JP2022533088A - 変異体核酸を検出するための融解温度法、キットおよびレポータオリゴ - Google Patents

変異体核酸を検出するための融解温度法、キットおよびレポータオリゴ Download PDF

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Abstract

本発明は、目的のヌクレオチドを含む標的核酸配列中の変異体配列の存在を検出するための、特にマイクロサテライト不安定性を検出するための、融解分析に基づく方法に関する。方法は、フルオロフォアおよびクエンチャーを有するレポータオリゴヌクレオチドとしてプローブを使用し、ヌクレオチド配列は、疎水性インカレーティング残基を有するヌクレオチドを含む。また、薬剤の有効性を決定するための、および個体における臨床的障害の存在を予測するための方法、ならびにその方法を実行するためのレポータオリゴヌクレオチドおよびキットも開示される。【選択図】図１

Description

本発明は、目的のヌクレオチドを含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するための、特に、生殖細胞変異および体細胞変異、ならびにマイクロサテライト不安定性を検出するための方法に関する。薬剤の有効性を予測するための、および個体における臨床的障害の存在を検出するための方法、ならびにその方法を実行するためのレポータオリゴヌクレオチドおよびキットも開示される。
一塩基置換、欠失、挿入、転座および重複としての遺伝性（生殖細胞系）または非遺伝性（体細胞系）の変異イベントは、ヒト生物学に対して手段的影響を及ぼす。遺伝的プロファイルの決定は、運動および食事のような環境因子に対する応答および疾患の診断、予後、および適用可能な治療レジメンに関する情報を明らかにする。遺伝的評価は典型的には、ＤＮＡ配列決定または対立遺伝子－特異的ＰＣＲのようなツールを用いて実行される。分子プローブの可変結合を含む方法は、生殖細胞系の変異だけでなく、ＨＲＭのような技術と組み合わせると、低対立遺伝子頻度の体細胞系の変異にも適用可能である。
直接または逆方向リピートなどの反復ヌクレオチド配列は、多くの生物において観察される。一例として、数十万のマイクロサテライト遺伝子座が、ヒトゲノム全体に分布しており、したがって、統計的には１００，０００塩基対ごとに約１回発生する。マイクロサテライト遺伝子座は、短いタンデムリピートを含むゲノムＤＮＡの領域であり、最短の反復単位は典型的には、１～５のヌクレオチド長である。したがって、特定のマイクロサテライト遺伝子座の反復単位は、該当する場合、一般に、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－またはペンタヌクレオチドリピート遺伝子座と呼ばれる。与えられたマイクロサテライト遺伝子座は典型的には、タンデム配置において、約１０～４０のこれらの反復単位を含む。さらに、哺乳動物種からのゲノムＤＮＡなどの、ほとんどの二倍体種の正常なゲノムＤＮＡの各マイクロサテライト遺伝子座は、各遺伝子座で２つの対立遺伝子を含む。２つの対立遺伝子は、長さが互いに同一であるまたは異なる可能性があり、個体ごとに変わる可能性がある。
マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、または複製エラー（ＲＥＲ）は、特定のヒト新生物において発生するゲノム不安定性の一例であり、そこで腫瘍細胞はそれらのＤＮＡを正確に複製する能力が低下している。ＭＳＩは、ヒトＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子の根底にある機能的不活性化の一般的なマーカーである。ＭＭＲ遺伝子の機能喪失は、コーディング領域変異、ヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）、および／またはプロモータのメチル化を介した二対立遺伝子の不活性化が原因で発生すると考えられている。さらに、ＭＭＲ遺伝子の生殖細胞変異は、ほとんどの遺伝性非ポリポーシス結腸癌（ＨＮＰＣＣ）家系における常染色体優性遺伝的欠陥であることが知られている。ＨＮＰＣＣ個体における腫瘍細胞により引き起こされる他の変異は、特定のＭＭＲ遺伝子の二対立遺伝子の不活性化をもたらし、腫瘍におけるマイクロサテライトＤＮＡの正確な複製の喪失を引き起こす。ＭＳＩはしたがって、根底にあるＤＮＡミスマッチ修復欠陥のマーカーであり、コーディングＤＮＡの変異率の向上にも関連する。ＭＭＲ欠損から生じるこの変異誘発因子表現型は、ＭＳＩをもたらすことに加えて、コーディング領域の塩基置換および等頻度で直接リピートでのフレームシフト変異の両方を引き起こす。ＭＭＲ欠損の発生およびその結果生じる変異誘発因子表現型は、腫瘍形成の初期イベントであると考えられている。
ＭＳＩは、ＨＮＰＣＣ家族における生殖細胞系の欠陥に関連しているだけでなく、散発性結腸直腸癌の約１５～２０％にも見られ、この知見は、ゲノム不安定性の全体的な増加も反映する（また、腫瘍変異の負荷としても測定される）。腫瘍におけるＭＳＩ欠損の知見は、病期ごとに一致した腫瘍におけるより良好な予後とも関連している。したがって、ＭＳＩを有する腫瘍を同定することは、生殖細胞系ＭＭＲ欠損（ＨＮＰＣＣファミリー）を暗示するだけでなく、予後の階層化のためにも、臨床的に重要である。臨床的（ベセスダガイドライン（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｂｉｇａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）および組織病理学的特徴は、結腸直腸腫瘍がマイクロサテライト不安定でありおそらくＨＮＰＣＣファミリーにおいて生じる疑いを提起する可能性があるが、臨床病理学的特徴は、ＭＳＩの存在を診断するためには不充分であることが多い。したがって、分子検査が、臨床的に疑いのある腫瘍のＭＳＩ状態を解明するために利用され得る（Ｂｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
結腸直腸腫瘍に加えて、ＭＳＩはまた、他の種類の癌および他の遺伝子疾患にも関連している。説明するため、これらは、とりわけ、膵癌、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌、子宮癌および乳癌を含む。マイクロサテライト不安定性に関連すると考えられる他の代表的な遺伝子順序は、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、脆弱Ｘ症候群、ＦＲＡＸＥ精神遅滞および脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）ブルトンＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルーム症候群（ＢＳ）、頭蓋前頭鼻骨症候群（ＣＦＮＳ）および特発性肺線維症（ＩＰＦ）を含む。
上記に鑑み、変異体ヌクレオチド配列、例えばマイクロサテライトなどの反復ヌクレオチド配列の分析は、他の用途の中でも、多くの診断および予後の用途を有することは明らかである。したがって、感度が高く、客観的で信頼性があるアッセイが必要である。
本発明は、特許請求の範囲において定義されるようなものである。本明細書に記載の方法は、生殖細胞変異および体細胞変異ならびにマイクロサテライト不安定性を調査するための、迅速で、容易で、偏りがなく、感度が高い方法を表す。
本明細書において、２つの鎖からなり、好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するための方法が提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記方法は、以下の工程：
ａ）上記変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１試料を準備する工程；
ｂ）上記参照配列を含む核酸を含む第２試料を準備する工程であって、第２試料が、参照試料である、工程；
ｃ）レポータオリゴヌクレオチドを準備する工程；
ｄ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットを準備する工程であって、プライマのセットが一緒に、ＮＯＩを含む標的核酸配列を増幅できる、工程；
ｅ）上記第１試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１アンプリコンを得る工程；ならびに上記第２試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって参照配列を含む第２アンプリコン得る工程であって、第２アンプリコンが、参照アンプリコンである、工程；
ｆ）第１アンプリコンの高分解能融解（ＨＲＭ）分析などの融解分析を実行し、それによって第１融解曲線により特徴づけられる第１プロファイルを得る工程、ならびに第２アンプリコンのＨＲＭ分析などの融解分析を実行し、第２融解曲線により特徴づけられる第２プロファイルを得る工程であって、第２プロファイルが、参照融解曲線により特徴づけられる参照プロファイルである、工程（各アンプリコンは、第１鎖および第２鎖を含み、融解分析は、各アンプリコンの１つの鎖へのレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、フルオロフォアにより放出される信号の検出、ならびに第１および第２融解曲線を得ることを含む）；
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲、好ましくは、１５～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、
レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端でまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含む、ならびに
レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的である、
ならびにレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端に少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、上記ヘルパー配列は、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズする場合、第１および第２アンプリコンにハイブリダイズできる）；ならびに
ｇ）第１プロファイルを参照プロファイルと比較する工程であって、第１プロファイルおよび参照プロファイルの間の差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する、工程
を含む。
本明細書において、２つの鎖からなり、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するための方法が提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記方法は、以下の工程：
ａ）上記変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１試料を準備する工程；
ｂ）上記参照配列を含む核酸を含む第２試料を準備する工程であって、第２試料が、参照試料である、工程；
ｃ）レポータオリゴヌクレオチドを準備する工程；
ｄ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットを準備する工程であって、プライマのセットが一緒に、標的核酸配列を増幅できる、工程；
ｅ）上記第１試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１アンプリコンを得る工程；ならびに上記第２試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって参照配列を含む第２アンプリコンを得る工程であって、第２アンプリコンが、参照アンプリコンである、工程；
ｆ）第１アンプリコンの高分解能融解（ＨＲＭ）分析を実行し、それによって第１融解曲線により特徴づけられる第１ＨＲＭプロファイルを得る工程、ならびに第２アンプリコンのＨＲＭ分析を実行し、それによって第２融解曲線により特徴づけられる第２ＨＲＭプロファイルを得る工程であって、第２ＨＲＭプロファイルが、参照融解曲線により特徴づけられる参照プロファイルである、工程（各アンプリコンは、第１鎖および第２鎖を含み、ＨＲＭ分析は、各アンプリコンの１つの鎖へのレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、フルオロフォアにより放出される信号の検出、ならびに第１および第２融解曲線を得ることを含む）；
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、
レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端でまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含む、ならびに
レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である）；ならびに
ｇ）第１ＨＲＭプロファイルを参照ＨＲＭプロファイルと比較する工程であって、第１ＨＲＭプロファイルおよび参照ＨＲＭプロファイルの間の差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する、工程
を含む。
本明細書において、２つの鎖からなり、好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するためのキットオブパーツも提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記キットオブパーツは：
ａ）好ましくはその５’末端でまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチド
（レポータヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチド、好ましくは１５～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、ならびに
レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、ならびに、
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的である；
ならびにレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端に少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、上記ヘルパー配列は、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズする場合、第１および第２アンプリコンにハイブリダイズできる）；ならびに
ｂ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットであって、一緒に標的核酸配列を増幅できる、プライマのセット
を含む。
本明細書において、２つの鎖からなり、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するためのキットオブパーツも提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記キットオブパーツは：
ａ）好ましくはその５’末端でまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチド
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む）、
（少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、参照配列を含む標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である）；ならびに
ｂ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットであって、一緒に標的核酸配列を増幅できる、プライマのセット
を含む。
本明細書において、２つの鎖からなり、好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列の１つの鎖にハイブリダイズできるレポータオリゴヌクレオチドも提供され、上記レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端でまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含み、レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲、好ましくは１５～５０個の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含み、
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的であり、
レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端に少なくとも１つのヘルパー配列を含むか、それらからなり、上記ヘルパー配列は、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズする場合、第１および第２アンプリコンの第２鎖にハイブリダイズできる。
本明細書において、好ましくはその５’末端でまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチドも提供され、レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含み、
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である。
本明細書において、個体における臨床状態の治療の有効性を予測するための方法も提供され、以下の工程：
ａ．上記個体からの試料を準備する工程
ｂ．試料が変異体配列を含むかどうかを決定するために本明細書において説明されたような変異体配列の存在を検出するための方法を実行する工程
を含んでよく、上記変異体配列の存在は、上記薬剤が上記個体における上記臨床状態を治療する場合に有効であるかどうかを示唆する。
本明細書において、個体における特定の変異に関連する任意の臨床状態の存在を予測する、またはさらには診断するために有用である方法も提供され、以下の工程：
ａ）上記個体からの試料を準備する工程
ｂ）本明細書において説明されたような変異体配列を検出するための方法を実行することにより試料中の臨床状態に関連する変異の存在を検出する工程
を含み、上記変異体配列の存在は、上記臨床状態を患う上記個体を示唆する。
ＮＯＩを含む変異体核酸配列を検出するための方法の原理。（Ａ）標的核酸（黒色撚線）が提供される。第２鎖は、ＮＯＩを含む（淡灰色）。第１鎖は、相補的である（黒色線）。矢印は、プライマを示す。第１プライマは、第２鎖にハイブリダイズし、プライマの増幅が生じる（破線）。第２プライマは、第１鎖にハイブリダイズし、プライマの増幅が生じる（破線）。概要を簡単にするために、標的核酸の増幅された部分のみが示される。ここでは、第２プライマは、第１プライマと比較して過剰に提供される（非対称ＰＣＲ）。したがって、ＮＯＩ配列を含むより多くのＤＮＡが生成される（黒色破線および淡灰色破線）。（Ｂ）増幅されたＤＮＡは、二本鎖標的核酸およびＮＯＩを含む一本鎖標的核酸の混合物からなる。ここでは、ＮＯＩを含む一本鎖配列が示される（淡灰色）。レポータオリゴヌクレオチド（ＲＯ）は、その鎖にハイブリダイズする。それは、ここでは、フルオロフォアＦ’（円）およびクエンチャーＱ（四角）を含む。融解曲線が得られる（Ｘ－軸：Ｔは温度である；ｙ－軸：Ｆは蛍光である）。 マイクロサテライト不安定性は、必ずしも融解温度における有意な変化をもたらすわけではない。非対称ＰＣＲを使用するＢＡＴ２５アッセイ。Ｘ軸は、温度を示す。（Ａ）０．１ＲＦＵの強度閾値を用いるバイリニア型正規化および温度シフトが適用された、融解曲線。曲線間の振幅の最大差異として測定された曲線間の差異は、約０．０７ＲＦＵであった。（Ｂ）温度シフトの適用がない第１の負の導関数曲線では、清浄な組織は、５７．３１℃のＴｍを有し、腫瘍組織では、Ｔｍは、５７．４１℃である。 バイリニア型正規化は、実際の融解相の前後で、融解曲線の勾配をより０に近くする。マイクロサテライトＮＲ２２は、非対称ＰＣＲおよびレポータオリゴヌクレオチドを使用して分析される。Ｘ軸は、温度を示す。ＨＲＭ曲線は：（Ａ）標準正規化、温度シフトなし；（Ｂ）バイリニア型正規化、温度シフトなし、を用いて得られた。 バイリニア正規化は、実際の融解相の前後で、融解曲線の勾配をより０に近くする。参照ＨＲＭ曲線がベースラインとして設定され、それが他の（ここでは第１の）融解曲線から差し引かれる、図３の融解曲線からの差分ＨＲＭ曲線。Ｘ軸は、温度を表す。（Ａ）バイリニア型正規化、温度シフトなし；（Ｂ）バイリニア型正規化、温度シフトなし。 理論上、マイクロサテライトの安定な人からの正常および腫瘍組織試料の間には融解温度における差異はないはずである。しかし、試料間の量、塩濃度、不純物および他の変数における差異は、融解温度においてわずかな差異をもたらす可能性がある。しかし、バイリニア型正規化および温度シフトは、マイクロサテライトの安定な患者の正常組織および腫瘍組織の間の差異を低減できる。非対称ＰＣＲおよびレポータオリゴヌクレオチドを使用するＮＲ２４アッセイ。Ｘ軸は、温度を示す。（Ａ）標準正規化が適用された、ＨＲＭプロファイル。差分グラフに対する正規化領域間の所与の温度での蛍光における最大差異として測定された曲線間の差異は、約０．０４ＲＦＵであった。Ｘ軸は、温度を示す。（Ｂ）バイリニア型正規化が適用されたが温度シフト閾値は適用されなかったＨＲＭプロファイル。曲線間の差異は、約０．０２ＲＦＵであった。（Ｃ）バイリニア型正規化および０．１ＲＦＵの強度閾値を有する温度シフトが適用されたＨＲＭ曲線。曲線間の差異は、約０．０１ＲＦＵであった。 温度シフトは、ＤＮＡ緩衝液中の異なる塩濃度により引き起こされる融解温度における変化を中和できる。非対称ＰＣＲおよびレポータオリゴヌクレオチドを使用するＮＲ２４アッセイ。Ｘ軸は、温度を示す。（Ａ）バイリニア型正規化が適用されたが温度シフトは適用されなかったＨＲＭ曲線。差分グラフに対する正規化領域間の所与の温度での蛍光における最大差異として測定された曲線間の差異は、約０．０７ＲＦＵであった。（Ｂ）バイリニア型正規化および０．１ＲＦＵの温度シフト強度閾値が適用されたＨＲＭ曲線。曲線間の差異は、約０．０１ＲＦＵであった。 １６の正常組織ＤＮＡ試料について非対称ＰＣＲを使用するマイクロサテライトＭＯＮＯ２７の調査のためのアッセイ。ＨＲＭ曲線は：（Ａ）バイリニア型正規化、温度シフトなし；（Ｂ）バイリニア型正規化、および０．１ＲＦＵの強度閾値で温度シフトありを用いて得られた。Ｘ軸は、温度を示す。温度シフトの適用は、普遍的参照としての１つの試料の使用を可能にする。 図７のＨＲＭ曲線の差分プロット。（Ａ）バイリニア型正規化、温度シフトなし；（Ｂ）バイリニア型正規化、および０．１ＲＦＵの強度閾値で温度シフトあり。Ｘ軸は、温度を示す。 非対称ＰＣＲは、より多くの一本鎖標的アンプリコンを作成する。対称および非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２２アッセイ。Ｘ軸は、ＰＣＲサイクル数を示し、Ｙ軸は、蛍光を示す。 非対称ＰＣＲは、より高い信号対ノイズ比およびより鋭い融解（すなわち、より狭い融解ピーク）を作成する。対称および非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２２アッセイ。（Ａ）融解曲線；（Ｂ）標準正規化を使用して正規化された融解曲線。Ｘ軸は、温度を示す。 非対称ＰＣＲは、ＭＳＳおよびＭＳＩ患者の区別を容易にする。ＮＲ２２アッセイを使用するデータが示される。ＨＲＭ曲線を、非対称ＰＣＲ（Ａ）を用いるか対称ＰＣＲ（Ｂ）を用いて標準正規化を適用した後に得た。Ｘ軸は、温度を示す。 非対称ＰＣＲは、ＭＳＳおよびＭＳＩ患者の区別を容易にする。ＮＲ２２アッセイを使用するデータが示される。図１１のＨＲＭ曲線からの差分プロット。（Ａ）非対称ＰＣＲ；（Ｂ）対称ＰＣＲ。Ｘ軸は、温度を示す。 レポータヌクレオチドにおける単一末端オーバーハングは、融解温度を上げることができる。２つの異なるレポータオリゴヌクレオチドを有するレポータオリゴヌクレオチドを使用する非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２２に基づくデータが示される。（Ａ）ＨＲＭ曲線。（Ｂ）ＨＲＭ曲線の負の第１導関数。Ｘ軸は、温度を示す。 レポータオリゴヌクレオチドを二重クエンチすることは、信号対ノイズ比を増加させる。非対称ＰＣＲを使用するＢＡＴ２６アッセイを使用するデータが示される。単回クエンチされた（「ＤＱプローブではない」）および二重クエンチされた（「ＤＱプローブ」）レポータオリゴヌクレオチドを使用するＨＲＭ曲線（Ａ）および負の第１導関数曲線（Ｂ）。Ｘ軸は、温度を示す。 レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列における追加のヌクレオチドリピートは、より長いマイクロサテライトを検出することを可能にする。非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２１アッセイを使用するデータが示される。Ｘ軸は、温度を示す。 一点変異は、融解温度を数度変化させる。ＫＩＴエクソン１３アッセイを実験のために使用した。ＰＣＲを非対称ＰＣＲとして実行した。Ｘ軸は、温度を示す。破線は、野生型標的核酸に対する結果を示し、実線は、変異を含む標的核酸に対する結果を示す。（Ａ）正規化されたＨＲＭ曲線；Ｙ軸は、蛍光を示す。（Ｂ）融解ピーク（融解曲線の負の第１導関数）。Ｙ軸は、－ｄＦ／ｄＴである。 強力なヘルパー配列は、野生型および変異体を区別するのに役立つ。ＮＲ２４アッセイを実験のために使用した。ＰＣＲを非対称ＰＣＲとして実行した。Ｘ軸は、温度を示し、ｙ軸は、蛍光を示す。破線は、野生型標的核酸に対する結果を示し、実線は、変異を含む標的核酸に対する結果を示す。（Ａ）第１ヘルパー配列を含む第１レポータオリゴヌクレオチドを用いる正規化されたＨＲＭ曲線。（Ｂ）第１ヘルパー配列よりも強力な第２ヘルパー配列を含む第２レポータオリゴヌクレオチドを用いる正規化されたＨＲＭ曲線。 強力なヘルパー配列は、野生型および変異体の区別を支援する。ＮＲ２４アッセイを、実験のために使用した。ＰＣＲを、非対称ＰＣＲとして実行した。Ｘ軸は、温度を示し、ｙ軸は、蛍光を示す。破線は、野生型標的核酸に対する結果を示し、実線は、変異を含む標的核酸に対する結果を示す。（Ａ）第１ヘルパー配列を含む第１レポータオリゴを用いる差分プロット。（Ｂ）第１ヘルパー配列よりも強力な第２ヘルパー配列を含む第２レポータオリゴを用いる差分プロット。
定義
アンプリコン
「アンプリコン」は、別の分子をコピーまたは転写することにより作成された分子を指す。アンプリコンを生産できる代表的なプロセスは、転写、クローニング、および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または別の核酸増幅技術（例えば、鎖置換ＰＣＲ増幅（ＳＤＡ）、デュープレックスＰＣＲ増幅など）を含む。典型的には、アンプリコンは、選択された核酸（例えば、テンプレートまたは標的核酸）のコピーであるか、それと相補的である。
バイリニア型正規化。用語「バイリニア型正規化」は本明細書において、差分曲線の蛍光データを正規化された曲線にスケーリングすることにより曲線（複数可）に適用される数学的変換を指すために使用される。これは、蛍光信号に影響を与える可能性のある他の因子（機器内の異なる位置の中での異なる信号強度、プラスチックの異なる透明度および蛍光測定の変数を導入する他の因子など）を取り除く差分曲線の比較を可能にする。バイリニア型正規化は、選択された正規化領域において、曲線（複数可）が（正規化領域の平均値で）同じ値を有し曲線のコースが可能な限り水平（フラット）になるように強制する。曲線に適用でき、曲線（複数可）を異なる融解曲線の比較を可能にする曲線（複数可）に変換できる、いくらかのアルゴリズムが当技術分野において既知である。正規化はまた、ウェル間の異なる光学的および機械的差異の影響も低減する。
疎水性ヌクレオチド
本明細書において使用されるような用語「疎水性ヌクレオチド」は、以下の「疎水性ヌクレオチド」のセクションで、本明細書において詳細に説明される疎水性ヌクレオチドを指す。特に、本発明による疎水性ヌクレオチドは、リンカーを介してヌクレオチド／ヌクレオチド類縁体／骨格モノマー単位に接続されるインターカレーターを含む。
融解温度
本明細書において使用されるような用語「融解温度」は、そこで５０％螺旋（ハイブリダイズされた）形状対コイル（ハイブリダイズされていない）形状が存在する、摂氏温度を示す。融解温度はまた、（Ｔｍ）とも呼ばれてよい。核酸および核酸類縁体の融解は、二本鎖核酸分子の２つの鎖の熱分離を指す。
マイクロサテライト
用語「マイクロサテライト」、「マイクロサテライトマーカー」または「マイクロサテライト遺伝子座」は、タンデムヌクレオチドリピートを含むゲノムＤＮＡの領域を指す。これらのリピートまたは「反復単位」は典型的に、長さが約１～約７の塩基対である。マイクロサテライト遺伝子座は典型的に、タンデム配列中に約１０～４０個のこれらの反復単位を含む。１つのヌクレオチドのリピートであるモノヌクレオチドリピートに加えて、他の代表的な反復ヌクレオチド配列は、ジヌクレオチドリピート、例えば、ＡＴリピートおよびＧＣリピート、トリヌクレオチドリピート、例えば、ＣＧＧリピート、ＣＧＣリピート、ＴＡＴリピート、ＡＴＴリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピートおよび／またはそれらの相補的リピートを含む。
ヌクレオチド類縁体
用語「ヌクレオチド類縁体」は、核酸骨格に組み込むことができ、本質的に天然に存在するヌクレオチドのように、特定の塩基対形成が可能であるすべてのヌクレオチド類縁体を含む。本発明によるヌクレオチド類縁体は、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＸＮＡ、ＩＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’－ＮＨ）－ＴＮＡ、（３’－ＮＨ）－ＴＮＡ、α－Ｌ－リボ－ＬＮＡ、α－Ｌ－キシロ－ＬＮＡ、β－Ｄ－キシロ－ＬＮＡ、α－Ｄ－リボ－ＬＮＡ、［３．２．１］－ＬＮＡ、ビシクロ－ＤＮＡ、６－アミノ－ビシクロ－ＤＮＡ、５－エピ－ビシクロ－ＤＮＡ、α－ビシクロ－ＤＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］－ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］－ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド－ＤＮＡ、β－Ｄ－リボピラノシル－ＮＡ、α－Ｌ－リキソピラノシル－ＮＡ、２’－Ｒ１－ＲＮＡ、２’－ＯＲ１－ＲＮＡ（Ｒ１は、置換基である）、α－Ｌ－ＲＮＡ、α－Ｄ－ＲＮＡ、およびβ－Ｄ－ＲＮＡからなる群より選択されるヌクレオチド類縁体を含むが、これらに限定されない。
目的のヌクレオチド
本明細書において使用されるような用語「目的のヌクレオチド（複数可）」は、２つの異なる変異体で存在してよい、標的核酸配列内のヌクレオチド（複数可）を指す。「目的のヌクレオチド（複数可）」はまた、本明細書において「ＮＯＩ」と呼ばれることもある。したがって、ＮＯＩは、変異体配列からなってよい、または本明細書において「参照配列」とも呼ばれる参照配列からなってよい。いくらかの実施形態において、参照配列は、野生型配列であり得る。
ヌクレオチド
本明細書において使用されるような用語「ヌクレオチド」は、天然に存在するヌクレオチド、例えば、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの天然に存在する誘導体を指す。天然に存在するヌクレオチドは、４つのヌクレオ塩基アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）の１つを含むデオキシリボヌクレオチド、および４つのヌクレオ塩基アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）の１つを含むリボヌクレオチドを含む。
オリゴヌクレオチド
本明細書において使用されるような用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類縁体および／または疎水性ヌクレオチドのオリゴマーを指す。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、任意で１つまたは複数の疎水性ヌクレオチドを含むヌクレオチドのオリゴマーである。
参照標的配列
用語「参照標的配列」は、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチを指す。
標準正規化
用語「標準正規化」は、差分曲線の蛍光データの正規化された曲線へのスケーリングを指し、蛍光信号に影響する可能性のある他の因子（機器内の異なる位置の中での異なる信号強度、プラスチックの異なる透明性および蛍光測定の変数を導入する他の因子など）を除去する差分曲線の比較を可能にする。
標的核酸配列
本明細書において使用されるような用語「標的核酸配列」は、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む核酸配列を指す。標的核酸配列は、プライマのセットを使用して増幅できる。
温度シフト
本明細書において使用されるような用語「温度シフト」は、２つのまたはそれより多い正規化された曲線に適用され、所与の蛍光限界（強度閾値）でまったく同じＴｍを有するように、これらを温度方向にシフトさせる、数学的ツールを指す。そのような変換アルゴリズムをデータセットに適用することは、例えば、異なる試料中の異なる塩濃度からの影響を低減する。
変異体配列
本明細書において使用されるような用語「変異体配列」は、参照配列とは異なる、標的核酸配列内のヌクレオチド（複数可）を指す。したがって、標的核酸配列は、変異体配列であるＮＯＩを含んでよい、または標的核酸配列は、参照配列であるＮＯＩを含んでよい、またはＮＯＩは、さらに別の変異体配列であってよい。変異体配列は、例えば、一塩基変異などの変異であり得る、またはそれは、挿入もしくは欠失であり得る。変異体配列および参照配列は、一方の配列が他方の全配列を含むように重複してよい。そのような場合、変異体配列および参照配列は、配列を構成するヌクレオチドの数が異なってよい。
標的核酸配列中の変異体配列の存在を検出する方法
本発明は、標的核酸配列中の変異体配列の検出のための方法に関する。したがって、方法は特に、２つのまたはそれより多い異なる配列で生じる可能性がある、標的核酸配列中の特定の配列の存在を検出するために有用である。方法は、例えば、野生型配列および変異体配列を区別するために有用であり得、異なる多形配列を区別するために有用であり得る。方法は特に、野生型配列または参照配列とは異なる長さを有する変異体配列の存在を検出することによりマイクロサテライト不安定性から生じる変異体配列を検出するために有用である。したがって、方法は、リピート、特にマイクロサテライトを含む標的核酸配列を検出するために好都合に使用できる。
本明細書において、２つの鎖からなり、好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するための方法が提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記方法は、以下の工程：
ａ）上記変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１試料を準備する工程；
ｂ）上記参照配列を含む核酸を含む第２試料を準備する工程あって、第２試料が、参照試料である、工程；
ｃ）レポータオリゴヌクレオチドを準備する工程；
ｄ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットを準備する工程であって、プライマのセットが一緒に、ＮＯＩを含む標的核酸配列を増幅できる、工程；
ｅ）上記第１試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１アンプリコンを得る工程；ならびに上記第２試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって参照配列を含む第２アンプリコンを得る工程であって、第２アンプリコンが、参照アンプリコンである、工程；
ｆ）第１アンプリコンの高分解能融解（ＨＲＭ）分析などの融解分析を実行し、それによって第１融解曲線により特徴づけられる第１プロファイルを得る工程、ならびに第２アンプリコンのＨＲＭ分析などの融解分析を実行し、それによって第２融解曲線により特徴づけられる第２プロファイルを得る工程であって、第２プロファイルが、参照融解曲線により特徴づけられる参照プロファイルである、工程（各アンプリコンは、第１鎖および第２鎖を含み、融解分析は、各アンプリコンの１つの鎖へのレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、フルオロフォアにより放出される信号の検出、ならびに第１および第２融解曲線を得ることを含む）；
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲、好ましくは１５～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、
レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端でまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含む、ならびに
レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的である、
ならびにレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端での少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、上記ヘルパー配列は、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズする場合、第１および第２アンプリコンにハイブリダイズできる）；ならびに
ｇ）第１プロファイルを参照プロファイルと比較する工程であって、第１プロファイルおよび参照プロファイルの間の差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する、工程
を含む。
本明細書において、２つの鎖からなり、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するための方法が提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記方法は、以下の工程：
ａ）上記変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１試料を準備する工程；
ｂ）上記参照配列を含む核酸を含む第２試料を準備する工程であって、第２試料が、参照試料である、工程；
ｃ）レポータオリゴヌクレオチドを準備する工程；
ｄ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットを準備する工程であって、プライマのセットが一緒に、標的核酸配列を増幅できる、工程；
ｅ）上記第１試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１アンプリコンを得る工程；ならびに上記第２試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって参照配列を含む第２アンプリコンを得る工程であって、第２アンプリコンが、参照アンプリコンである、工程；
ｆ）第１アンプリコンの高分解能融解（ＨＲＭ）分析を実行し、それによって第１融解曲線により特徴づけられる第１ＨＲＭプロファイルを得る工程、ならびに第２アンプリコンのＨＲＭ分析を実行し、それによって第２融解曲線により特徴づけられる第２ＨＲＭプロファイルを得る工程であって、第２ＨＲＭプロファイルが、参照融解曲線により特徴づけられる参照プロファイルである、工程（各アンプリコンは、第１鎖および第２鎖を含み、ＨＲＭ分析は、各アンプリコンの１つの鎖へのレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、フルオロフォアにより放出される信号の検出、ならびに第１および第２融解曲線を得ることを含む）；
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、
レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端でまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含む、ならびに
レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である）；ならびに
ｇ）第１ＨＲＭプロファイルを参照ＨＲＭプロファイルと比較する工程であって、第１ＨＲＭプロファイルおよび参照ＨＲＭプロファイルの間の差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する、工程
を含む。
したがって、２つのまたはそれより多い異なる標的核酸配列が存在する場合、方法は、少なくとも２つの異なる標的核酸配列、すなわち、変異体配列を含む標的核酸配列および変異体配列を含まない標的核酸配列を区別するために有用である。後者はまた、「参照配列」と呼ばれることもある。任意で、方法は、他の変異体配列を含む標的核酸配列間を区別するために有用であり得る。方法の一般原理を、図１に例示する。要するに、第１および第２プロファイル間の差異、特に、分析された融解プロファイルおよび参照融解プロファイルの間の差異は、試験された試料（第１試料）が変異体配列を含むことを示唆する；本開示を通じて、差異が好ましくは、有意差を指すことが理解されるであろう。
野生型および変異体の配列を区別するために方法が使用される本発明の実施形態において、変異体配列は、参照配列であり得る。しかし、多くの場合、野生型配列が参照配列である。本発明の方法はまた、野生型およびいくらかの異なる変異体配列を区別するために使用されてもよく、その場合、野生型配列は典型的に、参照配列であり、いくらかの異なる変異体配列は、変異体配列である。方法のいくらかの実施形態において、参照配列は、マイクロサテライト配列である。その場合、変異体配列は、参照配列のタンデムリピートの数とは異なる数のタンデムリピートを有する、いくつかのタンデムリピートからなるマイクロサテライト配列であり得る。例えば、変異体配列は、マイクロサテライト不安定性の結果であり得る－これらの場合、変異体配列は、異なる数のタンデムリピートを有する複数の変異体配列であり得る。比較により、参照配列はその場合、一定数のタンデムリピートを有する。
変異体配列は、いくらかの実施形態において、病状を示唆する変異であり得る、またはそれは、所与の処置の有効性の予測であり得る。
目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）、変異体配列および参照配列
変異体配列は、別の配列、特に参照配列とは異なる任意の配列であり得る。多くの場合、変異体配列は、変異体配列であり、例えば、ヌクレオチドを別のものに置き換える変異の存在のため、および／または参照配列と比較したヌクレオチドの挿入および／または欠失のため、野生型配列とは異なる配列である。しかし、変異体配列はまた、多形配列または参照配列とは異なる任意の他の配列であってよい。好ましくは、変異体配列は、、マイクロサテライトの正常な長さとは異なる長さを有する、マイクロサテライトの変異体である。本方法は実際に、マイクロサテライト不安定性を検出するために特に有用である。それらは、短い（１５未満のヌクレオチド）マイクロサテライトおよびより長いマイクロサテライト（１５を超えるヌクレオチド）の不安定性を検出するために使用できる。マイクロサテライト不安定性を有する対象において、より長いマイクロサテライトは典型的に、より短いマイクロサテライトの前に変異する－したがって、１５ヌクレオチドまたはそれより大きい長さを有する、より長いマイクロサテライトである標的核酸を使用することが好都合であり得る。
変異体配列は、１など、例えば２、３など、例えば４、５など、例えば６、７など、例えば８、９など、例えば１０、１０～２０など、例えば２０～５０、５０を超えるヌクレオチドなどの少なくとも１つからなってよい。好ましくは、変異体配列は、１０のまたはそれより多い、例えば１５のまたはそれより多いヌクレオチドからなる。したがって、いくらかの実施形態において、変異体配列は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０のまたはそれより多いヌクレオチド、２５、３０、３５、４０、４５または５０のまたはそれより多いヌクレオチドなどからなる。例えば、変異体配列は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のまたはそれより多いヌクレオチドからなる。
本発明のいくらかの実施形態において、変異体配列は、一塩基変異または一塩基多型（ＳＮＰ）である。
変異体配列は、参照標的配列と比較した、１つまたは複数の他のヌクレオチドに対する１つまたは複数のヌクレオチドの変化であり得る。さらに、用語、変異体配列は、核酸内のヌクレオチドの欠失または挿入、例えば、参照標的配列と比較したヌクレオチドの欠失または挿入であり得る。
標的核酸配列は、多形部位を含んでよく（本明細書の以下の詳細を参照する）、したがって、参照標的配列は、１つの多形体を含んでよく、一方で「変異体配列」は、別の多形体を構成してよい。
一実施形態において、参照標的配列は、野生型配列である、すなわち、最も頻繁に天然に存在する配列であり、一方で変異体配列は、上記野生型配列と比較して、１つまたは複数の変異、挿入または欠失を含む。したがって、本発明による変異体配列は、一実施形態において、一塩基多型（ＳＮＰ）などの、多形体であり得る。例えば、多形体は、特定のＤＮＡプロファイルを示してよい。特定のＤＮＡプロファイルの知識は、例えば、個体を同定するために使用できる。例えば、特定のＤＮＡプロファイルは、犯罪または潜在的な犯罪を同定するか、死体または死体の一部を同定するために使用できる。さらに、特定のＤＮＡプロファイルは、個体間の関係、例えば、親子間の関係またはより遠い関係を決定するために使用できる。関係はまた、異なる種および所与の種の異なる個体群の間の関係であり得る。
いくらかの実施形態において、参照配列は、所与の数のリピートを有するマイクロサテライトであるか、それを含む。変異体配列はその場合、参照または野生型配列において観察された数とは異なる数のリピートを有する、１つまたはいくらかの変異体配列であり得る。
一実施形態において、変異体配列は、臨床状態を示唆してよい、または変異は、臨床状態の増加した危険性を示唆してよい。特に、変異体配列は、マイクロサテライトであってよく、臨床状態は、マイクロサテライト不安定性に関連してよい。
上記臨床状態は、例えば、腫瘍性疾患、神経変性疾患、心血管疾患および糖尿病を含む代謝疾患からなる群より選択できる。
さらに、変異体配列は、所定の薬剤治療に対する特定の応答を示唆してよい。例えば、変異体配列の存在は、個体が上記薬剤治療に対して正に応答するかどうか、または個体が特定の薬剤治療に耐えることができるか、できないかを示唆してよい。例えば、ＭＳＩの検出は、例えば、キイトルーダ（登録商標）（ペムブロリズマブ、メルクアンドカンパニー）またはオプジーボ（ニボルマブ、ブリストル－マイヤーズスクイブ）などのようなチェックポイント阻害剤の使用を定める決定プロセスにおいて使用できるであろう。
変異体配列は、特定の遺伝子、遺伝子セグメント、マイクロサテライトまたは任意の他のＤＮＡ配列中に位置してよい。さらに、変異体配列は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは任意の他のＲＮＡ配列中に位置してよい。本明細書に記載の方法は、真核生物、原核生物、古細菌またはウイルス起源のものであってよい、特定のＤＮＡの検出を可能にする。例えば、本発明は、特定の微生物に関連することが既知である特定の配列についてアッセイすることにより、種々の感染症の診断および／または遺伝子型決定を支援できる。
標的核酸配列
本方法は、２つの鎖からなり、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列中の変異体配列の存在を検出するためのものである。標的核酸配列が２つの鎖からなり、典型的にＤＮＡである一方で、－例えば、増幅が、ＲＮＡの増幅である場合、本発明の方法が、標的核酸配列の一本鎖を増幅させることにより標的核酸中の変異体配列の存在を検出するように容易に適合させることができることが理解されるであろう。したがって、本方法はまた、例えば、２つの鎖からなる標的核酸配列の転写から生じる、標的ＲＮＡ中の変異体配列を検出するために使用することもできる。
標的核酸はしたがって、変異体配列を含む疑いがある、目的の配列である。換言すると、それは多くの場合、特定の遺伝子座に対応する。
標的核酸配列は、１など、例えば２、３など、例えば４、５など、例えば６、７など、例えば８、９など、例えば１０、１０～２０など、例えば２０～５０、５０を超えるヌクレオチドなどの少なくとも１つからなってよい。好ましくは、標的核酸配列は、１５のまたはそれより多いヌクレオチドからなる。したがって、いくらかの実施形態において、標的核酸配列は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０のまたはそれより多いヌクレオチド、例えば２５、３０、３５、４０、４５または５０のまたはそれより多いヌクレオチドからなる。例えば、標的核酸配列は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のまたはそれより多いヌクレオチドからなる。本方法はマイクロサテライト、特に、標的核酸配列が参照配列である１５のまたはそれより多いヌクレオチドの長さを有するマイクロサテライトの変異体配列を検出するために特に有用であるので、その長さは、好ましくは１５のまたはそれより多いヌクレオチドである。
いくらかの実施形態において、標的核酸は、多くのタンデムリピートを含む、マイクロサテライトである。参照配列について、タンデムリピートの数は、Ｍであり、Ｍは、整数である。参照配列について、全長は、ｎ個のヌクレオチドである。変異体配列は、Ｍ’個のタンデムリピートおよびｎ’個のヌクレオチドの全長を有する。ＭおよびＭ’は、異なる整数であり、ｎおよびｎ’は、異なる整数である。しかし、いくらかの変異体配列がＭ個のタンデムリピートおよびｎ個のヌクレオチドの全長を有する可能性がある－しかし、この場合、いくらかまたはほとんどの変異体配列は依然として、参照配列と比較して異なる数のリピートおよび異なる全長を有しており、このことは、本方法が、参照配列とは異なる変異体配列の存在を検出することを可能にする。
いくらかの実施形態において、ｎおよび／またはｎ’は、１、１など、例えば２、３など、例えば４、５など、例えば６、７など、例えば８、９など、例えば１０、１０～２０など、例えば２０～５０の、５０を超えるなどのヌクレオチドである。好ましくは、ｎおよび／またはｎ’は、１５のまたはそれより多いヌクレオチドである；いくらかの実施形態において、少なくともｎは、１５のまたはそれより多いヌクレオチドである。したがって、いくらかの実施形態において、ｎおよび／またはｎ’は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のまたはそれより多いヌクレオチド、２５、３０、３５、４０、４５または５０などのまたはそれより多いヌクレオチドからなる。例えば、ｎおよび／またはｎ’は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のまたはそれより多いヌクレオチドからなる。好ましくは、少なくともｎは、１５、１６、１７、１８、１９、２０のまたはそれより多いヌクレオチド、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のまたはそれより多いヌクレオチドなど、２５、３０、３５、４０、４５または５０などのまたはそれより多いヌクレオチドからなる。いくらかの実施形態において、ｎ’は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のまたはそれより多いヌクレオチド、２５、３０、３５、４０、４５または５０などのまたはそれより多いヌクレオチドである。
本方法は、特定の障害を示唆してよい変異体配列を検出するために使用できる。例えば、障害は、マイクロサテライト不安定性に関連する。
いくらかの異なる変異体配列の存在について試料を調査することは、多くの場合有利である。したがって、本方法は、いくらかの変異体配列が同時に検出されるように適合されてよい。時として、多くの変異体配列の少なくとも１つが存在するかを決定するだけで充分である。
いくらかの実施形態において、標的核酸配列は、モノヌクレオチドリピートを含むマイクロサテライトマーカーである、１つまたは複数のＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４およびＭＯＮＯ２７を含む複数の標的核酸配列である。方法は、これらの標的核酸配列についての参照配列とは異なるリピートの数、したがって異なる全長を有する変異体配列の検出を可能にする。
ヒトＢＡＴ２５の参照または野生型配列は、配列番号１に示す通りである。ＢＡＴ２５のモノヌクレオチドリピートは、配列番号１の１４７位～１７１位と一致する。参照配列はしたがって、Ｍ個のモノヌクレオチドリピートを有し、Ｍ＝２５である。
ヒトＢＡＴ２６の参照または野生型配列は、配列番号２に示す通りである。ＢＡＴ２６のモノヌクレオチドリピートは、配列番号２の２２２位～２４８位と一致する。参照配列はしたがって、Ｍ個のモノヌクレオチドリピートを有し、Ｍ＝２７である。
ヒトＮＲ２１の参照または野生型配列は、配列番号３に示す通りである。ＮＲ２１のモノヌクレオチドリピートは、配列番号３の１８９位～２０９位と一致する。参照配列はしたがって、Ｍ個のモノヌクレオチドリピートを有し、Ｍ＝２１である。
ヒトＮＲ２２の参照または野生型配列は、配列番号４に示す通りである。ＮＲ２２のモノヌクレオチドリピートは、配列番号４の１５２位～１７２位と一致する。参照配列はしたがって、Ｍ個のモノヌクレオチドリピートを有し、Ｍ＝２１である。
ヒトＮＲ２４の参照または野生型配列は、配列番号５に示す通りである。ＮＲ２４のモノヌクレオチドリピートは、配列番号５の１６５位～１８７位と一致する。参照配列はしたがって、Ｍ個のモノヌクレオチドリピートを有し、Ｍ＝２３である。
ヒトＭＯＮＯ２７の参照または野生型配列は、配列番号６に示す通りである。ＭＯＮＯ２７のモノヌクレオチドリピートは、配列番号６の３００位～３２７位と一致する。参照配列はしたがって、Ｍ個のモノヌクレオチドリピートを有し、Ｍ＝２８である。
いくらかの実施形態において、標的核酸配列は、配列番号１に示すようなＢＡＴ２５であり、ＮＯＩは、配列番号１の１４７位～１７１位により定義される配列と一致する。他の実施形態において、標的核酸配列は、配列番号２に示すようなＢＡＴ２６であり、ＮＯＩは、配列番号２の２２２位～２４８位により定義される配列と一致する。他の実施形態において、標的核酸配列は、配列番号３に示すようなＮＲ２１であり、ＮＯＩは、配列番号３の１８９位～２０９位により定義される配列と一致する。他の実施形態において、標的核酸配列は、配列番号４に示すようなＮＲ２２であり、ＮＯＩは、配列番号４の１５２位～１７２位により定義される配列と一致する。他の実施形態において、標的核酸配列は、配列５に示すようなＮＲ２４であり、ＮＯＩは、配列番号５の１６５位～１８７位により定義される配列と一致する。他の実施形態において、標的核酸配列は、配列番号６に示すようなＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、配列番号６の３００位～３２７位により定義される配列と一致する。
他の実施形態において、標的核酸配列は、２つの標的核酸配列である。例えば、２つの標的核酸配列は、ＢＡＴ２５とＢＡＴ２６；ＢＡＴ２５とＮＲ２１；ＢＡＴ２５とＮＲ２２；ＢＡＴ２５とＮＲ２４；ＢＡＴ２５とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２６とＮＲ２１；ＢＡＴ２６とＮＲ２２；ＢＡＴ２６とＮＲ２４；ＢＡＴ２６とＭＯＮＯ２７；ＮＲ２１とＮＲ２２；ＮＲ２１とＮＲ２４；ＮＲ２１とＭＯＮＯ２７；ＮＲ２２とＮＲ２４；ＮＲ２２とＭＯＮＯ２７；ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、上で定義された通りである。
他の実施形態において、標的核酸配列は、３つの標的核酸配列である。例えば、３つの標的核酸配列は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６とＮＲ２１；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６とＮＲ２２；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６とＮＲ２４；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２５、ＮＲ２１とＮＲ２２；ＢＡＴ２５、ＮＲ２１とＮＲ２４；ＢＡＴ２５、ＮＲ２１とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２５、ＮＲ２２とＮＲ２４；ＢＡＴ２５、ＮＲ２２とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２５、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２６、ＮＲ２１とＮＲ２２；ＢＡＴ２６、ＮＲ２１とＮＲ２４；ＢＡＴ２６、ＮＲ２１とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２６、ＮＲ２２とＮＲ２４；ＢＡＴ２６、ＮＲ２２とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２６、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７；ＮＲ２１、ＮＲ２２とＮＲ２４；ＮＲ２１、ＮＲ２２とＭＯＮＯ２７；ＮＲ２１、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７；ＮＲ２２、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、上で定義された通りである。
他の実施形態において、標的核酸配列は、４つの標的核酸配列である。例えば、４つの標的核酸配列は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１とＮＲ２２；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１とＮＲ２４；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２２とＮＲ２４；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２２とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２とＮＲ２４；ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７；ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、上で定義された通りである。
他の実施形態において、標的核酸配列は、５つの標的核酸配列である。例えば、５つの標的核酸配列は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２とＮＲ２４；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２２、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７；ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、上で定義された通りである。
他の実施形態において、標的核酸配列は、６つの標的核酸配列である。例えば、６つの標的核酸配列は、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、上で定義された通りである。
好ましい実施形態において、標的核酸は、５つの標的核酸であり、好ましくはＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２とＮＲ２４；またはＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２２、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、上で定義された通りである。他の好ましい実施形態において、標的核酸配列は、６つの標的核酸配列であり、好ましくはＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４とＭＯＮＯ２７であり、ＮＯＩは、上で定義された通りである。
試料
方法の第１工程において、検出される変異体配列を含む疑いがある核酸を含む、第１試料が提供される。方法の第２工程において、参照配列を含む、第２試料が提供される。第２試料はしたがって、参照試料であり、これらの用語は、本明細書において交換可能に使用される。
試料は、上記核酸を含む細胞を含んでよい。細胞は例えば、植物細胞または哺乳動物細胞などの、原核細胞または真核細胞であり得る。
試料は例えば、合成的に調製された試料であり得、それはインビトロでさらに処理されても処理されなくてもよいが、最も頻繁には、試料は、個体から得られた試料である。
いくらかの実施形態において、第１試料は、変異体配列の存在により特徴づけられる疾患または障害を患っているか、患っている疑いがある個体から得られた試料であり、第２試料は、健康な個体から得られた試料である。例えば罹患組織からの細胞、すなわち疾患を患っている疑いがある１つの個体からの、疾患の特徴的な変異体配列を含む疑いがある細胞を含む第１試料、ならびに、健康な組織からの細胞、すなわち同じ個体からの、変異体配列を含まない細胞を含む第２試料を使用することも可能である。本方法は、いくらかの実施形態において、普遍的な参照試料を使用することを可能にする。
したがって、多くの場合、哺乳動物などの、例えばヒトの、個体のＤＮＡまたはＲＮＡを試験することが望ましい。そのような場合、試料は、上記個体に由来する試料である。したがって、試料は例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは任意の他のＲＮＡ配列からなる群より選択される核酸を含んでよい。試料は、体液試料、例えば血液試料、生検、毛髪、爪などの試料または任意の他の適切な試料に由来してよい。個体が癌を患っている本発明の実施形態において、試料は、外科手術により個体から取り出された癌腫瘍の試料、または上記腫瘍の生検であり得る。しかし、個体が癌を患っている本発明の実施形態において、試料はまた、典型的にＣＴＣおよびｃｆＤＮＡを含んでよい、血液試料であり得る。
試料は、変異体配列の存在の検出の前にインビトロで処理されてよい。例えば、試料は、完全にまたは部分的に試料から核酸を精製できる１つまたは複数の精製工程に供されてよい。さらに、試料は、逆転写に供されていてよい。
試料は、核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）および非核酸、例えば無傷の細胞または粗細胞抽出物の複合生物学的混合物を含んでよい。
標的ＤＮＡが二本鎖であるか、そうでなければ、その検出を妨げる可能性のある二次および／または三次構造を有している場合、本発明の方法を実行する前に、それを加熱する必要がある可能性がある。いくらかの場合においてまた、当技術分野において既知である任意の方法による増幅を実行する前に、複合生物学的試料から核酸を抽出することが望ましい可能性がある。
試料は、プロトプラストを含む広範囲の真核細胞および原核細胞；または標的デオキシリボ核酸を保持する可能性がある他の生物学的材料を含んでよい。方法はしたがって、組織培養動物細胞、動物細胞（例えば、血液、血清、血漿、網状赤血球、リンパ球、尿、骨髄組織、脳脊髄液または血液もしくはリンパから調製された任意の製品）または任意の種類の組織生検（例えば、溶解緩衝液で均質化された筋肉生検、肝臓生検、腎臓生検、膀胱生検、骨生検、軟骨生検、皮膚生検、膵臓生検、腸管の生検、胸腺生検、哺乳動物生検、子宮生検、精巣生検、眼生検または脳生検）、植物細胞または浸透圧ショックに感受性がある他の細胞ならびに細菌、酵母、ウイルス、マイコプラズマ、原生動物、リケッチア、真菌の細胞ならびに他の小さい微生物細胞などに適用可能である。本発明のアッセイおよび単離手順は、例えば、目的の非病原性または病原性微生物を検出するために有用である。生物学的試料中の変異体配列の存在を検出することにより、微生物の存在を確立できる。
いくらかの実施形態において、少なくとも第１試料は、上で詳述したような変異体配列の存在、特に変異体マイクロサテライト配列の存在または変異体配列の存在により特徴づけられる疾患または障害を患うか、その疑いがある個体から得られる。いくらかの実施形態において、疾患は、癌または遺伝性障害、例えば、膵癌、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌、子宮癌、乳癌、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌である。いくらかの実施形態において、疾患は、リンチ症候群、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体菱縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、脆弱Ｘ症候群、ＦＲＡＸＥ精神遅滞および脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）ブルトンＸ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルーム症候群（ＢＳ）、頭蓋前頭鼻骨症候群（ＣＦＮＳ）および特発性肺線維症（ＩＰＦ）などの遺伝性障害である。
増幅
本方法は、第１試料および第２試料からのＮＯＩを含む標的核酸配列の増幅を必要とする。これは、プライマのセットが提供されることを必要とする。プライマのセットは、第１プライマおよび第２プライマからなり、それらは一緒に、当技術分野において既知であるようなＮＯＩを含む標的核酸配列を増幅できる。
プライマのセットは、例えば、リアルタイムＰＣＲなどのＰＣＲにおいて使用される場合、標的核酸配列の存在下で、当技術分野において他の方法で既知である試薬を用いて、標的核酸の増幅をプライミングできる。そのような試薬は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓで説明されている。反応はその後、アンプリコンを生成する。増幅が第１試料の存在下で実行される場合、生成されたアンプリコンは、第１アンプリコンと名付けられる。増幅が第２（または参照）試料の存在下で実行される場合、生成されたアンプリコンは、第２アンプリコンまたは参照アンプリコンと名付けられる。
標的核酸配列に特異的なプライマのセットを与えるために、プライマは、標的核酸配列のストレッチと同一である配列を含む。特に、第１および第２プライマの３’末端は、少なくとも１５ヌクレオチドの配列を含んでよく、それは、最大１つのミスマッチを除き参照または変異体配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である。
標的核酸配列のストレッチと同一のプライマの配列の正確な長さは、ＰＣＲ増幅に有用な融解温度を有するプライマに到達するために調節できる。プライマの融解温度は、いくらかの因子に依存するが、特に、ＧＣ含量および長さに依存する。プライマは好ましくは、変異体配列（または変異体配列に相補的な配列）を含む標的核酸配列のストレッチと同一である必要があるため、プライマの特定の配列に対する制限がある。したがって、融解温度は、特にプライマの長さを調節することにより調節できる。当業者は、適切な融解温度でプライマを充分に設計でき、この目的のための有用なソフトウェアが、公に利用可能である。
したがって、プライマの３’末端は、最大１つのミスマッチを除き変異体配列を含む標的核酸配列と同一である、少なくとも１５のヌクレオチド、例えば少なくとも２０のヌクレオチド、少なくとも２５のヌクレオチドなど、例えば１５～５０の範囲のヌクレオチド、２０～４０の範囲のヌクレオチドなどの配列を含んでよい。
本発明の一実施形態において、第１および／または第２プライマは、最大１つのミスマッチを除き変異体配列を含む標的核酸配列と同一である、少なくとも１５のヌクレオチド、例えば少なくとも２０のヌクレオチド、少なくとも２５のヌクレオチドなど、例えば１５～５０の範囲のヌクレオチド、２０～４０の範囲のヌクレオチドなどの配列からなる。
上述したように、プライマの配列は、最大１つのミスマッチを除き変異体配列を含む標的核酸配列と同一の（または相補的な）配列を含むかまたはそれからなる。いくらかの実施形態において、第１および第２プライマの一方または両方に１つのミスマッチがあり、これはアッセイの特異性をさらに改善し得るためである。特に、上記ミスマッチは、プライマの３’末端から２位、３位または４位に位置する可能性がある。
いくらかの実施形態において、変異体配列に対応する領域の外側の標的核酸配列にハイブリダイズするプライマを設計することは、有用であり得る。例えば、標的核酸配列がマイクロサテライトであり、かつ変異体配列がヌクレオチドリピートの数により参照配列と異なる場合、プライマは好ましくは、タンデムリピートからなる領域の上流および下流でハイブリダイズし、なぜなら増幅は、そうでなければ非特異的であり異なる長さの種々のアンプリコンをもたらし得るからである。
プライマは、本明細書に記載されるような少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドを含んでよい。
増幅の工程は、リアルタイムＰＣＲなどの、ＰＣＲであり得る。いくらかの実施形態において、増幅（例えば、ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）反応は、非対称反応である。非対称は、反応がテンプレートの一方の鎖を他方よりも多く増幅することに向けられることを意味する。それは、プライマ対のプライマの異なる量を提供することにより実行される。
第１プライマは、ＮＯＩ配列を含む、標的核酸配列の第１鎖にハイブリダイズする。第２プライマは、ＮＯＩ配列と相補的である、標的核酸配列の第２鎖にハイブリダイズする。後者の工程において、変異体配列の存在は、以下で説明されるように、レポータプローブの存在下で、ＮＯＩ配列と同一の配列を含むアンプリコンの融解プロファイルを分析することにより検出される。例において示すように、融解プロファイルの分析は、それにレポータオリゴヌクレオチドがハイブリダイズできるアンプリコンの鎖が、レポータオリゴヌクレオチドと相補的であるアンプリコンの鎖よりも多い量で存在する場合、容易になる。したがって、好ましい実施形態において、増幅工程は、非対称である、すなわち、それは、第１プライマよりも多くの量の第２プライマを用いて実行される。これは、レポータオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするアンプリコンの鎖をより多く生成するように増幅を指示する。
融解分析（ＨＲＭ分析を含む）
融解分析、特にＨＲＭ（高解像度融解）分析は、形成されたヘテロ二本鎖アンプリコンの融解特性（特に二本鎖相から一本鎖相への遷移プロファイル）の分析に基づく。アンプリコンの融解プロファイルは、それらのグアニン－シトシン含量、長さ、配列、およびヘテロ接合性に依存する。ヌクレオチド配列における変化は、野生型の融解プロファイルと比較して融解曲線の形状を変化させるヘテロ二本鎖の形成を生じる。
第１アンプリコンおよび第２アンプリコンが、例えば、非対称増幅反応の使用を通じて得られる場合、方法は、融解分析、特にＨＲＭ分析を実行して、各アンプリコンについての融解プロファイル（例えば、ＨＲＭプロファイル）を得る工程を含む。第１融解プロファイル（または第１ＨＲＭプロファイル）は、第１アンプリコンについて得られ、参照プロファイル（または参照ＨＲＭプロファイル）とも呼ばれる第２融解プロファイル（または第２ＨＲＭプロファイル）は、第２アンプリコンについて得られる。融解プロファイル（またはＨＲＭプロファイル）はその後、以下に詳細に説明されるように比較される。
各融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイルは、融解曲線により特徴づけられる。第１アンプリコンの第１融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイルは、第１融解曲線により特徴づけられ、第２アンプリコンの第２（または参照）融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイルは、第２（または参照）融解曲線により特徴づけられる。
各アンプリコンの融解（例えば、ＨＲＭ）分析は、少なくとも１つのフルオロフォアおよび１つのクエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチドの、各アンプリコン（ＮＯＩ配列と同一の配列を有する）の１つの鎖、例えば第２鎖へのハイブリダイゼーションを含む。レポータオリゴヌクレオチドは、以下でさらに詳細に説明される。ハイブリダイゼーション後、フルオロフォアにより放出された信号は、当技術分野において他の方法で既知であるように、検出されて第１および第２融解曲線を得る。方法はさらに、さらなる分析の前に融解曲線を変換する工程を含んでよい。例えば、融解曲線は、負の一次導関数曲線に変換でき、それはその後、比較される。
第１融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイルおよび第２融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイルはその後、比較される。第１試料が変異体配列を含む場合、その結果、第１融解曲線（および任意で差分曲線、および融解曲線からの導関数）は、参照試料に対応する第２融解曲線（および任意でそれからの導関数）とは異なる。第１および第２融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイルの間の差異の検出はしたがって、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する。
融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイル間の差異は、融解曲線または差分曲線の形状、または融解曲線の導関数の形状における差異であり得る。例えば、いくらかの実施形態において、第１融解曲線は、参照融解曲線とは異なる形状を有する。典型的には、融解曲線の導関数は、最大値を有する正規曲線（またはベル型曲線）である。第１融解曲線の勾配は、第２曲線の勾配よりも「鋭さ」が小さい可能性があり、これは、第２融解曲線と比較して第１融解曲線の形状における変化を生じる。第１融解曲線の導関数の勾配は、第２曲線の導関数の勾配よりも「より鋭い」場合があり、例えば、勾配の絶対値は、少なくともその変曲点（複数可）において、第２融解曲線についての導関数の勾配の絶対値より、第１融解曲線の導関数についてより大きい。融解（例えば、ＨＲＭ）プロファイル間の差異を決定するため、分析は、差分曲線を得る工程を含んでよく、そこで、融解曲線の１つが、参照として設定され、他の融解曲線から差し引かれ、好ましくは参照試料の融解曲線が、参照として設定され、変異体試料の融解曲線から差し引かれる。
２つの曲線（または差分曲線または導関数）は、各温度Ｔで、距離ＤＴにより互いに離れていてよい。距離ＤＴは、温度ごとに決定され、最大距離ｍａｘＤＴの絶対値は、それが所定の閾値よりも大きい場合２つの曲線間の差異を示唆する。
当業者は、閾値の適切な値を決定する方法を知っている。閾値は、マイクロサテライト不安定性を示す対象および正常な対象を区別することを可能にする、ＤＴ値である。ＤＴ値は、参照（または野生型）について得られた融解プロファイルおよび変異体配列（複数可）について得られた融解プロファイルの間の差異、例えば、負の差異または正の差異である。適切な閾値を決定するために、マイクロサテライト不安定性を有しているかいないかが既知である、多くの対象（典型的には１００～５００人の患者）の融解プロファイルが確立される。これらの融解プロファイルを使用して、閾値は、野生型および変異体配列の間の所望の、または適切な区別を可能にする値として確立される。
したがって、分析された融解プロファイル間の差異が算出され、閾値と比較される；この差異はしたがって、数値的差異であり得、それは数値的閾値と比較できる。分析された融解プロファイル、例えばＨＲＭプロファイルの間のこの差異が、閾値よりも大きい場合、そこから第１融解プロファイルが決定される試料は、変異体配列を含むものとして分類される。標的核酸配列がマイクロサテライトである場合、そこから試料が得られた対象はしたがって、マイクロサテライト不安定性を有するものとみなされる。分析された融解プロファイル、例えばＨＲＭプロファイルの間の差異が、閾値よりも低い場合、試料は、野生型配列を含むものとして分類される。標的核酸配列がマイクロサテライトである場合、そこから試料が得られた対象はしたがって、マイクロサテライト不安定性を有しないものとみなされる。
１つの選択肢は、曲線間の面積を決定することである。面積が、所定の閾値よりも大きい場合、第１および第２融解曲線は、異なっているとみなされる。ここでも、当業者は、閾値のための値を設定する方法を知っている。
２つの融解曲線またはそれらの差分曲線またはそれらの導関数の間の差異を特徴づける別の方法は、当業者には明らかである。
第１および第２融解曲線間またはそれらの差分曲線もしくは第１および第２融解曲線の導関数間の上記の差異のいずれかは、第１および第２ＨＲＭプロファイル間の差異を示唆し、したがって、第１試料中の変異体配列の存在を示唆する。
いくらかの実施形態において、第１および第２融解曲線および／またはそれらの導関数および／または差分曲線は、正規化される。例えば、最低温度から０．５～２０℃内などの、融解が測定される最低温度に近いかその温度で、曲線は、第１値に正規化され、最高温度から０．５～２０℃内などの、融解が測定される最高温度に近いかその温度で、曲線は、第２値に正規化される。例えば、第１値は、１であり、第２値は、０である。
曲線間の差異をより視覚化するために、融解分析、例えばＨＲＭ分析は、標準正規化の工程を含んでよく、それは、初期および最終正規化領域における平均色素強度に基づきｙ軸における曲線を整列させることに対応する。
バイリニア型正規化を各曲線（融解曲線、差分グラフまたは導関数）に適用することもできる。第１線形関数を、初期色素強度にフィットさせ、最終の補正スケールの上端として使用する。第２線形関数を、最終色素強度にフィットさせ、補正スケールの下端として使用する。
融解分析、例えば、ＨＲＭ分析はまた、もしくは代わりに、相対蛍光単位（ＲＦＵ）での温度調節（温度シフト）を曲線（融解曲線または差分曲線）に適用する工程も含んでよい。そのような工程はまた、偽陽性の危険性を低減できる。好ましい実施形態において、融解分析は、融解曲線に対する相対蛍光単位で少なくとも温度調節を適用する工程を含む。
したがって、いくらかの実施形態において、第１プロファイルを参照プロファイルと比較する工程は、以下の工程：
ｉ）温度軸に沿って所与の蛍光強度で第１および第２融解曲線を整列させ、それにより上記蛍光強度での第１および第２融解曲線の間の融解温度の差異を無効にする工程；
ｉｉ）第１および第２融解曲線の間のフルオロフォアにより放出された信号における差異を決定する工程；ならびに、
ｉｉｉ）ｉｉ）において決定された差異を閾値と比較する工程であって、閾値よりも大きい差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆し、閾値よりも小さい差異は、第１試料が参照配列を含むことを示唆する、工程
を含むかそれらからなる。
閾値は、本明細書において上で説明したように決定される。差異は、上で説明されたような数値的閾値と比較される、数値的差異である。したがって工程ｉｉｉ）において、閾値が正の閾値である場合、上記閾値よりも大きい差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する。閾値が負の閾値である場合、上記閾値よりも小さい差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する。
いくらかの実施形態において、本明細書において開示された方法は、変異体配列の正確な長さおよび／または配列を決定する工程を含まない。これは、変異体配列が発見された個体が本明細書に記載されるような疾患または障害を患っていることを決定するために、変異体配列の正確な長さおよび／または配列を決定する必要がないことが多いためである。むしろ、多くの場合、差異があることを立証すれば充分である－差異の正確な性質は、常に重要であるとは限らない。好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法は、変異体配列の正確な長さおよび／または配列を決定する工程を含まない。これは、変異体配列の検出が、さらなる分析のための試料を選択するのに充分であり得るためである；典型的には、変異体配列の正確な長さおよび／または配列を決定する必要がない。
レポータオリゴヌクレオチド
本方法は、ＨＲＭ分析を実行するためにレポータオリゴヌクレオチドを必要とする。レポータオリゴヌクレオチドは、少なくとも第１フルオロフォアおよび少なくとも第１クエンチャーを含む。これらは、ＨＲＭ分析などの融解分析に有益である。好ましくは、レポータオリゴヌクレオチドは、少なくともその５’末端でまたは少なくともその３’末端で、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に第１フルオロフォアを含む。レポータオリゴヌクレオチドは好ましくは、少なくともその５’末端でまたは少なくともその３’末端で、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に第１クエンチャーを含む。したがって、フルオロフォアおよびクエンチャーは、５’末端にまたは３’末端に、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に位置してよいが、必ずしもレポータオリゴヌクレオチドの最後のヌクレオチドに位置するわけではない。好ましくは、第１フルオロフォアが、５’末端でまたは５’末端から４ヌクレオチド内に位置するならば、第１クエンチャーは、５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に位置しない。代わりに、それは、３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内、またはレポータの内部領域内に位置する。逆に、第１フルオロフォアが３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に位置する場合、第１クエンチャーは、３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に位置しない。代わりに、それは、５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、またはレポータの内部領域内に位置する。ここで用語、内部領域は、各端において５末端ヌクレオチドを含まないレポータオリゴヌクレオチドの領域である。好ましくは、第１フルオロフォアおよび第１クエンチャーは、互いに近接していない。
有用なフルオロフォアおよびクエンチャーは、当業者が容易に利用でき、当業者は本方法を実行するためにそれらを選択する困難はないであろう。
レポータオリゴヌクレオチドは、融解分析（またはＨＲＭ分析）に使用される。そのため、レポータオリゴヌクレオチドの配列は、それがハイブリダイズし検出する配列に依存する、いくらかの制約を受ける。レポータオリゴヌクレオチドは、例えばＮＯＩと同一であり、かつＮＯＩと相補的な鎖にハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む。換言すると、レポータオリゴヌクレオチドは、ＮＯＩを含む、第１および第２アンプリコンの鎖にハイブリダイズする。ＮＯＩがリピートを含む実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドはしたがって、リピートも含む、すなわち、ハイブリダイゼーション配列Ｈは、以下でさらに詳述するように、リピートも含む。
レポータオリゴヌクレオチドは、ＮＯＩと同一である配列に加えて、ハイブリダイゼーション配列中に追加のヌクレオチドをさらに含んでよい。例えば、以下の例において示されるように、これは、標的核酸がマイクロサテライトである場合、または変異体配列が挿入を含むと予想される場合、特に重要であり得る。マイクロサテライトが参照配列中にｎ個のヌクレオチドの全長を有するＭ個のタンデムリピートを有する場合、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は好ましくは、Ｍ”個のタンデムリピートを有し、Ｍ”≧Ｍ＋１であり、好ましくはＭ”≧Ｍ＋１またはＭ”≧Ｍ＋２である。タンデムリピートがモノヌクレオチドリピートである場合、ハイブリダイゼーション配列は、ｎ”個のヌクレオチドの長さを有し、ｎ”≧ｎ＋１であり、好ましくはｎ”≧ｎ＋１またはｎ”≧ｎ＋２である。換言すると、ハイブリダイゼーション配列は、少なくとも１つまたは２つの追加のヌクレオチドを含んでよい。これは、より長い変異体配列および参照配列のより感度の高い区別を可能にする。
特にＮＯＩがマイクロサテライトであるいくらかの実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は好ましくは、ＮＯＩのリピートと同一であるか相補的であるリピートからなる配列を含み、ハイブリダイゼーション配列がリピートにハイブリダイズされる場合にリピートのすぐ上流またはすぐ下流で第１および第２アンプリコンにハイブリダイズする、本明細書においてはヘルパー配列と呼ばれる、末端配列も有利に含んでよい。換言すると、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は好ましくは、リピートを含み、反復配列のすぐ上流または下流でＮＯＩまたはその相補鎖にハイブリダイズする１～１０のヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドをさらに含む。ヘルパー配列はしたがって、第１および第２アンプリコンにハイブリダイズする場合、ハイブリダイゼーション配列が上記反復配列にハイブリダイズすることを可能にする。ヘルパー配列は多くの場合、その相補配列についてのハイブリダイゼーション配列よりも、その相補配列についてより高い親和性を有する。換言すると、ヘルパー配列は多くの場合、ハイブリダイゼーション配列がその相補配列にハイブリダイズするよりも速くその相補配列にハイブリダイズする。
ヘルパー配列は、３’末端または５’末端であり得る。好ましくは、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列がリピートにハイブリダイズする場合、リピートのすぐ上流またはすぐ下流で第１および第２アンプリコンにハイブリダイズする５’末端ヘルパー配列を含む。ヘルパー配列は、実施例１３に示すように、融解プロファイル間の区別を容易にする。ヘルパー配列は、ヘルパー配列が高い第１または第２アンプリコンにハイブリダイズするときに、ハイブリダイゼーション配列のＴｍにおける増加をもたらす場合、強力であると呼ばれる。当業者は、配列がより高い割合のＡ／Ｔを含む２つのハイブリダイズされた配列と比較してより高い割合のＧ／Ｃを含む場合、２つの配列間のハイブリダイゼーションが強力であることをよく知っている；したがって、Ａ／Ｔよりもより高い割合のＧ／Ｃを含むヘルパー配列は、Ａ／Ｔよりもより低い割合のＧ／Ｃを含むヘルパー配列より強力である。より長い配列はより短い配列より強力なハイブリダイゼーションを与えることも既知であり、したがって、ヘルパー配列の強度は、第１および／または第２アンプリコンにハイブリダイズする長さを増加させることにより調節できる。ヘルパー配列の強度を高めることは、変異体配列および参照配列の区別を容易にする良好な方法であり得る。好ましくは、ヘルパー配列は、ＮＯＩがリピートを含む実施形態においても、リピートを含まない。
特に、標的核酸配列がマイクロサテライトであるいくらかの実施形態において、ヘルパー配列は、ヘルパー配列がない同じハイブリダイゼーション配列のＴｍと比較して、ハイブリダイゼーション配列のＴｍを、少なくとも５℃、例えば少なくとも６℃、例えば少なくとも７℃、例えば少なくとも８℃、例えば少なくとも９℃、例えば少なくとも１０℃、例えば少なくとも１１℃、例えば少なくとも１２℃、例えば少なくとも１３℃、例えば少なくとも１４℃、例えば少なくとも１５℃、またはそれを超えて上昇させる。ヘルパー配列を含むハイブリダイゼーション配列のＴｍはしたがって、ヘルパー配列がないハイブリダイゼーション配列のＴｍよりも５～２５℃高く、例えば１０～２０℃高く、例えば１２．５～１７．５℃高い可能性がある。
レポータオリゴヌクレオチドは、第２クエンチャーを含んでよい。好ましくは、第２クエンチャーは、非末端領域にある、すなわち、レポータオリゴヌクレオチドの内部領域に位置する。換言すると、第２クエンチャーは、５’末端にまたは３’末端に、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に位置しない。いくらかの実施形態において、第２クエンチャーの含有は、変異体配列および参照配列の区別を容易にする。
融解分析、特にＨＲＭ分析を可能にできる任意のレポータオリゴヌクレオチド、すなわち、上述した特徴を有する任意のレポータオリゴヌクレオチドを使用できるが、いくらかのレポータオリゴヌクレオチドは、特に好都合である。レポータオリゴヌクレオチドの特定の位置での疎水性ヌクレオチドの含有は、特に興味深い。実施例からわかるように、そのような疎水性ヌクレオチドを含むレポータオリゴヌクレオチドは、方法の感度を高める。
したがって、いくらかの実施形態において、上述した特徴に加えて、レポータオリゴヌクレオチドは、その５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドを含む、および／または、レポータオリゴヌクレオチドは、３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドを含む。
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターと連結するリンカー部分である）
を有する。
骨格モノマー単位Ｘは、以下のセクション「骨格モノマー単位」における本明細書に記載の任意の骨格モノマー単位であり得る。
インターカレーターＱは、以下のセクション「インターカレーター」における本明細書に記載の任意のインターカレーターであり得る。
本開示の状況において有用である疎水性ヌクレオチドは、国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９号、特に、３０ページ２行～２５行のタイトル「疎水性ヌクレオチド」のセクションにおいて詳細に説明される。
いくらかの実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドは、以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｄ－Ｚ－（Ｎ）ｅ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、条項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体の総数は、少なくとも１０である；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｄおよびｅは、個々に１～１９の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅは、少なくとも１０である）
を有する；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｄ－（Ｎ）ｅ－（Ｎ）ｂは、参照配列と同一である。
他の実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドは、以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｆ－Ｚ－（Ｎ）ｇ－Ｚ－（Ｎ）ｈ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、請求項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｆ、ｇおよびｈは、個々に１～１８の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｆ＋ｇ＋ｈは、少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｆ－（Ｎ）ｇ－（Ｎ）ｈ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する；または
以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｉ－Ｚ－（Ｎ）ｊ－Ｚ－（Ｎ）ｋ－Ｚ－（Ｎ）ｌ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、請求項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、１～１７の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌは、個々に少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｉ－（Ｎ）ｊ－（Ｎ）ｋ－（Ｎ）ｌ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する；または
以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｍ－Ｚ－（Ｎ）ｎ－Ｚ－（Ｎ）ｏ－Ｚ－（Ｎ）ｐ－Ｚ－（Ｎ）ｑ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、請求項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｍ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、個々に１～１６の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑは、少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｍ－（Ｎ）ｎ－（Ｎ）ｏ－（Ｎ）ｐ－Ｚ－（Ｎ）ｑ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する。
いくらかの実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドは、マイクロサテライトの検出用である。そのような実施形態において、ハイブリダイゼーション配列は、少なくともタンデムリピートを含む。好ましくは、ハイブリダイゼーション配列はまた、タンデムリピートのすぐ上流または下流に１～２０のヌクレオチド、例えば、タンデムリピートのすぐ上流または下流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のヌクレオチドからなるヘルパー配列も含み、好ましくは本明細書に記載されるような少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、挿入されている。ヘルパー配列は、１など、例えば２、３など、例えば４、５など、例えば６、７など、例えば８、９など、例えば１０、１０～２０など、例えば２０～５０の、５０を超えるなどのヌクレオチドの少なくとも１つからなってよい。例えば、ヘルパー配列は、１５のまたはそれを超えるヌクレオチドからなる。したがって、いくらかの実施形態において、ヘルパー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０のまたはそれを超えるヌクレオチド、例えば２５、３０、３５、４０、４５または５０のまたはそれを超えるヌクレオチドからなる。例えば、ヘルパー配列は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のまたはそれを超えるヌクレオチドからなる。例えば、ヘルパー配列は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のまたはそれを超えるヌクレオチド、例えば９ヌクレオチドからなる。
いくらかの実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドは、上述したようにＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４またはＭＯＮＯ２７などの、マイクロサテライトの検出のために使用される。
インターカレーター
本方法の状況における用語、インターカレーターは、核酸のヌクレオ塩基と同時に積み重ねることができる、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系を含む任意の分子部分を指す。好ましくは、インターカレーターは本質的に、核酸のヌクレオ塩基と同時に積み重ねることができる、少なくとも１つの本質的に平坦な共役系からなる。
インターカレーターは、少なくとも１つのπ（ファイ）電子系を含み、それは本発明によれば、π電子系を含む他の分子と相互作用できる。これらの相互作用は、上記インターカレーターの疎水性相互作用に、正または負の方法で寄与できる。ＨｕｎｔｅｒおよびＳａｎｄｅｒｓ（１９９０）Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：５５２５－５５３４は、２つのπ電子系が互いに正に相互作用できる異なる方向および条件の範囲を提案している。
好ましくは、インターカレーターは、ポリアロメートおよびヘテロポリアロメートからなる群より選択される化学基を含み、さらにより好ましくは、インターカレーターは、本質的にポリアロメートまたはヘテロポリアロメートからなる。最も好ましくは、インターカレーターは、ポリアロメートおよびヘテロポリアロメートからなる群より選択される。
本発明によるポリアロメートまたはヘテロポリアロメートは、１など、例えば２、３など、例えば４、５など、例えば６、７など、例えば８、８を超えるなどの任意の適切な数の環からなってよい。さらに、ポリアロメートまたはヘテロポリアロメートは、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコキシル（carboalkoyl）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、カルボニルおよびアミドからなる群より選択される１つまたは複数で置換されてよい。
したがって、インターカレーターＱは、例えば、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン、ベンズアントラセン、スチルベン、オキサロ－ピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリン、ソラレンからなる群より選択されるインターカレーター、ならびにヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコキシル（carboalkoyl）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルおよび／またはアミドからなる群より選択される１つまたは複数で置換された前述したインターカレーターのいずれかであり得る。
好ましくは、インターカレーターは、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン、ベンズアントラセン、スチルベン、オキサロ－ピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリンおよびソラレンからなる群より選択される。
好ましい実施形態において、インターカレーターは、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、フェナントレン、クリセン、ナフタセン、ベンズアントラセン、スチルベンおよびポルフィリンからなる群より選択される。
別の好ましい実施形態において、インターカレーターは、ピレンまたはピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（１Ｈ）－オンまたは７，９－ジメチル－ピリド［３’，２’，４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（３Ｈ）－オンを含む。インターカレーターは、また、ピレンまたはピリド［３’，２’：４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（１Ｈ）オン、または７，９－ジメチル－ピリド［３’，２’，４，５］チエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－４（３Ｈ）－オンを含む。
疎水性ヌクレオチドは、他のインターカレーター、特に、ＷＯ２０１７／０４５６８９号、３０ページ２６行～４０ページ４行のタイトル「インターカレーター」のセクション、または国際特許出願ＷＯ０３／０５２１３２号、４６ページ１０行～５４ページ１３行のセクション「インターカレーター」に記載のインターカレーターを含んでよい。
骨格モノマー単位
Ｘはまた、核酸または核酸類縁体の骨格に組み込むことができる骨格モノマー単位であり得る。本明細書におけるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体の骨格モノマー単位は、核酸または核酸類縁体の骨格への組み込みに関与する、ヌクレオチドの部分を指す。骨格モノマー単位（Ｘ）は好ましくは、インターカレーターと共有結合されるリンカー（Ｙ）に共有結合する。任意の適切な骨格モノマー単位を、インターカレーターをオリゴヌクレオチド類縁体に組み込むために使用できる。上記骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結する任意の種類のリンカーも、使用できる。加えて、骨格モノマー単位は、１つまたは複数の脱離基、保護基および／または反応性基を含んでよく、それらは、上記骨格モノマー単位を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類縁体の合成中または合成に続いて、任意の方法で除去または変更できる。
骨格モノマー単位は、任意の適切な骨格モノマー単位であり得る。一実施形態において、骨格モノマー単位は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＸＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’－ＮＨ）－ＴＮＡ、（３’－ＮＨ）－ＴＮＡ、a－Ｌ－リボ－ＬＮＡ、a－Ｌ－キシロ－ＬＮＡ、b－Ｄ－キシロ－ＬＮＡ、a－Ｄ－リボ－ＬＮＡ、［３．２．１］－ＬＮＡ、ビシクロ－ＤＮＡ、６－アミノ－ビシクロ－ＤＮＡ、５－エピ－ビシクロ－ＤＮＡ、α－ビシクロ－ＤＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］－ＤＮＡ，ビシクロ［３．２．１］－ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド－ＤＮＡ、b－Ｄ－リボピラノシル－ＮＡ、a－Ｌ－リキソピラノシル－ＮＡ、２’－Ｒ－ＲＮＡ、α－Ｌ－ＲＮＡまたはα－Ｄ－ＲＮＡ、β－Ｄ－ＲＮＡおよびそれらの混合物およびそれらのハイブリッドの骨格モノマー単位、ならびに限定されないがホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、ホスホロアミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエートなどのそれらのリン原子修飾からなる群より選択できる。加えて非リン含有化合物は、限定されないが、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートなどのヌクレオチドおよびアミドを含む連結基への連結のために使用できる。
一連の骨格モノマー単位は、国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９号、４０ページ５行～５６ページ３行のタイトル「骨格モノマー単位」のセクション、および国際特許出願ＷＯ０３／０５２１３２号、２４ページ２７行～４３ページ１４行のセクション「骨格モノマー単位」において説明される。これらはまた、本発明で有用なヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体の様々な異なる骨格モノマー単位、およびそれらが骨格モノマー単位の１つまたは２つの位置で付着されるリンカーを介してヌクレオ塩基に接続される方法を説明する。
リンカー
インターカレーターヌクレオチドのリンカーは、インターカレーターおよび上記疎水性ヌクレオチドの骨格モノマーを接続する、好ましくは、上記インターカレーターおよび骨格モノマー単位を共有結合する部分である。リンカーは、原子間に１つまたは複数の原子（複数可）または結合（複数可）を含んでよい。
本明細書の上で与えられた骨格およびインターカレーターの定義により、リンカーは、骨格およびインターカレーターを連結する最短経路である。インターカレーターが直接骨格に連結される場合、リンカーは、結合である。
リンカー、通常、原子の鎖または原子の分岐鎖からなる。鎖は、飽和であっても不飽和であってもよい。リンカーはまた、共役結合があるか、またはない環構造であり得る。
有用なリンカーは、国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９号、特に、５６ページ５行～５９ページ１０行のタイトル「リンカー」のセクションおよびＷＯ０３／０５２１３２号、５４ページ１５行～５８ページ７行のセクション「リンカー」において詳細に説明される。
キットオブパーツ
本明細書において、２つの鎖からなり、好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するためのキットオブパーツも提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記キットオブパーツは：
ａ）好ましくは、その５’末端にまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチド
（レポータヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチド、好ましくは１５～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、ならびに
レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、ならびに、
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的である；
ならびにレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端での少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、上記ヘルパー配列は、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズする場合、第１および第２アンプリコンにハイブリダイズできる）；ならびに
ｂ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットであって、一緒に標的核酸配列を増幅できる、プライマのセット
を含む。
本明細書において：
ａ）以下のセクション「レポータオリゴヌクレオチド」において、本明細書に記載の任意のレポータオリゴヌクレオチドであり得る、レポータオリゴヌクレオチド
ｂ）上記セクション「増幅」における本明細書に記載の任意のプライマのセットであり得る、第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセット
を含むキットオブパーツも提供される。
キットオブパーツは、特に、本方法を実行するために有用である。
したがって、２つの鎖からなり、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するためのキットオブパーツも本明細書において提供され、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記キットオブパーツは：
ａ）好ましくは、その５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチド
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む）、
（少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、参照配列を含む標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である）；ならびに
ｂ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットであって、一緒に標的核酸を増幅できる、プライマのセット
を含む。
上記レポータオリゴヌクレオチドおよび上記プライマのセットに加えて、キットオブパーツはまた、追加の成分も含んでよい。例えば、キットオブパーツは、ＰＣＲ試薬をさらに含んでよい。キットオブパーツはまた、ＰＣＲ産物の生成のリアルタイム検出を可能にするプローブなどの、検出プローブを含んでよい。
上記キットは、特に本明細書に記載の方法を実行するために、特に、好ましくはリピート、例えばマイクロサテライトを含む標的核酸配列の変異体配列を検出するために有用である。特にマイクロサテライトにおいて、本明細書において上記で詳述したように、野生型または参照配列は、１５ヌクレオチド以上である。
レポータオリゴヌクレオチド
本明細書において上記で詳述するように、本方法は、融解分析を実行するため、例えばＨＲＭ分析を実行するためにレポータオリゴヌクレオチドを必要とする。理論に縛られることなく、発明者らは、それらがアッセイの感度を高める可能性があるので、疎水性ヌクレオチドを含むレポータオリゴヌクレオチドが、本方法を実行するために特に有用であることを見出した。そのようなレポータオリゴヌクレオチドもしたがって、本明細書において開示される。
本明細書において、２つの鎖からなり、好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズできるレポータオリゴヌクレオチドも提供され、上記レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端にまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含み、レポータオリゴヌクレオチドは、２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲、好ましくは１５～５０個の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含み、
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的であり、
レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端での少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、上記ヘルパー配列は、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列がアンプリコンにハイブリダイズする場合、第１および第２アンプリコンの第２鎖にハイブリダイズできる。
本明細書において、好ましくはその５’末端にまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチドも提供され、レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含み、
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である。
レポータオリゴヌクレオチドは、第２クエンチャーを含んでよい。好ましくは、第２クエンチャーは、非末端領域にある、すなわち、レポータオリゴヌクレオチドの内部領域に位置する。換言すると、第２クエンチャーは、５’末端にまたは３’末端に、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に位置しない。
骨格モノマー単位Ｘは、上記セクション「骨格モノマー単位」において本明細書に記載の任意の骨格モノマー単位であり得る。
インターカレーターＱは、上記セクション「インターカレーター」において本明細書に記載の任意のインターカレーターであり得る。
本開示の状況において有用である疎水性ヌクレオチドは、国際特許出願ＷＯ２０１７／０４５６８９号、特に、３０ページ２行～２５行のタイトル「疎水性ヌクレオチド」のセクションにおいて詳細に説明される。
いくらかの実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドは、以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｄ－Ｚ－（Ｎ）ｅ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、条項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体の総数は、少なくとも１０である；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｄおよびｅは、個々に１～１９の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅは、少なくとも１０である）
を有する；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｄ－（Ｎ）ｅ－（Ｎ）ｂは、参照配列と同一である。
別の実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドは、以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｆ－Ｚ－（Ｎ）ｇ－Ｚ－（Ｎ）ｈ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、請求項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｆ、ｇおよびｈは、個々に１～１８の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｆ＋ｇ＋ｈは、少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｆ－（Ｎ）ｇ－（Ｎ）ｈ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する；または
以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｉ－Ｚ－（Ｎ）ｊ－Ｚ－（Ｎ）ｋ－Ｚ－（Ｎ）ｌ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、請求項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、１～１７の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌは、個々に少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｉ－（Ｎ）ｊ－（Ｎ）ｋ－（Ｎ）ｌ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する；または
以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｍ－Ｚ－（Ｎ）ｎ－Ｚ－（Ｎ）ｏ－Ｚ－（Ｎ）ｐ－Ｚ－（Ｎ）ｑ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、請求項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｍ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、個々に１～１６の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑは、少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｍ－（Ｎ）ｎ－（Ｎ）ｏ－（Ｎ）ｐ－Ｚ－（Ｎ）ｑ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する。
レポータオリゴヌクレオチドは、オーバーハングを含んでよい、すなわち、それは、標的核酸配列にハイブリダイズしないその末端の１つにヌクレオチドを含んでよい。オーバーハングは、３’末端または５’末端であり得る。好ましくは、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列がハイブリダイズできる第１および第２アンプリコンの鎖に対し５’オーバーハングを形成する５’末端配列を含む。
レポータオリゴヌクレオチドは、少なくとも第１フルオロフォアおよび少なくとも第１クエンチャーを含む。これらは、融解分析および／またはＨＲＭ分析に有益である。好ましくは、レポータオリゴヌクレオチドは、少なくともその５’末端にまたは少なくともその３’末端に、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に第１フルオロフォアを含む。レポータオリゴヌクレオチドは好ましくは、少なくともその５’末端にまたは少なくともその３’末端に、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に第１クエンチャーを含む。したがって、フルオロフォアおよびクエンチャーは、５’末端または３’末端または５’末端に、もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に位置してよいが、必ずしもレポータオリゴヌクレオチドの最後のヌクレオチドに位置するわけではない。好ましくは、第１フルオロフォアが５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に位置するならば、第１クエンチャーは、５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に位置しない。代わりに、それは、３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、またはレポータの内部領域内に位置する。逆に、第１フルオロフォアが３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に位置する場合、第１クエンチャーは、３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に位置しない。代わりに、それは、５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、またはレポータの内部領域内に位置する。用語、内部領域は本明細書において、各端において５末端ヌクレオチドを含まないレポータオリゴヌクレオチドの領域である。好ましくは、第１フルオロフォアおよび第１クエンチャーは、互いに近接していない。
有用なフルオロフォアおよびクエンチャーは、当業者が容易に利用でき、当業者は本方法を実行するためにそれらを選択する困難はないであろう。
レポータオリゴヌクレオチドは、融解分析、例えばＨＲＭ分析を実行するために使用される。そのため、レポータオリゴヌクレオチドの配列は、それがハイブリダイズし検出される配列に依存する、いくらかの制約を受ける。レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含み、それは例えばＮＯＩと同一であり、かつＮＯＩと相補的な鎖にハイブリダイズする。ＮＯＩがリピートを含む実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドはしたがって、リピートも含む、すなわちハイブリダイゼーション配列Ｈはまた、以下でさらに詳述するように、リピートを含む。
レポータオリゴヌクレオチドは、ＮＯＩと同一である配列に加えて、ハイブリダイゼーション配列中に追加のヌクレオチドをさらに含む。例えば、以下の実施例において示されるように、これは、標的核酸がマイクロサテライトである場合、特に重要である可能性がある。マイクロサテライトが参照配列中にｎ個のヌクレオチドの全長を有するＭ個のタンデムリピートを有する場合、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は好ましくは、Ｍ”個のタンデムリピートを有し、Ｍ”≧Ｍ＋１であり、好ましくはＭ”≧Ｍ＋１またはＭ”≧Ｍ＋２である。したがって、タンデムリピートがモノヌクレオチドリピートである場合、ハイブリダイゼーション配列は、ｎ”個のヌクレオチドの長さを有し、ｎ”≧ｎ＋１であり、好ましくはｎ”≧ｎ＋１またはｎ”≧ｎ＋２である。換言すると、ハイブリダイゼーション配列は、少なくとも１つまたは２つの追加のヌクレオチドを含んでよい。これは、特に変異体配列が挿入を含む場合、変異体配列および参照配列のより感度の高い区別を可能にする。
ＮＯＩがマイクロサテライトであるいくらかの実施形態において特に、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は好ましくは、ＮＯＩのリピートと同一であるか、相補的であるリピートからなる配列を含み、ハイブリダイゼーション配列がリピートにハイブリダイズされる場合にリピートのすぐ上流またはすぐ下流で第１および第２アンプリコンの鎖にハイブリダイズする、本明細書においてはヘルパー配列（複数可）と呼ばれる、１つまたは２つの末端配列などの末端配列も有利に含んでよい。換言すると、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は好ましくは、リピートを含み、反復配列のすぐ上流または下流でＮＯＩまたはその相補鎖にハイブリダイズする、１～２０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドをさらに含む。
ヘルパー配列は、３’末端または５’末端であり得る。好ましくは、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列がリピートにハイブリダイズされる場合にリピートのすぐ上流またはすぐ下流で第１および第２アンプリコンの鎖にハイブリダイズする、５’末端ヘルパー配列を含む。ヘルパー配列は、実施例１３に示すように、融解プロファイル間の区別を容易にする。ヘルパー配列は、それが第１または第２アンプリコンにハイブリダイズするときに高いＴｍを有する場合、強力であると呼ばれる。当業者は、配列がより高い割合のＡ／Ｔを含む２つのハイブリダイズされた配列と比較して、より高い割合のＧ／Ｃを含む場合、２つの配列間のハイブリダイゼーションが強力であることをよく知っている；したがって、Ａ／Ｔよりもより高い割合のＧ／Ｃを含むヘルパー配列は、Ａ／Ｔよりもより低い割合のＧ／Ｃを含むヘルパー配列よりも強力である。より長い配列は、より短い配列よりも強力なハイブリダイゼーションを与えることも既知であり、したがって、ヘルパー配列の強度は、第１および／または第２アンプリコンにハイブリダイズする長さを増加させることにより調節できる。
いくらかの実施形態において、レポータオリゴヌクレオチドは、マイクロサテライト不安定性を示唆する変異体配列を検出するために有用であり、すなわち参照配列は、マイクロサテライト配列を含む。参照配列がｎ個のヌクレオチドの全長を有するＭ個のタンデムリピートのマイクロサテライト配列を含む場合、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列Ｈの長さは、ｎ”であり、ｎ”≧ｎ＋１であり、好ましくはｎ”≧ｎ＋１またはｎ”≧ｎ＋２である。
上記レポータオリゴヌクレオチドは、第２クエンチャーを含んでよい。好ましくは、第２クエンチャーは、非末端領域にある、すなわち、レポータオリゴヌクレオチドの内部領域に位置する。換言すると、第２クエンチャーは、５’末端にまたは３’末端に、または５’末端もしくは３’末端から４ヌクレオチド内に位置しない。
有用なフルオロフォアおよびクエンチャーは、当技術分野において既知であり、当業者が容易に利用でき、当業者は適切なフルオロフォアおよびクエンチャーを選択する困難はないであろう。
本明細書において、変異体核酸を検出するための方法における疎水性ヌクレオチドを含むそのようなレポータオリゴヌクレオチドの使用、特に本明細書に記載の方法におけるそれらの使用も提供される。レポータオリゴヌクレオチドはまた、特に以下で本明細書において説明されるように、臨床状態の治療の有効性を予測するための方法において、および臨床状態の存在を予測するための方法において使用できる。
臨床状態の治療の有効性の予測
本開示はまた、所定の薬剤を用いる、それを必要とする個体における臨床状態の治療の有効性を予測するための方法にも関し、上記薬剤を用いる上記臨床状態の治療の有効性は、変異体配列の存在に関連する。
したがって、いくらかの変異は、特定の薬剤が個体の治療に有効であるか、そうでないかを示唆してよい。特に、特定の変異は、所定の薬剤治療に対する特定の応答を示唆してよい。例えば、変異は、個体が上記薬剤治療に正に応答するかどうか、個体の疾患が所与の薬剤に耐性があるかどうか、または個体が特定の薬剤治療に耐えることができないかどうかを示唆してよい。
個体における臨床状態の治療の有効性を予測するための方法は、以下の工程
ａ．上記個体からの試料を準備する工程
ｂ．試料が変異体配列を含むかどうかを決定するために、本明細書に記載されるような変異体配列の存在を検出するための方法を実行する工程
を含んでよく、
上記変異体配列の存在は、上記薬剤が、上記個体における上記臨床状態の治療において有効であるかどうかを示唆する。
臨床状態は、例えば癌、または本明細書に記載の任意の臨床状態、疾患または障害であり得る。多くの変異が同定されており、それらは、所与の制癌剤または薬剤の組み合わせが、特定の癌の治療において有効であるかどうかを示唆する。
いくらかの実施形態において、変異体配列は、上で本明細書において詳述したように、マイクロサテライトの変異体である。
臨床状態の存在の予測
本方法はまた、個体における特定の変異に関連する任意の臨床状態の存在を予測する、またはさらには診断するためにも有用である。
そのような方法は、以下の工程
ａ）上記個体からの試料を準備する工程
ｂ）本明細書に記載されるように変異体配列を検出するための方法を実行することにより、試料中の臨床状態に関連する変異の存在を検出する工程
を含んでよく；
上記変異体配列の存在は、上記臨床状態を患う上記個体を示唆する。
多数の臨床状態は、特定の変異に関連していることが既知であり、そのような変異を検出するためのレポータオリゴヌクレオチドおよびプライマのセットを設計できる。本方法は、マイクロサテライトの変異体配列を検出するために使用される場合、マイクロサテライト不安定性に関連する状態を検出するために特に有用であり、好ましくは対応する野生型または参照配列は、上で詳述したように、少なくとも１５ヌクレオチド長である。
一実施形態において、臨床状態は、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌などの、癌である。別の実施形態において、臨床状態は、リンチ症候群である。
方法は、上記臨床状態を治療する工程をさらに含んでよい。臨床状態の存在を示唆する変異体配列が見出される場合、個体は、上記臨床状態を患うものとして分類され、方法は、治療剤を有効量で上記個体に投与する工程をさらに含んでよい。
実施例
実施例１：マイクロサテライト不安定性は必ずしも、融解温度における変化をもたらすわけではない。
モノヌクレオチドリピートを含む領域の上流および下流でハイブリダイズするプライマを用いる非対称ＰＣＲを使用するＢＡＴ２５アッセイ。アッセイは、ＢＡＴ２５マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。この実施例において使用されるレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャー、ならびに内部クエンチャーを保持した。レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号１の１４２位～１７１位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング、およびその５’末端でヘルパー配列を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。ＣＲＣからの正常組織ＤＮＡおよび腫瘍組織ＤＮＡまたはマイクロサテライト不安定性患者からの子宮内膜試料１～２ｎｇ／μＬを、試験した。初期正規化間隔は、３９～４０℃であり、最終の正規化間隔は、６３～６４℃であった。２つの融解曲線を得（図２Ａ）、それらを、負の一次導関数曲線に変換した（図２Ｂ）。２つの曲線は、バイリニア型正規化を適用し、０．０５ＲＦＵ閾値を超える０．１ＲＦＵの温度シフト強度閾値を適用することにより温度を調節した場合、同一ではなかった（２つの曲線の振幅間の最大差異は、約０．０７ＲＦＵ（絶対値）であり、図示していない）。０．０７の差異は、この特定のアッセイについて設定された０．０５ＲＦＵ閾値よりも高く、したがって試料は、ＢＡＴ２５について不安定であると分類される。負の一次導関数曲線を、図２Ｂに示す。確認できるように、正常組織は、５７．３１℃のＴｍを有し、腫瘍組織は、５７．４１℃のＴｍを有した。そのような小さい差異は通常、重要ではなく、試料中の異なる塩濃度、または機器のばらつきが原因である可能性があった。
この実施例から、融解温度は必ずしも、正常試料から変異した腫瘍試料で大幅に変化するわけではないが、融解曲線の形状は変化し、それはバイリニア型正規化および温度シフトを適用する場合にさらに容易に視覚化されると結論づけることができる。正常試料および腫瘍試料はしたがって、Ｔｍにおける非常に小さい差異であっても、ＨＲＭ曲線間の形状の差異を使用して、区別できる。
例２：バイリニア型正規化
モノヌクレオチドリピートを含む領域の上流および下流でハイブリダイズするプライマを用いる非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２２アッセイ。アッセイは、ＮＲ２２マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。この実施例において使用されるレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャー、ならびに内部ＢＨＱ－１クエンチャーを保持した。レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号４の１４３位～１７２位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング（２ヌクレオチド）、およびその５’末端でヘルパー配列（９ヌクレオチド；１４．２℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。マイクロサテライト不安定性患者からのＦＦＰＥ精製正常および腫瘍組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。２つの融解曲線を得た（図３）。図３Ａは、バイリニア型正規化または温度シフトを適用しない融解曲線を示す。図３Ｂは、バイリニア型正規化を適用した後（温度シフトはなし）の融解曲線を示す。
図４は、温度の関数として、参照（任意の所与の温度で０に設定された蛍光；試料は、患者の健康な細胞からのものである）および腫瘍試料の間の蛍光における差異ＤＴを示す。これはまた、差分プロット、差分曲線または差分グラフとも呼ばれる。最大差異ｍａｘＤＴは、差分曲線の最大振幅の絶対値として測定される。標準正規化を適用した後（図４Ａ）またはバイリニア型正規化を適用した後（温度シフトなし）（図４Ｂ）のデータを示す。
この実施例は、バイリニア型正規化が、異なる試料の融解の前後に確認される蛍光における異なる減少を補償でき、正常（健康な）試料および腫瘍試料についてのＨＲＭプロファイルを区別するのに役立つことを示す。
例３：バイリニア型正規化および温度シフトは、融解曲線間の差異を低減できる。
非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２４アッセイ。アッセイは、ＮＲ２４マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。この実施例において使用されるレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャー、ならびに内部クエンチャーを保持した。レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号５の１５８位～１８７位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング、およびその５’末端でヘルパー配列（１４．８℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。同じマイクロサテライト安定性患者からの正常組織ＤＮＡおよび腫瘍組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。初期間隔４４～４５℃（値１と設定される）および最終間隔６６～６７℃（値０と設定される）で標準正規化を適用した。結果を図５に示す。
バイリニア型正規化および温度シフト強度閾値が適用されなかった場合、曲線間の差異は、約０．０４ＲＦＵであった（図５Ａ）。バイリニア型正規化が適用されるが温度シフト強度閾値が適用されなかった場合、曲線間の差異は、約０．０２ＲＦＵであった（図５Ｂ）。バイリニア型正規化および０．１ＲＦＵの温度シフト強度閾値が適用された場合、曲線間の差異は、約０．０１ＲＦＵであった（図５Ｃ）。
この実施例から、バイリニア型正規化および温度シフトは、マイクロサテライト安定性患者からの健康および正常試料の融解曲線間の差異を低減できると結論づけることができる。これは、偽陽性の危険性を低減する。
例４：温度シフト強度閾値は、ＤＮＡ緩衝液中の異なる塩濃度により引き起こされる融解温度における変化を中和できる。
非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２４アッセイ。アッセイは、ＮＲ２４マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。この実施例において使用されるレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャー、ならびに内部ＢＨＱ－１クエンチャーを保持していた。レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号５の１５８位～１８７位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング（２ヌクレオチド）、およびその５’末端でヘルパー配列（１４．８℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。正常組織ＤＮＡを水およびＴＥ緩衝液でそれぞれ４０ｎｇ／μＬ～２ｎｇ／μＬに希釈した。初期正規化を、領域４４～４５℃で行い、最終正規化を、領域６６～６７℃で行った。結果を図６に示す。
バイリニア型正規化が適用されるが温度シフトが適用されなかった場合、曲線間の最大差異ｍａｘＤＴは、約０．０７ＲＦＵであった（図６Ａ）。バイリニア型正規化および０．１ＲＦＵの強度閾値を用いる温度シフトが適用された場合、ｍａｘＤＴは、約０．０１ＲＦＵであった（図６Ｂ）。
この実施例から、温度シフトの適用は、差異がＤＮＡ緩衝液中の異なる塩濃度により引き起こされる場合、２つの試料間の差異を低減できると結論づけることができる。したがって、バイリニア型正規化および温度シフトの適用後に、１つの試料のアリコートは、アリコートが異なる緩衝液で得られた場合であっても、同一のＨＲＭプロファイルを生じることができる。これは、アッセイが、比較される試料間の塩および緩衝液濃度の変動に対しそれほど脆弱性でないので、偽陽性の呼び出しの危険性を大幅に低減する。
例５：温度シフトは、１つの普遍的な参照試料を使用する可能性を生む。
モノヌクレオチドリピートを含む領域の上流および下流でハイブリダイズするプライマを用いる非対称ＰＣＲを使用するＭＯＮＯ２７アッセイ。アッセイは、ＭＯＮ２７マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。この実施例において使用されるレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャー、ならびに内部ＢＨＱ－１クエンチャーを保持していた。レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号６の３００位～３３３位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング、およびその５’末端でヘルパー配列（１０．８℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。１６人の異なる患者からのＦＦＰＥ精製正常組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。初期正規化間隔は、４４～４５℃であり、最終正規化間隔は、６６～６７℃であった。
図７Ａは、バイリニア型正規化が適用されたが温度シフトが適用されなかった、ＨＲＭ曲線を示す。曲線間の最大差異ｍａｘＤＴは、約０．２５ＲＦＵであった。図７Ｂは、バイリニア型正規化および０．１ＲＦＵの強度閾値を用いる温度シフトが適用された、ＨＲＭ曲線を示し、ｍａｘＤＴは、約０．０６ＲＦＵに低下した。
図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ図７Ａおよび図７ＢのＨＲＭ曲線の差分プロットを示す。
この実験から、温度シフトの適用は、異なる患者からの健康な試料間の差異を低減すると結論づけることができる。これは、各患者の対になった正常試料および腫瘍試料の代わりに、１つの普遍的な参照試料を使用する可能性を生む。
例６：非対称ＰＣＲは、より多くの一本鎖アンプリコンを作成する。
モノヌクレオチドリピートを含む領域の上流および下流でハイブリダイズするプライマを用いる非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２２アッセイ。アッセイは、ＮＲ２２マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。この実施例において使用されるレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャー、ならびに内部ＢＨＱ－１クエンチャーを保持していた。レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号４の１４２位～１７２位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング、およびその５’末端でヘルパー配列（１４．２℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。
血液精製正常組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。図では、リアルタイムＰＣＲ曲線が確認される。対称ＰＣＲ曲線は、４５サイクル後にＲＦＵにおける増加が止まり、非対称ＰＣＲについては、増幅は、線形増幅を有する指数増殖期後に継続する。
この実験から、非対称ＰＣＲは、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列が結合できる配列を含むより多くの単一ＤＮＡ鎖を作成することを確認できる。
実施例７：非対称ＰＣＲは、より高い信号対ノイズ比およびより鋭い融解曲線を作成する。
アッセイを、例６において説明したように行った。正規化されたＨＲＭ曲線を得、図１０に示す。
この実験から、非対称ＰＣＲは、より高い信号対ノイズ比を作成し、「より鋭い」融解プロファイル作成すると結論づけることができる。
例８：非対称ＰＣＲは、ＭＳＳおよびＭＳＩ患者を区別することをより容易にする。
ＮＲ２２アッセイを、例６において説明したように実行した。マイクロサテライト不安定性患者からのＦＦＰＥ精製正常および腫瘍組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。
図１１は、非対称ＰＣＲを用いる（図１１Ａ）または対称ＰＣＲを用いる（図１１Ｂ）標準正規化を適用した後に得られたＨＲＭ曲線を示す。対応する差分曲線を、それぞれ図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。
この実験から、非対称ＰＣＲを用いる増幅は、対称ＰＣＲと比較して、マイクロサテライト不安定性患者について、正常および腫瘍組織曲線の間のより大きな差異を作成すると結論づけることができる。したがって、非対称ＰＣＲは、ＭＳＳおよびＭＳＩ患者を区別することをより容易にする。
実施例９：レポータオリゴヌクレオチド中のシングルエンドオーバーハングは、融解温度を上げることができる。
モノヌクレオチドリピートを含む領域の上流および下流でハイブリダイズするプライマを用いる非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２２アッセイ。アッセイは、ＮＲ２２マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。
２つの異なるレポータオリゴヌクレオチドを、この実験に使用した。この実施例において使用される第１レポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャーを保持した。第１レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号４の１４８位～１７７位にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション配列は、また、５’末端で４ヌクレオチド長のヘルパー配列（７．５℃のＴｍにおける上昇をもたらす）および３’末端で５ヌクレオチド長のヘルパー配列（３．６℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を含み、それらは、リピートのすぐ上流および下流でＮＲ２２の領域に相補的である。第２レポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャーならびに内部クエンチャーを保持した。第２レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号４の１４３位～１７２位にハイブリダイズし、その３’末端にオーバーハングおよびその５’末端に９ヌクレオチド長のヘルパー配列のみ（１４．２℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、両方のレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。血液精製正常組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。
第１レポータオリゴヌクレオチドを使用するアッセイについての結果を、図１３において破線として示す；第２レポータオリゴヌクレオチドを使用する結果を、実線として示す。融解曲線を図１３Ａに示し、導関数曲線を図１３Ｂに示す。バイリニア型正規化および温度シフトは、適用しなかった。
第２レポータオリゴヌクレオチドについての融解温度が、第１レポータオリゴヌクレオチドについてのものよりも高いことが確認される。第２レポータオリゴヌクレオチドについてのより低いバックグラウンド蛍光は、追加の内部クエンチャーの存在が原因である可能性がある。
この実験から、両端での２つのより小さいヘルパー配列の代わりに一方の端で１つのより長いヘルパー配列を有することは、プローブの融解温度を上昇させることができ、モノヌクレオチド反復マイクロサテライトを調査する場合に有利であり得ることがわかる。
実施例１０：レポータオリゴヌクレオチドを二重クエンチすることは、信号対ノイズ比を増加させる。
モノヌクレオチドリピートを含む領域の上流および下流でハイブリダイズするプライマを用いる非対称ＰＣＲを使用するＢＡＴ２６アッセイ。アッセイは、ＢＡＴ２６マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。血液精製正常組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。Ａ：標準正規化が適用されたＨＲＭ曲線。この実験において、いずれも５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャーを保持する、２つのレポータオリゴヌクレオチドを使用した。一重クエンチされただけのレポータオリゴヌクレオチドの例として、ＤＱプローブではなく、ＢＡＴ２６レポータオリゴヌクレオチドＦＡＭ５’－ＣＺＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＺＣ－３’ＢＨＱ－１（配列番号７）を使用した。ＢＡＴ２６レポータオリゴヌクレオチドＦＡＭ５’－ＣＺＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＺＣ－３’ＢＨＱ－１（配列番号８）を、二重クエンチされたＤＱ、レポータオリゴヌクレオチドを説明するために使用した；Ｘは、内部クエンチャーを示唆する。
レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号２の２２０位～２５１位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハングならびにその５’末端（５．２℃のＴｍにおける上昇をもたらす）およびその３’末端（１．９℃のＴｍにおける上昇をもたらす）の両方でヘルパー配列を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流および下流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドおよび３’末端から１０ヌクレオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。
ＨＲＭ曲線および負の一次導関数曲線を、それぞれ図１４ＡおよびＢに示す。一重クエンチされたレポータオリゴヌクレオチド（ＤＱプローブではない）のバックグラウンド蛍光が、二重クエンチされたレポータオリゴヌクレオチド（ＤＱプローブ）と比較して高いことが確認される。この実験から、ＤＱレポータオリゴヌクレオチドが、蛍光ノイズを低減し、一重クエンチされたレポータオリゴヌクレオチドと比較して融解をより鋭くすると結論づけられる。二重クエンチされたレポータオリゴヌクレオチドの使用はしたがって、正常な試料および腫瘍試料の区別を容易にできる。
例１１：レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列中の追加のヌクレオチドリピートは、より長いマイクロサテライトを検出することを可能にする。
ＮＲ２１アッセイを、非対称ＰＣＲを使用して実行した。アッセイは、ＮＲ２１マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。この実施例において使用されるレポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャー、ならびに内部クエンチャーを保持していた。レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号２の１８９位～２１４位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング、およびその５’末端でヘルパー配列（１５．２℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの下流でハイブリダイズする。加えて、レポータオリゴヌクレオチドは、５’末端から５ヌクレオチド内に２つの疎水性ヌクレオチド、および３’末端から５ヌクレオチド内に１つの疎水性ヌクレオチドを含む。レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、２２Ｔのヌクレオチドリピートを含む；ＮＲ２１マイクロサテライトは、ほとんどの正常細胞において２１のリピートからなる。レポータオリゴヌクレオチドはしたがって、参照配列と比較して１つの追加のＴを有する。
レポータオリゴヌクレオチドを、２１、２２または２３のアデニンリピートの人工標的に対して試験した。
バイリニア型正規化を適用した後であるが温度シフトを適用していないＨＲＭ曲線を図１５に示す。この実験から、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列における１つの余分なリピートを追加することは、参照の２１のリピートよりも長い、マイクロサテライトの検出を可能にすると結論づけることができる。
実施例１２：一点変異は、融解温度を数度変更する。
ＫＩＴエクソン１３における変異体配列を検出するためのＫＩＴエクソン１３アッセイ。ＰＣＲを、非対称ＰＣＲとして実行した。レポータオリゴヌクレオチドは、その５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよびその３’末端でＢＨＱ１クエンチャーを保持した。野生型試料からのＦＦＰＥ精製組織ＤＮＡおよび患者の試料からのＦＦＰＥ精製腫瘍組織１ｎｇ／ｕｌを、調べた。初期正規化間隔は、７０～７１℃であり、最終正規化間隔は、８０～８１℃であった。結果を図１６に示す。野生型組織は、７９．１℃のＴｍを与え、腫瘍組織は、２つのＴｍ；７５．７℃および７９．１℃を与える。
この実験から、プローブの融解温度が最大３．４℃で変更され、融解曲線の形状が、一点変異の場合に大幅に変化すると結論づけることができる。したがって、健康な試料および腫瘍試料を区別できる。
実施例１３：より強力なシングルエンドヘルパー配列は、差異を増加させ、変異体および野生型の区別を容易にする。
モノヌクレオチドリピートを含む領域の上流および下流でハイブリダイズするプライマを用いる非対称ＰＣＲを使用するＮＲ２４アッセイ。アッセイは、ＮＲ２４マイクロサテライト中の変異体配列を検出するためである。
２つの異なるレポータオリゴヌクレオチドを、この実験で使用した。第１レポータオリゴヌクレオチドは、５’末端でＦＡＭフルオロフォアおよび３’末端でＢＨＱ－１クエンチャーならびに内部クエンチャーを保持した。第１レポータオリゴヌクレオチドは、配列番号５の１５９位～１８７位にハイブリダイズし、その３’末端でオーバーハング（２ヌクレオチド）、およびその５’末端で５ヌクレオチド長のヘルパー配列（１０．５℃のＴｍにおける上昇をもたらす）を有し、それはモノヌクレオチドリピートの上流でハイブリダイズする。加えて、それは、５’末端から１０ヌクレオチド内に２つの疎水性ヌクレオチド、および３’末端から１０レオチド内に疎水性ヌクレオチドを含む。第２レポータは、実施例４において説明される。マイクロサテライト不安定性患者からのＦＦＰＥ精製正常および腫瘍組織ＤＮＡ１～２ｎｇ／μＬを、試験した。
初期正規化を、領域４０．５～４１．５℃で行い、最終正規化を、領域６６～６７℃で行った。バイリニア型正規化および０．０５ＲＦＵでの温度シフトを適用した。結果を図１７および１８に示す；図１７Ａおよび１８Ａ（第１レポータオリゴヌクレオチドを用いる結果）ならびに図１７Ｂおよび１８Ｂ（第２レポータオリゴヌクレオチドを用いる結果）を比較する。
ハイブリダイズした場合、第２ヘルパー配列は、第１ヘルパー配列よりも高いＴｍにおける上昇（１４．８℃、すなわち、４．３℃高い）をもたらし、これは２つの融解プロファイルを区別するのに役立つ。
より強力なヘルパー配列が、変異体のｍａｘＤＴを上昇させることが確認される。弱いヘルパー配列を有する第１レポータオリゴヌクレオチドは、正常および腫瘍組織の間で約０．０３ＲＦＵのｍａｘＤＴを生じた。これは、ＮＲ２４マーカーについて設定された閾値を下回り、そのため変異体は、野生型として誤って分類される（図１８Ａ）。より強力なヘルパー配列を有する第２レポータオリゴヌクレオチドは、約０．１７のｍａｘＤＴを生じ、したがって試料は、変異体として正確に分類される（図１８Ｂ）。
この実験から、より強力なヘルパー配列は、野生型および変異体の間の差異を増加さ得ると結論づけることができ、これは、モノヌクレオチド反復マイクロサテライトを調査する場合、有利である可能性がある。
配列
Figure 2022533088000002
Figure 2022533088000003
参考文献
Boland et al. (1998) "A National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer," Cancer Res 58:5248-5257
Rodriguez-Bigas et al. (1997) "A National Cancer Institute workshop on hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines," J Natl Cancer Inst 89:1758-1762
Hunter and Sanders (1990) J. Am Chem. Soc. 112: 5525-5534
WO 2017/045689
WO 03/052132
条項
１．２つの鎖からなり、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するための方法であって、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記方法は、以下の工程：
ａ）上記変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１試料を準備する工程；
ｂ）上記参照配列を含む核酸を含む第２試料を準備する工程であって、第２試料が、参照試料である、工程；
ｃ）レポータオリゴヌクレオチドを準備する工程；
ｄ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットを準備する工程であって、プライマのセットが一緒に、標的核酸配列を増幅できる、工程；
ｅ）上記第１試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１アンプリコンを得る工程；ならびに上記第２試料、上記第１プライマおよび上記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅させ、それによって参照配列を含む第２アンプリコンを得る工程であって、第２アンプリコンが、参照アンプリコンである、工程；
ｆ）第１アンプリコンの高分解能融解（ＨＲＭ）分析を実行し、それによって第１融解曲線により特徴づけられる第１ＨＲＭプロファイルを得る工程、ならびに第２アンプリコンのＨＲＭ分析を実行し、それによって第２融解曲線により特徴づけられる第２ＨＲＭプロファイルを得る工程であって、第２ＨＲＭプロファイルが、参照融解曲線により特徴づけられる参照プロファイルである、工程（各アンプリコンは、第１鎖および第２鎖を含み、ＨＲＭ分析は、各アンプリコンの１つの鎖へのレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、フルオロフォアにより放出される信号の検出、ならびに第１および第２融解曲線を得ることを含む）；
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、
レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端にまたは５’末端からの４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含む、ならびに
レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である）；ならびに
ｇ）第１ＨＲＭプロファイルを参照ＨＲＭプロファイルと比較する工程であって、第１ＨＲＭプロファイルおよび参照ＨＲＭプロファイルの間の差異は、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する、工程
を含む、方法。
２．ＮＯＩが、リピートを含み、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列が、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端でのヘルパー配列からなり、上記ヘルパー配列が、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズする場合、第１および第２アンプリコンの第１または第２鎖にハイブリダイズでき、好ましくはレポータオリゴヌクレオチドが、反復配列およびその５’末端またはその３’末端での１つのみのヘルパー配列からなる、条項１に記載の方法。
３．ヘルパー配列が、１～２０のヌクレオチド、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドなどを含むかそれらからなり、好ましくはヘルパー配列が、条項１において定義されたような少なくとも１つの疎水性オリゴヌクレオチドを含む、条項２に記載の方法。
４．条項１において定義されたような少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド、１、２または３個の疎水性ヌクレオチドなどが、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端から１～１０ヌクレオチド内、３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド内などに挿入される、条項１から３のいずれか一項に記載の方法。
５．条項１において定義されたような少なくとも１つの疎水性ヌクレオチド、１、２または３個の疎水性ヌクレオチドなどが、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端から１～１０ヌクレオチド内、５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド内などに挿入される、条項１から４のいずれか一項に記載の方法。
６．複数の標的核酸配列が、ＢＡＴ２５およびＢＡＴ２６からなり、好ましくは複数が、配列番号１に示すようなＢＡＴ２５および配列番号２に示すようなＢＡＴ２６からなる、条項１から５のいずれか一項に記載の方法。
７．標的核酸配列が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４およびＭＯＮＯ２７、好ましくは配列番号１に示すようなＢＡＴ２５、配列番号２に示すようなＢＡＴ２６、配列番号３に示すようなＮＲ２１、配列番号４に示すようなＮＲ２２、配列番号５に示すようなＮＲ２４および配列番号６に示すようなＭＯＮＯ２７の１つまたは複数を含む１つまたは複数の核酸配列である、条項１から６のいずれか一項に記載の方法。
８．標的核酸が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２およびＮＲ２４からなる複数の標的核酸配列であり、好ましくは複数が、配列番号１に示すようなＢＡＴ２５、配列番号２に示すようなＢＡＴ２６、配列番号３に示すようなＮＲ２１、配列番号４に示すようなＮＲ２２、および配列番号５に示すようなＮＲ２４からなる、条項１から７のいずれか一項に記載の方法。
９．標的核酸が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２２、ＮＲ２４およびＭＯＮＯ２７からなる複数の標的核酸配列であり、好ましくは複数が、配列番号１に示すようなＢＡＴ２５、配列番号２に示すようなＢＡＴ２６、配列番号４に示すようなＮＲ２２、配列番号５に示すようなＮＲ２４および配列番号６に示すようなＭＯＮＯ２７からなる、条項１から８のいずれか一項に記載の方法。
１０．標的核酸が、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、ＮＲ２１、ＮＲ２２、ＮＲ２４およびＭＯＮＯ２７からなる複数の標的核酸配列であり、好ましくは複数の標的核酸配列が、配列番号１に示すようなＢＡＴ２５、配列番号２に示すようなＢＡＴ２６、配列番号３に示すようなＮＲ２１、配列番号４に示すようなＮＲ２２、配列番号５に示すようなＮＲ２４および配列番号６に示すようなＭＯＮＯ２７からなる、条項１から９のいずれか一項に記載の方法。
１１．工程ｅ）における増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、好ましくは第１および第２プライマが異なる量で与えられる非対称ＰＣＲにより実行され、それによって各アンプリコンの第１鎖よりも各アンプリコンの第２鎖をより多く増幅するようにＰＣＲを指示する、条項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．第１試料が、癌などの疾患を患うか、患う疑いがある個体から単離されており、好ましくは癌が、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌である、条項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．ＮＯＩが、マイクロサテライトである、条項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．参照配列が、ｎ個のヌクレオチドの全長を有するＭ個のタンデムリピートのマイクロサテライト配列を含み、変異体配列が、ｎ’個のヌクレオチドの全長を有するＭ’個のタンデムリピートを有し、ＭおよびＭ’が、異なる整数である、条項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列Ｈの長さが、ｎ”であり、ｎ”≧ｎ＋１であり、好ましくはｎ”≧ｎ＋１またはｎ”≧ｎ＋２である、条項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．レポータオリゴヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの非末端位置に位置する第２クエンチャーを含む、条項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．第１試料が、上記疾患の変異特徴を有する細胞を含むか含む疑いがある組織の試料である、条項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．参照試料が、第１試料として同じ個体から、任意で非疾患組織から単離されるか、参照試料が、健康な個体から単離される、条項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．工程ｆ）が、第１および第２融解曲線の負の一次導関数を得るために第１および第２ＨＲＭ融解曲線を変換する工程を含み、第１ＨＲＭプロファイルおよび参照ＨＲＭプロファイルの間の差異が、第１および第２融解曲線の負の一次導関数の間の差異である、条項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．第１融解曲線の蛍光および第２融解曲線の蛍光が、正規化され、ＨＲＭプロファイル間の差異が、温度の関数としての上記第１および第２融解曲線の蛍光間の差異である、条件１から１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．第１ＨＲＭプロファイルおよび参照ＨＲＭプロファイルの間の差異が、第１および第２ＨＲＭ曲線の間の上下の正規化領域の境界内の相対蛍光単位の絶対最大差異として測定される、条項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．ＨＲＭ分析が、第１および第２融解曲線のバイリニア型正規化の工程を含む、条項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．ＨＲＭ分析が、相対蛍光単位（ＲＦＵ）での温度調節を、第１および第２融解曲線にならびに／または第１および第２融解曲線の負の一次導関数に適用する工程を含む、条項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．第２プライマが、標的核酸配列の連続配列と相補的である、少なくとも１５ヌクレオチドの配列を含む、条項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．変異体配列が、参照配列と比較して１つまたは複数のヌクレオチドの挿入を含むかそれからなる、条項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
２６．変異体配列が、参照配列と比較して１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含むかそれからなる、条項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．レポータオリゴヌクレオチドが、以下の一般式
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｄ－Ｚ－（Ｎ）ｅ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、条項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体の総数は、少なくとも１０である；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｄおよびｅは、個々に１～１９の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅは、少なくとも１０である）
を有する；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｄ－（Ｎ）ｅ－（Ｎ）ｂは、参照配列と同一である、
条項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．レポータオリゴヌクレオチドが、以下の一般構造：
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｆ－Ｚ－（Ｎ）ｇ－Ｚ－（Ｎ）ｈ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、条項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｆ、ｇおよびｈは、個々に１～１８の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｆ＋ｇ＋ｈは、少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｆ－（Ｎ）ｇ－（Ｎ）ｈ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する；または
以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｉ－Ｚ－（Ｎ）ｊ－Ｚ－（Ｎ）ｋ－Ｚ－（Ｎ）ｌ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、条項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、１～１７の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌは、個々に少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｉ－（Ｎ）ｊ－（Ｎ）ｋ－（Ｎ）ｌ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する；または
以下の一般構造
５’－（Ｎ）ａ－Ｚ－（Ｎ）ｍ－Ｚ－（Ｎ）ｎ－Ｚ－（Ｎ）ｏ－Ｚ－（Ｎ）ｐ－Ｚ－（Ｎ）ｑ－Ｚ－（Ｎ）ｂ－３’
（式中、
Ｎは、任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体である；ならびに
Ｚは、条項１において定義されるような疎水性ヌクレオチドである；ならびに
ａおよびｂは、個々に０～４の範囲の整数である；ならびに
ｍ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、個々に１～１６の範囲の整数である；ならびに
ａ＋ｂ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑは、少なくとも１０であり、最大５０である；ならびに
（Ｎ）ａ－（Ｎ）ｍ－（Ｎ）ｎ－（Ｎ）ｏ－（Ｎ）ｐ－Ｚ－（Ｎ）ｑ－（Ｎ）ｂは、参照配列を含む標的核酸配列のストレッチと同一である）
を有する、
条項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．少なくとも１つのインターカレーター、Ｑが、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、複素環、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルボアルコキシル（carboalkoyl）、アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、アミノ、アルコキシルおよびアミドからなる群より選択される１つまたは複数で任意に置換されたポリアロメートおよびヘテロポリアロメートからなる群より選択される、条項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．インターカレーターが、ベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ａｓ－インダセン、ｓ－インダセン、ビフェニレン、アセナフチレン、フェナレン、ヘプタレン、フェナントラン、フルオランテン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、ピレン、アントラセン、ナフテン、フェナントレン、フルレン、ピセン、クリセン、ナフタセン、アクリドン、ベンズアントラセン、スチルベン、オキサロ－ピリドカルバゾール、アジドベンゼン、ポルフィリンおよびソラレンならびにそれらの誘導体からなる群より選択される、条項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
３１．少なくとも１つ、例えばすべての骨格モノマー単位（複数可）Ｘが、ホスホロアミダイトである、条項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．少なくとも１つのリンカー、Ｙが、Ｃ、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群より選択されるｘ個の原子の鎖を含み、任意で上記鎖が、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｓ、ＮおよびＰからなる群より選択される１つまたは複数で置換される、条項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．標的核酸配列が、複数の標的核酸配列である、条項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．２つの鎖からなり、目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列における変異体配列の存在を検出するためのキットオブパーツであって、上記標的核酸配列は、変異体配列または参照配列からなり、上記キットオブパーツは：
ａ）好ましくはその５’末端でまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端でまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチド、
（レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５０個の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む）、
（少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である）；ならびに
ｂ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットであって、一緒に、標的核酸を増幅さできる、プライマのセット
を含む、
上記キットオブパーツ。
３５．レポータオリゴヌクレオチドならびに第１プライマおよび第２プライマが、条項１から３４のいずれか一項に定義されるものである、条項３４に記載のキット。
３６．標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズできるレポータオリゴヌクレオチドであって、好ましくはその５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端からの４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含み、レポータオリゴヌクレオチドは、そこに２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入された１０～５個０の範囲のヌクレオチドの配列であり、レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含み、
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；および／または
少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドは、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
疎水性ヌクレオチドは、構造
Ｘ－Ｙ－Ｑ
（式中、
Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格に組み込むことができるヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
Ｙは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位および上記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する；ならびに
ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチに相補的である、
レポータオリゴヌクレオチド。
３７．上記ＮＯＩが、リピートを含み、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列が、反復配列およびその５’末端および／またはその３’末端でのヘルパー配列からなり、上記ヘルパー配列が、リピートを含まず、ハイブリダイゼーション配列が標的核酸にハイブリダイズする場合に標的核酸の第２鎖にハイブリダイズでき、好ましくはレポータオリゴヌクレオチドが、反復配列およびその５’末端またはその３’末端での１つのみのヘルパー配列からなる、条項３６に記載のレポータオリゴヌクレオチド。
３８．ヘルパー配列が、１～２０のヌクレオチド、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドなどを含むかそれらからなり、好ましくはヘルパー配列が、条項１において定義されたような少なくとも１つの疎水性オリゴヌクレオチドを含む、条項３６から３７のいずれか一項に記載のレポータオリゴヌクレオチド。
３９．参照配列が、ｎ個のヌクレオチドの全長を有するＭ個のタンデムリピートのマイクロサテライト配列を含み、レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列Ｈの長さが、ｎ”であり、ｎ”≧ｎ＋１であり、好ましくはｎ”≧ｎ＋１またはｎ”≧ｎ＋２である、条項３６から３８のいずれか一項に記載のレポータオリゴヌクレオチド。
４０．レポータオリゴヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの非末端位置に位置する第２クエンチャーを含む、条項３６から３９のいずれか一項に記載のレポータオリゴヌクレオチド。
４１．所定の薬剤を用いてそれを必要とする個体における臨床状態の治療の有効性を予測するための方法であって、上記薬剤を用いる上記臨床状態の治療の有効性は、変異体配列の存在に関連しており、上記方法は、以下の工程
ａ．上記個体からの試料を準備する工程
ｂ．上記変異体配列の存在を決定するために、条項１から３３のいずれか一項に記載の方法を実行する工程
を含み；
上記変異体配列の存在は、上記薬剤が、上記個体における上記臨床状態の治療において有効であるかどうかを示唆する、方法。
４２．それを必要とする個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、上記臨床状態は、変異体配列を含む標的核酸配列の存在に関連しており、上記方法は、以下の工程
ａ．上記個体からの試料を準備する工程
ｂ．変異体配列の存在を決定するために、条項１から３３のいずれか一項に記載の方法を実行する工程
を含み；
上記変異体配列の存在は、上記臨床状態を患う上記個体を示唆する、方法。
４３．臨床状態が癌、好ましくは遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌である、条項４１から４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．上記個体に治療剤を有効量で投与する工程をさらに含む、条項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。

Claims (26)

  1. ２つの鎖からなり好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列中の変異体配列の存在を検出するための方法であって、前記標的核酸配列が、変異体配列または参照配列からなり、以下の工程：
    ａ）前記変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１試料を準備する工程；
    ｂ）前記参照配列を含む核酸を含む第２試料を準備する工程であって、第２試料が、参照試料である、工程；
    ｃ）レポータオリゴヌクレオチドを準備する工程；
    ｄ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットを準備する工程であって、プライマのセットが一緒に、ＮＯＩを含む標的核酸配列を増幅できる、工程；
    ｅ）前記第１試料、前記第１プライマおよび前記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅する、それにより変異体配列を含む疑いがある核酸を含む第１アンプリコンを得る工程；ならびに前記第２試料、前記第１プライマおよび前記第２プライマの存在下で標的核酸配列を増幅する、それにより参照配列を含む第２アンプリコンを得る工程であって、第２アンプリコンが、参照アンプリコンである、工程；
    ｆ）第１アンプリコンの高分解能融解（ＨＲＭ）分析などの、融解分析を実行する、それにより第１融解曲線により特徴づけられる第１プロファイルを得る工程、ならびに第２アンプリコンのＨＲＭ分析などの、融解分析を実行する、それにより第２融解曲線により特徴づけられる、第２プロファイルを得る工程であって、第２プロファイルが、参照融解曲線により特徴づけられる参照プロファイルである、工程（各アンプリコンは、第１鎖および第２鎖を含み、融解分析は、各アンプリコンの１つの鎖へのレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、フルオロフォアにより放出される信号の検出、ならびに第１および第２融解曲線を得ることを含む）；
    （レポータオリゴヌクレオチドは、その中に２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入されている、１０～５０個の範囲、好ましくは１５～５０個の範囲のヌクレオチドの配列である、
    レポータオリゴヌクレオチドは、好ましくはその５’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含む、ならびに
    レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、
    ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、かつハイブリダイゼーション配列は、標的核酸配列の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的である、
    ならびにレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端でのおよび／またはその３’末端での少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、前記ヘルパー配列は、リピートを含まず、かつハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズされる場合第１および第２アンプリコンにハイブリダイズできる）；ならびに
    ｇ）第１プロファイルを参照プロファイルと比較する工程であって、第１プロファイルおよび参照プロファイルの間の差異が、第１試料が変異体配列を含むことを示唆する、工程
    を含む、方法。
  2. 工程ｇ）が、以下の工程：
    ｉ）温度軸に沿って所与の蛍光強度で第１および第２の融解曲線を整列させる、それにより第１融解曲線および第２融解曲線の間の融解温度における差異を無効にする工程；
    ｉｉ）第１および第２融解曲線の間のフルオロフォアにより放出された信号における差異を決定する工程であって、好ましくは差異が、数値差である、工程；ならびに、
    ｉｉｉ）閾値に対しｉｉ）で決定された差異を比較する工程であって、閾値よりも大きい差異が、第１試料が変異体配列を含むことを示唆しかつ閾値よりも小さい差異は、第１試料が参照配列を含むことを示唆する、工程
    を含むかそれらからなる、請求項１に記載の方法。
  3. 参照配列が、１５ヌクレオチドまたはそれより多い、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドまたはそれより多いなどの長さを有する、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
  4. レポータオリゴヌクレオチドが、反復配列およびその５’末端またはその３’末端での１つのみのヘルパー配列からなるかレポータオリゴヌクレオチドが、反復配列およびレポータオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の両方での１つのヘルパー配列などの、２つのヘルパー配列からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
    少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
    疎水性ヌクレオチドが、構造
    Ｘ－Ｙ－Ｑ
    （式中、
    Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格中に組み込まれ得るヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
    Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
    Ｙは、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する、
    請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ヘルパー配列が、１～２０ヌクレオチド、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドなどを含むかそれらからなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ヘルパー配列が、請求項３で定義されるような少なくとも１つの疎水性オリゴヌクレオチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. １、２、または３個の疎水性ヌクレオチドなどの、請求項３で定義されるような少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド内などの、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端から１～１０ヌクレオチド内に挿入される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. １、２、または３個の疎水性ヌクレオチドなどの、請求項３で定義されるような少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド内などの、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端から１～１０ヌクレオチド内に挿入される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 工程ｅ）での増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、好ましくは第１および第２プライマが異なる量で与えられる非対称ＰＣＲにより実行され、それにより各アンプリコンの他の鎖よりも各アンプリコンの１つの鎖をより多く増幅するようにＰＣＲを指示する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 第１試料が、癌などの、疾患、または障害、好ましくはマイクロサテライト不安定性に関連する障害を患っているか患っている疑いがある個体から単離されており、好ましくは癌が、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ＮＯＩが、ｎ個のヌクレオチドの全長を有するＭ個のタンデムリピートのマイクロサテライト配列などの、マイクロサテライトであり、かつ変異体配列が、ｎ’個のヌクレオチドの全長を有するＭ’個のタンデムリピートを有し、ＭおよびＭ’が、異なる整数である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ｎが、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより大きいなどの、１５以上である、請求項１２に記載の方法。
  14. レポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列Ｈの長さが、ｎ”であり、ｎ”≧ｎ＋１であり、好ましくはｎ”≧ｎ＋１またはｎ”≧ｎ＋２である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ｎ”が、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれより大きいなどの、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより大きいなどの、１６以上である、請求項１４に記載の方法。
  16. 第１試料が、前記疾患または障害の変異特徴を有する細胞を含むか含む疑いがある組織の試料である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ２つの鎖からなりかつ好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸配列中の変異体配列の存在を検出するためのキットオブパーツであって、前記標的核酸配列が、変異体配列または参照配列からなり、前記キットオブパーツが：
    ａ）好ましくはその５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含むレポータオリゴヌクレオチド、
    （レポータヌクレオチドは、その中に２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入されている、好ましくは１５～５０ヌクレオチドの範囲の、１０～５０ヌクレオチドの範囲の配列である、ならびに
    レポータオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列Ｈを含む、ならびに、
    ハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、かつハイブリダイゼーション配列は、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的である；
    ならびにレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列は、反復配列およびその５’末端でのおよび／またはその３’末端でに少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、前記ヘルパー配列は、リピートを含まず、かつハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズされる場合第１および第２アンプリコンにハイブリダイズできる）；ならびに
    ｂ）第１プライマおよび第２プライマからなるプライマのセットであって、一緒に標的核酸配列を増幅できる、プライマのセット
    を含む、キットオブパーツ。
  18. 好ましくはレポータオリゴヌクレオチド、第１プライマおよび第２プライマが、請求項１から１６のいずれか一項に定義されるようである、請求項１７に記載のキット。
  19. レポータオリゴヌクレオチドが、反復配列およびその５’末端またはその３’末端での１つのみのヘルパー配列からなるか、またはレポータオリゴヌクレオチドが、反復配列およびレポータオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の両方での１つのヘルパー配列などの、２つのヘルパー配列からなる、請求項１７から１８のいずれか一項に記載のキット。
  20. 少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
    少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
    疎水性ヌクレオチドが、構造
    Ｘ－Ｙ－Ｑ
    （式中、
    Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格中に組み込まれ得るヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
    Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
    Ｙは、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する、
    請求項１７から１９のいずれか一項に記載のキット。
  21. ２つの鎖からなりかつ好ましくはリピートを含む目的のヌクレオチド（複数可）（ＮＯＩ）を含む標的核酸の１つの鎖にハイブリダイズできるレポータオリゴヌクレオチドであって、好ましくはその５’末端にまたは５’末端から４ヌクレオチド内に、第１フルオロフォア、および好ましくはその３’末端にまたは３’末端から４ヌクレオチド内に、第１クエンチャーを含み、その中に２～１０個の範囲の疎水性ヌクレオチドが挿入されている、１０～５０個の範囲の、好ましくは１５～５０ヌクレオチドの範囲の配列であり、かつハイブリダイゼーション配列Ｈを含むレポータオリゴヌクレオチドであって、
    ハイブリダイゼーション配列が、標的核酸の第１鎖の配列の連続ストレッチと同一であり、かつハイブリダイゼーション配列が、標的核酸の第２鎖の配列の連続ストレッチと相補的であり、
    かつレポータオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列が、反復配列およびその５’末端でのおよび／またはその３’末端での少なくとも１つのヘルパー配列を含むかそれらからなり、前記ヘルパー配列が、リピートを含まず、かつハイブリダイゼーション配列がそれにハイブリダイズされる場合第１および第２アンプリコンの第２鎖にハイブリダイズできる、
    レポータオリゴヌクレオチド。
  22. 反復配列およびその５’末端またはその３’末端での１つのみのヘルパー配列からなるか反復配列およびレポータオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の両方での１つのヘルパー配列などの、２つのヘルパー配列からなる、請求項２１に記載のレポータオリゴヌクレオチド。
  23. 少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの５’末端にまたは５’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに／または
    少なくとも１つの疎水性ヌクレオチドが、レポータオリゴヌクレオチドの３’末端にまたは３’末端から１０ヌクレオチド内に位置する；ならびに
    疎水性ヌクレオチドが、構造
    Ｘ－Ｙ－Ｑ
    （式中、
    Ｘは、核酸もしくは核酸類縁体の骨格中に組み込まれ得るヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位である、
    Ｑは、ワトソン－クリック水素結合に関与していないインターカレーターである；ならびに
    Ｙは、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体または骨格モノマー単位と前記インターカレーターを連結するリンカー部分である）を有する、
    請求項２１から２２のいずれか一項に記載のレポータオリゴヌクレオチド。
  24. ヘルパー配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドなどの、１～２０ヌクレオチドを含むかそれらからなり、好ましくはヘルパー配列が、請求項３で定義されるような少なくとも１つの疎水性オリゴヌクレオチドを含む、請求項２１から１４のいずれか一項に記載のレポータオリゴヌクレオチド。
  25. 所定の薬剤を用いてそれを必要とする個体における臨床状態の治療の有効性を予測する方法であって、前記薬剤を用いる前記臨床状態の治療の有効性が、変異体配列の存在に関連し、以下の工程
    ａ．前記個体からの試料を準備する工程
    ｂ．前記変異体配列の存在を決定するために請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法を実行する工程
    を含み；
    前記変異体配列の存在が、前記薬剤が前記個体における前記臨床状態を治療することにおいて有効であるかどうかを示唆する、方法。
  26. それを必要とする個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、前記臨床状態が、変異体配列を含む標的核酸配列の存在に関連し、以下の工程
    ａ．前記個体からの試料を準備する工程
    ｂ．変異体配列の存在を決定するために請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法を実行する工程
    を含み；
    変異体配列の存在が、前記臨床状態を患う前記個体を示唆する、方法。
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