CN113490751A - 核酸检测和引物设计方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于检测来自单细胞的靶核酸的方法。所述方法的优选实施方案包括在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列通常与细胞中的细胞DNA和RNA互补，所述细胞DNA包括基因组DNA。提供细胞样品，并且在优选实施方案中，所述样品来自单细胞。所述细胞被裂解，并且在单一反应中，可以检测DNA和RNA两者，而无需对所述样品进行细分。这可以通过提供与一种或多种靶核酸互补的核酸扩增引物组，特别是在扩增反应中选择性扩增特定靶核酸或扩增子的引物组来实现。还提供了用于这些方法的引物设计方法以及用于执行所述方法的设备和系统。

Description

核酸检测和引物设计方法
技术领域
本发明整体涉及检测细胞或生物体中的靶基因或核酸，更具体地涉及从单细胞中的一种或多种靶核酸中检测并识别DNA和RNA两者。
相关申请
本申请要求D.Dhingra和D.Ruff于2019年1月22日提交的题为“Method,Systemsand Apparatus for DNA and RNA Primer Design”的美国临时申请USSN 62/795,171的优先权。
背景技术
基于核酸核苷酸序列互补性的核酸分析方法可以直接分析遗传性状。因此，这些方法是识别遗传疾病、识别和监测癌症、微生物等的非常有力的手段。
当需要分析包含细胞DNA(包括基因组、染色体外、病毒和线粒体DNA)和RNA的多种靶核酸时，检测以极少量存在于样品中的靶基因或核酸(例如来自单细胞)是困难的并且变得甚至更成问题。
需要提供结合了与靶向DNA测序组合的靶向RNA测序的高通量单细胞核酸测序的方法、系统和设备。本文描述的发明满足了这些未解决的挑战和需求。
发明内容
本文描述和要求保护的发明具有多个属性和实施方案，包括但不限于在本发明内容中阐述或描述或引用的那些属性和实施方案。本文描述和要求保护的发明不限于本发明内容中识别的特征或实施方案，或受这些特征或实施方案的限制，这些特征或实施方案仅出于说明而非限制的目的包括在内。
在一方面，所公开的实施方案通常结合了与靶向DNA测序组合的靶向RNA测序。某些实施方案向单细胞测序工作流程提供基本上组合的靶向RNA测序和靶向DNA测序。在一个实施方案中，该方法基本上不需要将样品分成RNA和DNA部分。扩增产物(扩增子)在基因组与转录组之间可能有重叠覆盖。一些实施方案部分地通过选择具有特定序列或引物修饰的引物来提供选择性扩增DNA或RNA扩增子的方法。DNA和RNA扩增子也可以通过测序来区分并平衡每个扩增子的最佳测序深度。
在另一方面，提供了设计并提供用于选择性或优先扩增DNA或RNA扩增子的引物的方法。扩增引物还可以在骨架、核苷酸或其他地方包含基于序列或靶核酸类型(例如mRNA或gDNA)而影响(例如减少、阻止或限制)特定扩增子的扩增的化学修饰。
例如，在一些实施方案中，设计并提供引物，其中DNA反向引物被阻断以便在PCR之前不延伸。在其他实施方案中，DNA反向引物和正向引物被阻断。在其他实施方案中，扩增反应使DNA反向引物和正向引物被阻断，以便在PCR之前不延伸。
某些实施方案利用具有替代化学性质的固体珠粒，其中用于DNA和RNA两者的正向引物均在溶液中。在这些实施方案中，正向引物含有嵌入的PCR退火序列或‘柄(handle)’，其允许与引物杂交。柄是靶序列上游5’的特定尾部。此柄与珠粒条形码寡核苷酸互补，并充当PCR延伸桥，以将靶扩增子连接到珠粒条形码文库引物序列。固体珠包含可以与正向引物上的PCR柄退火的引物。基因特异性RNA反向引物和基因特异性DNA反向引物在溶液中。RNA反向引物可用于逆转录。在特定的实施方案中，DNA反向引物被阻断以便在PCR之前不延伸。本文描述的方法在可以产生的唯一核酸标记的数量方面实际上是不受限制的。
示例性实施方案的工作流程涉及在仪器上装载细胞以释放基因组DNA和RNA(核酸)。然后将释放的核酸引入配置用于逆转录和PCR的试剂中。在一个实施方案中，固体珠粒可用于此目的。在这里，珠粒装载有待用于DNA和RNA两者的正向引物，其中所有反向引物均在溶液中-基因特异性RNA反向引物和基因特异性DNA反向引物。RNA反向引物可用于逆转录。本文所描述的方法的高通量性质允许对数千到数百万个单细胞执行DNA和RNA的多组学分析，从而提供了一种可扩展的方法来表征大量单细胞的核酸。
在另一方面，提供了用于检测来自单细胞的靶核酸的方法。一个非限制性的代表性实施方案独立于所呈现的顺序包括多个或所有以下步骤：在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中靶核酸序列与细胞中的核酸互补；提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；将包封的细胞与液滴中的蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；提供一个或多个核酸扩增引物组，其中每个引物组与靶核酸互补并且核酸扩增引物组的至少一个引物包括条形码识别序列；执行核酸扩增反应以从单细胞的核酸形成扩增产物，其中扩增产物包括一个或多个靶核酸序列的扩增子；提供包括与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的扩增产物在足以使亲和试剂与靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触；以及通过对第一条码和第二条码进行测序来确定靶核酸的身份。
靶核酸通常是DNA或RNA。在一些实施方案中，扩增产物由DNA和RNA靶核酸序列两者产生。
某些实施方案包括添加逆转录酶聚合酶并包括从RNA靶序列产生cDNA的步骤，在此步骤中，检测并识别来自单细胞的mRNA靶核酸。
在另一实施方案中，所提供的每个引物组包括与靶核酸或其互补物互补的正向引物和反向引物。
在另一实施方案中，引物组的正向引物包括识别条形码序列。
在一个实施方案中，所提供的一个或多个核酸扩增引物组包含在添加逆转录酶之前被阻断的DNA特异性引物。此实施方案的一种实施方式包括提供在任何逆转录酶活性期间被阻断的DNA反向引物，使得仅通过RNA反向引物产生cDNA。在另一实施方式中，提供在RNA反向引物之外的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。
在一个实施方案中，靶核酸可以包括DNA和RNA两者，并且选择性扩增DNA或RNA以形成对DNA或RNA靶核酸具有特异性的扩增子产物。
在一个实施方案中，DNA或RNA扩增子在扩增期间通过使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的竞争物而被衰减、限制或阻止。
在另一实施方案中，DNA或RNA扩增子在扩增期间通过使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的生物素化引物而被衰减、限制或阻止。
在另一实施方案中，为RNA扩增而提供的扩增引物的一部分包含尿嘧啶并且能够通过裂解而去除RNA扩增子。
在另一个实施方案中，独立于所呈现的顺序，用于检测来自单细胞的靶核酸的方法包括以下步骤：在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中靶核酸序列与细胞中的基因组DNA和RNA互补；提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；将经包封的细胞与液滴中的所述蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；提供与一种或多种靶核酸互补的一个或多个核酸扩增引物组，其中核酸扩增引物组的至少一个引物包括条形码识别序列，并且其中所提供的一个或多个核酸扩增引物组包含DNA特异性引物；添加逆转录酶聚合酶并从RNA靶标产生cDNA；执行核酸扩增反应以从单细胞的所述核酸形成扩增产物，所述扩增产物包含一个或多个靶核酸序列的扩增子。
上述实施方案的实施方式还可包括：i)提供包括与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合，以及ii)使亲和试剂与具有一个或多个靶核酸序列的扩增子的扩增产物在足以使亲和试剂与靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触以及通过对第一条码和第二条码进行测序来确定靶核酸的身份。
在另一方面，提供了通过本文所描述的方法设计用于扩增靶核酸的引物的方法。不考虑顺序，用于选择性检测具有基因组DNA和mRNA两者的样品中的核酸的引物设计的示例性方法包括以下步骤：在单独的细胞中选择感兴趣的靶核酸序列，其中靶核酸序列与具有相应的潜在感兴趣的基因组DNA的潜在感兴趣的mRNA互补；选择并提供被逆转录酶阻断而不能引发和延伸的DNA反向引物；选择并提供与一种或多种靶核酸互补的一个或多个核酸扩增引物组，其中核酸扩增引物组的至少一个引物包括条形码识别序列，并且其中所提供的一个或多个核酸扩增引物组包括DNA特异性引物；以及任选地，选择并提供在待扩增的靶核酸区域中的RNA反向引物之外的DNA反向引物；以及任选地，选择并提供选择性扩增DNA或RNA扩增子的竞争性竞争物引物。
附图说明
图1示意性地说明了示例性的RNA加DNA扩增实施方案。对于文库PCR，扩增子具有相同的尾部。它们可以与其来自读段2的起始位点区分开来。可以在文库PCR期间，使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的竞争物或生物素化引物对RNA扩增子进行衰减。也可以用尿嘧啶合成一定百分比的RNA文库引物，因此我们可以通过裂解而去除RNA文库分子。
图2示意性地说明了示例性的ddNTP扩增实施方案。对于文库PCR，扩增子具有相同的尾部。它们可以与其来自读段2的起始位点区分开来。可以在文库PCR期间，使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的竞争物或生物素化引物对RNA扩增子进行衰减。也可以用尿嘧啶合成一定百分比的RNA文库引物，因此我们可以通过裂解而去除RNA文库分子。
图3示意性地说明了样品引物相互作用。如果多重化，则将发生来自新DNA引物的引物相互作用。在此图(左侧)中，显示具有THSP_APC_1_fwd的THSP_HRAS_1_fwd引物5’-(CAAATGAAAACCAAGAGAAAGAGGC SEQ ID NO:))与THSP_HRAS_1_fwd引物(GGATGTCCTCAAAGACTTGGTGT SEQ ID NO:))杂交。显示具有THSP_PTEN_2_fwd的THSP_HRAS_1_fwd引物5’-(GTAAATACATTCTTCATACCAGGACCAGAG(SEQ ID NO:))与5’-(GGATGTCCTCAAAAGACTTGGTGT(SEQ ID NO:)杂交。单独使用RNA引物观察到类似的相互作用。还显示(右侧)了RNA引物相互作用的样品。引物5’(GTAAATACATTCTTCATACCAGGACCAGAG(SEQ ID NO:)与5’-(TTTGCAGGGTATTA(SEQ ID NO:)以及5’-(CCTGTTGGACATC(SEQ ID NO:)与5’(CACCATGATGTGC SEQ ID NO:))杂交。
图4显示了示例性的正向引物设计，其中正向引物与V1化学相同，引物位于珠粒上。对于DNA和RNA，使用相同的正向引物。批量反应将使用与珠粒上的正向引物相同的尾部来执行。
图5说明了SNP检查。只有NOTCH1_1和PIK3CA_12在RNA反向引物下具有SNP。它们经过重新设计，以移动位点远离3’端。使用特定的Tm要求设计引物。逆转录酶引物被设计成具有42-48℃的范围内的Tm(图5中的下方引物)。相反的PCR引物(正向引物)被设计成具有58-64℃的范围内的更高的Tm。此过程中的第一个反应是由逆转录酶催化的，并且反应在37-50℃之间的最佳温度下进行。RNA分子只能由下方的引物引发，以产生cDNA的第一链。上方的正向引物用于产生第二链，然后两个引物都参与PCR扩增。引物设计的一个整体要求是确保与引物杂交的靶序列中不存在常见的SNP。可以针对常见的人类基因组数据库(例如UCSC基因组浏览器)筛选引物以完成此过程。图5显示了引物围绕着具有待询问的SNP的靶区的示例性设计。
图6显示了来自RNA扩增即RT-qPCR的结果。扩增反应混合物包含以下成分：5μL 2XMasterMix；0.2μL 10μM RNA rev；0.4μL 10μM fwd；0.25μL Superscript RT；1.5μL RNA；0.5μL Evagreen；0.2μL ROX；以及0.43μL水。在此图中，Y轴显示如通过荧光所测量的扩增产物量，X轴显示扩增循环数。在此实施方案中，将15ng RNA用作输入。SuperScript IV一步RT-PCR系统中使用的引物是THSP_PTEN_2RNA_rev_seq+THSP_PTEN_2_fwd_seq。随着每个qPCR循环扩增靶标，测量SYBR绿色染料荧光。qPCR循环参数显示在表中。一旦足够的PCR扩增循环产生高于检测阈值的扩增产物量，qPCR仪器(Agilent)就会显示荧光扩增曲线。当此扩增曲线穿过阈值线(Y轴)时，循环数(X轴)称为阈值循环(CT)。
图7显示了来自图6中所示RNA扩增的产物。Y轴显示了以荧光单位测量的每个峰中的扩增产物量，而X轴显示了核苷酸碱基对中扩增子的大小或长度。将来自扩增的qPCR产物在Bioanalyzer DNA 1000芯片上进行分析；1:10稀释；预期的THSP_PTEN_2RNA扩增子＝149bp。此生物分析仪显示来自大小约为149-154个碱基对的样品的单个PCR产物。
图8显示了来自第一次DNA扩增实验的结果。扩增反应混合物包含以下成分：5μL2X Platinum SuperFi RT-PCR MasterMix；0.2μL 10μM DNA rev；0.4μL 10μM fwd；1.32μLDNA；0.5μL Evagreen；0.2μL ROX；以及2.18μL水。在此图中，Y轴显示了如通过荧光所测量的扩增产物量，X轴显示了扩增循环数。在此实施方案中，将10ng DNA用作输入。使用的引物是THSP_PTEN_2DNA_rev_seq+THSP_PTEN_2_fwd_seq。SuperScript IV+Platinum SuperFiRT-PCR MasterMix。随着每个qPCR循环扩增靶标，测量SYBR绿色染料荧光。qPCR循环参数显示在表中。一旦足够的PCR扩增循环产生高于检测阈值的扩增产物量，qPCR仪器(Agilent)就会显示荧光扩增曲线。当此扩增曲线穿过阈值线(Y轴)时，循环数(X轴)称为阈值循环(CT)。
图9显示了图8的DNA扩增实验。扩增反应混合物包含以下成分：5μL 2X PlatinumSuperFi RT-PCR MasterMix；0.2μL 10μM DNA rev；0.4μL 10μM fwd；1.32μL DNA；0.5μLEvagreen；0.2μL ROX；和2.18μL水。Y轴显示了以荧光单位测量的扩增产物量，而X轴显示了核苷酸中扩增子的大小或长度。将qPCR产物在Bioanalyzer DNA 1000芯片上进行分析；1:10稀释。预期的THSP_PTEN_2DNA扩增子＝270bp。此生物分析仪显示来自大小约为270-280个碱基对的样品的单个PCR产物。
图10显示了来自第二次DNA扩增实验的结果。扩增反应混合物包含以下成分：5μL2X Platinum SuperFi RT-PCR MasterMix；0.2μL 10μM DNA rev(退火至阻断性寡核苷酸)；0.4μL 10μM fwd；1.32μL DNA；0.5μL Evagreen；0.2μL ROX；和2.18μL水。在此图中，Y轴显示了如通过荧光所测量的扩增产物量，并且X轴显示了扩增循环数。将10ng DNA用作输入。使用的引物是THSP_PTEN_2DNA_rev_seq+THSP_PTEN_2_fwd_seq+THSP_PTEN_2_DNA_阻断。SuperScript IV+Platinum SuperFi RT-PCR MasterMix。随着每个qPCR循环扩增靶标，测量SYBR绿色染料荧光。qPCR循环参数显示在表中。一旦足够的PCR扩增循环产生高于检测阈值的扩增产物量，qPCR仪器(Agilent)就会显示荧光扩增曲线。当此扩增曲线穿过阈值线(Y轴)时，循环数(X轴)称为阈值循环(CT)。
图11显示了来自图10中所示的第二次DNA扩增实验的更多结果。Y轴显示了以荧光单位测量的扩增产物量，而X轴显示了核苷酸中扩增子的大小或长度。将qPCR产物在Bioanalyzer DNA 1000芯片上进行分析；1:10稀释。预期的THSP_PTEN_2DNA扩增子–270bp。此生物分析仪显示来自大小约为270-280个碱基对的样品的单个PCR产物。
图12显示了使用dd NTP引物进行的RNA扩增。Y轴显示了如通过荧光所测量的扩增产物量，并且X轴显示了扩增循环数。将15ng RNA用作输入。使用的引物是THSP_PTEN_2DNA_rev_seq_ddNTP+THSP_PTEN_2_fwd_seq_ddNTP+THSP_PTEN_2_RNA_rev。SuperScript IV+Platinum SuperFi RT-PCR MasterMix。扩增反应混合物包含以下成分：5μL 2X PlatinumSuperFi RT-PCR MasterMix；0.2μL 10μM RNA rev引物；0.4μL 10μM fwd ddNTP引物；0.2μL 10μM DNA rev ddNTP引物；1.5μL RNA；0.25Superscript RT；0.5μL Evagreen；0.2μLROX；和2.18μL水。随着每个qPCR循环扩增靶标，测量SYBR绿色染料荧光。qPCR循环参数显示在表中。一旦足够的PCR扩增循环产生高于检测阈值的扩增产物量，qPCR仪器(Agilent)就会显示荧光扩增曲线。当此扩增曲线穿过阈值线(Y轴)时，循环数(X轴)称为阈值循环(CT)。
图13显示了来自使用图12中描述的ddNTP引物进行RNA扩增的更多结果。扩增反应混合物包含以下成分：5μL 2X Platinum SuperFi RT-PCR MasterMix；0.2μL 10μM RNArev引物；0.4μL 10μM fwd ddNTP引物；0.2μL 10μM DNA rev ddNTP引物；1.5μL RNA；0.25Superscript RT；0.5μL Evagreen；0.2μL ROX；和2.18μL 水。Y轴显示了如通过荧光所测量的扩增产物量，并且X轴显示了扩增循环数。将从扩增产生的qPCR产物在BioanalyzerDNA 1000芯片上进行分析；1:5稀释；预期的THSP_PTEN_2RNA扩增子＝149bp。此生物分析仪显示来自大小约为149个碱基对的样品的单个PCR产物。
图14显示了来自使用ddNTP引物进行DNA扩增的结果。扩增反应混合物包含以下成分：5μL Platinum SuperFi RT-PCR Master Mix；0.2μL 10μM RNA rev引物；0.4μL 10μMfwd ddNTP引物；0.2μL 10μM DNA rev ddNTP引物；1.32μL DNA；0.5μL Evagreen；0.2μLROX；和2.18μL水。Y轴显示了如通过荧光所测量的扩增产物量，并且X轴显示了扩增循环数。将10ng DNA用作输入。使用的引物是THSP_PTEN_2DNA_rev_seq ddNTP+THS P_PTEN_2_fwd_seq_ddNTP+THSP_PTEN_2_RNA_rev。SuperScrip t IV+Platinum SuperFi RT-PCRMasterMix。随着每个qPCR循环扩增靶标，测量SYBR绿色染料荧光。qPCR循环参数显示在表中。一旦足够的PCR扩增循环产生高于检测阈值的扩增产物量，qPCR仪器(Agilent)就会显示荧光扩增曲线。当此扩增曲线穿过阈值线(Y轴)时，循环数(X轴)称为阈值循环(CT)。
图15显示了来自使用图14中描绘的ddNTP引物进行DNA扩增的更多结果。扩增反应混合物包含以下成分：5μL Platinum SuperFi RT-PCR MasterMix；0.2μL 10μM RNA rev引物；0.4μL 10μM fwd ddNTP引物；0.2μL 10μM DNA rev ddNTP引物；1.32μL DNA；0.5μLEvagreen；0.2μL ROX；和2.18μL水。Y轴显示以荧光单位测量的扩增产物量，而X轴显示核苷酸中扩增子的大小或长度。将从扩增产生的qPCR产物在Bioanalyzer DNA 1000芯片上进行分析；1:5稀释；预期的THSP_PTEN_2DNA扩增子＝270bp。此生物分析仪显示来自大小约为270个碱基对的样品的单个PCR产物。
图16显示了来自使用ddNTP引物进行RNA+DNA扩增的结果。扩增反应混合物包含以下成分：5μL Superfi MasterMix；0.2μL 10μM RNA rev引物；0.4μL 10μM fwd ddNTP引物；0.2μL 10μM DNA rev ddNTP引物；1.5μL RNA；1.32DNA；0.25Superscript RT；0.5μLEvagreen；0.2μL ROX；和2.43μL水。Y轴显示了如通过荧光所测量的扩增产物量，并且X轴显示了扩增循环数。将15ng RNA和10ng DNA用作输入。使用的引物是THSP_PTEN_2DNA_rev_seq ddNTP+THSP_PTEN_2_fwd_seq_ddNTP+THSP_PTEN_2_RNA_rev。SuperScript IV+SuperFi MasterMix。随着每个qPCR循环扩增靶标，测量SYBR绿色染料荧光。qPCR循环参数显示在表中。一旦足够的PCR扩增循环产生高于检测阈值的扩增产物量，qPCR仪器(Agilent)就会显示荧光扩增曲线。当此扩增曲线穿过阈值线(Y轴)时，循环数(X轴)称为阈值循环(CT)。
图17显示了来自使用图16中所示的ddNTP引物进行RNA+DNA扩增的更多结果。Y轴显示以荧光单位测量的扩增产物量，而X轴显示核苷酸中扩增子的大小或长度。qPCR产物在Bioanalyzer DNA 1000芯片上。1:5稀释。预期的THSP_PTEN_2RNA扩增子–149bp。预期的THSP_PTEN_2DNA扩增子＝270bp。此生物分析仪显示来自大小约为149-153和270-274个碱基对的样品的PCR产物。
具体实施方式
现在将参考以下章节描述本发明的各个方面，以下章节将被理解为仅通过说明的方式提供而不构成对本发明范围的限制。
“互补性”是指核酸形成氢键或通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非传统类型与另一核酸序列杂交的能力。如本文所用，“杂交”是指分子在低、中或高度严格条件下仅与特定核苷酸序列结合、双重化或杂交，包括当所述序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时。参见例如Ausubel等人,Current Protocols In MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1993。如果多核苷酸的特定位置处的核苷酸能够与反平行DNA或RNA链中相同位置处的核苷酸形成沃森-克里克配对，则所述多核苷酸和DNA或RNA分子在所述位置处彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可以彼此杂交或退火以影响所需过程的核苷酸占据时，多核苷酸和DNA或RNA分子彼此“基本互补”。互补序列是能够在严格条件下退火以提供用作互补链的合成起点的3'-末端的序列。
本领域已知的“同一性”是两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定。在本领域中，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，如通过这些序列的串之间的匹配所确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法来计算，所述方法包括但不限于在Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M StocktonPress,New York,1991；以及Carillo,H.和Lipman,D.,Siam J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些。此外，可以从使用Vector NTI Suite 8.0(Informax,Frederick,Md.)的AlignX组件的默认设置产生的氨基酸和核苷酸序列比对中获得同一性百分比值。确定同一性的优选方法被设计成在测试的序列之间提供最大匹配。确定同一性和相似性的方法编入公开可用的计算机程序中。确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.215:403-410(1990))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.,等人,NCBINLM NIH Bethesda,Md.20894:Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。众所周知的史密斯沃特曼算法(Smith Waterman algorithm)也可用于确定同一性。
术语“扩增(amplify/amplifying/)”、“扩增反应”或“NAAT”及其变体通常是指任何动作或过程，由此至少一部分核酸分子(称为模板核酸分子)被复制或复制到至少一个额外的核酸分子中。额外的核酸分子任选地包括与模板核酸分子的至少一些部分基本上相同或基本上互补的序列。模板核酸分子可以是单链或双链的，并且另外的核酸分子可以独立地是单链或双链的。在一些实施方案中，扩增包括用于产生核酸分子的至少一些部分的至少一个拷贝或产生与核酸分子的至少一些部分互补的核酸序列的至少一个拷贝的模板依赖性体外酶催化反应。扩增任选地包括核酸分子的线性或指数复制。在一些实施方案中，使用等温条件执行这种扩增；在其他实施方案中，这种扩增可包括热循环。在一些实施方案中，扩增是包括在单个扩增反应中同时扩增多个靶序列的多重扩增。至少一些靶序列可以位于包括在单个扩增反应中的相同核酸分子或不同靶核酸分子上。在一些实施方案中，“扩增”包括单独或组合扩增基于DNA和RNA的核酸的至少一些部分。扩增反应可以包括单链或双链核酸底物，并且可以进一步包括本领域普通技术人员已知的任何扩增过程。在一些实施方案中，扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。在本发明中，使用术语核酸的“合成”和“扩增”。本发明中的核酸合成是指核酸从用作合成起点的寡核苷酸伸长或延伸。如果不仅这种合成而且其他核酸的形成以及这种形成的核酸的伸长或延伸反应连续发生，则这一系列反应统称为扩增。通过所采用的扩增技术产生的多核酸通常称为“扩增子”或“扩增产物”。
多种核酸聚合酶可用于本文提供的某些实施方案中使用的扩增反应中，包括可催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。这种核苷酸聚合可以模板依赖性方式发生。这些聚合酶可包括但不限于天然存在的聚合酶及其任何亚基和截短物、突变体聚合酶、变体聚合酶、重组、融合或以其他方式工程化的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或组装体，以及其保留催化这种聚合的能力的任何类似物、衍生物或片段。任选地，聚合酶可以是包含一个或多个突变的突变体聚合酶，所述突变涉及用其他氨基酸替换一个或多个氨基酸、从聚合酶中插入或删除一个或多个氨基酸、或连接两个或更多个聚合酶的部分。通常，聚合酶包含一个或多个活性位点，在所述位点处可以发生核苷酸结合和/或对核苷酸聚合的催化。一些示例性的聚合酶包括但不限于DNA聚合酶和RNA聚合酶。如本文所用，术语“聚合酶”及其变体还包括融合蛋白，所述融合蛋白包含至少两个相互连接的部分，其中第一部分包含可催化核苷酸聚合成核酸链的肽并连接至包含第二多肽的第二部分。在一些实施方案中，第二多肽可包括报告酶或加工性增强结构域。任选地，聚合酶可以具有5'核酸外切酶活性或末端转移酶活性。在一些实施方案中，聚合酶可以任选地被重新激活，例如通过使用热量、化学物质或将新的量的聚合酶重新添加至反应混合物中。在一些实施方案中，聚合酶可以包括热启动聚合酶或基于适体的聚合酶，其任选地可以被重新激活。
术语“靶引物”或“靶特异性引物”及其变型是指与结合位点序列互补的引物。靶引物通常是单链或双链多核苷酸，通常是寡核苷酸，其包括至少一个与靶核酸序列至少部分互补的序列。‘竞争物’可以具有互补或部分互补的序列作为靶引物或靶特异性引物，并且其可以在核酸或核苷酸中并入修饰。竞争物通常与另一种引物竞争结合扩增子中的靶核酸或靶核酸序列，并且因此可以增强或选择对扩增反应中特定扩增子的扩增。在多重PCR扩增过程期间，可以使用竞争物来淬灭特异性产物形成。
“正向引物结合位点”和“反向引物结合位点”是指模板DNA和/或扩增子上正向和反向引物所结合的区域。引物用于界定在扩增期间呈指数扩增的原始模板多核苷酸的区域。在一些实施方案中，额外引物可以与正向引物和/或反向引物的5'的区域结合。在使用此类额外引物的情况下，正向引物结合位点和/或反向引物结合位点可涵盖这些额外引物的结合区以及引物本身的结合区。例如，在一些实施方案中，所述方法可以使用一个或多个与位于正向和/或反向引物结合区的5'的区域结合的额外引物。例如，在WO0028082中公开了这种方法，其公开了“置换引物”或“外引物”的用途。
可以将条形码序列并入微流体珠粒中，以用相同的序列标签装饰珠粒。可将此类标记的珠粒插入微流体液滴中，并通过液滴PCR扩增，用唯一的珠粒条形码标记每个靶扩增子。此类条形码可用于识别源于扩增子群的特定液滴。当将包含单个单独细胞的微流体液滴与另一个含有标记珠粒的微流体液滴组合时，可以使用这种方案。在收集和组合多个微流体液滴后，扩增子测序结果允许将每个产物分配给唯一的微流体液滴。在一典型的实施方式中，我们使用Mission Bio Tapestri珠粒上的条形码来标记，然后识别每个液滴的扩增子内容。条形码的用途描述于Abate,A.等人于2018年3月29日提交的题为‘Sequencingof Nucleic Acids via Barcoding in Discrete Entities’的美国专利申请序列号15/940,850中，所述申请通过引用并入本文。
条形码还可以包含‘唯一识别序列’(UMI)。UMI是具有可用于识别和/或区分与UMI缀合的一个或多个第一分子与一个或多个第二分子的序列的核酸。UMI通常很短，例如长度约为5至20个碱基，并且可以与一种或多种感兴趣的靶分子或其扩增产物缀合。UMI可以是单链或双链的。在一些实施方案中，核酸条形码序列和UMI两者都被并入核酸靶分子或其扩增产物中。通常，UMI用于区分群体或群组内相似类型的分子，而核酸条形码序列用于区分群体或分子群组。在使用UMI和核酸条形码序列两者的一些实施方案中，UMI的序列长度比核酸条形码序更短。
当用于指两个或更多个核酸序列时，如本文所用的术语“同一性”和“相同的”及其变体是指两个或更多个序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列相似性。在两个或更多个同源序列的情形中，序列或其子序列的同一性或同源性百分比指示所有单体单元(例如，核苷酸或氨基酸)相同(即约70％同一性，优选地75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性)。当在比较窗口上进行最大对应性的比较和比对时，同一性百分比可以在规定的区域内，或者如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下文描述的默认参数或通过手动比对和目视检查所测量的指定区域内。当在氨基酸水平或核苷酸水平上有至少85％同一性时，序列被称为“基本相同”。优选地，同一性存在于长度为至少约25、50或100个残基的区域内，或跨越至少一个比较序列的全长。确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的典型算法是BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)中。其他方法包括Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)和Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)等的算法。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其互补物在严格杂交条件下彼此杂交。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸的生物聚合物，并且除非上下文另有说明，否则包括修饰的和未修饰的核苷酸，以及DNA和RNA两者，以及修饰的核酸骨架。例如，在某些实施方案中，核酸是肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。通常，本文所描述的方法使用DNA作为核酸模板以执行扩增。然而，其核苷酸被来自天然DNA或RNA的人工衍生物或修饰的核酸替换的核酸也包括在本发明的核酸中，只要其用作用于合成互补链的模板。本发明的核酸通常含于生物样品中。生物样品包括动物、植物或微生物组织、细胞、培养物和分泌物，或其提取物。在某些方面，生物样品包括细胞内寄生基因组DNA或RNA，例如病毒或支原体。核酸可以源自含于所述生物样品中的核酸。例如，基因组DNA或从mRNA合成的cDNA，或基于源自生物样品的核酸扩增的核酸优选用于所描述的方法中。除非另有说明，每当表示寡核苷酸序列时，应理解核苷酸呈从左到右的5'至3'顺序，“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。寡核苷酸被称为具有“5'端”和“3'端”，因为单核苷酸通常通过将一个核苷酸的5'磷酸或等效基团连接至其相邻核苷酸的3'羟基或等效基团上，任选地通过磷酸二酯或其他合适的键合而反应形成寡核苷酸。
示例性实施方案中的模板核酸是在核酸扩增技术中用作用于合成互补链的模板的核酸。具有与模板互补的核苷酸序列的互补链具有与模板对应的链的含义，但两者之间的关系仅是相对的。也就是说，根据本文所描述的方法，合成为互补链的链可以再次充当模板。也就是说，互补链可以成为模板。在某些实施方案中，模板源自生物样品，例如植物、动物、病毒、微生物、细菌、真菌等。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，例如人类患者。模板核酸通常包含一种或多种靶核酸。示例性实施方案中的靶核酸可包含可根据本公开扩增或合成的任何单链或双链核酸序列，包括怀疑或预期存在于样品中的任何核酸序列。
本文实施方案中使用的引物和寡核苷酸包含核苷酸。核苷酸包含任何化合物，包括但不限于任何天然存在的核苷酸或其类似物，其可以选择性地结合聚合酶或被聚合酶聚合。通常，但不是必须地，核苷酸与聚合酶的选择性结合之后是核苷酸被聚合酶聚合成核酸链；然而，有时核苷酸可能会从聚合酶解离而不会并入核酸链中，此事件在本文中称为“非生产性”事件。此类核苷酸不仅包括天然存在的核苷酸，还包括任何类似物，无论其结构如何，其可以选择性地结合聚合酶或被聚合酶聚合。虽然天然存在的核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸部分，但本公开的核苷酸可包括缺少任何一种、一些或所有此类部分的化合物。例如，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施方案中，磷链可连接至糖环的任何碳，例如5'碳。磷链可以通过中间的O或S连接至糖。在一个实施方案中，链中的一个或多个磷原子可以是具有P和O的磷酸基团的一部分。在另一实施方案中，链中的磷原子可以与中间的O、NH、S、亚甲基、取代的亚甲基、亚乙基、取代的亚乙基、CNH2、C(O)、C(CH2)、CH2CH2或C(OH)CH2R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)连接在一起。在一个实施方案中，链中的磷原子可以具有含O、BH3或S的侧基。在磷链中，具有除O之外的侧基的磷原子可以是取代的磷酸基团。在磷链中，具有除O之外的中间原子的磷原子可以是取代的磷酸基团。核苷酸类似物的一些实例描述于Xu的美国专利号7,405,281中。
在一些实施方案中，核苷酸包含标记并且在本文中称为“标记的核苷酸”；标记的核苷酸的标记在本文中称为“核苷酸标记”。在一些实施方案中，标记可以是连接到末端磷酸基团(即，离糖最远的磷酸基团)的荧光部分(例如，染料)、发光部分等的形式。可用于所公开的方法和组合物中的核苷酸的一些实例包括但不限于核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、多磷酸核糖核苷酸、多磷酸脱氧核糖核苷酸、修饰的多磷酸核糖核苷酸、修饰的多磷酸脱氧核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、金属核苷、膦酸核苷和修饰的磷酸-糖骨架核苷酸、上述化合物的类似物、衍生物或变体等。在一些实施方案中，核苷酸可包含非氧部分，例如硫代或硼烷部分，以代替桥接核苷酸的α磷酸和糖、或核苷酸的α和β磷酸、或核苷酸的β和γ磷酸、或核苷酸的任何其他两种磷酸之间、或其任意组合的氧部分。“核苷酸5'-三磷酸”是指在5'位置处具有三磷酸酯基的核苷酸，有时也表示为“NTP”、或“dNTP”和“ddNTP”，以特别指出核糖的结构特征。三磷酸酯基可以包括对各种氧的硫取代，例如α-硫代核苷酸5'-三磷酸。有关核酸化学的综述，参见：Shabarova,Z.和Bogdanov,A.Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,VCH,New York,1994。
可以使用任何核酸扩增方法，例如基于PCR的测定，例如定量PCR(qPCR)，可以用于检测离散实体或其一种或多种组分，例如包封在其中的细胞中存在的某些感兴趣的核酸，例如基因。此类测定可应用于微流体装置或其一部分或任何其他合适位置内的离散实体。此类基于PCR的测定的条件可以包括随时间检测核酸扩增并且可以一种或多种方式变化。
可以添加到微滴中的PCR引物的数量可能会有所不同。可以添加到微滴中的PCR引物的数量可以在约1至约500个或更多个，例如约2至100个引物、约2至10个引物、约10至20个引物、约20至30个引物、约30至40个引物、约40至50个引物、约50至60个引物、约60至70个引物、约70至80个引物、约80至90个引物、约90至100个引物、约100至150个引物、约150至200个引物、约200至250个引物、约250至300个引物、约300至350个引物、约350至400个引物、约400至450个引物、约450至500个引物或约500个引物或更多个引物的范围内。
引物组的一个或两个引物可以包含条形码序列。在一些实施方案中，一个或两个引物包含条形码序列和唯一分子标识符(unique molecular identifier；UMI)。在使用UMI和核酸条形码序列两者的一些实施方案中，在并入核酸条形码序列之前将UMI并入靶核酸或其扩增产物中。在使用UMI和核酸条形码序列两者的一些实施方案中，在将UMI并入靶核酸或其扩增产物之后，将核酸条形码序列并入UMI或其扩增产物中。
引物可以含有用于一种或多种感兴趣的核酸(例如一种或多种感兴趣的基因)的引物。添加的用于感兴趣基因的引物的数量可以是约1至500个，例如约1至10个引物、约10至20个引物、约20至30个引物、约30至40个引物、约40至50个引物、约50至60个引物、约60至70个引物、约70至80个引物、约80至90个引物、约90至100个引物、约100至150个引物、约150至200个引物、约200至250个引物、250至300个引物、约300至350个引物、约350至400个引物、约400至450个引物、约450至500个引物或约500个引物或更多个引物。引物和/或试剂可以在一个步骤中或在一个以上步骤中添加至离散实体，例如微滴。例如，可以在两个或更多个步骤、三个或更多个步骤、四个或更多个步骤或五个或更多个步骤中添加引物。无论引物是在一个步骤中还是一个以上步骤中添加，其都可以在添加裂解剂之后、在添加裂解剂之前或与添加裂解剂同时添加。当在添加裂解剂之前或之后添加时，可以在与添加裂解剂分开的步骤中添加PCR引物。在一些实施方案中，离散实体(例如微滴)可以在添加PCR试剂之前经历稀释步骤和/或酶灭活步骤。此类方法的示例性实施方案描述于PCT公开号WO 2014/028378中，其公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。
用于扩增靶核酸的引物组通常包括与靶核酸或其互补物互补的正向引物和反向引物。在一些实施方案中，可以在单个扩增反应中使用多个靶标特异性引物对执行扩增，其中每个引物对包括正向靶标特异性引物和反向靶标特异性引物，其中每个引物包括至少一个与样品中的相应靶序列基本上互补或基本相同的序列，并且每个引物对具有不同的相应靶序列。因此，本文中的某些方法用于检测或识别来自单细胞样品的多个靶序列。
引物可以被设计成仅选择性扩增DNA或RNA靶序列。例如，引物组的一个或两个引物可以具有防止由特定聚合酶进行延伸的修饰。例如，引物组的一个或两个引物可以包含DNA特异性引物，所述引物在作为检测或扩增方法中的步骤添加逆转录酶之前被阻断，使得仅通过RNA反向引物延伸cDNA。在另一实施方式中，提供在RNA反向引物之外的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。
在一个实施方案中，靶核酸可以包括DNA和RNA两者，并且选择性扩增DNA或RNA以形成对DNA或RNA靶核酸具有特异性的扩增子产物。在本发明的实施方案的某些实施方式中，DNA或RNA扩增子在扩增期间被减弱、限制或阻止。一些实施方案使用选择性修饰DNA或RNA扩增子的扩增的竞争物。其他实施方案使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的生物素化引物。在本发明的实施方案的某些实施方式中，为RNA扩增而提供的扩增引物的一部分包含尿嘧啶并且能够通过裂解而去除RNA扩增子。
可以使用多种方法来阻断特定引物的延伸，例如在反应的特定部分期间。这些包括修饰、间隔区和其他非天然寡核苷酸引物。在某些实施方式中，阻断性寡核苷酸是具有/3SpC3/的DNA反向引物GSP区域的反向互补物，以阻断任何延伸。
在某些实施方式中，ddNTP错配引物是正向引物和添加/3ddC/的DNA反向引物，以阻断延伸，直到热启动温聚合酶(Hotstart polymerase)被激活。如果引物后面的C不是错配，则添加A/3ddC/。这些ddNTP错配引物与RNA反向引物一起在ThermoFisher多重引物分析中进行测试和分析，以确认没有引物相互作用，其中如果热启动聚合酶在室温下保留3'至5'核酸外切酶活性，则其可以在逆转录过程中修复。双脱氧C是唯一可用的双脱氧IDT。替代实施方案利用TdTon ddNTPsin 4池。
根据本发明的方法开发的一些示例性引物组显示在下表中。
表I–为可行性研究而开发的引物组，显示了基因特异性部分
Figure BDA0003217827060000211
Figure BDA0003217827060000221
表2–RNA反向引物。
Figure BDA0003217827060000222
表3A–引物序列
Figure BDA0003217827060000223
Figure BDA0003217827060000231
表3B–引物序列
Figure BDA0003217827060000232
Figure BDA0003217827060000241
Figure BDA0003217827060000251
表4–引物序列
Figure BDA0003217827060000252
Figure BDA0003217827060000261
本发明的其他方面可以描述于以下示例性实施方案中：
1.一种组合物或系统，其用于执行本文所描述的方法。
2.根据实施方案1所述的组合物或系统，其包含一个或多个核酸扩增引物组，其中每个引物组与靶核酸互补并且核酸扩增引物组的至少一个引物包含条形码识别序列。
3.根据实施方案1所述的组合物或系统，其包含含有与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合。
4.一种转录组文库，其根据本文所描述的方法产生。
5.一种基因组和转录组文库，其根据本文所描述的方法产生。
6.一种试剂盒或设备，其用于执行本文所描述的方法。
7.一种系统，其用于执行本文所描述的方法。
8.根据实施方案1所述的组合物或系统，其中靶核酸是DNA或RNA。
9.根据实施方案1所述的组合物或系统，其中DNA和RNA扩增产物均由靶核酸序列产生。
10.根据实施方案1所述的组合物或系统，其另外包含逆转录酶聚合酶。
11.根据实施方案1所述的组合物或系统，其另外包含被阻断的DNA反向引物。
12.根据实施方案1所述的组合物或系统，其包含在RNA反向引物之外的DNA反向引物。
13.根据实施方案1所述的组合物或系统，其包含选择性调节DNA或RNA扩增子扩增的竞争物。
14.根据实施方案1所述的组合物或系统，其包含选择性扩增DNA或RNA扩增子的生物素化引物。
15.根据实施方案1所述的组合物或系统，其中为RNA扩增而提供的文库引物的一部分包含尿嘧啶并且能够通过裂解而去除RNA扩增子。
16.根据实施方案1所述的组合物或系统，其中每个引物组包含与靶核酸或其互补物互补的正向引物和反向引物。
包括以下实施例以进行说明而非限制。
实施例1：
引物设计
最初设计了10个现有肿瘤热点基因试剂盒(tumor hotspot panel)扩增子的RNA反向引物，选择在通用人类参考RNA中表达的基因。相应的正向引物和DNA反向引物、3’端带有ddNTP错配的正向引物和DNA反向引物、DNA正向引物的阻断性寡核苷酸以及其他引物均获自。用SYBR或EvaGreen执行qPCR测定以确定这些引物的扩增效率。通用人类参考RNA得自Agilent(Santa Clara,CA)，而Promega男性DNA得自Promega(Madison,WI)以批量执行这些测定。我们使用的模板包括RNA、DNA和RNA+DNA(比例为10比6.6)，所有的退火温度均为60C。
在仪器外执行逆转录，然后在qPCR仪器(Agilent,Santa Clara,CA)上扩增样品。我们观察到Ct测量值回到报告的通用人类参考RNA的基因表达。逆转录最初以SuperScript开始，然后用Platinum HiFi Taq向条形码反应添加等分试样。一旦证明可行性，我们针对RT和Kapa2G或其他多重高保真聚合酶以及RT-PCR主混合物(例如SuperScript IV一步RT-PCR系统)测试了WarmStart Rtx。在对单细胞进行测试之前，此测定用于优化缓冲液组成，并入预期体积的细胞裂解缓冲液。
RT-SuperScript III
Figure BDA0003217827060000281
加热至65C持续5分钟，冰1分钟
Figure BDA0003217827060000283
45C(对于GSP推荐55C)30-60分钟，70C 15分钟
Figure BDA0003217827060000282
Figure BDA0003217827060000291
Figure BDA0003217827060000292
在此实施方案中，RNA反向引物被设计成在约45℃或低于约45℃下引发。这将允许在逆转录所需的温度下进行基因特异性引发，并且在条形码PCR期间使用的较高退火温度期间使基因特异性基因组DNA引发最小化。由于RNA反向引物都具有在所有反向引物上发现的条形码测序接合体(PCR柄)尾部，因此其能够在较高的条形码PCR退火温度下引发对cDNA，但不能引发乳液中存在的gDNA。
对于此实施方案，使用了来自AML(肿瘤热点基因试剂盒)的扩增子。整个DNA扩增子都在一外显子内。在此实施方案中，相同的正向引物设计和DNA反向引物设计用于DNA扩增子。RNA扩增子也可以使用相同的正向引物。使用输入DNA扩增子并修剪DNA反向引物的IDT PrimerQuest工具来设计RNA反向引物。这是为了扩增与DNA扩增子相同的区域，但DNA反向引物将无法在条形码PCR循环期间扩增cDNA。PrimerQuest中使用的Tm参数最低为45C，最佳为45C，并且最高为50C。最小长度降低至12nt，最佳为20nt，并且还选择靶向区域在输入的最后40个碱基内。我们还设计了引物，我们从这些设计的5'端剪去-2到4个碱基，以将Tm降低至低于PrimerQuest所允许的水平。
使用IDT发夹工具查看潜在RNA反向引物的二级结构，并且确认不存在有问题的二级结构。然后使用NCBI Blast将这些引物针对人类基因组和转录组进行Blast，以验证是否列出了预期的基因或转录物。
一旦为靶标选择了潜在的RNA反向引物，就将RNA反向引物和正向引物的引物对输入曼彻斯特大学(University of Manchester)SNPcheck3，以确认一般人群中不存在可能影响杂交或延伸的预期SNV。重新设计了在3'端最后4个碱基内具有SNP的任何引物。
然后将RNA反向和正向引物输入NCBI Primer Blast工具中，以确定任何脱靶效应。重新设计了具有长度可以与预期产物竞争或没有错配的脱靶扩增子的任何引物组。
也将具有尾部的整组引物输入Thermo Fisher多重引物分析仪工具中，以确认尾部序列不应发生引发。
一些实施方案进一步针对使脱靶效应和引物相互作用最小化。在这些实施方案中，阻断性寡核苷酸可用于抑制DNA反向聚合酶在逆转录期间杂交，合成cDNA或产生引物假象。这些阻断性寡核苷酸可被设计成与DNA反向引物的基因特异性引物部分杂交并具有3’C3间隔区。由于此基因特异性引发区的Tm约为60C，因此阻断性寡核苷酸在逆转录期间可能不会变性。
在其他实施方案中，使用高保真聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性来避免DNA反向引物和正向引物在逆转录期间的任何延伸。获得在3’端上具有错配ddNTP的DNA反向引物和正向引物。每个正向引物和DNA反向引物都用双脱氧C排序，除非其与插入片段的第一个碱基匹配。在这些情况下，在双脱氧C之前添加A。
用于设计RNA引物的方法的示例性实施方案包括以下一般过程和步骤：
a.从DNA引物将扩增RNA的肿瘤热点基因试剂盒中选择扩增子
b.从肿瘤热点基因试剂盒中取出扩增子序列，去除DNA反向引物序列，并且使用IDT Primer Quest设计RNA反向引物
c.选择Tm为约45C-50C，在一些实施方案中最佳为45C的引物
d.选择长度约为12-30nt，在一些实施方案中最佳为20nt的引物
e.使用NCBI blast验证RNA引物序列具有所列出的预期基因
f.使用IDT发夹工具确保没有二级结构
g.如果可能，使用曼彻斯特大学SNPcheck3确认反向引物的3'端的5个碱基内没有SNP。
h.使用Thermo Fisher多重引物分析仪预测引物相互作用
i.使用NCBI Primer Blast验证每个引物对的特异性
j.添加尾部并使用IDT发夹工具重新检查二级结构，并且使用Thermo Fisher多重引物分析法重新检查引物相互作用。具有RNA反向引物的二级结构在PCR盐条件下优选具有<50C的Tm。
实施例II
聚合酶核酸外切酶活性和延伸阻断实验
在热启动后，测试高保真聚合酶，以确定其是否可以在引物杂交后去除ddNTP错配。逆转录酶不具有在较低温度反应期间修复这些寡核苷酸的3'-5’核酸外切酶活性。低温反应期间的任何引物相互作用都会在热启动期间与gDNA一起变性。
在存在RNA、DNA以及DNA和RNA的情况下测试DNA引物。使用Platinum SuperFi DNA聚合酶，我们观察到以DNA以及DNA和RNA作为输入的预期的DNA扩增子。SuperFi聚合酶能够去除两个引物上的ddCTP并继续将核苷酸并入以产生预期的扩增子。使用高保真PlatinumTaq DNA聚合酶，采用用传统引物产生DNA扩增子的条件，当使用具有ddNTP的引物时，未观察到DNA扩增子。阻断的DNA反向引物和阻断的正向引物也在存在RNA、DNA以及DNA和RNA的情况下用RNA反向引物进行了测试。使用SuperScript IV一步RT-PCR系统进行逆转录和PCR，我们观察到存在RNA时的预期RNA扩增子、存在DNA时的预期DNA扩增子、存在DNA和RNA时的预期DNA和RNA扩增子，以及在NTC中没有扩增子。
在代表另一实施方案的另一实验中，在逆转录期间用DNA反向引物的3'端上的3-O-硝基苄基阻断DNA引物的延伸。此部分是可光裂解的并且可以在工作流程中的UV步骤期间去除。可以在UV处理之前执行逆转录，然后执行条形码PCR。3-O-硝基苄基dATP是可商购的。
在代表另一实施方案的另一实验中，在逆转录期间中用DNA反向引物的3'端的3-O-硝基苄基测试阻断DNA引物的延伸。此部分是可光裂解的并且可以在工作流程中的UV裂解步骤期间去除。在此实施方案中，DNA反向引物可以用此3'光可裂解部分进行测试，并执行逆转录，然后执行UV处理，再执行条形码PCR。在此实施方案中，当使用UV处理时，预期会出现DNA扩增子，而在不执行UV裂解时，将没有产物。
本文引用或提及的所有专利、出版物、科学文章、网站以及其他文件和材料表明了本发明所属领域的技术人员的技能水平，并且每个这样的引用文件和材料据此通过引用并入，其程度与将其整体通过引用单独并入或在本文整体阐述的程度相同。申请人保留将来自任何此类专利、出版物、科学文章、网站、电子可用信息和其他参考材料或文件的任何和所有材料及信息实际并入本说明书中的权利。
本文描述的具体方法和组合物代表了优选的实施方案并且是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。考虑到本说明书，本领域技术人员将想到其他目的、方面和实施方案，并且涵盖在由权利要求书的范围限定的本发明的精神内。对本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文说明性地描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开为必要条件的任何一个或多个要素或者一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，在本文的每个实例中，在本发明的实施方案或实例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可以用说明书中的其他两个术语中的任何一个来替换。此外，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地而非限制地解读。本文说明性描述的方法和过程可以按不同的步骤顺序适当地实践，并且其不必限于本文或在权利要求书中所指示的步骤顺序。应该指出，如本文和在所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。在任何情况下，本专利都不应被解释为限于本文具体公开的具体实施例或实施方案或方法。在任何情况下，本专利都不应被解释为受任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员做出的任何陈述的限制，除非在申请人的书面答复中具体地并且不带有限制或保留地明确地采用这种陈述。
所采用的术语和表述作为说明性而非限制性的术语使用，并且不希望在此类术语和表述的使用中排除所示出和描述的特征的任何等价物或其部分，但应当认识到，在要求保护的本发明的范围内，多种修改是可能的。因此，将理解的是，虽然本发明通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开，但是对本文公开的概念的修改和变化可以由本领域技术人员采取，并且此类修改和变化被认为是在由所附权利要求限定的本发明的范围内。
在本文已经宽泛地并一般地描述了本发明。落入一般性公开内容内的每个较窄的种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括具有附带条件或否定限制的本发明的一般性描述，从而从种属中去除任何主题，而不管删除的材料在本文中是否进行了具体叙述。
其他实施方案在以下权利要求书内。此外，在根据马库什群组(Markush group)描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，因此也根据马库什组的任何单个成员或成员子组来描述本发明。

Claims (20)

1.一种用于检测来自单细胞的靶核酸的方法，所述方法独立于所呈现的顺序包括以下步骤：
i)在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列与细胞中的核酸互补；
ii)提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；
iii)将经包封的细胞与液滴中的所述蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；
iv)提供一个或多个核酸扩增引物组，其中每个引物组与靶核酸互补并且核酸扩增引物组的至少一个引物包含条形码识别序列；
v)执行核酸扩增反应以从单细胞的所述核酸形成扩增产物，所述扩增产物包含一个或多个靶核酸序列的扩增子；
vi)提供包含与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与所述识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；
vii)使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的所述扩增产物在足以使所述亲和试剂与所述靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触；以及
viii)通过对第一条码和第二条码进行测序来确定所述靶核酸的身份。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是DNA或RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中DNA和RNA扩增产物均由所述靶核酸序列产生。
4.根据权利要求1所述的方法，其包括添加逆转录酶聚合酶并包括从RNA靶序列产生cDNA的步骤，在此步骤中，检测并识别来自单细胞的RNA靶核酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所提供的所述一个或多个核酸扩增引物组包含在添加逆转录酶之前被阻断的DNA特异性引物。
6.根据权利要求5所述的方法，其包括提供在任何逆转录酶活性期间被阻断的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。
7.根据权利要求1所述的方法，其包括在所述RNA反向引物之外的DNA反向引物，使得cDNA仅通过RNA反向引物延伸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸可以包括DNA和RNA两者，并且选择性扩增DNA或RNA以形成对DNA或RNA靶核酸具有特异性的扩增子产物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在形成细胞裂解物之后通过加热使步骤iii)中的所述蛋白酶失活。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增期间通过使用选择性调节DNA或RNA扩增子扩增的竞争物来衰减、限制或阻止DNA或RNA扩增子。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增期间通过使用选择性扩增DNA或RNA扩增子的生物素化引物来衰减、限制或阻止DNA或RNA扩增子。
12.根据权利要求1所述的方法，其中为RNA扩增而提供的文库引物的一部分包含尿嘧啶并且能够通过裂解而去除RNA扩增子。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤iv)中，每个引物组包含与靶核酸或其互补物互补的正向引物和反向引物。
14.根据权利要求12所述的方法，其中正向引物包含识别条形码序列。
15.一种用于检测来自单细胞的靶核酸的方法，所述方法独立于所呈现的顺序包括以下步骤：
i)在单独的细胞中选择一个或多个感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列与细胞中的细胞DNA和RNA互补；
ii)提供具有多个单独的单细胞的样品；将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；
iii)将经包封的细胞与液滴中的所述蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；
iv)提供与一种或多种靶核酸互补的一个或多个核酸扩增引物组，其中核酸扩增引物组的至少一个引物包含条形码识别序列，并且其中所提供的一个或多个核酸扩增引物组包含DNA特异性引物；
v)添加逆转录酶聚合酶并从RNA靶标产生cDNA；以及
vi)执行核酸扩增反应以从单细胞的所述核酸形成扩增产物，所述扩增产物包含一个或多个靶核酸序列的扩增子。
16.根据权利要求15所述的方法，其还包括提供包含与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与所述识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合。
17.根据权利要求16所述的方法，其还包括使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的所述扩增产物在足以使所述亲和试剂与所述靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触，以及通过对所述第一条码和第二条码进行测序来确定所述靶核酸的身份。
18.一种用于选择性检测包含细胞DNA和RNA两者的样品中的核酸的引物设计方法，所述方法包括：i)在单独的细胞中选择感兴趣的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列与具有相应的潜在感兴趣的细胞DNA的潜在感兴趣的RNA互补；ii)选择并提供被逆转录酶阻断而不能引发和延伸的DNA反向引物；iii)选择并提供与一种或多种靶核酸互补的一个或多个核酸扩增引物组，其中核酸扩增引物组的至少一个引物包含条形码识别序列，并且其中所提供的一个或多个核酸扩增引物组包含DNA特异性引物；iv)任选地，选择并提供在待扩增的靶核酸区域中的RNA反向引物之外的DNA反向引物；以及v)任选地，选择并提供选择性扩增DNA或RNA扩增子的竞争性竞争物引物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中正向引物包含识别条形码序列。
20.根据权利要求18所述的方法，其中设计所述引物以扩增DNA和RNA靶核酸序列两者。
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