JP2013513360A5 - - Google Patents
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Claims (17)
- 数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち1種の変異配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって対立遺伝子特異的に増幅する方法であって、
(a)第1及び第2のオリゴヌクレオチドを、前記標的配列にハイブリダイズさせるステップ、ここで、前記第1のオリゴヌクレオチドは、前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記第2のオリゴヌクレオチドは、その3’側部分及び5’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち1種の変異配列のみと相補的な少なくとも1個の選択的ヌクレオチドを有し、前記選択的ヌクレオチドは、3’末端の内側に配置されており、前記第2のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基は、アデノシンの6位のアミノ基、グアノシンの2位のアミノ基又はシチジンの4位のアミノ基である、
(b)核酸ポリメラーゼによる前記オリゴヌクレオチドの伸長に適した、前記第1及び前記第2のオリゴヌクレオチドの、前記標的配列のうち少なくとも1種の変異配列へのハイブリダイゼーションのための条件を整えるステップ、ここで、前記ポリメラーゼは、前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的な前記変異配列にハイブリダイズするときには、前記第2のオリゴヌクレオチドを選択的に伸長させる能力を有するが、前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的でない前記変異配列にハイブリダイズするときには、その能力が実質的に低下する、並びに
(c)一連のハイブリダイゼーション及び伸長ステップを複数回繰り返すステップ
を含む方法。 - ステップ(b)における前記核酸ポリメラーゼが、前記選択的ヌクレオチドが前記標的配列と塩基対を形成するときにのみ、前記第2のオリゴヌクレオチドを伸長させることができる、請求項1に記載の方法。
- 前記選択的ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端付近の1〜5個のヌクレオチドに位置する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)におけるプライマー伸長産物を検出するステップ(d)をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ,Z05 DNAポリメラーゼ,ΔZ05 DNAポリメラーゼ及びΔZ05−Gold DNAポリメラーゼからなる群より選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが3’−5’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが、Pfu DNAポリメラーゼ及びサーモトガ・マリティマ(Thermatoga Maritima)からなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- ステップ(a)における前記変異配列が、ヒトBRAF,EGFR,PIK3CA又はKRAS遺伝子のV600E変異配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが配列番号11である、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のオリゴヌクレオチドが、配列番号2,3,4,5,7,8,9,10及び17からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち1種の変異配列を検出する方法であって、
(a)第1及び第2のオリゴヌクレオチドを、前記標的配列にハイブリダイズさせるステップ、ここで、前記第1のオリゴヌクレオチドは、前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記第2のオリゴヌクレオチドは、その3’側部分及び5’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち1種の変異配列のみと相補的な少なくとも1個の選択的ヌクレオチドを有し、前記選択的ヌクレオチドは、3’末端の内側に配置されており、前記第2のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基は、アデノシンの6位のアミノ基、グアノシンの2位のアミノ基又はシチジンの4位のアミノ基である、
(b)核酸ポリメラーゼによる前記オリゴヌクレオチドの伸長に適した、前記第1及び前記第2のオリゴヌクレオチドの、前記標的配列のうち少なくとも1種の変異配列へのハイブリダイゼーションのための条件を整えるステップ、ここで、前記ポリメラーゼは、前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的な前記変異配列にハイブリダイズするときには、前記第2のオリゴヌクレオチドを選択的に伸長させる能力を有するが、前記第2のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的でない前記変異配列にハイブリダイズするときには、その能力が実質的に低下する、
(c)一連のハイブリダイゼーション及び伸長ステップを複数回繰り返すステップ、並びに
(d)前記オリゴヌクレオチドの伸長産物を検出するステップ、ここで、前記伸長は、前記第2のオリゴヌクレオチドが有する選択的ヌクレオチドと相補的な標的配列の変異配列の存在を表す、
を含む方法。 - 数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち1種の変異配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって対立遺伝子特異的に増幅するためのキットであって、
(a)前記標的配列と少なくとも部分的に相補的な第1のオリゴヌクレオチド、
(b)その3’側部分及び5’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち1種の変異配列のみと相補的な少なくとも1個の選択的ヌクレオチドを有する第2のオリゴヌクレオチドであって、前記選択的ヌクレオチドが、3’末端の内側に配置されており、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基がアデノシンの6位のアミノ基、グアノシンの2位のアミノ基又はシチジンの4位のアミノ基である第2のオリゴヌクレオチド、並びに
(c)核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、前記核酸ポリメラーゼによる核酸伸長に適した緩衝液、及び対立遺伝子特異的増幅を実施するための説明書
を含むキット。 - 数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち1種の変異配列のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による対立遺伝子特異的増幅を実施するためのオリゴヌクレオチドであって、
(a)その3’側部分及び5’側部分が前記標的配列の一部分と少なくとも部分的に相補的な配列、
(b)前記標的配列のうち1種の変異配列のみと相補的な少なくとも1個の選択的ヌクレオチドであって、3’末端の内側に配置された選択的ヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有するヌクレオチドの構造は、下記群:
から選択され、前記修飾ヌクレオチドは、3’末端に対して5位、4位、3位、2位又は1位に存在する、
を含むオリゴヌクレオチド。 - 環外アミノ基が共有結合的に修飾された前記塩基が、N6−ベンジル−アデニン,N6−パラ−tert−ブチル−ベンジルアデニン,N2−アルキル−グアニン及びN4−ベンジル−シトシンからなる群より選択される、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号2,3,4,5,7,8,9,10及び17からなる群より選択された配列を有する、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
- 数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち1種の変異配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって対立遺伝子特異的に増幅するための反応混合物であって、
(a)前記標的配列と少なくとも部分的に相補的な第1のオリゴヌクレオチド、及び
(b)その3’側部分及び5’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち1種の変異配列のみと相補的な少なくとも1個の選択的ヌクレオチドを有する第2のオリゴヌクレオチドであって、前記選択的ヌクレオチドが、3’末端の内側に配置されており、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基がアデノシンの6位のアミノ基、グアノシンの2位のアミノ基又はシチジンの4位のアミノ基である第2のオリゴヌクレオチド、並びに
(c)核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及び前記核酸ポリメラーゼによる核酸伸長に適した緩衝液
を含む反応混合物。
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