JP2005532074A - 核酸増幅法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は核酸増幅法に関する。
WO01/06004は、試料中に存在するmRNA種に対応する配列を含有するポリヌクレオチドの数を増加する方法を開示する。該方法は、3工程、すなわち、第1のcDNA鎖を提供するための、第1のヒール化(heeled)プライマー集団を用いるmRNA種の逆転写;第2のヒール化プライマー集団を用いる、第1のcDNA鎖からの第2のcDNA鎖の合成;および第1および第2のcDNA鎖の増幅からなる。第1および/または第2工程において使用されるプライマーのヒール(heel)配列は、RNAポリメラーゼプロモーター部位を含有する。増幅に使用されるプライマーは、少なくとも、第1のヒール配列の一部および第2のヒール配列の一部を含む。該ヒール配列のいずれか、または各々は、好ましくは、低頻度制限酵素切断部位のヌクレオチド配列を含み;生産されるポリヌクレオチドはコンカテマーを含みうるが、所望のアンプリコン(amplicon)に影響を及ぼすことなく、該切断部位で切断する物質で処理することができる。
本発明は、WO01/06004において開示された手法を簡略化できることを見出したことに基づく。本発明によると、試料中に存在するmRNA種に対応する配列を含有するポリヌクレオチドの数を増加する方法は、
(i)ヒール化5’−増幅プライマー(FAP−RAND)およびヒール化3’−増幅プライマー(TAP−RT)を用いるmRNA種の逆転写(ここに、各プライマー配列は特有であって、関連するゲノムに存在せず、各ヒール配列はRNAポリメラーゼプロモーター部位を含み、FAP−RANDは可変配列を含む)により、該RNAを逆転写して二本鎖cDNAを生産し、したがって、該可変配列に応じて複数のcDNAを生産する工程;および
(ii)FAP−RANDおよびTAP−RT内のプライマー、すなわち、FAPおよびTAPに対して十分に相補的なプライマーを用いて該cDNAを増幅する工程を含む。
本発明(本明細書において「MEX」と記載される)は、少数の細胞(単一細胞レベルであってもよい)における遺伝子発現の分子分析のための技術である。MEX産物は、単一細胞PCR、サブトラクション発現ライブラリーの構築およびスクリーニング、マイクロアレイ分析および標的バリデーションを包含する多くのダウンストリーム分子技術と直接、一体化され、適合するように設計されている。
MEX段階1生産物は、cDNAプール内のMEX−RTプライミング部位の組み込みに依存し、MEX前の初めのRNA集団における転写産物と類似のサイズを有する。これは、MEXにおいて、全長cDNAが生産され、増幅されることを説明する。さらに、クローン化されたMEX産物のバイオインフォマティック分析は、100%の生産物が、転写産物(n=43)中の適当な部位にMEX−RTプライマーを含有することを示した。すなわち、3’MEXプライマーは、転写産物の3’ポリA部位に正確にプライムし、5’プライマーは転写産物の5’末端に含有される。
FAP配列−T3 RNAポリメラーゼ配列−(N)15−遺伝子X−(T)20−T7 RNAポリメラーゼ−TAP配列
MEXの力は、確実に、簡単に、再現可能に、かつ、典型的な方法で、少量のmRNAを増幅できるその能力に由来する。それにもかかわらず、該技術の真の潜在能力は、それを一連のアップストリームおよびダウンストリーム応用に結びつけることによって、最もよく理解されうる。これらは、レーザー捕獲顕微解剖(LCM)およびパッチクランプ採取(Patch Clamp Harvesting;PCH)などのアップストリーム細胞採取技術、および出発点としてMEX生産物を使用するダウンストリーム分子応用を包含する。
さらに、MEX産物は、一連のハイスループット分子技術と適合するように設計されうる。MEXプライマーにおける設計特徴は、PCRサブトラクションライブラリーの構築のためのベクター−適合性制限部位の組み込み、ならびにマイクロアレイおよびAffymetrixチップをスクリーニングするための鎖特異的プローブを生産する能力を包含する。
MEX−サブトラクションライブラリー内または未処理のMEXアンプリコンプール内に含有される生産物の集団をスクリーニングするための有効な方法は、これらの生産物をクローニングし、次いで、例えば、それらをプローブとしてガラスマイクロアレイに結合させることによって、それらを基体上に固定することによるものである。さらに、同時に、未処理のアンプリコンおよびライブラリーを標識された標的として使用して、これらおよび他のマイクロアレイをスクリーニングすることができる。
該工程において、PCR増幅に特異的なプライミング部位をcDNA集団の適当な末端に導入した。
水に溶解した10μlの全RNA(細胞/組織/レーザー捕獲顕微鏡細胞採取物から標準的な分子生物学プロトコールによって、または直接的パッチクランプ採取から調製された)を、各々10μMのFAP−RandomerおよびTAP−RT 1μlに加えた。FAP−Randomerは、ACT CCG GGA ACC ATA GTG GCA CTC CTA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAG ATC GTAC(N)15であり、その塩基1−25がプライマーを構成し、塩基26−46がT3 RNAポリメラーゼプロモーターを構成し、塩基48−51(GATC)がSau3A制限部位を構成し、塩基52−55(GTAC)がRsa1制限部位を構成する。TAP−RT配列は、CAA GCA TTC AGT ATC TCG ACT GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA GAT CGT AC(T)20であり、その塩基1−22がプライマーを構成し、塩基22−45がT7 RNAポリメラーゼプロモーターを構成し、塩基46−53が同じ制限部位を構成する。これを70℃に5分間加熱した後、氷上で2分間、snap−冷却した。
該工程において、逆転写されたMEX−RT産物を、ダウンストリーム分子応用のためにPCRによって増幅した。
5μlのRT反応物を100μl PCRにおいて、下記の試薬:10μl Advantage II PCRバッファー(Clontech)、1μlのdNTPs(各10mMのdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPの混合物)、10μMの FAP 1μl、すなわち、上記のFAp−Randomerの塩基1−25、および10μMのTAP 1μl、すなわち、上記のTAP−RTの塩基1−22、および77μlの滅菌水の添加によって増幅した。
サイクリング・パラメーターは下記の通りであった:95℃で1分間を1サイクル、次いで、95℃で15秒間、65℃で30秒間、68℃で6分間を24サイクルまで。
約100ngの全脳RNAを実施例1のMEX RT/増幅プロトコールにしたがって逆転写した。これを連続希釈し、9サイクルまたは15サイクルのMEX増幅に付した。さらに、増幅を行わなかった対照も含まれた。PCRを行って、cDNAおよびMEX増幅プール中におけるアクチンmRNA転写産物の増幅度を決定した。
アクチン転写産物は、全RNA相当量50ngの濃度でのみ、非増幅cDNA中で検出できた。転写産物は、5pg未満のcDNA濃度では検出できなかった。対照的に、アクチンは、9サイクルのMEX増幅後、0.5pgおよび15サイクルのMEX増幅後、50fgという低濃度にて、同じcDNA試料中で検出できた。
該実験は、cDNAのMEX増幅が、従来のRT PCRのみによって検出可能な範囲を越えて検出範囲を拡張することを明らかにする。
G−1培養細胞をガラス顕微鏡スライド上で生育させ、レーザー捕獲顕微解剖(LCM)のために処理した。確定数の細胞を採取し、Stratagene mico−RNA抽出キットを用いてRNA抽出した。MEX RTプライマーを用いて該RNAを逆転写し、次いで、15または21サイクルのMEX増幅に付した。また、cDNAの一部をMEX増幅を用いない分析のために保持した。MEX増幅の有効性の最終的なアッセイとして、アクチンに特異的なプライマーを用いてPCRを行った。
アクチン配列は、15サイクルのMEX増幅後、わずか50個の細胞において、および21サイクルのMEX増幅後、わずか10個の細胞において検出された。対照的に、アクチン配列は、MEXプレ増幅に付されなかった試料中において検出されなかった。これは、分子技術をLCMに結びつけるためにMEXを使用できることを明らかにする。
約100ngの全RNAをMEXプライマーを用いて逆転写し、連続希釈し、次いで、MEX増幅を3、6または9サイクル行った。これらの生産物をMegascribeキット(Ambion)を用いてイン・ビトロ転写(IVT)し、従来の(dT)18プライマーおよびSuperscripts II(Invitrogen)を用いて二度目の逆転写を行った。相対的増幅効率を測定するために、これらの生産物において、アクチン配列について遺伝子特異的なPCRを30サイクル行った。IVTと共に用いた場合、3サイクルのMEXの組み合わせが、5pgの全RNAにおいてアクチン転写物の同定を可能にするのに十分であった。IVT前に付加的な3サイクルのMEXを適用することにより、該検出領域を50fgの全RNAまで拡張できた。ちなみに、IVTを用いないで50fgのRNAにおいてアクチンの検出を可能にするには、15サイクルのMEXが必要とされた。
結論として、MEXをIVTと共に用いると、検出感度を拡張すると共に、サイクル数を最少にすることができる。これは、アンプリコンプールにおけるレプリゼンテーションの線形性を維持しながら、MEX由来のアンプリコン収量を増加させるのに重要であるかもしれない。さらに、MEX産物からRNAラン・オフが生じることにより、これらの生産物のAffymetrixおよび他のマイクロアレイ上でのプローブとしての使用が可能になる。
MEXの有用性を明らかにするために、LCMを用いて、c線維をイン・ビトロ疼痛モデルから採取した。該モデルは、神経生長因子(NGF)などのプロ侵害受容物質で処理したラット三叉神経節細胞の初代培養を基礎とした。
50個のニューロンを三叉神経節培養物から採取し、RNA抽出し、24サイクルのMEXを用いて増幅した。遺伝子特異的PCRプライマーを用いて、これらの細胞由来のいくつかのハウスキーパーおよび疼痛関連遺伝子を同定した。より詳細には、侵害受容との関連が知られた遺伝子に対するプライマーを用いて、アンプリコンプールをアッセイした。MEX増幅の前後にアンプリコンプールをアッセイしたとき、明確な差異を観察することができた。アクチンおよびシクロフィリン(actおよびcyc)などの対照遺伝子はプレ−MEXプールにおいて検出することができたが、他のあまり豊富ではない、生物学的により重要な侵害受容応答に関する遺伝子、すなわち、TrkB受容体、PN3、ナトリウムチャネルBeta3サブユニット、カルシトニン遺伝子関連タンパク質、脈管腸管ペプチド、ニューロペプチドY、ガラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼ(PN3、β3、CGRP、VIP、NPY、Gal、およびTH)は欠如していた。これは、多数のこれらのプロ−侵害受容遺伝子を容易に検出できたMEX増幅後のアンプリコンプールとは対照的であった。また、これにより、イン・ビトロ疼痛モデルが確認された。
したがって、MEXは、少数の病理学的に関連する細胞における目的遺伝子の検出に有用である。これらの遺伝子は、治療的介入のための標的として使用されうる。
MEXプライマーは、多くのダウンストリーム応用に適合するように設計された。これらは、サブトラクションPCRライブラリーの作成における使用を包含する。
少数の細胞(100ng全RNA相当量)由来のMEX産物を、神経生長因子で処理した、または非処理の三叉神経節初代培養物から増幅し、精製して、サブトラクションライブラリーの作成のための出発材料を得た。これらをサイズで選別して、小さい生産物およびプライマー配列(<50塩基対)を除去した。サブトラクションを容易にするために、リンカー分子をこれらの生産物にライゲートし(これらは、リンカー−ベース/遺伝子−ベースのPCRプライマーの組み合わせを用いることによって品質管理された)、2ラウンドの抑制PCRサブトラクションをMEXアンプリコンに適用した。これにより、最終的な順方向および逆方向のサブトラクションライブラリー対を作成した。該ライブラリーは、両サブトラクションプールに共通する「ハウスキーパー」遺伝子がサブトラクション過程の間に確実に除去されるように品質管理された。これは、サブトラクションライブラリーからのアクチン転写産物の除去によって明らかにされた。これらのライブラリーの内容物の最終的なチェックとして、生産物をクローン化し、サイズを測定した。これらのクローンのいくつかを配列決定し、差別的な発現を同定した。
したがって、MEXを用いて、少数の細胞中での遺伝子発現を分析でき、2以上の細胞型または異なる表現型を有する細胞型間で差別的に発現される遺伝子を同定することができる。
MEXを用いて、MEX逆転写された全RNA(2ng−2μg)由来の連続希釈cDNAを、15〜25サイクルのPCRサイクル範囲を用いて増幅した。同時に、同じ濃度の従来法で逆転写したRNAを同様に増幅した。PCRアンプリコンは、MEX増幅後にのみ見られた。MEX増幅は、25サイクルのPCRと組み合わせたとき、20ngというわずかな全RNAから好結果が得られた(アガロースゲル上で可視生産物の存在によって決定される場合)。
さらに、100ngの全RNAのMEX増幅後アンプリコンと10μgの非増幅全RNAとを比較すると、MEX増幅後の生産物のサイズ範囲は非増幅対照試料のそれと類似する。さらに、MEX試料中の生産物の量は、対照試料の1%から開始したにもかかわらず、増幅原料中よりも多い。
RNAの希釈物を段階1MEXまで増幅し、これらのMEX産物のアリコートを鋳型として、T3 RNAポリメラーゼを用いるIVT反応において用いた。該アプローチを用いて、MEXの感度を、〜10ng tRNAから2.5pgほどのわずかなRNAへ、3桁拡張することができる。鎖特異的プローブは、該技術を用いて作成することができる。T3 RNAポリメラーゼを用いてセンス鎖RNAを作成することができ、一方、T7を用いてアンチセンス転写物を合成することができる。
これらのIVT産物の配向は、鎖特異的プローブを含有するマイクロアレイをスクリーニングすることによって、すなわち、ガラススライドに異なるコーディネートで別々に結合させたセンスおよびアンチセンスプローブを用いて分析された。同じ段階1反応由来のアリコートをこれらのセンスおよびアンチセンス反応のための鋳型として用いたことから、予測通り、信頼できるセンスおよびアンチセンスプローブが生産されたならば、2つの標的調製物のハイブリダイゼーションパターンにおいて明らかな差異が予想されたであろう。
より詳細には、T3またはT7 RNAポリメラーゼのいずれかを用いて、段階1MEX産物をイン・ビトロで転写し、RNA逆転写し、cy3(T7)またはcy5(T3)で標識した後、鎖特異的マイクロアレイにハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションシグナルは、もっぱら、「緑色」(cy3)のみ、または「赤色」(cy5)のみであり、「黄色」スポットはあったとしてもわずかであり、それは混合したセンス/アンチセンス転写物の不適当な転写を示す。
鎖特異的転写産物が段階1MEX産物から生産されたことを説明するために、T3およびT7 IVTラン・オフ標的を生産し、各々、cy3およびcy5で標識した。これらを一緒に(T3 cy3 v T3 cy5およびT7 cy3 v T7cy5)、鎖特異的プローブからなるマイクロアレイにハイブリダイズした。両センスおよびアンチセンスプローブのチューブリンに対するハイブリダイゼーション強度を各マイクロアレイにわたって比較した。結果は、T3標的がセンス鎖プローブにハイブリダイズしたことを示し、それは、アンチセンスプローブと比較したとき、より高い蛍光シグナルを示した。これは、T7標的を用いたとき逆転した。これは、鎖特異的ハイブリダイゼーションが起こっていることを明らかにする。T3実験におけるチューブリンに対するセンスおよびアンチセンスプローブ間の強度の差は、103倍であり、T7実験においては104倍であった。
MEXの間に達成された増幅レベルを定量するために、典型的なMEX反応から生産されたRNAの量を測定した。〜45μgのポリA RNAが<5ngの投入した全RNA(〜50pgポリA RNA)から合成された。したがって、約100,000培の増幅が達成された。これは、可能な増幅レベルの粗測定値を与えるが、増幅過程の間に基本的な反応成分が枯渇するために、これは推定値未満になるようである。同時に、アンプリコンプール内の遺伝子の相対的な濃度は、リアルタイムRT−PCRによって確認された。
より詳細には、リアルタイムPCRを、2つの遺伝子、アクチンおよび高アフィニティーNGF受容体trkAについて、MEX前、段階1MEX後、および段階2MEX後の2つのバランスのとれたcDNA試料において行った。図2の2つのグラフは、Sybrグリーンアッセイによって決定されたPCR開始点を示す。2つの試料は、増幅過程を通じてこれら2つの転写産物の相対レベルを維持するが、これらが出現する相対的サイクル数は左にシフトし、これは、cDNAプールの増幅が起こったことを示し、結果として、転写産物のより早い検出をもたらす。
サブトラクションMEX産物および従来法で作成したライブラリーをクローン化し、社内で構築したマイクロアレイ上でプローブとして用いるために増幅した。該マイクロアレイを、対になったMEXにより作成されたサブトラクションライブラリーを用いてスクリーンした。実質的に直線的な関係が、ハイブリダイゼーションシグナルのグラフ解釈において見られた(ここに、各プローブは、y軸上に示されるcy3蛍光強度およびx軸上のcy5蛍光強度を用いて、単一データポイントとして示される)。
同じRNA供給源由来の2つの独立して逆転写されたRNAをMEXによって増幅し、独立して、cy3またはcy5で標識した。これらの試料を混合し、マイクロアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後の全プローブの「黄色」の性質は、各チャネルにおけるシグナルが等しかったことを示す。これは、各プローブがcy3(y軸)およびcy5(x軸)チャネルにおけるそのシグナルにしたがってプロットされたときに示され;該グラフの直線性は、同一RNA試料が別々のMEX反応において全く同じに増幅されることの証明である。これは、各反応/チャネルにおいて増幅/標識される出発材料が同一であった場合の予測された結果である。これは、MEXが増幅の間中、試料RNAレプリゼンテーションを維持することを明らかにする。
2つの別々の供給源(脳cy3および精巣cy5)由来の2つの独立して逆転写されたRNAを、MEX増幅後または増幅前に比較した。これらの試料を比較したとき、ハイブリダイゼーションパターンはほとんど同一であり、よって、増幅しても、増幅しなくても、MEXが2つのRNA供給源間のレプリゼンテーションのバランスを維持したことが明らかにされた。
同じRNA供給源の独立した逆転写由来のRNA量1μg〜1ngを、MEXおよびIVT増幅によって増幅し、cy3またはcy5のいずれかで標識した。量は下記の通りである。
1=1μg出発全脳RNA RT 250ngMEX 25ngMEX/IVT
2=10ng出発全脳RNA RT 2.5ngMEX 250pgMEX/IVT
3=1ng出発全脳RNA RT 250pgMEX 25pgMEX/IVT
これらの量は、個々の実験に使用される当初の試料の量に関係する(すなわち、RTの1/4がMEX反応に用いられ、MEX反応の1/10がIVTに用いられた)。試料間の直線的な関係は、投入RNAが非常に低濃度であってもレプリゼンテーションが維持されたことを示す。
Claims (18)
- 試料中に存在するmRNA種に対応する配列を含有するポリヌクレオチドの数を増加する方法であって、
(i)ヒール化5’−増幅プライマー(FAP−RAND)およびヒール化3’−増幅プライマー(TAP−RT)を用いるmRNA種の逆転写(ここに、各プライマー配列は特有であり、いずれかのヒール配列または両方のヒール配列はRNAポリメラーゼプロモーター部位を含み、FAPは可変配列を含む)により、該RNAを逆転写して二本鎖cDNAを生産し、したがって、該可変配列に応じて複数のcDNAを生産する工程;および
(ii)FAP−RANDおよびTAP−RT内のプライマー、すなわち、FAPおよびTAPに対して十分に相補的なプライマーを用いて該cDNAを増幅する工程を含む方法。 - さらに、(iii)アンプリコンのいずれかの末端からRNAラン・オフを生ずるためのイン・ビトロ転写工程を含む請求項1記載の方法。
- 各ヒール配列が異なるRNAポリメラーゼ部位を含む請求項1または2記載の方法。
- 鎖特異的ライブラリーを作成するための請求項3記載の方法。
- 2つの細胞集団からサブトラクションライブラリーを作成するための上記請求項のいずれか1項記載の方法。
- ポリヌクレオチド産物をクローニングし、それらをアレイに固定することを含む上記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 試料がレーザー捕獲顕微解剖由来である上記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 試料がパッチクランプ採取由来である上記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 第1および/または第2のヒール配列が切断部位のヌクレオチド配列を含む上記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 切断部位がそのヒール配列の3’末端に位置する請求項9記載の方法。
- 第1および第2のヒール化プライマーが同一の切断部位を有する請求項10記載の方法。
- 第1および第2のヒール化プライマーが異なる切断部位を有する請求項10記載の方法。
- 切断部位で切断する物質でポリヌクレオチドを処理する付加的な工程を含む請求項9〜12のいずれか1項記載の方法。
- 増幅が50サイクルまでの増幅サイクルからなる上記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 各増幅サイクルが:
(i)85℃〜97℃で一本鎖DNA分子を得る工程;
(ii)45℃〜65℃で一本鎖DNA分子をアニールする工程;および
(iii)70℃〜75℃でアニールしたDNA分子を伸長する工程
を含む請求項14記載の方法。 - 第1のヒール化プライマー集団が、5’末端から3’末端へ
(i)試料中に初めに存在するmRNA分子に対して非相補的な15〜22個のヌクレオチドからなるヒール配列;および
(ii)15〜25個のヌクレオチドからなるオリゴdT配列
を含む核酸の集団からなり、ここに、実質的に全ての可能な可変配列の組み合わせが該第1のヒール化プライマー集団において見られる、上記請求項のいずれか1項記載の方法。 - さらに、増幅後の反応混合物中に含有される少なくとも1つの核酸配列の存在を確認することを含む上記請求項のいずれか1項記載の方法。
- 確認が、
(i)特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる目的配列の検出;
(ii)特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる目的配列の増幅;および
(iii)複製および/または発現ベクター中に得られるDNA分子のクローニング
のいずれか1つを含む請求項17記載の方法。
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