CN113215227A - 一种人维生素d受体基因分型检测用的引物和探针 - Google Patents

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CN113215227A CN202110155477.7A CN202110155477A CN113215227A CN 113215227 A CN113215227 A CN 113215227A CN 202110155477 A CN202110155477 A CN 202110155477A CN 113215227 A CN113215227 A CN 113215227A
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，包括ApaI(rs7975232)SNP位点多态性设计的引物和探针、BsmI(rs1544410)SNP位点多态性设计的引物和探针、FokI(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针、TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针和采用人类GAPDH基因作为监控样本DNA提取质量的内控引物探针，本发明采用ARMS‑PCR结合蝎型探针技术可以在一管内标记不同荧光基团，可以实现多重PCR检测，同时只有当蝎型探针和扩增的模板完全互补时候才能打开颈环结构，其荧光信号的产生都是源于分子内杂交，分子内杂交反应快速有效，优先于可能与之竞争的副反应，可提供更强的荧光信号，更短的信号响应时间，同时与传统的双标记探针相比，具有更强的错配区分能力。

Description

一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针
技术领域
本发明涉及一种引物和探针，特别涉及一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，属于分子生物学检测领域。
背景技术
维生素D(vitamin D)为固醇类衍生物，是一种人体所需的非常重要而又特殊的脂溶性维生素，又称抗佝偻病维生素。人类获取维生素D的主要来源是阳光照射和食物摄取。我们皮肤中有一种7-脱氢胆固醇，它经过紫外线中UVB的照射后转化为维生素D3。皮肤中产生的维生素D3通过血流输送到肝脏，在那里转化为25-羟维生素D3，然后再进一步运输到肾脏和单核巨噬细胞系统中，完成由25-羟维生素D3转化为1,25(OH)2维生素D3的过程，从而成为具有生物活性的维生素D。1,25(OH)2维生素D3作为一种激素重新进入循环，调节小肠、肾脏和骨骼对钙的吸收与代谢，促进骨骼的生长和重构。
近年来越来越多的研究发现，维生素D缺乏和不足已经成为一个日益严重的全球性问题。各国的研究均提示大量不同遗传背景的人群处于维生素D 不足和缺乏状态。目前尚无有关国内人群中维生素D缺乏状况的大样本量研究。根据对部分地区部分人群的研究发现，维生素D缺乏同样是一个相当严重的问题，在各个年龄阶段都十分普遍，而且与季节有明显关系，我们的研究发现在大城市的市民中，无论男性还是女性、无论年龄高低，维生素D缺乏和不足均存在相当高的发生率。仅11.1％的男性和9.3％的女性处于维生素D 充足状态，有88.9％的男性和90.7％的女性为维生素D不足或缺乏。由此看来，维生素D的状况至少在城市中不容乐观，其原因除了与气候条件、空气污染、穿衣习惯、饮食习惯(奶制品的摄入不足)有关外，可能还与生活方式的改变、户外活动的减少、防紫外线用品和体重的增加有关。
维生素D受体基因(vitamin D(1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor,VDR),位于12q13.11，全长63.5kb，有11个外显子，mRNA长 4,775nt，编码428个氨基酸残基组成的维生素D受体(VDR)蛋白，是维生素 D3的核激素受体，该蛋白也是胆石酸的第二受体。影响维生素D受体基因活性相关的基因位点主要ApaI、BsmI、FokI及TaqI等基因。
目前常用的针对SNP位点多态性检测方法主要有：
基于直接测序进行SNP基因型的分型。存在设备昂贵，PCR扩增产物需要开盖处理，极易造成室内气溶胶污染，影响结果的准确性等问题。
基于PCR凝胶电泳进行分型，PCR扩增后，经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断目标SNP位点的基因型。存在气溶胶污染的问题，结果以图片的形式呈现，判读过程依赖主观因素，容易出错的问题。
基于单碱基延伸法检测SNP，基本原理与直接测序方法相同,从本质上讲是测SNP位点一个碱基的序列,所以也被称作Mini-Sequencing。该方法目前已经在多种仪器平台上得到应用,包括:毛细管DNA测序仪,飞行时间质谱仪, 偏振光酶标仪。缺点是实验步骤与测序一样多,存在气溶胶污染的问题，在做多重分析时往往成功率降低,需要优化条件。
基于ARMS PCR(探针法)，基本原理是当等位基因引物3’末端和模板 DNA完全匹配时可以高效扩增；当等位基因引物3’末端和模板发生错配时则扩增效率很低，结合Taqman探针法可以实现等位基因的区分，缺点是判断标准需要引入相对CT差来判断，同时一管中无法区分SNP基因型，无法进行多重PCR分型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，包括ApaI(rs7975232)SNP位点多态性设计的引物和探针、BsmI(rs1544410)SNP位点多态性设计的引物和探针、 FokI(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针、TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针和采用人类GAPDH基因作为监控样本DNA提取质量的内控引物探针。
作为本发明的一种优选技术方案，所述ApaI(rs7975232)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因ApaI(rs7975232)正向扩增引物和反向扩增引物，所述VDR受体基因ApaI(rs7975232)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因ApaI(rs7975232)正向扩增引物：
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGGtA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGaCA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGaGCA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TaGGCA
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGGtC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGaCC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGaGCC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TaGGCC
VDR受体基因ApaI(rs7975232)反向扩增引物：
TCCTAAATGCACGGAGAAGTCACT。
作为本发明的一种优选技术方案，所述BsmI(rs1544410)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因BsmI(rs1544410)反向扩增引物和正向扩增引物，所述VDR受体基因BsmI(rs1544410)反向扩增引物的序列特征和正向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因BsmI(rs1544410)反向扩增引物：
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAATtT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAAgGT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAcTGT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGcATGT
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAATtC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAAgGC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAcTGC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGcATGC
VDR受体基因BsmI(rs1544410)正向扩增引物：
CTGTGGTGTGTGGACGCTGA。
作为本发明的一种优选技术方案，所述FokI(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因FokI(rs2228570)正向扩增引物和反向扩增引物，所述VDR受体基因FokI(rs2228570)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因FokI(rs2228570)正向扩增引物：
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGGtC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGtAC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGtGAC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAtGGAC
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGGtT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGtAT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGtGAT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAtGGAT
VDR受体基因FokI(rs2228570)反向扩增引物：
CATAGCATTGAAGTGAAAGCC。
作为本发明的一种优选技术方案，所述(4)TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物和反向扩增引物，所述VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物：
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGAgC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGcTC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTtATC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCgGATC
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGAgT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGcTT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTtATT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCgGATT
VDR受体基因TaqI(rs731236)反向扩增引物：
GCTAGCTTCTGGATCATCTTGGCATA。
作为本发明的一种优选技术方案，所述采用人类GAPDH基因作为监控样本DNA提取质量的内控引物探针的序列特征如下：
GAPDH上游引物：GCTCACATATTCTGGAGGAG
GAPDH下游引物：GGTCATTGATGGCAACAATA
GAPDH探针序列：CY5-ATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTA-BHQ1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，本发明采用ARMS-PCR技术在引物的3’末端附近引入适当的错配碱基，当引物3’末端与模板完全匹配条件下，PCR产物才能有效扩增；当引物3’末端与模板不匹配条件下，则PCR产物扩增效率很低。
本发明采用ARMS-PCR结合蝎型探针技术可以在一管内标记不同荧光基团，可以实现多重PCR检测，同时只有当蝎型探针和扩增的模板完全互补时候才能打开颈环结构，其荧光信号的产生都是源于分子内杂交，分子内杂交反应快速有效，优先于可能与之竞争的副反应，因此使用蝎型探针进行定量 PCR检测的最大优点在于：可提供更强的荧光信号，更短的信号显示时间，同时与传统的双标记探针相比，具有更强的错配区分能力。
附图说明
图1为本发明Bsml-AA基因型实验数据图；
图2为本发明Bsml-GG基因型实验数据图；
图3为本发明Bsml-AG基因型实验数据图
图4为本发明Fokl-CC基因型实验数据图；
图5为本发明Fokl-TT基因型实验数据图；
图6为本发明Fokl-CT基因型实验数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，本发明提供了一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针的技术方案：
包括ApaI(rs7975232)SNP位点多态性设计的引物和探针、 BsmI(rs1544410)SNP位点多态性设计的引物和探针、FokI(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针、TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针和采用人类GAPDH基因作为监控样本DNA提取质量的内控引物探针。
ApaI(rs7975232)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因 ApaI(rs7975232)正向扩增引物和反向扩增引物，VDR受体基因 ApaI(rs7975232)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因ApaI(rs7975232)正向扩增引物：
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGGtA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGaCA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGaGCA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TaGGCA
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGGtC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGGaCC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TGaGCC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGC TaGGCC
VDR受体基因ApaI(rs7975232)反向扩增引物：
TCCTAAATGCACGGAGAAGTCACT。
BsmI(rs1544410)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因 BsmI(rs1544410)反向扩增引物和正向扩增引物，VDR受体基因 BsmI(rs1544410)反向扩增引物的序列特征和正向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因BsmI(rs1544410)反向扩增引物：
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAATtT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAAgGT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAcTGT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGcATGT
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAATtC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAAgGC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAcTGC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGcATGC
VDR受体基因BsmI(rs1544410)正向扩增引物：
CTGTGGTGTGTGGACGCTGA。
FokI(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因 FokI(rs2228570)正向扩增引物和反向扩增引物，VDR受体基因 FokI(rs2228570)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因FokI(rs2228570)正向扩增引物：
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGGtC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGtAC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGtGAC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAtGGAC
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGGtT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGtAT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGtGAT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAtGGAT
VDR受体基因FokI(rs2228570)反向扩增引物：
CATAGCATTGAAGTGAAAGCC。
(4)TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物和反向扩增引物，VDR受体基因TaqI(rs731236) 正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物：
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGAgC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGcTC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTtATC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCgGATC
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGAgT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGcTT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTtATT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCgGATT
VDR受体基因TaqI(rs731236)反向扩增引物：
GCTAGCTTCTGGATCATCTTGGCATA。
采用人类GAPDH基因作为监控样本DNA提取质量的内控引物探针的序列特征如下：
GAPDH上游引物：GCTCACATATTCTGGAGGAG
GAPDH下游引物：GGTCATTGATGGCAACAATA
GAPDH探针序列：CY5-ATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTA-BHQ1。
实施例一：
人维生素D受体基因BsmI引物探针准确度验证试验。
根据人BsmI(rs1544410)序列信息，分别合成BsmI-A质粒及BsmI-G质粒，将其稀释至1000copys/ul，备用；
具体实施如下：
用于检测VDR受体基因BsmI(rs1544410)-AA及GG基因型反向扩增引物分别为：
(VIC)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAAgGT
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAATtC
VDR受体基因BsmI(rs1544410)正向扩增引物：
CTGTGGTGTGTGGACGCTGA
配制qPCR反应液，每孔18ul，分装至8联排管1号，2号及3号管中，其中1号管加入BsmI-A质粒2ul；2号管加入BsmI-G质粒2ul；3号管加入 BsmI-AG质粒2ul；反应程序参考表2,实验结果显示：1号管中BsmI-T引物高效扩增BsmI-A质粒，其PCR产物与其探针进行有效杂交产生信号，而对 BsmI-G质粒几乎不扩增，因此几乎不产生信号；
2号管中BsmI-C引物高效扩增BsmI-G质粒，其PCR产物与其探针进行有效杂交产生信号，而对BsmI-A质粒几乎不扩增，因此几乎不产生信号；
3号管中加入BsmI-AG质粒时，则FAM和VIC均产生相当的荧光信。
实施例二：
人维生素D受体基因FokI引物探针准确度验证试验。
根据人FokI(rs2228570)序列信息，分别合成FokI-C质粒及FokI-T质粒，将其稀释至1000copys/ul，备用；
具体实施如下：
用于检测VDR受体基因FokI(rs2228570)-CC及TT基因型正向扩增引物分别为：
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGGtC
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGtAT
VDR受体基因FokI(rs2228570)反向扩增引物
CATAGCATTGAAGTGAAAGCC
配制qPCR反应液，每孔18ul，分装至8联排管1号，2号及3号管中，其中1号管加入FokI-C质粒2ul；2号管加入FokI-T质粒2ul；3号管加入 FokI-CT质粒2ul；反应程序参考表2,实验结果显示：1号管中FokI-C引物高效扩增FokI-C质粒，其PCR产物与其探针进行有效杂交产生信号，而对 FokI-T质粒几乎不扩增，因此几乎不产生信号；
2号管中FokI-T引物高效扩增FokI-T质粒，其PCR产物与其探针进行有效杂交产生信号，而对FokI-C质粒几乎不扩增，因此几乎不产生信号；
3号管中加入FokI-CT质粒时，则FAM和VIC均产生相当的荧光信号。
综上所述，本发明采用ARMS-PCR技术在引物的3’末端附近引入适当的错配碱基，当引物3’末端与模板完全匹配条件下，PCR产物才能有效扩增；当引物3’末端与模板不匹配条件下，则PCR产物扩增效率很低。
本发明采用ARMS-PCR结合蝎型探针技术可以在一管内标记不同荧光基团，可以实现多重PCR检测，同时只有当蝎型探针和扩增的模板完全互补时候才能打开颈环结构，其荧光信号的产生都是源于分子内杂交，分子内杂交反应快速有效，优先于可能与之竞争的副反应，因此使用蝎型探针进行定量 PCR检测的最大优点在于：可提供更强的荧光信号，更短的信号显示时间，同时与传统的双标记探针相比，具有更强的错配区分能力。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 郑州华沃生物科技有限公司
<120> 一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针
<141> 2021-02-04
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
hcccggcggt gctgccgttg agtgtctgcc gggbhhgaca ggagctctca gctgggtahc 60
ccggcggtgc tgccgttgag tgtctgccgg gbhhgacagg agctctcagc tggacahccc 120
ggcggtgctg ccgttgagtg tctgccgggb hhgacaggag ctctcagctg agcahcccgg 180
cggtgctgcc gttgagtgtc tgccgggbhh gacaggagct ctcagctagg caamcccggc 240
ggtgctgccg ttgagtgtct gccgggbhhg acaggagctc tcagctgggt camcccggcg 300
gtgctgccgt tgagtgtctg ccgggbhhga caggagctct cagctggacc amcccggcgg 360
tgctgccgtt gagtgtctgc cgggbhhgac aggagctctc agctgagcca mcccggcggt 420
gctgccgttg agtgtctgcc gggbhhgaca ggagctctca gctaggcc 468
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctaaatgc acggagaagt cact 24
<210> 3
<211> 484
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
hcccggcttc tgaggaacta gataagcagc cgggbhhgag agcctgagta ttgggaattt 60
hcccggcttc tgaggaacta gataagcagc cgggbhhgag agcctgagta ttgggaaggt 120
hcccggcttc tgaggaacta gataagcagc cgggbhhgag agcctgagta ttgggactgt 180
hcccggcttc tgaggaacta gataagcagc cgggbhhgag agcctgagta ttgggcatgt 240
amcccggctt ctgaggaact agataagcag ccgggbhhga gagcctgagt attgggaatt 300
camcccggct tctgaggaac tagataagca gccgggbhhg agagcctgag tattgggaag 360
gcamcccggc ttctgaggaa ctagataagc agccgggbhh gagagcctga gtattgggac 420
tgcamcccgg cttctgagga actagataag cagccgggbh hgagagcctg agtattgggc 480
atgc 484
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtggtgtg tggacgctga 20
<210> 5
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
vccccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacagggtc 60
vccccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacaggtac 120
vccccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacagtgac 180
vccccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacatggac 240
amcccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacagggtt 300
amcccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacaggtat 360
amcccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacagtgat 420
amcccggcca gggaagtgct ggccgccatg ccgggbhhgg cttgctgttc ttacatggat 480
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catagcattg aagtgaaagc c 21
<210> 7
<211> 476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
rcccggcgtg tgttggacag gcggtcctgc cgggbhhggt gcaggacgcc gcgctgagcr 60
cccggcgtgt gttggacagg cggtcctgcc gggbhhggtg caggacgccg cgctgctcrc 120
ccggcgtgtg ttggacaggc ggtcctgccg ggbhhggtgc aggacgccgc gcttatcrcc 180
cggcgtgtgt tggacaggcg gtcctgccgg gbhhggtgca ggacgccgcg cggatcamcc 240
cggcgtgtgt tggacaggcg gtcctgccgg gbhhggtgca ggacgccgcg ctgagtamcc 300
cggcgtgtgt tggacaggcg gtcctgccgg gbhhggtgca ggacgccgcg ctgcttamcc 360
cggcgtgtgt tggacaggcg gtcctgccgg gbhhggtgca ggacgccgcg cttattamcc 420
cggcgtgtgt tggacaggcg gtcctgccgg gbhhggtgca ggacgccgcg cggatt 476
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctagcttct ggatcatctt ggcata 26
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctcacatat tctggaggag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtcattgat ggcaacaata 20
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cyatgccttc ttgcctcttg tctcttabh 29

Claims (6)

1.一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，其特征在于，包括ApaI(rs7975232)SNP位点多态性设计的引物和探针、BsmI(rs1544410)SNP位点多态性设计的引物和探针、FokI(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针、TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针和采用人类GAPDH基因作为监控样本DNA提取质量的内控引物探针。
2.根据权利要求1所述的一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，其特征在于：所述ApaI(rs7975232)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因ApaI(rs7975232)正向扩增引物和反向扩增引物，所述VDR受体基因ApaI(rs7975232)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因ApaI(rs7975232)正向扩增引物：
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTGGGtA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTGGaCA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTGaGCA
(HEX)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTaGGCA
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTGGGtC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTGGaCC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTGaGCC
(FAM)CCCGGCGGTGCTGCCGTTGAGTGTCTGCCGGG-BHQ1-HEG-ACAGGAGCTCTCAGCTaGGCC
VDR受体基因ApaI(rs7975232)反向扩增引物：
TCCTAAATGCACGGAGAAGTCACT。
3.根据权利要求1所述的一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，其特征在于：所述BsmI(rs1544410)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因BsmI(rs1544410)反向扩增引物和正向扩增引物，所述VDR受体基因BsmI(rs1544410)反向扩增引物的序列特征和正向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因BsmI(rs1544410)反向扩增引物：
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAATtT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAAgGT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAcTGT
(HEX)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGcATGT
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAATtC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAAgGC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGAcTGC
(FAM)CCCGGCTTCTGAGGAACTAGATAAGCAGCCGGG-BHQ1-HEG-AGAGCCTGAGTATTGGGcATGC
VDR受体基因BsmI(rs1544410)正向扩增引物：
CTGTGGTGTGTGGACGCTGA。
4.根据权利要求1所述的一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，其特征在于：所述FokI(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因FokI(rs2228570)正向扩增引物和反向扩增引物，所述VDR受体基因FokI(rs2228570)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因FokI(rs2228570)正向扩增引物：
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGGtC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGtAC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGtGAC
(VIC)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAtGGAC
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGGtT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGGtAT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAGtGAT
(FAM)CCCGGCCAGGGAAGTGCTGGCCGCCATGCCGGG-BHQ1-HEG-GCTTGCTGTTCTTACAtGGAT
VDR受体基因FokI(rs2228570)反向扩增引物：
CATAGCATTGAAGTGAAAGCC。
5.根据权利要求1所述的一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，其特征在于：所述(4)TaqI(rs731236)SNP位点多态性设计的引物和探针包括VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物和反向扩增引物，所述VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物的序列特征和反向扩增引物的序列特征如下：
VDR受体基因TaqI(rs731236)正向扩增引物：
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGAgC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGcTC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTtATC
(Rox)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCgGATC
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGAgT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTGcTT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCTtATT
(FAM)CCCGGCGTGTGTTGGACAGGCGGTCCTGCCGGG-BHQ1-HEG-GTGCAGGACGCCGCGCgGATT
VDR受体基因TaqI(rs731236)反向扩增引物：
GCTAGCTTCTGGATCATCTTGGCATA。
6.根据权利要求1所述的一种人维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，其特征在于：所述采用人类GAPDH基因作为监控样本DNA提取质量的内控引物探针的序列特征如下：
GAPDH上游引物：GCTCACATATTCTGGAGGAG
GAPDH下游引物：GGTCATTGATGGCAACAATA
GAPDH探针序列：CY5-ATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTA-BHQ1。
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