JPWO2020021272A5

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Publication number: JPWO2020021272A5
Application number: JP2021503732A
Authority: JP
Publication date: 2022-04-07

Claims

試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法であって：
a) 該試料を：
i. 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
ii. 鎖置換型DNAポリメラーゼ；
iii. dNTP；
iv. 1以上の修飾dNTP；
v. ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
vi. ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素；
と接触させて、温度周期変化を用いることなく、該標的核酸の存在下で増幅産物を生産すること；
b) 工程a）の増幅産物を：
i. 該増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ii. 該増幅産物中の該少なくとも1つの種の同じ鎖中の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ；
と接触させることであって、
該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも1つが、該DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、該第1又は第2の制限酵素によって切断できず、
該増幅産物中の該少なくとも1つの種との該第1及び第2のプローブのハイブリダイゼーションにより、ディテクター種が生産される、前記接触させること；並びに
c) 工程b)で生産された該ディテクター種の存在を検出することであって、該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す、前記検出すること、
を含む、前記方法。
前記少なくとも1つの阻止されたオリゴヌクレオチドプローブが、1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができなくなる、請求項1記載の方法。
前記少なくとも1つの阻止されたオリゴヌクレオチドプローブを工程a)の実施と同時に前記試料と接触させる、請求項1又は2記載の方法。
前記少なくとも1つの阻止されたオリゴヌクレオチドプローブが追加の領域を含み、結果、該阻止されたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする前記増幅産物中の種の3'末端が前記鎖置換型DNAポリメラーゼによって伸長されることができる、請求項1～3のいずれか1項記載の方法。
工程a)において前記試料をさらに：（A）5'から3'の方向に前記第1の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに前記標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第3のオリゴヌクレオチドプライマー；及び/又は（B) 5'から3'の方向に前記第2の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、前記DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第4のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、
存在する場合、前記第3のオリゴヌクレオチドプライマーは、任意に、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーより過剰に提供され、かつ存在する場合、前記第4のオリゴヌクレオチドプライマーは、任意に、前記第2のオリゴヌクレオチドより過剰に提供される、請求項1～4のいずれか1項記載の方法。
前記1以上の修飾dNTPが、αチオール修飾dNTPである、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
前記第1及び第2の制限酵素が同じ制限酵素である、請求項1～6のいずれか1項記載の方法。
工程a）を50℃以下の温度で実施するか、又は開始周囲温度、例えば15～30℃の範囲から、40～50℃の範囲の温度までの増加など、工程a)の実施の間温度を増加させる、請求項1～7のいずれか1項記載の方法。
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分が、比色定量色素若しくは蛍光定量色素、又は比色定量若しくは蛍光定量色素との結合を可能とする部分、例えばビオチンであるか、又は基質との接触後に検出可能なシグナル、例えば比色定量若しくは蛍光シグナルを生じる酵素である、請求項1～8のいずれか1項記載の方法。
前記ディテクター種が電気シグナルの変化によって検出される、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、該一本鎖オリゴヌクレオチド部分の配列は、2～4塩基のDNA配列モチーフの3以上の反復コピーを含み得る、請求項1～10のいずれか1項記載の方法。
工程c)において前記ディテクター種の存在が核酸ラテラルフロー、例えば、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分との配列特異的ハイブリダイゼーションを可能とする1以上の核酸を利用する核酸ラテラルフローによって検出される、請求項1～11のいずれか1項記載の方法。
工程c)によりカーボン又は金、好ましくはカーボンを使用して比色定量又は電気化学的シグナルが生成される、請求項1～12のいずれか1項記載の方法。
前記第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記制限酵素認識配列及び前記切断部位の上流の、例えば5又は6塩基長の安定化配列を含む、請求項1～13のいずれか1項記載の方法。
前記第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ領域が、9～16塩基長である、請求項1～14のいずれか1項記載の方法。
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方を、他方のプライマーより過剰に提供する、請求項1～15のいずれか1項記載の方法。
前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が0～15塩基、例えば、3～15塩基により隔てられている、請求項1～16のいずれか1項記載の方法。
工程b)において前記増幅産物中の前記少なくとも1つの種の前記第1又は第2の一本鎖検出配列が、請求項17で定義した3～15塩基に対応する少なくとも3塩基の配列を含む、請求項1～17のいずれか1項記載の方法。
前記標的核酸が、二本鎖RNA由来一本鎖RNAと二本鎖DNA由来一本鎖RNAとを含む一本鎖RNA、又は、一本鎖RNA由来一本鎖DNA、例えば、逆転写酵素の使用により一本鎖RNAから得た一本鎖DNAと二本鎖DNA由来一本鎖DNA、例えば、鎖侵入により二本鎖DNAから得た一本鎖DNA、又は、ヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼIIIの使用により二本鎖DNAから得た一本鎖DNAとを含む、一本鎖DNAである、請求項1～18のいずれか1項記載の方法。
定義された配列の2以上の異なる標的核酸の存在が同じ試料中で検出される、請求項1～19のいずれか1項記載の方法。
前記試料が生体試料、例えば鼻若しくは鼻咽頭スワブ若しくは吸引液、血液若しくは血液由来試料、尿、ヒト試料、法医学試料、農学試料、獣医学試料、環境試料、又は生体防御試料である、及び/又は
前記標的核酸がウイルス性又はウイルス性核酸材料に由来し、細菌性である又は細菌性核酸材料に由来し、癌細胞又は胎児細胞から放出される循環型無細胞DNAであり、マイクロRNAであり、又はマイクロRNA由来である、及び/又は
前記標的核酸の検出を、疾患又は罹患状態、例えば、限定はされないが、HIV、インフルエンザ、RSV、ライノウイルス、ノロウイルス、結核、HPV、髄膜炎、肝炎、MRSA、エボラ、クロストリジウム・ディフィシル、エプスタイン・バーウイルス、マラリア、ペスト、ポリオ、クラミジア、ヘルペス、淋病、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、コレラ、又は天然痘を含む感染症、又は限定はされないが、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、白血病、食道癌、卵巣癌、腎癌、胃癌、又は黒色腫を含む癌の診断、予後判定又はモニタリングのために使用する；又は前記標的核酸の検出を、ヒトの遺伝子検査、出生前検査、血液汚染スクリーニング、薬理ゲノミクス、又は薬物動態学のために使用する、請求項1～20のいずれか1項記載の方法。
キットであって：
a) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに定義された配列の一本鎖標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
b) ニッキング酵素ではなく、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる第1の制限酵素、及びニッキング酵素ではなく、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる第2の制限酵素；
c) 鎖置換型DNA ポリメラーゼ；
d) dNTP 、
e) 1以上の修飾dNTP；
f) 該標的核酸の存在下で生産された増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；並びに
g) 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ、を含み、
該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも1つが、該DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、該第1又は第2の制限酵素によって切断できない、前記キット。
前記少なくとも1つの阻止されたオリゴヌクレオチドプローブが、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができない、請求項22記載のキット。
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記第1若しくは第2のプライマーのハイブリダイズ領域との5塩基以上の相補性又は該第1若しくは第2のプライマーのハイブリダイズ領域の逆相補鎖を有する、請求項22又は23記載のキット。
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方のハイブリダイズ領域との5塩基以上の相補性を有し、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの他方のハイブリダイズ領域の逆相補鎖との5塩基以上の相補性を有する、請求項24記載のキット。
前記標的核酸の存在下で生産されたディテクター種の存在を検出する手段をさらに含む、請求項22～25のいずれか1項記載のキット。
前記増幅産物中の前記少なくとも1つの種における前記標的核酸、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第1の制限酵素、及び/又は前記第2の制限酵素、及び/又は前記DNAポリメラーゼ、及び/又は前記dNTP、及び/又は前記1以上の修飾dNTP、及び/又は前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記第1若しくは第2の一本鎖検出配列が、請求項4、6、7、9、11又は14～21のいずれか1項で定義された通りである、請求項22～26のいずれか1項記載のキット。
請求項5で定義された通りの第3及び/又は第4のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項22～27のいずれか1項記載のキット。
請求項22～28のいずれか1項記載のキットを含む装置であって、該装置が動力付きの装置であり、加熱手段を備え、かつ/又は使い捨て診断装置であり得る、前記装置。