A5 rs4646453、POR rs2286822、PORrs1135612、POR rs1057868的基因型；
步骤2：根据下列公式确定他克莫司血药浓度/单位体重剂量比：
Y(他克莫司血药浓度/单位体重剂量比)＝41.474+7.437*性别+0.286*年龄(岁)+9.879*肾功能延迟恢复-8.554*rs15524基因型+8.878*rs4646453基因型-23.462*rs1135612基因型+26.243*rs2286822基因型-1.167*rs1057868基因型+0.059*移植后时间(天)
其中，各参数的赋值如下：
性别：女性，性别＝0，男性，性别＝1；
肾功能延迟恢复：未发生，肾功能延迟恢复＝0；发生，肾功能延迟恢复＝1；
rs15524基因型：TT时，rs15524基因型＝0；TC时，rs15524基因型＝1；CC时，rs15524基因型＝2；
rs4646453基因型：TT时，rs4646453基因型＝0；TC时，rs4646453基因型＝1；CC时，rs4646453基因型＝2；
rs1135612基因型：CC时，rs1135612基因型＝0；CT时，rs1135612基因型＝1；TT时，rs1135612基因型＝2；
rs2286822基因型：AA时，rs2286822＝0；AG时，rs2286822＝1；GG时，rs2286822＝2；
rs1057868基因型：CC时，rs1057868＝0；CT时，rs1057868＝1；TT时，rs1057868＝2。
优选地，步骤1中5个位点基因型的检测采用本发明提供的试剂盒及检测方法。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1)如图1-图2所示，本发明中涉及的基因CYP3A5、POR的五个SNP位点(CYP3A5rs15524、CYP3A5rs4646453、POR rs2286822、POR rs1135612、POR rs1057868)与他克莫司代谢有关，进一步的，通过表4-表5分析数据可知，五个SNP位点与他克莫司在不同时间点的代谢显著相关(P<0.05)，能够更加精准的预测他克莫司的代谢状态。
2)本发明提供的检测引物组及试剂盒，包含的5对特异性引物能准确、特异性的扩增出CYP3A5 rs15524、CYP3A5 rs4646453、POR rs2286822、POR rs1135612、POR rs1057868的基因片段。通过标准PCR-限制性片段长度多态性方法进行基因分型，能够准确检测各位点的基因型，以CYP3A5 rs15524为例，各基因型的判读结果如图5所示。而且操作简单、快速。
3)本发明提供的他克莫司药物代谢状态的评估方法，是基于五个SNP位点基因型显著相关，且基因型的确定步骤简单、结果准确的基础上，对于指导临床上使用他克莫司进行免疫抑制治疗以及增加他克莫司的临床安全性均具有积极的意义。
本发明建立在大样本肾移植受者的研究结果上，方法准确、高效、具有较高的实用性，为综合患者病情及药理学作用特点制定适宜的他克莫司给药方案提供依据。
表4.POR基因上SNP位点与他克莫司代谢的关系
Figure BDA0002779775930000061
备注:a,P<0.05；b,P<0.01；c,P<0.001
表5.CYP3A5基因上的SNP位点与他克莫司代谢之间的关系。
Figure BDA0002779775930000062
/>
Figure BDA0002779775930000071
备注:P值小于0.00556认为显著。
附图说明
图1为POR上三个显著位点不同基因突变型对他克莫司代谢的影响，其中a是rs1135612位点，b是rs2286822位点，c是rs1057868位点；
图2为CYP3A5上两个显著位点组成的单倍体突变对他克莫司代谢的影响图；
图3为肾移植术后30天时高血药浓度的风险值与目标SNP位点的关系图；
图4为肾移植术后3个月时高血药浓度的风险值与目标SNP位点的关系图；
图5为CYP3A5 rs15524 SNP基因型的分型结果示例；
图6为使用本发明的方法对验证队列中他克莫司代谢状态预测能力的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。
如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。
浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。
任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。
实施例1
该研究纳入了220例在本中心(南京医科大学第一附属医院肾移植中心)完成肾脏移植手术的受者，该研究设计通过了南京医科大学第一附属医院的伦理委员会审批。
采用本发明，预测患者的他克莫司血药浓度/单位体重剂量比，包括如下步骤：
步骤1、确定患者基本信息
患者，35岁，男性，术后未发生肾功能延迟恢复。
步骤2、确定患者5个位点的基因型
(1)血标本总RNA的提取：
取2ml全血标本，加入1mL Trizol，冰浴中快速混合后转至1.5mL的离心管中，冰上静置5min；
加入0.2mL氯仿，用手剧烈摇15秒混匀，15-30℃孵育2-3min后，于4℃12000rpm离心15分钟，取上层水相于一新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀后15-30℃静置10min；
12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用现配的75％乙醇洗涤，4℃7500rpm离心5min；
弃上清，室温干燥沉淀，干燥后加入30-60μL的去离子甲酰胺以溶解RNA，-70℃保存。
(2)cDNA的合成：
a.在0.5mL的微量离心管中，加入上述提取的总RNA约1～5μg，并补充适量体积的焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)水，使离心管中液体的总体积达到11μL。后在微量离心管中加10微摩尔(Micromole，μM)Oligo(dT)12～18μL，轻轻震荡混匀并在室温下离心；
b.将上述微量离心管中的液体置于70℃环境下加热10min，立即将微量离心管转移并插入到0℃环境中冷却至少1min；
c.向上述离心管中按比例加入下列试剂的混合物：
10×PCR buffer 2μL；
25毫摩尔/升(Mmol/L，mM)MgCl2 2μL
10mM dNTPmix 1μL
0.1摩尔(Mole，M)DTT 2μL
将上述液体轻轻震荡混匀后于室温下离心，后置于42℃环境下孵育2～5min；
d.向上述离心管中加入SuperscriptⅡ液体1μL，后转移至42℃水浴环境中孵育50min；
e.后将上述离心管转移并置于70℃环境下加热15min，以终止上述孵育反应；
f.将上述离心管转移至冰中，并加入RNase H液体1μL，转移至37℃环境下孵育20min，以达到降解残留RNA的目的，最终转移至-20℃环境下保存待用；
(3)PCR检测：
a.取0.5mL的PCR管，并依据以下试剂浓度加入相应液体至PCR管中：
第一链cDNA 2μL
上游引物【10皮摩尔(Picomole，pM)】2μL
下游引物【10皮摩尔(Picomole，pM)】2μL
dNTP(2mM)4μL
10×PCR buffer 5μL
Taq酶(2μ/μL)1μL
b.向PCR管中加入适量的双蒸水，使PCR管中液体的总体积达50μL。后轻轻震荡混匀，并置于室温下离心；
c.依据实验具体要求设定相应的PCR程序，并在适当的温度参数下扩增28～32个循环。在PCR扩增目的基因过程中加入一对内参(G3PD)的特异性引物，并扩增G3PD DNA，以将其作为PCR检测中的对照组。
(4)基因型的确定：
通过htSNPer1.0软件分析，该患者各位点的基因型为:rs15524基因型：TC；rs4646453基因型：CC；rs1135612基因型：CC；rs2286822基因型：AA；rs1057868基因型：CT。
步骤3.根据下列公式确定他克莫司血药浓度/单位体重剂量比：
Y(他克莫司血药浓度/单位体重剂量比)＝41.474+7.437*性别+0.286*年龄(岁)+9.879*肾功能延迟恢复-8.554*rs15524基因型+8.878*rs4646453基因型-23.462*rs1135612基因型+26.243*rs2286822基因型-1.167*rs1057868基因型+0.059*移植后时间(天)
根据基本信息及基因型测定结果，各参数赋值如下：
男性，则性别＝1；
年龄＝35；
肾功能延迟恢复未发生，则肾功能延迟恢复＝0；
rs15524基因型为TC，则rs15524基因型＝1；
rs4646453基因型为CC，则rs4646453基因型＝2；
rs1135612基因型为CC，则rs1135612基因型＝0；
rs2286822基因型为AA，则rs2286822基因型＝0；
rs1057868基因型为CT，则rs1057868基因型＝1。
代入计算，该患者术后30天的他克莫司药物浓度/单位体重剂量比＝41.474+7.437*1+0.286*35+9.879*0-8.554*1+8.878*2-23.462*0+26.243*0-1.167*1+0.059*30＝68.726。
该患者术后30天体重为76.5kg，他克莫司服用剂量为4.5mg/天，因此该患者术后30天的他克莫司预期谷浓度＝68.726*4.5/76.5＝4.043ng/ml。而该患者在术后30天实测的他克莫司谷浓度为4.10ng/ml，与预测谷浓度较为接近。
实施例2
60例肾移植受者术后30天的他克莫司血药浓度跟踪对比(患者一般信息见表5)，包括：
(1)提取60例患者外周血的DNA标本，采用qRT-PCR方法检测预测公式中的五个位点(rs15524、rs4646453、rs1135612、rs2286822、rs1057868)。
(2)赋值，根据下列条件进行赋值。
女性，性别＝0，男性，性别＝1；
肾功能延迟恢复未发生，肾功能延迟恢复＝0；发生，肾功能延迟恢复＝1；
rs15524基因型为TT时，rs15524基因型＝0；TC时，rs15524基因型＝1；CC时，rs15524基因型＝2；
rs4646453基因型为TT时，rs4646453基因型＝0；TC时，rs4646453基因型＝1；CC时，rs4646453基因型＝2；
rs1135612基因型为CC时，rs1135612基因型＝0；CT时，rs1135612基因型＝1；TT时，rs1135612基因型＝2；
rs2286822基因型为AA时，rs2286822＝0；AG时，rs2286822＝1；GG时，rs2286822＝2；
rs1057868基因型为CC时，rs1057868＝0；CT时，rs1057868＝1；TT时，rs1057868＝2。
(3)将上述赋值代入公式Y(他克莫司血药浓度/单位体重剂量比)＝41.474+7.437*性别+0.286*年龄(岁)+9.879*肾功能延迟恢复-8.554*rs15524基因型+8.878*rs4646453基因型-23.462*rs1135612基因型+26.243*rs2286822基因型-1.167*rs1057868基因型+0.059*移植后时间(天)，得到他克莫司血药浓度/单位体重剂量比。
(4)收集了上述60例患者术后30天的他克莫司药物浓度，并计算出他克莫司血药浓度/单位体重剂量比。
结果分析：结果如图6所示，该预测公式的预测能力(AUC，曲线下面积)为79％，其95％可信区间为72-85％。因此，我们认为该公式可有效预测肾移植术后受者体内他克莫司的代谢状态。
表5.验证队列纳入患者的一般信息
临床参数 数值
年龄(岁,平均值±标准差) 41.2±10.25
性别,n(％)
男性 25(41.67)
女性 35(58.33)
身体质量指数(kg/m2,平均值±标准差) 22.01±2.98
肾移植前群体反应性抗体(％) 0
首次/二次肾移植 60/0
捐赠类型,n(％)
心脏死亡后捐赠 59(98.33)
活体捐赠 1(1.67)
肾功能延迟恢复发生率,n(％) 10(16.67)
排斥反应发生率,n(％) 2(3.33)
服用雷帕霉素患者n(％) 12(20.00)
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> 一种评估他克莫司药物代谢的引物组、试剂盒及评估方法
<140> 2020112780565
<141> 2020-11-16
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attagacacg caaggacttc ttca 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaagaaagc tgtgccccag 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgaaagaaa ctgagtccca caa 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgctatgtgg caaaaattct catc 24
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcggagccct cggagc 16
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggcacatcc tggccatc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggtcctgtc cctgtttctg 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accgtaggtg gccatgca 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acaggtccac cccaactctg 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acccttcata ggcttcatcc ag 22

Claims (7)

1.一种评估他克莫司药物代谢的引物组，其特征在于：包含引物对1、引物对2、引物对3、引物对4及引物对5，
所述引物对1的序列为：F: 5’-ATTAGACACGCAAGGACTTCTTCA-3’；R: 5’-TCAAGAAAGCTGTGCCCCAG-3’；
所述引物对2的序列为：F: 5’-TCGAAAGAAACTGAGTCCCACAA-3’；R: 5’-TGCTATGTGGCAAAAATTCTCATC-3’；
所述引物对3的序列为：F: 5’-TCGGAGCCCTCGGAGC-3’；R: 5’-AGGCACATCCTGGCCATC-3’；
所述引物对4的序列为：F: 5’-CGGTCCTGTCCCTGTTTCTG-3’；R: 5’-ACCGTAGGTGGCCATGCA-3’；
所述引物对5的序列为：F: 5’-ACAGGTCCACCCCAACTCTG-3’；R: 5’-ACCCTTCATAGGCTTCATCCAG-3’。
2.一种评估他克莫司药物代谢的试剂盒，其特征在于：包括总RNA提取试剂、PCR扩增试剂以及测序试剂，所述PCR扩增试剂包括权利要求1所述的引物组。
3.一种非诊疗目的的他克莫司药物代谢相关基因型的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）总RNA提取：取受试者的全血标本，进行总RNA提取；
2）PCR扩增：取上述步骤1）提取的总RNA，加入PCR扩增试剂进行PCR扩增得到扩增片段；
3）测序：取步骤2）中扩增得到的片段进行测序，测序结果进行分析，确认该受试者中他克莫司药物代谢相关基因型；所述他克莫司药物代谢相关基因型包括CYP3A5 rs15524、CYP3A5 rs4646453、POR rs2286822、POR rs1135612及POR rs1057868 五个位点的基因型；
所述步骤2）中所采用的PCR扩增试剂包括权利要求1所述的引物组。
4. 根据权利要求3所述的一种非诊疗目的的他克莫司药物代谢相关基因型的检测方法，其特征在于：PCR扩增反应体系为：第一链cDNA 2μL；上游引物2μL；下游引物2μL；dNTP 4μL；10×PCR buffer 5μL；Taq 酶1μL，用双蒸水补足总体积达50μL。
5.根据权利要求3或4所述的一种非诊疗目的的他克莫司药物代谢相关基因型的检测方法，其特征在于：在PCR扩增过程中加入内参特异性引物。
6.根据权利要求5所述的一种非诊疗目的的他克莫司药物代谢相关基因型的检测方法，其特征在于：所述测序结果分析通过htSNPer1.0软件进行。
7.一种非诊疗目的的评估他克莫司药物代谢状态的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）确定受试者的基因型：通过权利要求6所述的检测方法确认CYP3A5 rs15524、CYP3A5rs4646453、POR rs2286822、POR rs1135612及POR rs1057868五个位点的基因型；
2）根据测定的基因型计算他克莫司血药浓度/单位体重剂量比，计算公式如下：
他克莫司血药浓度/单位体重剂量比Y=41.474+7.437×性别+0.286×年龄+9.879×肾功能延迟恢复-8.554×rs15524基因型+8.878×rs4646453基因型-23.462×rs1135612基因型+26.243×rs2286822基因型-1.167×rs1057868基因型+0.059×移植后时间，
公式中各参数赋值如下：
所述年龄用岁来计算，所述移植后时间用天来计算；
性别：当受试者为女性时，性别=0，当受试者为男性时，性别=1；
肾功能延迟恢复：当受试者未发生肾功能延迟恢复时，肾功能延迟恢复=0；当受试者发生肾功能延迟恢复时，肾功能延迟恢复=1；
rs15524基因型：当受试者的rs15524基因型为TT时，rs15524基因型=0；当受试者的rs15524基因型为TC时，rs15524基因型=1；当受试者的rs15524基因型为CC时，rs15524基因型=2；
rs4646453基因型：当受试者的rs4646453基因型为TT时，rs4646453基因型=0；当受试者的rs4646453基因型为TC时，rs4646453基因型=1；当受试者的rs4646453基因型为CC时，rs4646453基因型=2；
rs1135612基因型：当受试者的rs1135612基因型为CC时，rs1135612基因型=0；当受试者的rs1135612基因型为CT时，rs1135612基因型=1；当受试者的rs1135612基因型为TT时，rs1135612基因型=2；
rs2286822基因型：当受试者的rs2286822基因型为AA时，rs2286822基因型=0；当受试者的rs2286822基因型为AG时，rs2286822基因型=1；当受试者的rs2286822基因型为GG时，rs2286822基因型=2；
rs1057868基因型：当受试者的rs1057868基因型为CC时，rs1057868基因型=0；当受试者的rs1057868基因型为CT时，rs1057868基因型=1；当受试者的rs1057868基因型为TT时，rs1057868基因型=2。
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