JP2009521223A5

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Publication number: JP2009521223A5
Application number: JP2008547582A
Authority: JP
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2010-02-25
Anticipated expiration: 2026-12-20

Claims

鋳型核酸の少なくとも一部を配列決定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの鋳型核酸を、少なくとも１つのポリメラーゼ、糖部分の２’位における保護基であって、該２’位の保護基がリン酸である保護基を含む少なくとも１つの２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチド、および少なくとも鋳型核酸の部分配列に相補的な少なくとも１つのプライマー核酸とインキュベートし、それによって、該ポリメラーゼが該プライマー核酸を伸長させて、プライマー伸長産物の３’末端において該２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを取り込む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生じさせる工程と、
（ｂ）プライマー伸長産物の３’末端にある２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドの２’位から保護基を除去する工程と、そして
（ｃ）工程（ｂ）の前および／またはその工程中に、プライマー伸長産物中にある２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを同定し、それによって、同定された２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドから鋳型核酸の塩基配列の少なくとも一部を決定することが可能になり、したがって鋳型核酸の少なくとも一部を配列決定する工程と、
を含む方法。
前記工程（ｂ）が、２’位のリン酸を除去する活性を有するプライマー伸長産物をインキュベートする工程を含む、請求項１記載の方法。
前記２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが、

である、請求項１に記載の方法。
前記２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが、少なくとも１つの標識成分で標識されている、請求項１記載の方法。
反応混合物が４種類の異なった２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを含み、それぞれが異なる塩基を有し、かつ異なる標識成分で標識されている、請求項１記載の方法。
前記検出工程が、２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを取り込む際に生じるピロリン酸を検出することを含む、請求項１記載の方法。
工程（ａ）〜（ｃ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項１記載の方法。
合成によって配列決定するためのキットであって、
糖部分の２’位における保護基としてリン酸を含む少なくとも１つの２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチド、
ポリメラーゼ、および
２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドの２’位の修飾を除去するための試薬、を含むキット。
さらに、少なくとも１つの伸張可能なターミネーターヌクレオチドを含む、請求項８に記載のキット。
遺伝子型解析法であって、
ａ）プライマー、ポリメラーゼ、および２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む反応混合液中の鋳型核酸をインキュベートする工程であって、該修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが、４種類の天然型塩基またはそれらのアナログのうち１つを含み、そしてさらに糖部分の２’位の修飾を含み、ここで該２’位の修飾は、該プライマーが鋳型核酸にアニールし、そして反応液中に存在するポリメラーゼによって伸長して伸長産物を生成する条件下で合成を停止させるリン酸であることを特徴とする、工程と、
ｂ）２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが伸長産物に取り込まれたことを示すシグナルが存在するか否かを判定する工程と、
ｃ）前記シグナルが存在しない場合には、異なる２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを用いて工程ａ）およびｂ）を繰り返す工程であって、該異なる２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが４種類の天然型塩基またはそれらのアナログのうち別の１つを含む、工程と、
ｄ）前記可逆的ターミネーターヌクレオチド上に存在する２’位の修飾を除去する活性を有する前記伸長産物をインキュベートする工程と、
ｅ）工程ａ）〜ｄ）を所望の回数繰り返して、前記鋳型核酸の一部の配列を決定する工程と、そして
ｆ）鋳型核酸の一部の配列を多型性部位の既知の配列と比較する工程と、
を含む遺伝子型解析法。
核酸の配列決定を行うためのシステムであって、
反応用チャンバーを含むサーマルサイクラーであって、ここで鋳型核酸がプライマー、ポリメラーゼ、および２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む反応混合液中でインキュベートされ、該修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが４種類の天然型塩基またはそれらのアナログのうち１つを含み、そしてさらに糖部分の２’位の修飾を含み、ここで該２’位の修飾は合成を終了させるリン酸であることを特徴とし、該プライマーが鋳型核酸にアニールし、反応液中に存在するポリメラーゼによって伸長して伸長産物を生成する条件を作り出すのに効果的なサーマルサイクラーと、
試薬を添加および除去するための入口及び出口を有する前記反応用チャンバー、及び
２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが伸長産物に取り込まれたことを示すシグナルが存在することを検出するために有効な検出器と、
を含むシステム。
下記

および

からなる群から選択される、標識された２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチド。
鋳型核酸の少なくとも一部を配列決定する方法であって、
ａ）該鋳型核酸を、プライマー、ポリメラーゼ、および糖部分の２’位において保護基としてリン酸を含む２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む反応混合液の中で、プライマーが該鋳型核酸にアニールし、反応液中に存在するポリメラーゼによって伸長して伸長産物を生成する条件下でインキュベートする工程と、
ｂ）２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが伸長産物に取り込まれたことを示すシグナルが存在することを判定する工程と、
ｃ）可逆的ターミネーターヌクレオチド上に存在する２’位の修飾を除去する活性を有する該伸長産物をインキュベートする工程と、
ｄ）工程ａ）〜ｃ）を所望の回数繰り返して、該鋳型核酸の少なくとも一部の配列を決定する工程と、
を含む方法。
工程（ａ）が、単一の反応混合液において複数の異なる２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを用いて行われ、それぞれ異なる２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが異なる塩基を含む、請求項１３に記載の方法。
鋳型核酸の少なくとも一部を配列決定する方法であって、
ａ）プライマー、ポリメラーゼ、および２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む反応混合液中の鋳型核酸をインキュベートする工程であって、該修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが、４種類の天然型塩基またはそれらのアナログのうち１つを含み、そしてさらに糖部分の２’位の修飾を含み、ここで該２’位の修飾は合成を停止させるリン酸であることを特徴とし、該インキュベートが、プライマーが鋳型核酸にアニールし、反応液中に存在するポリメラーゼによって伸長して伸長産物を生成する条件下において行われる工程と、
ｂ）２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが前記伸長産物に取り込まれたことを示すシグナルが存在するか否かを判定する工程と、
ｃ）前記シグナルが存在しない場合には、異なる２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドを用いて工程ａ）およびｂ）を繰り返す工程であって、該異なる２’修飾型可逆的ターミネーターヌクレオチドが４種類の天然型塩基またはそれらのアナログのうち別の１つを含む、工程と、
ｄ）前記可逆的ターミネーターヌクレオチド上に存在する２’位の修飾を除去する活性を有する前記伸長産物をインキュベートする工程と、そして
ｅ）工程ａ）〜ｄ）を所望の回数繰り返して、該鋳型核酸の一部の配列を決定する工程と、
を含む方法。