JP2009513142A5 - - Google Patents
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Claims (23)
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、
(a)各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、該ハイブリダイズ部分が6個、7個又は8個のヌクレオチドの1つからなり、及び
(b)オリゴヌクレオチドの集団が、6個、7個又は8個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、前記所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの集団を生成するように選択される、前記方法。 - 各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する所定の配列部分をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 所定の配列部分が転写プロモーターを含む、請求項2に記載の方法。
- 所定の配列部分がPCR増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項2に記載の方法。
- 核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られる、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物の血液細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、赤血球及び血小板からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られるmRNA分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸集団の第二の亜集団が、核酸分子の標的集団中の最も豊富に表現された核酸分子から実質的になり、前記最も豊富に表現された核酸分子の各々が、核酸分子の標的配列に存在する全てのmRNAの少なくとも0.1%を構成する、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸集団の第二の亜集団が、リボソームRNA、リボソームDNA,グロビンDNA及びグロビンRNA、又はこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 核酸分子の標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、RNA分子を生成するためのインビトロ転写の工程を含む、請求項3に記載の方法。
- 標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、二本鎖DNA分子を生成するためのPCR増幅の工程をさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 逆転写工程がdNTPの存在下で実施され、dNTP濃度が50〜5000マイクロモルの範囲を含む、請求項10又は11に記載の方法。
- dNTP濃度が1000〜2000マイクロモルの範囲を含む、請求項12に記載の方法。
- 所定のハイブリダイゼーション条件が40℃〜50℃の範囲のアニーリング温度を含む、請求項1に記載の方法。
- スペーサー部分が、各オリゴヌクレオチドの所定の配列部分とハイブリダイズ部分との間に配置されている、請求項2に記載の方法。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、
(a)各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、該ハイブリダイズ部分が6個、7個又は8個のヌクレオチドの1つ及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する所定の配列部分からなり、並びに
(b)オリゴヌクレオチドの集団が、6個、7個又は8個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、前記所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの集団を生成するように選択される、前記方法。 - 所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項16に記載の方法。
- 所定の配列部分がPCR増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項16に記載の方法。
- 標的細胞から得られた核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、オリゴヌクレオチドの前記集団内の各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する所定の配列部分を含み、前記ハイブリダイズ部分が所定の条件下で前記標的細胞から得られたmRNA核酸分子にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で前記標的細胞から得られたリボソームRNA、リボソームDNA、グロビンDNA又はグロビンRNAの少なくとも1つにはハイブリダイズしないように選択される、前記方法。
- 所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項19に記載の方法。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、
(a)オリゴヌクレオチドの集団(各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する転写プロモーター部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は6〜8ヌクレオチド長であり、前記オリゴヌクレオチドの集団は6個、7個又は8個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、前記所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの集団を生成するように選択される)を準備する工程と;
(b)哺乳動物対象から単離されたmRNAを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と;
(c)逆転写酵素を用いて、前記mRNAからcDNAを合成する工程と;及び
(d)DNAポリメラーゼを用いて二本鎖cDNAを合成する工程と、
を含む、前記方法。 - 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であって、
(a)オリゴヌクレオチドの第一の集団(各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分、該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する第一のPCRプライマー結合部位、及び前記第一PCRプライマー結合部位と前記ハイブリダイズ部分との間に配置されたスペーサー部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は6個、7個又は8個のヌクレオチドからなり、6個、7個又は8個のヌクレオチドからなる前記ハイブリダイズ部分の全ての可能な配列を生成すること、及び標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズするハイブリダイズ部分を除去することにより、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の前記第二の亜集団にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの前記第一の集団を生成するように選択される)を準備する工程と;
(b)哺乳動物対象から単離されたmRNAを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と;
(c)逆転写酵素を用いて、前記mRNAからcDNAを合成する工程と;
(d)DNAポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドの第二の集団(各オリゴヌクレオチドは、ランダムなハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する第二のPCR結合部位を含む)を用いて二本鎖cDNAを合成する工程と;並びに
(e)熱安定性DNAポリメラーゼ、第一のPCRプライマー結合部位に結合する第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマー結合部位に結合する第二のPCRプライマーを用いて、二本鎖cDNAをPCR増幅して、増幅された二本鎖DNAを生成させる工程と、
を含む、前記方法。 - スペーサー部分が、1〜6ヌクレオチド長を有する、請求項15又は22に記載に記載の方法。。
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