JP2009513142A - 非ランダムプライマーを用いる核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
一態様において、本発明は、核酸分子の標的集団(例えば、最も高度に発現されているmRNA種を除く、細胞種に発現されている全てのmRNA分子)を選択的に増幅するための方法を提供する。本発明の本態様の方法は、それぞれ、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始するためのオリゴヌクレオチドの集団を使用する工程を含む。オリゴヌクレオチドの集団は、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないその能力に基づいて選択される。
本実施例では、以下のように、NSRプライマーを使用した。
フォワードプライマー:5’ACGGTGGCCATGGAAGTC3’(配列番号940);
リバースプライマー:5’TCGGCAGGTGAGTTGTTACAC3’(配列番号941);
FAMプローブ:5’ACTCCTTAGCGGATTCC3’(配列番号942)
フォワードプライマー:5’GCACGCGCACAAGCT3’(配列番号943)
リバースプライマー:5’GGGTCACCAGCAGGCA3’(配列番号944);
FAMプローブ:5’ACTTCAAGCTCCTAAGCCAC3’(配列番号945)
実施例5に記載されているように、40μLの反応容量でNSR7、T7−N7及びN8プライマーを用いて、全血全RNA400ngを逆転写した。qPCRによって、IGF1R、GAPDH、rRNA及びグロビンの存在量を評価するために、20μL(200ng全血全RNA)を使用し、次いで、最も成績が優れているプライマーの組をIVTに供した。2つのプライマー濃度(10μM及び25μM)及び2つのdNTP濃度(1000μM及び2500μM)を評価した。第一鎖逆転写後の生のCt及び絶対的存在量の値が、表17及び表18に示されている。
第一鎖逆転写
以下のように、第一鎖逆転写を実施する。
・全RNAテンプレート1μg
・100μM原NSRプライマー2μL
・10μLの最終容量になる水xμL
・混合し、65℃で5分間温置し、氷上で瞬間凍結。
・5×FS緩衝液4μL
・25mMdNTP1.6μL
・水1.4μL
・原DTT1μL
・RNAsOUT1μL
・SSIII1μL
試料を混合し、遠心し、(「ホットスタート」を与えるために)予め加温された40℃のサーマルサイクラーに移し、40℃で3時間、70℃で10分間、試料を温置し、4℃まで冷却した。
SuperScriptTMRNA Amplification System(Invitrogen、カタログ番号L1016−01)の成分を使用して、以下のように、第二鎖合成カクテルを調製する。
・5×第二鎖緩衝液30μL
・10mMdNTPMix3μL
・DNAポリメラーゼI(10単位/μL)4μL
・DNAリガーゼ(10単位/μL)1μL
・RNAseH(2単位/μL)1μL
第二鎖合成カクテル130μLを、上記第一鎖反応20μLに添加し、混合し、16℃で2時間、試料を温置する。
1.cDNALoading Buffer500μLを、第二鎖cDNA合成から得た反応チューブに添加する。チューブ内の総容量は、650μLとすべきである。ピペット操作で上下させることによって、完全に混合する。
2.各Spin Cartridgeを、コレクションチューブ中に予め挿入する。SpinCartridge上に直接cDNA/緩衝溶液を載せる。
3.12,000×g、室温で、微小遠心管中において、1分間遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
4.同じコレクションチューブ中にSpinCartridgeを置き、cDNA Wash Buffer700μLを添加する。
5.12,000×g、室温で、2分間遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
6.同じコレクションチューブ中にSpinCartridgeを置き、12,000×g、室温で、さらに4分間遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
7.新しいRecovery Tube中にSpinCartridgeを置く。
8.Spin Cartridgeの中心にDEPC処理された水28μLを添加し、室温で2日間温置する。
9.12,000×gで、室温で、1分間遠心する。
10.cDNAをカラム上に、ピペットで戻し、1分間放置し、再度遠心する。
以下のように、In Vitro Transcription Cocktailを調製する(18μLの容量)
・100mMATP 1.5μL
・100mMCTP 1.5μL
・100mMGTP 1.5μL
・100mMUTP 0.75μL
・アミノ−アリルUTP(50mM) 1.75μL
・10×T7Reaction Buffer 4.0μL
・T7EnzymeMix 7.0μL
カクテルに、精製されたcDNA22μLを添加し、37℃で一晩、試料を温置する。
aRNAを精製するために、以下の手順を使用する。
2.100%エタノール100μLを反応チューブに添加する。ピペット操作で上下させることによって、完全に混合する。
3.各Spin Cartridgeを、コレクションチューブ中に予め挿入する。SpinCartridge上に直接、全てのaRNA/緩衝溶液を載せる。
4.12,000×gで、微小遠心管中において、15秒間、室温で遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
5.同じコレクションチューブ中にSpinCartridgeを置き、aRNA Wash Buffer500μLを添加する。
6.12,000×gで、15秒間、室温で遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
7.工程5から6を繰り返す。
8.同じコレクションチューブ中にSpinCartridgeを置き、カラムを乾燥させるために、さらに2分間、全速で遠心する。コレクションチューブを取り出し、フロースルーを廃棄する。
9.新しいRecovery Tube中にSpinCartridgeを置く。
10.Spin Cartridgeの中心にDEPC処理された水100μLを添加し、室温で1分間温置する。
11.溶出液中の精製されたaRNAを集めるために、12,000×gで、2分間、室温で遠心する。
12.Nanodropを用いて、aRNAの収率を定量する。
(ランダムな9マーに加えて、第二のPCRプライマー結合部位、すなわち「尾部」を含むRRT1と称される。)。
リバースプPCR1:5’TGCATTGAGAGGGTGTAATTTG3’(配列番号947)
(第二のPCRプライマー結合部位に結合する。)
表35に上記されているプライマーの組は、T7プロモーターを含むNSR7とともに使用されるが、aDNAを作製する方法は、少なくとも1つのプライマー結合配列を含有する何れかの所定の配列が尾部に付着されたさほどランダムでないプライマー(NSR)のプールを用いて実施され得ることが理解される。例えば、933個の6マー(配列番号1から933)に加えて、6マーの配列と第一のプライマー結合配列(配列番号:956:5’CCGAACTACCCACTTGCATT3’)の間に挿入された単一のランダムなヌクレオチドを含むNSRプライマーのプールを含むプライマープールを使用した。
5’CCACTCCATTTGTTCGTGTGNNNNNNNNN3’(配列番号957)を用いて、第二鎖合成を実施した。
次いで、以下のPCRプライマーを用いて、二本鎖cDNAのPCR増幅を実施した。
(第一のPCRプライマー結合部位に結合する。)
リバースPCRプライマー:5’CCACTCCATTTGTTCGTGTG3’(配列番号959)
(第二のPCRプライマー結合部位に結合する。)
検査試料:上で表35中に示されているプライマーの組を用いて、試験試料1から8を実施し、以下のプライマーの組#1について記載したように、平行して検査した。
2.第一鎖逆転写酵素反応後に(第二鎖Klenowなし)、PCR増幅。
以下のように、第一鎖逆転写を実施した。
・(Ambion,Inc.(Austin,TX)から入手した)1μg/μLのJurkat全RNAテンプレート1μL
・100μM原NSR7プライマープール2μL
・10μLの最終容量になるようにH2O7μL
・混合し、65℃で5分間温置し、氷上で瞬間凍結。
・5×First Strand Buffer(250mMTris−HCl,pH8.3、375mMKCl、15mMMgCl2)4μL
・20mMdNTP2μL
・H2O1μL
・0.1MDTT1μL
・RNAseOUT(Invitrogen)1μL
・MMLV逆転写酵素(200単位/μL)(SuperScriptIIITM(SSIII)、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA)1μL
試料を混合し、(「ホットスタート」を与えるために)予め加温された40℃のサーマルサイクラーに移し、次いで、40℃で2時間、70℃で10分間、試料を温置し、4℃まで冷却した。
第二鎖合成カクテルを以下のように調製した。
・N9ReverseRT1プライマー(配列番号947)10μL
・20mMdNTP2.5μL
・H2O57.5μL
・Klenow酵素(NEBexo−50U/μL)0.33μL
第二鎖合成カクテル80μLを、第一鎖テンプレート反応混合物20μLに添加し、混合し、37℃で30分間温置する。
製造業者の指示に従って、Invitrogenから入手したSpinCartridges及びキット中に供給されていた緩衝液を用いて、得られた二本鎖cDNAを精製した。30μLの総容量がカラムから溶出され、このうち20μLを、後続のPCRのために使用した。
精製されたcDNAテンプレート20μLに以下の混合物を添加した。
・20mMdNTPS2.5μL
・フォワードPCRプライマー(10mM原液)(配列番号946)4μL
・リバースPCRプライマー(10mM原液)(配列番号947)4μL
・ExpandEnzyme(5U/μL)(Roche)1μL
・H2O40μL
・25mMMgCl210μL
PCR増幅条件:
計25のPCRサイクル:
10サイクル:
・94℃、30秒間
・55℃又は60℃、30秒間
・72℃、1分間
15サイクル:
・94℃、30秒間
・55℃又は60℃、30秒間
・72℃、1分間(各サイクルについて、伸長工程に10秒を付加した。)
・仕上げのために72℃、7分間、4℃で冷却。
良好でないcDNA及びPCR収率を有するが、PCR増幅に対するcDNAの高いレベルを有する試料(例えば、試料7)により、強固なcDNA合成レベル及び強固なPCR収率(例えば、試料2)を有する試料を優先して増幅を重み付けするために、この増幅係数を導入した。上記増幅係数に基づいて調整された存在量の値は、以下で表37中に示されている。
NSR7プライマープールとともに、Jurkat又はK562細胞(Ambion、Inc.AustinTXから入手)から得た全RNAテンプレート1μgを用いて、実施例11に記載されているように、第一鎖cDNA合成を実施した。2つのJurkat試料を平行して泳動した。第二鎖合成及びcDNA精製についても、実施例11に記載されているように実施した。
PCR反応中で使用する前に、cDNAテンプレートを10倍及び100倍希釈し、精製されたcDNA10μL又は希釈されたcDNA10μLの何れかを使用した。
・5×Roche Expand Plus PCR Buffer20μL
・10mMdNTPS2.0μL
・フォワードPCRプライマー(10mM原液)(配列番号946)4μL
・リバースPCRプライマー(10mM原液)(配列番号947)4μL
・ExpandEnzyme(5U/μL)(Roche)1μL
・H2O60μL
・25mMMgCl210μL
PCR増幅条件:
計30のPCRサイクルを実施:
10サイクル:
・94℃、30秒間
・60℃、30秒間
・72℃、1分間
20サイクル:
・94℃、30秒間
・60℃、30秒間
・72℃、1分間(各サイクルについて、伸長工程に10秒を付加した。)
・仕上げのために72℃、7分間、4℃で冷却。
以下のように、後続のPCR反応において、1μL+9μLのH2O又は10μLのcDNAテンプレートの何れかを使用した。
・5×Roche Expand Plus PCR Buffer20μL(1.5mMMgCl2を含む。)
・20mMdNTPS1.0μL
・フォワードPCRプライマー(10mM原液)(配列番号949)4μL
・リバースPCRプライマー(10mM原液)(配列番号948)4μL
・ExpandEnzyme(5U/μL)(Roche)1μL
・H2O60μL
PCR増幅条件:
計20のPCRサイクルを実施:
10サイクル:
・94℃、30秒間
・60℃、30秒間
・72℃、1分間
10サイクル:
・94℃、30秒間
・60℃、30秒間
・72℃、1分間(各サイクルについて、伸長工程にを付加した。)
・仕上げのために72℃7分間、4℃で冷却。
テンプレート:実施例13に記載されているように、NSR7プライマーを用いてJurkat全RNAからcDNAを調製した。
フォワード:配列番号949;リバース:配列番号948
検査したプライマー濃度:200、400、600、800及び1000nM
検査したdNTP濃度:200μM、1.5mM
検査したMg++濃度:500μM、4mM
実施例13に記載されているように、PCR反応を調製した。
計30のPCRサイクルを実施:
10サイクル:
・94℃、30秒間
・60℃、30秒間
・72℃、1分間及び
20サイクル:
・94℃、30秒間
・60℃、30秒間
・72℃、1分間(各サイクルについて、伸長工程に10秒を付加した。)
・仕上げのために72℃7分間、4℃で冷却。
Cy3及びCy5直接標識キットは、Minis(Madison、WI、kit MIR製品番号3625及び3725)から入手した。
・4mMMgCl2
・フォワードプライマーのみ又はリバースプライマーのみ400から1000nM(例えば、フォワード:配列番号949;又はリバース配列番号948)、但し、両者ではない。
・4mMMgCl2
・フォワードプライマー及びリバースプライマー400から1000nM(例えば、フォワード:配列番号949;又はリバース配列番号948)
PCR反応:PCRの5から20サイクル(940C30秒、60℃30秒、72℃30秒)、この時間中、二本鎖PCRテンプレートの両鎖が合成される。次いで、二本鎖のaa標識されたaDNAPCR産物が精製され、標準的な化学カップリングによって、Cy3又はCy5標識が取り込まれる。
Claims (42)
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であり、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、
(a)各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、該ハイブリダイズ部分が6個、7個又は8個のヌクレオチドの1つからなり、及び
(b)オリゴヌクレオチドの集団が、所定の条件下で前記標的核酸集団の第一の亜集団にハイブリダイズするが、前記所定の条件下で前記標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないように選択される、前記方法。 - 各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する所定の配列部分をさらに含む、請求項1の方法。
- 所定の配列部分が転写プロモーターを含む、請求項2の方法。
- 所定の配列部分がPCR増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項2の方法。
- ハイブリダイズ部分の集団が、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド又は8ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドから選択される、請求項1の方法。
- ハイブリダイズ部分の集団が、6ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドから選択される、請求項1の方法。
- ハイブリダイズ部分の集団が、配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドから選択される、請求項1の方法。
- ハイブリダイズ部分が、配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである、請求項1の方法。
- ハイブリダイズ部分の集団が、7ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドから選択される、請求項1の方法。
- ハイブリダイズ部分の集団が、8ヌクレオチドの長さを有する全ての可能なオリゴヌクレオチドから選択される、請求項1の方法。
- 核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られる、請求項1の方法。
- 哺乳動物の血液細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、赤血球及び血小板からなる群から選択される、請求項11の方法。
- 核酸分子の標的集団が哺乳動物の血液細胞から得られるmRNA分子を含む、請求項1の方法。
- 標的核酸集団の第二の亜集団が、核酸分子の標的集団中の最も豊富な核酸分子から実質的になる、請求項1の方法。
- 最も豊富な核酸分子が、リボソームRNA、リボソームDNA,グロビンDNA又はグロビンRNAからなる群から選択される、請求項14の方法。
- 核酸分子の標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、RNA分子を生成するためのインビトロ転写の工程を含む、請求項3の方法。
- 標的集団の増幅が、核酸分子の標的集団を逆転写することに続き、二本鎖DNA分子を生成するためのPCR増幅の工程をさらに含む、請求項4の方法。
- 逆転写工程がdNTPの存在下で実施され、dNTP濃度が50から5000マイクロモルの範囲を含む、請求項16又は17の方法。
- dNTP濃度が1000から2000マイクロモルの範囲を含む、請求項18の方法。
- 所定のハイブリダイゼーション条件が40℃から50℃の範囲のアニーリング温度を含む、請求項1の方法。
- スペーサー部分が、各オリゴヌクレオチドの所定の配列部分とハイブリダイズ部分との間に配置されている、請求項2の方法。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であり、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、
(a)各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分を含み、該ハイブリダイズ部分が6個、7個又は8個のヌクレオチドの1つ及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する所定の配列部分からなり、並びに
(b)オリゴヌクレオチドの集団が、所定の条件下で標的核酸集団の第一の亜集団へハイブリダイズするが、前記所定の条件下で標的核酸集団の第二の亜集団にハイブリダイズしないように選択される、前記方法。 - 所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項22の方法。
- 所定の配列部分がPCR増幅用のプライマー結合部位を含む、請求項22の方法。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であり、オリゴヌクレオチドの集団を使用して、核酸分子のより大きな集団内の核酸分子の標的集団の増幅を開始する工程を含み、オリゴヌクレオチドの前記集団内の各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する所定の配列部分を含み、前記ハイブリダイズ部分が配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである、前記方法。
- 所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項25の方法。
- ハイブリダイズ部分の集団が、配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも10%を含む、請求項25の方法。
- 配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの集団。
- 配列番号1から933からなるオリゴヌクレオチドの集団。
- 配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも10%を含むオリゴヌクレオチドの集団。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための試薬であり、配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも10%を含む、前記試薬。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための試薬であり、核酸分子の標的集団の増幅を開始するためのオリゴヌクレオチドの集団を含み、各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する所定の配列部分を含み、前記ハイブリダイズ部分が配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである、前記試薬。
- 所定の配列部分がインビトロ転写に適した転写プロモーターを含む、請求項32に記載の試薬。
- ハイブリダイズ部分の集団が、配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも10%を含む、請求項32に記載の試薬。
- ハイブリダイズ部分の集団が、配列番号1から933からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項32に記載の試薬。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅するためのキットであり、オリゴヌクレオチドの集団を含む試薬を含み、各オリゴヌクレオチドは、配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーであるハイブリダイズ部分を含む、前記キット。
- ハイブリダイズ部分の集団が、配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも10%を含む、請求項36に記載のキット。
- ハイブリダイズ部分の集団が、配列番号1から933からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項36に記載のキット。
- 以下の成分:逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、RNアーゼH酵素、Tris緩衝液、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、還元剤、デキシヌクレオシド三リン酸又はリボヌクレアーゼ阻害剤の少なくとも1つをさらに含む、請求項36に記載のキット。
- 以下の成分:RNAポリメラーゼ、IPPアーゼ、転写緩衝液、Tris緩衝液、ナトリウム塩、マグネシウム塩、スペルミジン、還元剤、ヌクレオシド三リン酸又はアミノ−アリル−UTPの少なくとも1つをさらに含む、請求項36に記載のキット。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であり、
(a)オリゴヌクレオチドの集団(各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する転写プロモーター部分を含み、前記ハイブリダイズ部分は配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである。)を準備する工程と;
(b)哺乳動物対象から単離されたmRNAを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と;
(c)逆転写酵素を用いて、前記mRNAからcDNAを合成する工程と;
(d)DNAポリメラーゼを用いて二本鎖cDNAを合成する工程と;及び
(e)各オリゴヌクレオチドの転写プロモーター部分に結合するRNAポリメラーゼを用いて、二本鎖cDNAをRNAへ転写して、増幅されたRNAを生成させる工程と、
を含む、前記方法。 - 核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法であり、
(a)オリゴヌクレオチドの第一の集団(各オリゴヌクレオチドはハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する第一のPCRプライマー結合部位を含み、前記ハイブリダイズ部分は配列番号1から933を含むオリゴヌクレオチドの集団のメンバーである。)を準備する工程と;
(b)哺乳動物対象から単離されたmRNAを含む試料に、前記オリゴヌクレオチドの集団をアニールする工程と;
(c)逆転写酵素を用いて、前記mRNAからcDNAを合成する工程と;
(d)DNAポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドの第二の集団(各オリゴヌクレオチドは、ランダムなハイブリダイズ部分及び該ハイブリダイズ部分に対して5’に位置する第二のPCR結合部位を含む。)を用いて二本鎖cDNAを合成する工程と;並びに
(e)熱安定性DNAポリメラーゼ、第一のPCRプライマー結合部位に結合する第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマー結合に結合する第二のPCRプライマーを用いて、二本鎖cDNAをPCR増幅して、増幅された二本鎖DNAを生成させる工程と、
を含む、前記方法。
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