JP2009529337A5

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Publication number: JP2009529337A5
Application number: JP2008558640A
Authority: JP
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2010-07-08
Anticipated expiration: 2027-03-16

Claims

ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列並びに少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログが共有結合的にシグナリングペアに連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
[式中、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑはワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして、
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である]
を有し；そして、
ｎは少なくとも４の整数であり；そして、
前記の少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドが一方の末端から最大で９ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に有り；そして、
前記の少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドが前記シグナリングペアの各部分からおよそ同一の距離に位置しており、そして
前記シグナリングペアが２つの部分で構成されるシステムからなっており、ここで一方の部分が５’末端から最大で６ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの位置に有り、他方の部分が３’末端から最大で６ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの位置に有り；
前記シグナリングペアの前記部分が前記疎水性ヌクレオチドと同一ではなく、
前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として５’末端に位置している場合、５’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではなく、前記シグナリングペアの１個の部分が突出末端として３’末端に位置している場合、３’末端の最初のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログは疎水性ヌクレオチドではない
オリゴヌクレオチドアナログ。
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが、前記リンカーＹに結合する部位にメチル基が加わった際に０を超えるｌｏｇＰ値を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
少なくとも１個の疎水性分子Ｑが、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコイル（ｃａｒｂｏａｌｋｏｙｌ）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル及びアミドからなる群より選択される１個又は複数によって任意に置換された多環芳香族類及び複素多環芳香族類からなる群より選択される、請求項１記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
前記シグナリングペアがこのペアの部分間の物理的距離に応じて検出可能なシグナルを変化させ得る請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
前記シグナリングペアの一方の部分がフルオロフォアであり、前記シグナリングペアのもう一方の部分がクエンチャーであり、前記フルオロフォア及び前記クエンチャーが分子内ＦＲＥＴ複合体を形成し得る請求項４に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
少なくとも２個の前記疎水性ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドアナログの反対側半分に位置している請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
前記疎水性ヌクレオチドの前記疎水性分子が互いに疎水性相互作用が可能であり、それによって前記シグナリングペアの２つの部分を近接させ得る請求項６に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
前記シグナリングペアの一方の部分よりも５’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無く、前記シグナリングペアのもう一方の部分よりも３’末端に近く位置している疎水性ヌクレオチドが無い請求項７に記載のオリゴヌクレオチドヌクレオチドアナログ。
前記オリゴヌクレオチドが固相に固定されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログ。
ａ）ｎ個のヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログの連続した配列並びに少なくとも２個の疎水性ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドアナログが２つの部分で構成されるシステムからなるシグナリングペアに共有結合的に連結しており、
ここで、前記疎水性ヌクレオチドが一般構造
Ｘ−Ｙ−Ｑ
［式中、
Ｘはヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、又は核酸若しくは核酸アナログの主鎖に組み込まれ得る主鎖モノマー単位であり、
Ｑは特定のワトソン・クリック水素結合には関与しない疎水性分子であり；そして、
Ｙは前記ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ又は主鎖モノマー単位と前記疎水性分子とを連結するリンカー部分である］
を有し；そして、
ｎは少なくとも６の整数であり；そして、
前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズしない場合の方が、前記ヌクレオチドアナログが標的配列にハイブリダイズする場合よりも、前記シグナリングペアの前記の２つの部分がより近接している
オリゴヌクレオチドアナログを提供し；そして、
ｂ）前記オリゴヌクレオチドアナログの標的配列を潜在的に含んだ核酸の混合物を提供し；そして、
ｃ）前記核酸及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして、
ｄ）前記シグナリングペアの前記部分が近接しているかどうかを決定することによりハイブリダイゼーションを検出し；
ｅ）それによってハイブリダイゼーションを決定する
工程を含む、ハイブリダイゼーションを決定するための方法。
前記ヌクレオチドアナログが請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログである請求項１０に記載の方法。
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログと標的配列とのハイブリダイゼーションを増幅中に検出及び／又は定量する方法であって、前記方法が
ａ）標的配列を潜在的に含む核酸の混合物を提供し；そして、
ｂ）増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、１組のプライマー、及び請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素が鋳型を標的とした様式でプライマーを伸長することが出来、前記増幅緩衝液が前記増幅酵素に対してこのような伸長をプライマー及び鋳型の存在下で行うための条件を提供し；そして、
ｃ）前記プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で前記プライマー及びオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とともにインキュベートし；そして、
ｄ）前記標的配列を鋳型に用い、前記増幅酵素を使用して前記のハイブリダイズしたプライマーの３’末端を伸長し；そして、
ｅ）前記核酸、伸長産物及び前記オリゴヌクレオチドアナログをハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートし；そして、
ｆ）ハイブリダイゼーションを検出し、また任意にハイブリダイゼーションを定量し；そして、
ｇ）任意に工程ｃ）からｆ）までを反復する
工程を含む方法。
ハイブリダイゼーションの前記検出が融解温度及び／又は親和温度の測定を含む請求項１０又は１２に記載の方法。
ヌクレアーゼ活性が前記シグナリングペアの最も５’の部分を除去する請求項１２に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドアナログが前記標的配列に相補的であり、前記の少なくとも１個の多型サイトが前記オリゴヌクレオチドアナログの中央部分内に位置している請求項１２に記載の方法。
請求項１に記載の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドアナログが提供され、前記オリゴヌクレオチドアナログの１種が前記標的配列の１個の遺伝子型に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドアナログの他のものが前記標的配列の他の遺伝子型に相補的である請求項１２に記載の方法。
一方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ｃ」−核酸塩基を前記多型サイトに含んでおり、他方のオリゴヌクレオチドアナログが「Ａ」−核酸塩基を前記多型サイトに含んでいる請求項１６に記載の方法。
オリゴヌクレオチドアナログの標的配列への親和温度を測定する方法であって、前記方法が請求項１０又は１２に記載の方法を実施することを含み、最後の工程の後に以下の工程が実施される方法：
ａ）前記混合物を変性し、前記親和温度を超える第一の所定の温度まで急速に冷却し；そして、
ｂ）前記シグナリングペアからの検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出し、ここで前記シグナリングペアは前記ペアの前記部分間の物理的距離に応じて前記の検出可能なシグナルを変化させることが出来；そして
ｃ）前記混合物を変性し、第二の所定の温度まで急速に冷却し、ここで前記の第二の所定の温度は前記の第一の所定の温度よりも低く、
ｄ）前記の検出可能なシグナルを測定することによりハイブリダイゼーションを検出し、
ｅ）３）及び４）の工程を反復し、ここで前記の所定の温度は徐々に前記親和温度未満にまで下げられ、
ｆ）そして、前記核酸アナログの前記標的配列に対する前記親和温度を測定する。
標的配列の増幅のための方法であって、前記方法が
ａ）前記標的配列を任意に含んだ核酸の混合物を提供し；そして
ｂ）１組のプライマー、増幅酵素を含んだ増幅緩衝液、及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを提供し、ここで前記プライマー及び前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログは前記標的配列又はそれに相補的な配列とハイブリダイズすることが出来、前記増幅酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合は前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログがヌクレアーゼ抵抗性であり；そして、
ｃ）前記プライマー及びオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを核酸の前記混合物とハイブリダイゼーション可能な条件下でインキュベートし；そして、
ｄ）ハイブリダイゼーションを検出し；そして、
ｅ）前記の所望の伸長温度に達するまで特定の間隔でハイブリダイゼーションを検出しながら徐々に温度を上昇させ、そして、
ｆ）伸長反応を終了させ、生成したアンプリコンを変性し、所望の増幅が生ずるまで工程ｃ）からｆ）を反復する
工程を含む方法。
請求項１に記載の複数種のオリゴヌクレオチドアナログが同一の密閉されたチューブ内で用いられる請求項１９に記載の方法。