BR112021000574A2 - Método de detecção de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se aos métodos para a detecção de ácidos nucleicos de sequência definida e a kits e dispositivos para o uso nos ditos métodos. os métodos usam enzima de restrição, polimerase e iniciadores de oligonucleotídeos para produzir um produto de amplificação na presença de um ácido nucleico alvo, o qual é contactado com sondas de oligonucleotídeos para produzir um produto detector.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO DE FITA SIMPLES, KIT E DISPOSITIVO".

ANTECEDENTES Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a métodos para a detecção de ácidos nucleicos de sequência definida e a kits e dispositivos para o uso nos ditos métodos. Técnica Relacionada

[002] Os métodos de amplificação de sequências de ácidos nucleicos baseados em polimerases são usados extensamente no campo do diagnóstico molecular. O método mais estabelecido, a reação de cadeia de polimerase (PCR), envolve tipicamente dois iniciadores para cada sequência alvo e usa ciclos de temperatura para obter o pareamento de iniciadores, extensão pela polimerase de DNA e a desnaturação do DNA recentemente sintetizado em um processo de amplificação exponencial cíclica. O requisito de ciclos de temperatura necessita de um equipamento complexo, o que limita o uso de métodos baseados em PCR em determinadas aplicações.

[003] A Amplificação de Deslocamento de Fita (SDA) (EP0497272; US5455166; US5712124) foi desenvolvida como uma alternativa isotérmica à PCR que não requer ciclos de temperatura para obter o pareamento e a desnaturação do RNA de fita dupla durante a amplificação de polimerase, e usa de preferência enzimas de restrição combinadas com uma polimerase de deslocamento de fita para separar as duas fitas de DNA.

[004] Na SDA, um sítio de enzima de restrição na extremidade 5' de cada iniciador é introduzido no produto de amplificação na presença de um ou mais alfa tiol nucleotídeos, e uma enzima de restrição é usada para a clivagem hidrolítica dos sítios de restrição em virtude de sua capacidade de clivar somente a fita não modificada de uma forma de hemifosforotioato de seu sítio de reconhecimento. Uma polimerase de deslocamento de cordão estende a extremidade 3' de cada ponta e des- loca o cordão de DNA a jusante. A amplificação exponencial resulta das reações de sentido e antissentido de acoplamento em que os cordões deslocados de uma reação de sentido servem como alvo para uma re- ação antissentido, e vice-versa. A SDA leva tipicamente mais de 1 hora para ser executada, o que tem limitado bastante o seu potencial para a exploração no campo do diagnóstico clínico. Além disso, o requisito para processos separados para a detecção específica do produto depois da amplificação e para iniciar a reação adiciona uma complexidade signifi- cativa ao método.

[0005] Maples et al. (WO2009/012246) executou subsequente- mente a SDA ao usar enzimas de clivagem hidrolítica, uma subclasse das enzimas de restrição que são capazes de clivar somente um dos dois cordões de DNA depois da ligação à sua sequência de reconheci- mento de cordão duplo específica. Eles se referem ao método tal como Reação de Clivagem Hidrolítica e Amplificação de Extensão [Nicking and Extension Amplification Reaction] (NEAR). A NEAR, que emprega enzimas de clivagem hidrolítica em vez de enzimas de restrição, tam- bém foi usada subsequentemente por outros, que tentaram melhorar o método ao usar iniciadores otimizados por software (WO2014/164479) e através de um início quente ou redução controlada da temperatura (WO2018/002649). No entanto, somente um número muito pequeno de enzimas de clivagem hidrolítica está disponível, e desse modo é mais desafiador encontrar uma enzima com as propriedades desejadas para uma aplicação particular.

[0006] Uma desvantagem crucial da SDA ao usar enzimas de res- trição ou enzimas de clivagem hidrolítica (NEAR) é que ela produz um produto de ácido nucleico de cordão duplo e desse modo não provê um processo intrínseco para a detecção eficiente do sinal de amplificação.

Isto tem limitado de maneira significativa a sua utilidade, por exemplo, nos dispositivos de diagnóstico de baixo custo. A natureza de cordão duplo do produto amplificado produzido apresenta um desafio para o acoplamento do método de amplificação à detecção de sinal, uma vez que não é possível executar a detecção baseada na hibridização sem separar primeiramente os dois cordões. Portanto, métodos de detecção mais complexos são requeridos, tais como balizas moleculares e son- das de fluoróforo/supressor, o que pode complicar os protocolos de en- saio ao requerer uma etapa do processo separada e reduzir de maneira significativa o potencial de desenvolver ensaios multiplexados.

[0007] Há uma necessidade importante quanto a métodos de am- plificação melhorados para a detecção rápida, sensível e específica de sequências de ácidos nucleicos para superar as limitações da SDA. A presente invenção refere-se a um método de amplificação e detecção de sequência de ácido nucleico alvo que, além de um par de iniciadores com sítios de restrição 5', utiliza sondas de oligonucleotídeos adicionais para produzir uma espécie detectora que permite a detecção eficiente de sinais.

SUMÁRIO

[0008] A invenção provê um método para a detecção da presença de um ácido nucleico alvo de um só cordão de sequência definida em uma amostra, o qual compreende: a) a colocação da amostra em contato com: i. um primeiro iniciador de oligonucleotídeo e um segundo ini- ciador de oligonucleotídeo, em que o dito primeiro iniciador compreende na direção 5' a 3' um cordão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hi- bridizar a uma primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo, e o dito segundo iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um cor- dão de um sítio de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar ao complemento reverso de uma segunda sequência de hibridização a montante da primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo; ii. uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão; iii. dNTPs; iv. um ou mais dNTPs modificados; v. uma primeira enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reco- nhecimento do primeiro iniciador e de clivar somente o cordão do pri- meiro iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reco- nhecimento e o sítio de clivagem têm cordões duplos, em que a cliva- gem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complemen- tar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modifi- cados; e vi. uma segunda enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reco- nhecimento do segundo iniciador e clivar somente o cordão do segundo iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reconheci- mento e o dito sítio de clivagem são de cordões duplos, em que a cliva- gem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complemen- tar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modifi- cados; para produzir, sem ciclos de temperatura, na presença do dito ácido nu- cleico alvo, o produto de amplificação; b) a colocação do produto de amplificação da etapa a) em con- tato com: i. uma primeira sonda de oligonucleotídeo que pode hibridizar a uma primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação e que é fixada a uma porção que permite a sua detecção; e ii. uma segunda sonda de oligonucleotídeo que pode hibridizar a uma segunda sequência de detecção de um só cordão a montante ou a jusante da primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma dita espécie dentro do produto de amplificação e que é fi- xada a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido; onde a hibridização da primeira e segunda sondas a pelo menos uma dita espécie dentro do produto de amplificação produz uma espécie de detecção; e c) a detecção da presença da espécie detectora produzida na etapa b) em que a presença da espécie detectora indica a presença do ácido nucleico alvo na dita amostra.

[0009] Uma modalidade do método é ilustrada na Figura 1.

[0010] Em várias modalidades, na presença do ácido nucleico alvo, o método produz rapidamente muitas cópias da espécie detectora que é idealmente adequada à detecção sensível.

[0011] A presente invenção em vários aspectos é vantajosa em re- lação aos métodos conhecidos, uma vez que ele engloba a amplificação rápida sem ciclos de temperatura além de prover um processo intrín- seco para a detecção eficiente do produto amplificado.

[0012] O método da invenção supera uma grande desvantagem da SDA, incluindo a SDA com enzimas de clivagem hidrolítica (NEAR), a qual consistem no fato que a SDA não provê um processo intrínseco para a detecção eficiente do sinal de amplificação devido à natureza de cordão duplo do produto de amplificação. O presente método supera esta limitação mediante a utilização de duas sondas de oligonucleotí- deos adicionais que hibridizam pelo menos uma espécie no produto de amplificação para facilitar a sua detecção rápida e específica. O uso destas duas sonda de oligonucleotídeos adicionais, a primeira das quais é fixada a uma porção que permite a sua detecção e a segundo das quais é fixada a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido, provê uma série de vantagens adicionais em relação aos métodos conhecidos, tal como a SDA. Por exemplo, nas modalidades da invenção em que uma das sondas de oligonucleotídeos é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA, ela não pode ser clivada pela enzima de restrição e é colocada em con- tato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a), surpre- endentemente, nenhuma inibição prejudicial significativa da amplifica- ção é observada e uma espécie pré-detecção que contém uma região de um só cordão é produzida de maneira eficiente. Este aspecto da in- venção é contraintuitivo, uma vez que se pode supor que tal sonda blo- queada deve conduzir à amplificação assimétrica que é impelida ao cor- dão do produto de amplificação oposto àquele compreendido na espé- cie pré-detecção. De fato, a dita espécie pré-detecção é produzida de maneira eficiente e é idealmente adequada à detecção eficiente uma vez que a região de um só cordão exposta fica de imediato disponível para a hibridização da outra sonda de oligonucleotídeo.

[0013] A abordagem de detecção de amostra intrínseca do presente método contrasta fundamentalmente com as tentativas prévias de su- perar esta limitação importante da SDA que envolvia a execução da am- plificação "assimétrica", por exemplo, ao usar uma razão de iniciador desigual com um objetivo de produzir um excesso de um cordão de am- plicon em relação a outro. O presente método não requer a amplificação assimétrica, nem tem nenhuma necessidade de produzir um excesso de ume cordão do amplicon em relação a outro e é focalizado de prefe- rência na produção da espécie detectora depois da hibridização da pri- meira e da segunda sondas de oligonucleotídeos. A abordagem de de-

tecção de amostra intrínseca do presente método que envolve a produ- ção de uma espécie detectora é idealmente adequada para o seu aco- plamento com, dentre outros métodos de detecção, o fluxo lateral de ácido nucleico, provendo um meio simples, rápido e de baixo custo para a execução da detecção na etapa c), por exemplo, mediante a impres- são da segunda sonda de oligonucleotídeo na tira de fluxo lateral. Quando acoplado ao fluxo lateral de ácido nucleico, o método também permite a multiplexação eficiente baseada na hibridização diferencial de múltiplas segundas sondas de oligonucleotídeos fixadas em locais dis- tintos na tira de fluxo lateral, cada uma com uma sequência diferente desenhada para uma sequência de ácidos nucleicos alvo diferente na amostra. Em outras modalidades do método, a eficiência da detecção de fluxo lateral é realçada pelo uso de um oligonucleotídeo de um só cordão como a porção dentro da segunda sonda de oligonucleotídeo que permite a sua fixação a um material sólido, e a sequência comple- mentar reversa para a dita porção é impressa na tira. Esta última abor- dagem também permite que a tira de fluxo lateral seja otimizada e ma- nufaturada como um sistema de detecção "universal" único através de múltiplas aplicações alvo, uma vez que as sequências fixadas à tira de fluxo lateral podem ser definidas e não precisam corresponder à se- quência de ácido(s) nucleico(s) alvo. O requisito integral para duas sonda de oligonucleotídeos adicionais no método da invenção propicia desse modo muitas vantagens em relação à SDA, incluído a SDA com enzimas de clivagem hidrolítica (NEAR).

[0014] Uma vez que a presente invenção requer o uso de enzima(s) de restrição que não é(são) enzima(s) de clivagem hidrolítica e um ou mais dNTPs modificados, é fundamentalmente diferente da DAS execu- tada ao usar enzimas de clivagem hidrolítica (NEAR)e e tem um número de outras vantagens em relação a tais métodos dependentes de enzi- mas de clivagem hidrolítica. Por exemplo, um número muito maior de enzimas de restrição que não são enzimas de clivagem hidrolítica é dis- ponível em relação às enzimas de clivagem hidrolítica, o que significa que a enzima de restrição para o uso no método da invenção pode ser selecionada de um grande número de enzimas potenciais para identifi- car aquelas com propriedades superiores para uma dada aplicação, por exemplo, temperatura da reação, compatibilidade do tampão, estabili- dade e velocidade da reação (sensibilidade). Devido a esta vantagem chave do presente método, foi possível selecionar enzimas de restrição com uma temperatura mais baixa ideal e uma taxa mais rápida do que é possível obter com enzimas de clivagem hidrolítica. Tais enzimas de restrição são muito mais adequadas à exploração em um dispositivo de diagnóstico de baixo custo. Além disso, a necessidade de usar um ou mais dNTPs modificados é uma característica integral da presente in- venção que oferece vantagens importantes além de prover as enzimas de restrição para clivas somente uma cordão de seus sítios de restrição. Por exemplo, determinados dNTPs modificados, tais como dNTPs de alfa tiol, conduzem a uma redução na temperatura de fusão (Tm) do DNA ao qual são incorporados, o que significa que os iniciadores e as sondas de oligonucleotídeos no método têm uma afinidade maior com a hibridização para espécie dentro do produto de amplificação do que qualquer cordão complementar competitivo que contém o dNTP modifi- cado produzido durante a amplificação. Além disso, a redução na Tm do produto de amplificação em consequência da inserção da base de dNTP modificado facilita a separação da espécie de DNA de cordão duplo e desse modo realça a taxa de amplificação, reduz a temperatura ideal e melhora a sensibilidade. Alternativamente, outros dNTPs modifi- cados podem aumentar a Tm do DNA em que são incorporados, apre- sentando outras oportunidades de se adequar à execução do método para uma dada aplicação.

[0015] Em conjunto, as numerosas vantagens da presente invenção em relação a SDA, ao usar enzimas de restrição ou então enzimas de clivagem hidrolítica (NEAR), propiciam a utilidade do método em dispo- sitivos de diagnóstico de um só uso de baixo custo, em virtude da taxa melhorada de amplificação e da visualização simples do sinal de ampli- ficação que não são possíveis com os métodos conhecidos.

[0016] Várias modalidades dos aspectos acima mencionados da in- venção, e outros aspectos, são descritos em mais detalhes a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] Figura 1. Representação esquemática do método de acordo com um aspecto da invenção.

[0018] Figura 2. Representação esquemática do método no qual a primeira sonda de oligonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou segunda enzima de restrição e é colocada em contato com a amostra na etapa a).

[0019] Figura 3. Representação esquemática das etapas b) e c) do método em que a porção que permite a fixação da segunda sonda de oligonucleotídeo a um material sólido é um oligonucleotídeo de um só cordão.

[0020] Figura 4. Representação esquemática de uma parte da etapa a) do método no qual a amostra também é colocada em contato com um terceiro e um quarto iniciadores de oligonucleotídeo na etapa a).

[0021] Figura 5. A execução do método no qual a segunda sonda de oligonucleotídeo é fixada a um material sólido, uma tira de fluxo late- ral de nitrocelulose (vide o Exemplo 1).

[0022] Figuras 6A e 6B. Execução do método no qual a primeira sonda de oligonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou se- gunda enzimas de restrição e é colocada em contato com a amostra na etapa a) (vide o Exemplo 2).

[0023] Figuras 7A, 7B, 7C e 7D. Execução do método no qual a pre- sença de dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes de sequência definida é detectada na mesma amostra (vide o Exemplo 3).

[0024] Figura 8. Execução do método em que a primeira e a se- gunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo são separadas por 5 bases (vide o Exemplo 4).

[0025] Figura 9. Desempenho do método em que a porção que per- mite a fixação da segunda sonda de oligonucleotídeo a um material só- lido é um antígeno e o anticorpo correspondente é fixado a uma super- fície sólida, uma tira de fluxo lateral de nitrocelulose (vide o Exemplo 5).

[0026] Figuras 10A e 10B. Execução do método no qual a porção que permite a fixação da segunda sonda de oligonucleotídeo a um ma- terial sólido é um oligonucleotídeo de um só cordão que compreende quatro cópias de repetição de um motivo de sequência de DNA de três bases e o complemento reverso da dita sequência de oligonucleotídeos de um só cordão é fixado a um material sólido (vide o Exemplo 6).

[0027] Figura 11. Uso do método para a detecção de um vírus de RNA em espécimes clínicos (vide o Exemplo 7).

[0028] Figuras 12A e 12B. Execução do método a temperaturas di- ferentes (vide o Exemplo 8).

[0029] Figuras 13A e 13B. Execução do método no qual o ácido nu- cleico alvo é derivado do RNA de cordão duplo por meio de invasão de cordão (vide o Exemplo 9).

[0030] Figuras 14A e 14B. Execução comparativa do método da in- venção versus métodos conhecidos (vide o Exemplo 10).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] A presente invenção provê um método para a detecção da presença de um ácido nucleico alvo de um só cordão de sequência de- finida em uma amostra. O ácido nucleico alvo pode ser um DNA de um só cordão, incluindo o DNA de um só cordão derivado do RNA de cordão duplo depois da dissociação dos dois cordões na amostra, tal como por meio de desnaturação a quente ou através da atividade de desloca- mento de cordão de uma polimerase, ou derivado do RNA, por exemplo, mediante a ação de transcriptase reverso, ou derivado do RNA de cor- dão duplo, por exemplo, mediante o uso de um nuclease, tal como uma endonuclease de restrição ou uma exonuclease III, ou derivado de um híbrido de RNA/DNA, por exemplo, através de uma enzima tal como a ribonuclease H. O ácido nucleico alvo pode ser o DNA de um só cordão derivado do DNA na amostra por uma polimerase, helicase ou recombi- nase do DNA. Os sítios de um só cordão dentro do RNA de cordão duplo podem ser expostos suficientemente para a hibridização e a extensão do primeiro iniciador de oligonucleotídeo para iniciar o método, por exemplo, através da "invasão de cordão" em que a abertura transiente de um ou mais pares base de DNA dentro do RNA de cordão duplo ocorre suficientemente para permitir a hibridização e a extensão da hi- droxila 3' do primeiro iniciador de oligonucleotídeo, ou pela abertura es- pontânea de pares base de DNA, a conversão transiente em pares de Hoogsteen ou clivagem hidrolítica produtiva de DNA pelas abordagens de enzimas de restrição ou termoquímica. O ácido nucleico alvo pode ser o RNA de um só cordão, incluindo o RNA de um só cordão derivado do RNA de cordão duplo na amostra depois da dissociação dos dois cordões, tal como por meio da desnaturação a quente ou o RNA de um só cordão derivado do RNA de cordão duplo, por exemplo, por meio de transcrição.

[0032] O método envolve na etapa a) a colocação da amostra em contato com: (i) um primeiro iniciador de oligonucleotídeo e um segundo iniciador de oligonucleotídeo, em que o dito primeiro iniciador compre- ende na direção 5’ a 3’ um cordão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar a uma primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo, e o dito segundo iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um cor- dão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar ao complemento re- verso de uma segunda sequência de hibridização a montante da pri- meira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo; (ii) uma polime- rase de DNA de deslocamento de cordão; (iii) dNTPs; (iv) um ou mais dNTPs modificados; (v) uma primeira enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a se- quência de reconhecimento do primeiro iniciador e clivar somente o cor- dão do primeiro iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reconhecimento e o dito sítio de clivagem são de cordões duplos, em que clivagem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complementar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modificados; e (vi) uma segunda enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a se- quência de reconhecimento do segundo iniciador e clivar somente o cor- dão do segundo iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reconhecimento e o dito sítio de clivagem são de cordões duplos, em que a clivagem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complementar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modificados.

[0033] Quando o ácido nucleico alvo a ser detectado na amostra é de cordão duplo, um ou outro cordão pode ser considerado como o ácido nucleico alvo de um só cordão do método, uma vez que um dos dois iniciadores de oligonucleotídeos pode hibridizar a uma cordão e o outro iniciador de oligonucleotídeo pode hibridizar ao outro cordão. Tipi- camente, os iniciadores de oligonucleotídeos usados no método são os iniciadores de DNA que formam com o DNA ou o RNA alvo um DNA de cordão duplo ou um duplex híbrido que compreende cordões de RNA e de DNA. No entanto, os iniciadores que compreendem outros ácidos nucleicos, tais como bases não naturais e/ou estruturas de cadeia prin- cipal alternativas, também podem ser usados.

[0034] Na presença do ácido nucleico alvo, o primeiro iniciador de oligonucleotídeo hibridiza à primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo. Depois da dita hibridização, o grupo hidroxila 3' do pri- meiro iniciador é estendido pela polimerase de DNA de deslocamento de cordão ou, opcionalmente, no caso de um ácido nucleico alvo de RNA uma transcriptase reversa (por exemplo M-MuLV), para produzir uma espécie de cordão duplo que contém o primeiro iniciador estendido e o ácido nucleico alvo (vide a Figura 1). A polimerase de DNA de des- locamento de cordão ou, quando presente, a transcriptase reversa, usa os dNTPs e um ou mais dNTPs modificados na dita extensão. Um cor- dão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e o sítio de clivagem na extremidade 5' do primeiro iniciador não hibridiza tipicamente, uma vez que a sequência complementar reversa ao mesmo não está geralmente presente na sequência de ácidos nucleicos alvo. O primeiro iniciador é desse modo geralmente usado para introduzir um dito cordão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restri- ção e sítio de clivagem na espécie de produto de amplificação subse- quente. Depois da extensão do primeiro iniciador, ocorre a "remoção do alvo". A remoção do alvo torna acessível a espécie de primeiro iniciador estendida para a hibridização do segundo iniciador de oligonucleotídeo ao complemento reverso da segunda sequência de hibridização. Quando o ácido nucleico alvo é o RNA, a remoção do alvo pode ser realizada, por exemplo, mediante a degradação RNase H do RNA, rea- lizada através da atividade de rNase H da transcriptase reversa se esti-

ver presente, ou através da adição separada dessa enzima. Alternativa- mente, quando o ácido nucleico alvo é o DNA de um só cordão, inclu- indo uma região de um só cordão dentro do RNA de cordão duplo, pode ser realizada mediante o deslocamento do cordão ao usar um iniciador a montante adicional ou um iniciador de colisão. Alternativamente, tal remoção alvo pode ocorrer depois da dissociação espontânea, em par- ticular se somente um produto de extensão curta foi produzido a partir de uma determinada molécula de ácido nucleico alvo, ou pode ocorrer através de invasão de cordão em que a abertura transiente de um ou mais pares base de DNA dentro da primeira espécie de iniciador esten- dida de cordão duplo ocorre suficientemente para permitir a hibridização e a extensão da hidroxila 3' do segundo iniciador de oligonucleotídeo com deslocamento de cordão.

[0035] Depois da hibridização do segundo iniciador de oligonucleo- tídeo ao complemento reverso da segunda sequência de hibridização, a polimerase de DNA de deslocamento de cordão estende a hidroxila 3' do dito iniciador ao usar os dNTPs e um ou mais dNTPs modificados. A sequência de reconhecimento de restrição de cordão duplo e o sítio de clivagem para a primeira enzima de restrição é formada com uma ou mais base(s) de dNTPs modificados incorporada(s) no cordão comple- mentar reverso que age para bloquear a clivagem do dito cordão pela dita primeira enzima de restrição. A primeira enzima de restrição reco- nhece a sua sequência de reconhecimento e cliva somente o cordão do primeiro iniciador do sítio de clivagem, criando uma hidroxila 3' que é estendida pela polimerase de DNA de deslocamento de cordão ao usar os dNTPs e um ou mais dNTPs modificados e deslocando o cordão do primeiro iniciador. A sequência de reconhecimento de restrição e o sítio de clivagem para a segunda enzima de restrição é formada com uma ou mais base(s) de dNTPs modificados incorporada(s) no cordão com- plementar reverso que age para bloquear a clivagem do dito cordão pela dita segunda enzima de restrição. Uma espécie de cordão duplo é pro- duzida desse modo, na qual as duas sequências de iniciadores são jus- tapostas e o sítio de restrição parcialmente bloqueado da primeira en- zima de restrição e da segunda enzima de restrição estão presentes. A clivagem pela primeira enzima de restrição do cordão do primeiro inici- ador e pela segunda enzima de restrição do cordão do segundo iniciador ocorre então, e duas espécies de cordões duplos são produzidas, uma que compreende a primeira sequência de iniciadores e a outra que com- preende uma segunda sequência de iniciadores. A clivagem sequencial e o deslocamento do cordão do primeiro iniciador e do cordão do se- gundo iniciador ocorre então em um processo de amplificação cíclica em que o cordão do primeiro iniciador deslocado age como um alvo para o segundo iniciador e o cordão do segundo iniciador deslocado age como um alvo para o primeiro iniciador.

[0036] Na presença do ácido nucleico alvo, o produto de amplifica- ção é produzido sem nenhuma necessidade de ciclos de temperatura.

[0037] Um aspecto integral da presente invenção é que, ao invés da detecção direta do produto de amplificação da etapa a), uma espécie detectora é produzida depois da hibridização específico de uma primeira e uma segunda sondas de oligonucleotídeos a pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação. A primeira sonda de oligonucleotí- deo, que é fixada a uma porção que permite a sua detecção, hibridiza a uma primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma dita espécie. A segunda sonda de oligonucleotídeo, que é fixada a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido, hibridiza a uma segunda sequência de detecção de um só cordão a montante ou a jusante da primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma dita espécie.

[0038] Será aparente a um elemento versado na técnica, com refe-

rência à Figura 1, que o produto de amplificação compreende um nú- mero de espécies diferentes, tal como a espécie que compreende se- quências de detecção de um só cordão, que consistem na sequência total ou parcial ou na sequência complementar reversa do primeiro ini- ciador e do segundo iniciador, em que as sequências podem ser sepa- radas pela sequência derivada do alvo no caso em que os iniciadores que ligam a primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo são separados por uma ou mais bases. Será mais apa- rente que qualquer uma das ditas espécies pode ser selecionadas para hibridizar à primeira e segunda sondas de oligonucleotídeos para formar a espécie detectora.

[0039] A espécie detectora produzida na etapa b) é detectada na etapa c), em que a presença da espécie detectora indica a presença do ácido nucleico alvo na amostra.

[0040] Ao utilizar duas sondas de oligonucleotídeos, uma para a de- tecção e uma para a fixação a um material sólido, o método da invenção provê a detecção rápida e eficiente de sinais, o que supera a necessi- dade quanto a métodos de detecção secundários mais complexos e provê uma visualização eficiente do sinal produzido na presença do alvo, tal como pelo fluxo lateral de ácido nucleico.

[0041] O método da invenção pode ser executado, no qual uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA de desloca- mento de cordão e não pode ser clivada pela primeira ou segunda enzi- mas de restrição. Desse modo, de acordo com uma modalidade adicio- nal, a invenção provê um método para a detecção da presença de um ácido nucleico alvo de um só cordão de sequência definida em uma amostra, o qual compreende: a) a colocação da amostra em contato com:

i. um primeiro iniciador de oligonucleotídeo e um segundo ini- ciador de oligonucleotídeo, em que o dito primeiro iniciador compreende na direção 5' a 3' um cordão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hi- bridizar a uma primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo, e o dito segundo iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um cor- dão de um sítio de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar ao complemento reverso de uma segunda sequência de hibridização a montante da primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo; ii. uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão; iii. dNTPs; iv. um ou mais dNTPs modificados; v. uma primeira enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reco- nhecimento do primeiro iniciador e de clivar somente o cordão do pri- meiro iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reco- nhecimento e o sítio de clivagem têm cordões duplos, em que a cliva- gem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complemen- tar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modifi- cados; e vi. uma segunda enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reco- nhecimento do segundo iniciador e clivar somente o cordão do segundo iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reconheci- mento e o dito sítio de clivagem são de cordões duplos, em que a cliva- gem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complemen-

tar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modifi- cados; para produzir, sem ciclos de temperatura, na presença do dito ácido nu- cleico alvo, o produto de amplificação; b) a colocação do produto de amplificação da etapa a) em con- tato com: i. uma primeira sonda de oligonucleotídeo que pode hibridizar a uma primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação e que é fixada a uma porção que permite a sua detecção; e ii. uma segunda sonda de oligonucleotídeo que pode hibridizar a uma segunda sequência de detecção de um só cordão a montante ou a jusante da primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma dita espécie dentro do produto de amplificação e que é fi- xada a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido; em que uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou pela segunda enzimas de restri- ção, e onde a hibridização da primeira e segunda sondas a pelo menos uma dita espécie dentro do produto de amplificação produz uma espécie detectora; e c) a detecção da presença da espécie detectora produzida na etapa b) em que a presença da espécie detectora indica a presença do ácido nucleico alvo na dita amostra.

[0042] Em uma modalidade, a dita sonda de oligonucleotídeo blo- queada deixa de poder ser clivada pela primeira ou pela segunda enzi- mas de restrição devido à presença de uma ou mais incompatibilidades de sequências e/ou uma ou mais modificações, tal como uma ligação de fosforotioato.

Em uma modalidade adicional, uma sonda de oligonu- cleotídeo bloqueada é colocada em contato com a amostra simultanea- mente à execução da etapa a), isto é, durante a execução da etapa a) de maneira tal que está presente durante a produção do produto de am- plificação na presença do ácido nucleico alvo.

Desse modo, de acordo com uma modalidade adicional, a invenção provê um método para a detecção da presença de um ácido nucleico alvo de um só cordão de sequência definida em uma amostra, o qual compreende: a) a colocação da amostra em contato com: i. um primeiro iniciador de oligonucleotídeo e um segundo ini- ciador de oligonucleotídeo, em que o dito primeiro iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um cordão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hi- bridizar a uma primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo, e o dito segundo iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um cor- dão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar ao complemento re- verso de uma segunda sequência de hibridização a montante da pri- meira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo; ii. uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão; iii. dNTPs; iv. um ou mais dNTPs modificados; v. uma primeira enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reco- nhecimento do primeiro iniciador e clivar somente o cordão do primeiro iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reconheci- mento e o dito sítio de clivagem são de cordões duplos, em que a cliva- gem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complemen-

tar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modifi- cados; e vi. uma segunda enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reco- nhecimento do segundo iniciador e clivar somente o cordão do segundo iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reconheci- mento e sítio de clivagem é bloqueada, em que a clivagem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complementar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modificados; para produzir, sem ciclos de temperatura, na presença do dito ácido nu- cleico alvo, o produto de amplificação; b) a colocação do produto de amplificação da etapa a) em con- tato com: i. uma primeira sonda de oligonucleotídeo que pode hibridizar a uma primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação e que é fixada a uma porção que permite a sua detecção; e ii. uma segunda sonda de oligonucleotídeo que pode hibridizar a uma segunda sequência de detecção de um só cordão a montante ou a jusante da primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma dita espécie dentro do produto de amplificação e que é fi- xada a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido; em que uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA, não pode ser clivada pela primeira ou pela segunda enzimas de restri- ção e é colocada em contato com a amostra simultaneamente à execu- ção da etapa a), e onde a hibridização da primeira e segunda sondas a pelo menos uma dita espécie dentro do produto de amplificação produz uma espécie detectora; e c) a detecção da presença da espécie detectora produzida na etapa b) em que a presença da espécie detectora indica a presença do ácido nucleico alvo na dita amostra.

[0043] Por exemplo, na modalidade ilustrada na Figura 2, a primeira sonda de oligonucleotídeo é bloqueada e hibridiza à primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação para formar uma espécie de pré-detecção que contém uma região de um só cordão. Pelo menos uma dita espécie pode ser estendida pela polimerase de DNA de deslocamento de cordão ao estender seu grupo hidroxila 3' e desse modo estabilizando ainda mais a dita espécie de pré-detecção. Desse modo, na dita modalidade a sonda de oligonucleotídeo bloqueada compreende uma região adicio- nal de maneira tal que a extremidade 3' da espécie dentro do produto de amplificação até a qual a sonda de oligonucleotídeo bloqueada hibri- diza pode ser estendida pela polimerase de DNA de deslocamento de cordão. Uma "espécie de pré-detecção estabilizada" é produzida tal como indicado na Figura 2. O elemento versado na técnica irá apreciar que esta região de estabilização de espécie de pré-detecção adicional na sonda de oligonucleotídeo bloqueada irá ficar a montante da região que hibridiza à primeira ou à segunda sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação. Nas modalidades que usam uma sonda de oligonucleotídeo bloqueada, a sequência de hibridização da sonda de oligonucleotídeo bloqueada e as concentrações relevantes dos iniciadores podem ser optimizadas de maneira tal que uma determinada proporção da espécie relevante pro- duzida no produto de amplificação hibridiza à sonda de oligonucleotídeo bloqueada em cada ciclo e as cópias restantes de tais espécies perma- necem disponíveis para participar do processo de amplificação cíclica. A sonda de oligonucleotídeo é bloqueada da extensão, por exemplo,

pelo uso de uma modificação de fosfate 3' e, nesta modalidade, também é fixada a uma porção que permite a sua detecção, tal como uma modi- ficação de biotina 5'. Alternativamente, uma única modificação 3' pode ser usada para bloquear a extensão e como uma porção que permite a sua detecção. Várias outras modificações são disponíveis para bloquear a extremidade 3' dos oligonucleotídeos, tal como um espaçador C-3; alternativamente, base(s) de incompatibilidade podem ser empregadas. A dita espécie de pré-detecção é idealmente adequada para a detecção eficiente uma vez que a região de um só cordão exposta permanece de imediato disponível para a hibridização à segunda sonda de oligonucle- otídeo. A segunda sonda de oligonucleotídeo pode ser fixada à superfí- cie de nitrocelulose de uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico de maneira tal que, quando a espécie de pré-detecção flui sobre ela, a hi- bridização específica de sequência ocorre de imediato e a espécie de- tectora fica localizada em um local definido na tira. Um corante que é fixado à porção de detecção, tal como uma partícula de carbono fixado com streptavidina, ouro ou poliestireno, que pode estar presente na al- mofada de conjugado da tira de fluxo lateral de ácido nucleico ou du- rante a reação de amplificação, propicia uma visualização rápida base- ada em cores da presença da espécie detectora produzida na presença do ácido nucleico alvo.

[0044] Em uma outra modalidade, a segunda sonda de oligonucle- otídeo é que é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polime- rase de DNA de deslocamento de cordão e não pode ser clivada pela primeira ou pela segunda enzimas de restrição, e é colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a). A segunda sonda de oligonucleotídeo pode ser fixada a um material sólido, tal como a superfície de uma sonda eletroquímica, uma placa de 96 poços grâ- nulos ou uma superfície de disposição, antes de ser colocada em con- tato com a amostra, ou pode ser fixada a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido. Uma certa proporção de pelo menos uma espécie produzida durante a amplificação hibridiza à segunda sonda de oligonucleotídeo depois da sua produção, em vez de hibridizar ao inici- ador de reação relevante para também participar do processo de ampli- ficação cíclica. Depois da hibridização à segunda sonda de oligonucle- otídeo, as ditas espécies são estendidas pela polimerase na sonda de oligonucleotídeo para produzir a espécie de pré-detecção estabilizada. A primeira sonda de oligonucleotídeo e a porção de detecção também podem ser colocadas em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a) e deve ficar localizada na dita superfície no sítio da segunda sonda de oligonucleotídeo. Com a detecção da acumulação da porção de detecção no sítio durante o processo de amplificação, um sinal em tempo real deve ser obtido, propiciando uma quantificação do número de cópias do ácido nucleico alvo presente na amostra. Desse modo, de acordo com uma modalidade da invenção, duas ou mais das etapas a), b) e c) são executadas simultaneamente.

[0045] Na execução dessas modalidades em que uma dentre a pri- meira e a segunda sonda de oligonucleotídeos são bloqueadas na ex- tremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não podem ser cli- vada pela primeira ou pela segunda enzimas de restrição e são coloca- das em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a), não foi observada nenhuma inibição significativa da taxa de amplifi- cação, indicando que a espécie de pré-detecção se acumula em tempo real sem romper o processo de amplificação cíclica ideal. Isto contrasta com as tentativas de projetar SDA assimétrica ao utilizar uma razão de iniciador desigual com o objetivo de produzir um excesso de um cordão de amplicon em relação ao outro. Ao invés de procurar usar a sonda de oligonucleotídeo bloqueada para remover um cordão de amplicon da reação e aumentar desse modo a proporção do outro cordão, a presente invenção é focalizada na produção e na detecção da espécie detectora que explora uma sonda bloqueada para facilitar a exposição de uma região de um só cordão durante o processo de amplificação. Desse modo não somente não foi observado nenhum efeito inibidor no pro- cesso de amplificação nas ditas modalidades, mas foi observado um realce surpreendente do sinal produzido que corresponde a uma quan- tidade aumentada de espécie detectora, de pelo menos 100 vezes em determinadas modalidades, vide o Exemplo 2 (Figura 6).

[0046] Além disso, as ditas modalidades do método da invenção em que uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos são bloqueadas na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não podem ser clivadas pela primeira ou pela segunda enzimas de restrição e são colocadas em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a), representam uma vantagem fundamental em relação às tentativas relatadas de integrar NEAR com o fluxo lateral de ácido nucleico em um processo de múltiplas etapas sem sondas blo- queadas. Por exemplo, no documento de patente WO2014/164479 uma incubação longa de 30 minutos a 48°C foi necessária para visualizar o produto de amplificação ao usar o fluxo lateral de ácido nucleico, o que representa um grande entrave ao uso desse método em um dispositivo de diagnóstico de ponto de cuidado, em particular um dispositivo de baixo custo ou de um só uso. Em contraste imenso, o método da inven- ção executa de imediato uma amplificação equivalente dentro de 5 mi- nutos e a uma temperatura de incubação mais baixa, por exemplo, de 40 a 45°C. Em um outro estudo comparativo direto (vide o Exemplo 10), o método da invenção demonstra uma taxa vastamente superior surpre- endente em comparação ao método da técnica anterior (WO2014/164479) que resulta de uma combinação do uso de uma en- zima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica, o uso de uma base de dNTP modificado e o uso da dita sonda de oligonucle- otídeo bloqueada.

[0047] Também deve ser apreciado que as outras dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos podem ser bloqueadas na ex- tremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA, e/ou não podem ser clivadas pela primeira ou pela segunda enzimas de restrição, tal como descrito acima.

[0048] Um aspecto integral do método é o uso de uma ou mais en- zimas de restrição que não são uma enzima de clivagem hidrolítica, mas são capazes de reconhecer a sua sequência de reconhecimento e clivar somente um cordão de seu sítio de clivagem quando a dita sequência e de reconhecimento e o dito sítio de clivagem são de cordões duplos, em que a clivagem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à presença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão complementar reverso por um polimerase de DNA de deslocamento de cordão ao usar um ou mais dNTPs modificados, por exemplo um dNTP que confere resistência à nuclease depois da sua incorporação por uma polimerase.

[0049] Uma "enzima de restrição" [ou "endonuclease de restrição"] é uma classe ampla de enzimas que clivam uma ou mais ligações de fosfodiéster em um ou ambos os cordões de uma molécula de cordão duplo de ácido nucleico nos sítios de clivagem específicos depois da ligação a uma sequência de reconhecimento específica. Um grande nú- mero de enzimas de restrição está disponível, com mais de 3.000 rela- tadas e mais de 600 comercialmente disponíveis, cobrindo uma ampla faixa de diferentes propriedades físico-químicas e especificidades de sequências de reconhecimento.

[0050] Uma "enzima de clivagem hidrolítica" [ou "endonuclease de clivagem hidrolítica"] é uma subclasse particular de enzimas de restri- ção, que só podem clivar um cordão de uma molécula de ácido nucleico de cordão duplo em um sítio de clivagem específico depois da ligação a uma sequência de reconhecimento específica, deixando o outro cordão intacto. Somente um número muito pequeno (cerca de 10) de enzimas de clivagem hidrolítica está disponível, incluindo as enzimas de ocorrên- cia natural e as desenhadas. As enzimas de clivagem hidrolítica incluem os cortadores de cordões inferiores Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BssSI e Nb.BtsI, e os cortadores de cordões superiores Nt.AlwI, Nt.BbvCI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nt.BstNBI e Nt.CviPII.

[0051] As enzimas de restrição que não são enzimas de clivagem hidrolítica, que são empregadas exclusivamente no método da inven- ção, apesar de poderem clivar ambos os cordões de um ácido nucleico de cordão duplo, também podem em determinadas circunstâncias clivar ou clivar hidroliticamente somente um cordão de seu sítio de clivagem de DNA de cordão duplo depois da ligação à sua sequência de reco- nhecimento. Isto pode ser realizado em uma série de maneiras. De re- levância particular ao presente método, isto pode ser realizado quando um dos cordões dentro do ácido nucleico de cordão duplo no sítio de clivagem deixa de poder ser clivado devido a um cordão do sítio alvo de ácido nucleico de cordão duplo ser modificado de maneira tal que a li- gação de fosfodiéster do sítio de clivagem em um dos cordões é prote- gida ao usar uma modificação resistente à nuclease, tal como uma liga- ção de fosforotioato (PTO), boranofosfato, metilfosfato ou peptídeo. Certas ligações internucleotídeos modificados, por exemplo, ligações de PTO, podem ser quimicamente sintetizadas dentro das sondas de oli- gonucleotídeos e dos iniciadores ou ser integradas em um ácido nu- cleico de cordão duplo por uma polimerase, tal como ao usar um ou mais deoxinucleotídeos modificados com alfa tiol. Desse modo, em uma modalidade um ou mais dNTPs modificados consistem em um dNTP modificado com alfa tiol. O isômero S é usado tipicamente, o qual é in- corporado e confere resistência à nuclease com mais eficácia.

[0052] Devido ao número muito grande de enzimas de restrição que não são enzimas de clivagem hidrolítica disponíveis, uma ampla faixa de enzimas com propriedades diferentes está disponível para ser sele- cionada quanto às características de desempenho desejadas, por exemplo, perfil da temperatura, taxa, compatibilidade do tampão, com- patibilidade cruzada com a polimerase, sequência de reconhecimento, termo estabilidade, manufaturabilidade, etc., para o uso no método para uma determinada aplicação. Por outro lado, o fato que somente um nú- mero pequeno de enzimas de clivagem hidrolítica está disponível limita o potencial dos métodos da técnica anterior que usam enzimas de cli- vagem hidrolítica, e pode conduzir a uma velocidade mais baixa da re- ação (sensibilidade, tempo até o resultado) e uma temperatura mais alta da reação, por exemplo. As enzima de restrição que não são enzimas de clivagem hidrolítica selecionadas para o uso no método podem ser enzimas de ocorrência natural ou então desenhadas.

[0053] Na seleção da enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica para o uso no método, o elemento versado na técnica irá reconhecer que é necessário identificar uma enzima com um sítio de clivagem apropriado a fim de assegurar que uma modificação seja incorporada na posição correta para bloquear a clivagem do cordão relevante e não o outro cordão. Por exemplo, em uma modalidade em que é usado um dNTP modificado, tal como um dNTP de alfa tiol, pode ser preferível selecionar uma enzima de restrição com um sítio de cliva- gem que caia fora da sequência de reconhecimento, tal como uma en- zima de restrição assimétrica com uma sequência de reconhecimento não palindrômica, a fim de conferir flexibilidade suficiente para posicio- nar os iniciadores de maneira tal que a sequência de ácidos nucleicos alvo contenha a base de nucleotídeo modificada no local apropriado para bloquear a clivagem do cordão relevante depois da sua incorpora- ção. Por exemplo, se o dATP de alfa tiol for usado, a sequência com- plementar reversa do sítio de clivagem da enzima de restrição no inici- ador de oligonucleotídeo relevante deve conter uma base de adenosina a jusante da posição de clivagem no dito cordão complementar reverso, mas não deve conter uma base de adenosina a jusante do sítio de cli- vagem na sequência, a fim de assegurar que o iniciador seja clivado apropriadamente na execução do método. Portanto, as enzimas de res- trição assimétricas com uma sequência de reconhecimento não palin- drômica que clivam fora de sua sequência de reconhecimento são ide- almente adequadas para o uso na presente invenção. As enzimas de restrição de reconhecimento de sequência palindrômica parcial ou de- generada que clivam dentro de seu sítio de reconhecimento também podem ser usadas. As modificações de ligação de nucleotídeos resis- tentes à nuclease, por exemplo, PTO, podem ser usadas para bloquear a clivagem de um ou outro cordão por uma faixa ampla de agentes de clivagem de cordão duplo comercialmente disponíveis de várias classes diferentes, incluindo as enzimas de restrição do tipo IIS e do tipo IIG com sequências de reconhecimento de restrição palindrômicas e assi- métricas parciais ou degeneradas, a fim de permitir o seu uso no método da invenção.

[0054] A enzima de restrição é usada tipicamente no método em uma quantidade de 0,1 a 100 unidades, onde uma unidade é definida como a quantidade de agente requerida para digerir 1 µg de T7 DNA em 1 hora a uma certa temperatura (por exemplo, 37°C) em um volume total da reação de 50 µl. No entanto, a quantidade depende de uma série de fatores, tais como a atividade da enzima selecionada, a concentração e a forma da enzima, a concentração antecipada do ácido nucleico alvo, o volume da reação, a concentração dos iniciadores e a temperatura da reação, e não deve ser considerada como limitadora de nenhuma ma- neira. As pessoas versadas na técnica irão compreender que uma en- zima de restrição usada no método vai requerer um tampão e sais apro- priados, por exemplo, íons de metais divalentes, para a função eficaz e eficiente, o controle do pH e a estabilização da enzima.

[0055] Em uma modalidade, a primeira e a segunda enzimas de res- trição são uma mesma enzima de restrição. Ao usar somente uma única enzima de restrição, o método é simplificado em um número de manei- ras. Por exemplo, somente uma única enzima que é compatível com outros componentes da reação precisa ser identificada, otimizada para a execução do método, manufaturada e estabilizada. A utilização de uma única enzima de restrição também simplifica o desenho dos inicia- dores de oligonucleotídeos e suporta a simetria do processo de amplifi- cação.

[0056] No método, as enzimas de restrição clivam somente um cor- dão do duplex de ácido nucleico, e desse modo depois da clivagem elas apresentam um grupo hidroxila 3' exposto que pode agir como um sítio de formação de iniciadores eficiente para uma polimerase. Uma polime- rase é uma enzima que sintetiza cadeias ou polímeros de ácidos nuclei- cos ao estender um iniciador e gerar uma "cópia" complementar reversa de um cordão de molde de DNA ou RNA ao usar interações de empa- relhamento de base. Uma polimerase com capacidade de deslocamento de cordão é usada na execução do método a fim de que os cordões sejam deslocados apropriadamente para afetar o processo de amplifi- cação. O termo "deslocamento de cordão" se refere capacidade de uma polimerase de deslocar o DNA a jusante encontrado durante a síntese. Uma faixa de polimerases com capacidade de deslocamento de cordão que operam a temperaturas diferentes foi caracterizada e está comerci- almente disponível. Por exemplo, a polimerase Phi29 tem uma capaci- dade muito forte de deslocar cordões. As polimerases da espécie Baci- llus, tal como Bst DNA Polymerase Large Fragment, exibem tipicamente uma elevada atividade de deslocamento de cordão e são bem adequa- das para uso na execução do método. O fragmento Klenow de E. coli Klenow (exo-) é uma outra polimerase extensamente usada de desloca- mento de cordão. As polimerases de deslocamento de cordão podem ser desenhadas de imediato, tal como KlenTaq, tal como por meio da clonagem de somente o domínio da polimerase ativa relevante de uma enzima endógena e knock-out de qualquer atividade de exonuclease. Para a execução do método em que o ácido nucleico alvo de um só cordão é o RNA, a atividade da síntese de DNA dependente de RNA (transcriptase reverso) também é requerida, em que a atividade pode ser executada pela polimerase de deslocamento de cordão e/ou por uma enzima de transcriptase reversa adicional separada na etapa a), por exemplo M-MuLV ou AMV.

[0057] A(s) polimerase(s) é(são) usada(s) tipicamente nas etapas relevantes do método em uma quantidade apropriada que é otimizada dependendo da enzima, da concentração de reagentes e da tempera- tura desejada da reação. Por exemplo, de 0,1 a 100 unidades de uma polimerase de Bacillus podem ser usadas, onde uma unidade é definida como a quantidade de enzima que irá incorporar 25 nmol de dNTP no material insolúvel em ácido em 30 minutos a 65°C. No entanto, a quan- tidade depende de uma série de fatores tais como a atividade da poli- merase, a sua concentração e forma, a concentração antecipada do ácido nucleico alvo, o volume da reação, o número e a concentração dos iniciadores de oligonucleotídeos e a temperatura da reação, e não deve ser considerada como limitadora de nenhuma maneira.

[0058] As pessoas versadas na técnica saberão que as polimerases requerem que os monômero de dNTP tenham a atividade da polimerase e também que requerem um tampão apropriado, com componentes tais como sais de tampão, íons divalentes e agentes estabilizantes. Além disso, um ou mais dNTPs modificados são usados no método a fim de bloquear a clivagem da cordão complementar reversa dos iniciadores depois da incorporação pela polimerase de deslocamento de cordão. Tipicamente quando um único dNTP modificado é usado, os dNTPs usados no método irão omitir a base correspondente. Por exemplo, em uma modalidade em que o dNTP modificado é dATP de alfa tiol, os dNTPs irão compreender somente dTTP, dCTP e dGTP e não irão in- cluir dATP. A remoção da base natural correspondente de dNTP asse- gura que os todos os sítios de clivagem de cordão requeridos inferiores dentro da sequência complementar reversa dos iniciadores sejam blo- queados uma vez que somente a base modificada está disponível para a incorporação pela polimerase, no entanto, a remoção completa ou par- cial da base natural correspondente do dNTP não é essencial. Os dNTPs podem ser tipicamente usados no método em concentrações si- milares àquelas empregadas em outros métodos de polimerase, tais como concentrações que variam de 10 micromolar a 1 milimolar, em- bora a concentração do dNTP para o método possa ser otimizada para qualquer enzima e reagentes, a fim de maximizar a atividade e minimi- zara síntese ab initio para evitar a geração de sinais de fundo. Dado que determinadas polimerases podem exibir uma taxa mais baixa de incor- poração com uma ou mais bases de dNTP modificadas, uma ou mais bases modificadas podem ser usadas no método a uma concentração relativa mais elevada que os dNTPs não modificados, tal como a uma concentração cinco vezes maior, embora isto deva ser considerado não limitador.

[0059] O uso de um ou mais dNTPs modificados é uma caracterís- tica integral da presente invenção que oferece uma vantagem impor- tante além de prover enzimas de restrição para clivar somente um cor- dão de seus sítios de restrição. Por exemplo, determinados dNTPs mo- dificados, tais como dNTPs de alfa tiol, conduzem a uma redução na temperatura de fusão (Tm) do DNA ao qual são incorporados, o que significa que os iniciadores de oligonucleotídeos e as sondas usados no método têm uma afinidade maior com a hibridização para a espécie den- tro do produto de amplificação do que quaisquer cordões complemen- tares de dNTP modificados competitivos durante a amplificação. Esta característica chave realça a taxa de amplificação uma vez que, por exemplo, quando um dos cordões deslocadas hibridiza ao seu comple- mento reverso para produzir uma espécie de ponto extremo "não pro- dutiva", ele se dissocia mais rapidamente do que a hibridização "produ- tiva" do dito cordão deslocado a um outro iniciador devido à presença de uma ou mais bases modificadas que conduzem a uma redução na Tm de hibridização. Foi relatado que as ligações internucleotídeos de fosforotioato podem reduzir a Tm, a temperatura à qual exatamente uma metade dos cordões únicos de um duplex é hibridizada, por 1 a 3°C por adição, uma mudança substancial nas propriedades físico-químicas. Também foi observada uma taxa realçada de deslocamento de cordão quando as ligações de nucleotídeos de fosforotioato estão presentes em uma sequência de DNA. Além disso, as sondas de oligonucleotídeos usadas no método, se foram colocadas em contato com a amostra si- multaneamente à execução da etapa a) ou subsequentemente, pos- suem uma afinidade maior com essas espécies dentro do produto de amplificação do que qualquer espécie modificada competitiva, e podem desse modo hibridizar de preferência ou até mesmo deslocar os cordões hibridizados para facilitar a produção da espécie detectora. A Tm redu- zida e o deslocamento realçado da espécie do produto de amplificação como resultado das ligações de internucleotídeos modificadas servem para realçar fundamentalmente a taxa do método e reduzir a tempera- tura requerida para que uma rápida amplificação ocorra.

[0060] Além do realce da taxa resultante do uso de um ou mais nu- cleotídeos modificados, a especificidade de hibridização dos iniciadores de oligonucleotídeos e sondas do método também é realçada. Dado que todas as bases de um nucleotídeo particular são substituídas tipica- mente dentro do produto de amplificação, os sítios de hibridização dos iniciadores e das sondas contêm tipicamente bases modificadas e a Tm reduzida que resulta das ligações internucleotídeos de fosforotioato, por exemplo, significa que as incompatibilidades de sequências de hibridi- zação não específica têm menos probabilidade de ser toleradas.

[0061] Desse modo, a característica integral do método da invenção para um ou mais dNTPs modificados conduz aos benefícios fundamen- tais que realçam a sensibilidade e a especificidade de amplificação e são bastante contrastantes com os métodos conhecidos sem tal requi- sito quanto a nucleotídeos modificados, tais como NEAR (WO2009/012246), incluindo variantes de NEAR com iniciadores otimi- zados por software (WO2014/164479) ou um início quente ou uma re- dução controlada da temperatura (WO2018/002649).

[0062] Existe um número de dNTPs modificados diferentes, tais como os dNTPs modificados que conferem resistência à nuclease de- pois da sua incorporação por uma polimerase, e eles podem ser empre- gados no método para concretizar a resistência à clivagem pela enzima de restrição e, nas modalidades, outras características para realçar a execução do método para uma dada aplicação. Além dos dNTPs de alfa tiol que conferem resistência à nuclease e uma redução na Tm, os dNTPs modificados que são relatados como dotados de potencial para a incorporação de polimerase e para conferir resistência à nuclease, in- cluem derivados de nucleotídeos equivalentes, tais como derivados de Borano, bases modificadas com 2'-O-Metil (2’OMe) e bases de 2'-Flu- oro. Outros dNTPs modificados ou compostos equivalentes que podem ser incorporados por polimerases e ser usados nas modalidades do mé- todo para realçar propriedades particulares do método incluem aqueles que diminuem a afinidade de ligação, por exemplo Inosina-5'-Trifosfato ou 2'-Deoxizebularina-5'-Trifosfato, aqueles que aumentam a especifici- dade de ligação, por exemplo 5-Metil-2'-deoxicitidina-5'-Trifosfato ou 5- [(3-Indolil)propionamida-N-alil]-2'-deoxiuridina-5'-Trifosfato, e aqueles que realçam a síntese de regiões ricas em GC, por exemplo, 7-deaza-

dGTP. Determinadas modificações podem aumentar a Tm, o que con- fere um potencial adicional para o controle dos eventos de hibridização nas modalidades do método.

[0063] As etapas a), b) e c) podem ser executadas em uma ampla faixa de temperaturas. A temperatura ideal para cada etapa é determi- nada pela temperatura ideal da polimerase e resinas de restrição rele- vantes e pela temperatura de fusão das regiões de hibridização dos ini- ciadores de oligonucleotídeos. De modo marcante, o método não usa ciclos de temperatura na etapa a). Além disso, a etapa de amplificação a) não requer nenhuma oscilação controlada da temperatura, nem qual- quer início quente ou morno, pré-aquecimento ou uma diminuição con- trolada da temperatura. O método permite que as etapas sejam execu- tadas em uma ampla faixa de temperatura, por exemplo, de 15°C a 60°C, tal como de 20 a 60°C, ou de 15 a 45°C. De acordo com uma modalidade, a etapa a) é executada em uma temperatura não maior do que 50°C, ou de cerca de 50°C. Dada a ampla gama de enzimas de restrição que não são as enzimas de clivagem hidrolítica disponíveis para o uso no método, é possível selecionar enzimas de restrição com uma taxa rápida a temperaturas relativamente baixas em comparação aos métodos alternativos com o uso de enzimas de clivagem hidrolítica. O uso de um ou mais nucleotídeos modificados também reduz a tempe- ratura de amplificação requerida. Além de ter o potencial para um perfil de temperatura ideal mais baixa em comparação aos métodos conheci- dos, o método da invenção pode ser executado em uma faixa não usu- almente ampla de temperaturas. Tais características são altamente atraentes para o uso do método em um dispositivo de diagnóstico de baixo custo, onde o aquecimento controlado impõe restrições físicas complexas que aumentam os custo dos produtos de tal dispositivo até um ponto em que um dispositivo de um só uso ou livre de instrumentos não seja comercialmente viável. Uma série de ensaios foi desenvolvida ao usar o método que pode executar a detecção rápida do ácido nu- cleico alvo à temperatura ambiente ou em torno de 37°C, por exemplo. Dessa maneira, em uma modalidade adicional, a etapa a) é executada a uma temperatura não maior do que 45°C, ou de cerca de 45°C. Pode ser preferível iniciar o método a uma temperatura mais baixa do que a temperatura alvo a fim de simplificar as etapas do usuário e diminuir o tempo total até o resultado. Dessa maneira, em uma modalidade adici- onal do método, a temperatura da etapa a) é aumentada durante a am- plificação. Por exemplo, a temperatura do método pode começar à tem- peratura ambiente, tal como 20°C, e aumentar por um período, tal como dois minutos, até a temperatura final, tal como cerca de 45°C ou 50°C. Em uma modalidade, a temperatura é aumentada durante a execução da etapa a), tal como um aumento de uma temperatura inicial ambiente, por exemplo, na faixa de 15 a 30°C, até uma temperatura na faixa de 40 a 50°C.

[0064] O potencial da temperatura baixa e a versatilidade do mé- todo da invenção significam que, ao contrário dos métodos conhecidos, ele é compatível com as condição requeridas para uma faixa de outros ensaios, tais como imunoensaios ou ensaios enzimáticos para a detec- ção de outros biomarcadores, tais como proteínas ou moléculas peque- nas. Portanto, o método pode ser usado, por exemplo, para a detecção simultânea de ambos ácidos nucleicos e proteínas ou moléculas peque- nas de interesse dentro de uma amostra. Os componentes requeridos para a execução do método, incluindo as enzimas de restrição que não são enzimas de clivagem hidrolítica, polimerase de DNA de desloca- mento de cordão, iniciadores de oligonucleotídeos, sondas de oligonu- cleotídeos, dNTPs e um ou mais dNTPs modificados, podem ser liofili- zados ou secados por congelamento para a armazenagem estável, e a reação pode então ser ativada por reidratação, tal como mediante a adi- ção da amostra. Tal liofilização ou secagem por congelamento para a armazenagem estável requer tipicamente uma adição de um ou mais excipientes, tal como a trehalose, antes de secar os componentes. Uma faixa muito larga de tais excipientes e estabilizantes para a liofilização ou secagem por congelamento é conhecida e disponível para os testes, a fim de identificar uma composição apropriada para os componentes requeridos para a execução do método.

[0065] Será aparente à pessoa versada na técnica que o método da invenção, que é um método de amplificação baseada em polimerase, pode ser realçado pela adição de um ou mais aditivos que mostraram realçar PCR ou outros métodos de amplificação baseados em polime- rase. Tais aditivos incluem, mas sem ficar a eles limitados, ao tetra-hi- drotiofeno 1-óxido, base livre de L-lisina, L-arginina, glicina, histidina, ácido 5-amino valérico, 1,5-diamino-2-metil pentano, N,N’-diisopropileti- leno diamina, tetrametileno diamina (TEMED), cloreto de tetrametil amô- nio, oxilato de tetrametil amônio, metil sulfona acetamida, brometo de hexadecil trimetil amônio, aldeído de betaína, cloreto de tetraetil amônio, cloreto de (3-carboxipropil)trimetil amônio, cloreto de tetrabutil amônio, cloreto de tetrapropil amônio, formamida, dimetil formamida (DMF), N- metil formamida, N-metil acetamida, N, N-dimetil acetamida, L-treonina, N,N-dimetil etilenodiamina, 2-pirrolidona, HEP (N-hidróxi etil pirroli- dona), NMP (N-metil pirrolidona) e 1-metil, 1-ciclohexil-2-pirrolidona (pir- rolidinonas), δ-valero lactama, N-metil succinimida, 1-formil pirrolidina, 4-formil morfolina, DMSO, sulfolano, trehalose, glicerol, Tween-20, DMSO, betaína e BSA.

[0066] As investigações revelaram que o presente método é eficaz em uma ampla faixa de níveis de ácido nucleico alvo, incluindo a detec- ção até números de cópias muito baixos e até mesmo únicas. Os inici- adores de oligonucleotídeo são tipicamente providos em um amplo ex- cesso em relação ao ácido nucleico alvo. Tipicamente, a concentração de cada iniciador fica na faixa de 10 a 200 nM embora isso deva ser considerado como não limitador. Uma maior concentração de iniciado- res pode realçar a eficiência de hibridização e, portanto, aumentar a ve- locidade da reação. No entanto, efeitos de fundo não específicos, tais como dímeros de iniciadores, também podem ser observados a uma concentração elevada e, portanto, a concentração dos primeiros e se- gundos iniciadores de oligonucleotídeos fazem parte do processo de oti- mização para qualquer ensaio que emprega o método. Em uma moda- lidade, os primeiros e segundos iniciadores de oligonucleotídeos são providos à mesma concentração. Em uma modalidade alternativa, um dentre o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeos é provido em excesso em relação ao outro. A velocidade da reação pode ser re- duzida nas modalidades em que um dos iniciadores é provido em ex- cesso em relação ao outro devido à simetria natural do processo de am- plificação cíclica, no entanto, em determinadas circunstâncias ele pode ser usado para reduzir o sinal de fundo não específico no método e/ou realçar a capacidade da primeira e da segunda sondas de oligonucleo- tídeos de hibridizar para produzir a espécie detectora. É desejável que ambos os iniciadores estejam presentes a um nível tal que não se torne limitador antes que a espécie detectora suficiente seja produzida para a detecção com o meio de detecção selecionado.

[0067] Há uma série de considerações para o desenho dos inicia- dores de oligonucleotídeos para a execução do método. Cada um den- tre o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeos deve com- preender na direção 5’ a 3’ um cordão de uma sequência de reconheci- mento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região de hibridização, em que a dita região de hibridização pode hibridizar a uma primeira região de hibridização no ácido nucleico alvo no caso do pri- meiro iniciador e ao complemento reverso de uma segunda sequência de hibridização a montante da primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo no caso do segundo iniciador. Um par de iniciadores é desenhado desse modo para amplificar uma região do ácido nucleico alvo. A sequência de reconhecimento de enzima de restrição dos inici- adores não está tipicamente presente dentro da sequência e desse modo o ácido nucleico alvo forma uma saliência durante os eventos ini- ciais de hibridização antes de ser introduzido no amplicon (vide a Figura 1). No caso em que uma enzima de restrição assimétrica é usada, o sítio de clivagem fica tipicamente a jusante da sequência de reconhecimento e, portanto, pode ficar opcionalmente presente dentro da sequência de hibridização do iniciador.

[0068] Os iniciadores de oligonucleotídeos são desenhados de ma- neira tal que, depois da sua clivagem no método, a sequência 5' do sítio de clivagem forma um iniciador a montante com uma temperatura de fusão suficiente (Tm) para permanecer hibridizado ao sua cordão com- plementar reverso sob as condições desejadas da reação e para deslo- car o cordão a jusante do sítio de clivagem depois da extensão do grupo hidroxila 3' pela polimerase de DNA de deslocamento de cordão. Desse modo, uma região "de estabilização" adicional pode ser incluída na ex- tremidade 5' dos iniciadores de oligonucleotídeos, cujo comprimento ideal é determinado pela posição do sítio de clivagem em relação à se- quência de reconhecimento para a enzima de restrição relevante e ou- tros fatores tais como a temperatura a ser usada para a amplificação na etapa a). Desse modo, em uma modalidade, o primeiro e/ou o segundo iniciadores de oligonucleotídeos compreendem uma sequência de esta- bilização a montante da sequência de reconhecimento de enzima de restrição e do sítio de clivagem, tal como na extremidade 5' e, por exem- plo, com 5 ou 6 bases de comprimento.

[0069] Durante o desenho do iniciador, é necessário definir a se- quência e o comprimento de cada região de hibridização a fim de per- mitir a hibridização específica de sequência ideal e o deslocamento de cordão para assegurar a amplificação específica e sensível no método.

O posicionamento dos iniciadores dentro do ácido nucleico alvo a ser detectado, por exemplo, dentro do genoma de um patógeno viral ou bacteriano, pode ser variado para definir a sequência da região de hibri- dização dos iniciadores e para selecionar desse modo os iniciadores com a sensibilidade ideal e a especificidade para a amplificação e a compatibilidade com as sondas de oligonucleotídeos. Portanto, pares de iniciadores diferentes podem ser selecionados para identificar a se- quência ideal e o posicionamento para a execução do método. O com- primento da região de hibridização dos iniciadores é desenhado tipica- mente de maneira tal que a sua Tm teórica permita a hibridização efici- ente à temperatura desejada da reação, mas também seja deslocada de imediato depois da clivagem. Durante o desenho do iniciador, a Tm teórica da sequência de hibridização e da sequência de cordões deslo- cados é considerada no contexto da temperatura provável da reação e da enzima de restrição selecionada, que é balanceada com a melhoria teórica para a especificidade derivada de sequência de ligação que pode resultar quando o comprimento da sequência é aumentado. Várias investigações indicaram uma versatilidade considerável no desenho dos iniciadores a ser usados eficazmente no método. Em uma modalidade, a região de hibridização do primeiro e/ou segundo iniciadores de oligo- nucleotídeos tem um comprimento entre 6 e 30, por exemplo, entre 9 e 16, bases. Em outras modalidades, modificações tais como bases não naturais e sítios de ligação internucleotídeos alternativos ou sítios abá- sicos podem ser empregadas nas regiões de hibridização dos iniciado- res para refinar as suas propriedades e o funcionamento do método para uma aplicação particular. Por exemplo, uma modificação que re- alça a Tm, tal como PNA, LNA ou G-clamp, pode permitir uma região de hibridização de iniciador mais curta e mais específica que permita um amplicon mais curto e desse modo realce a taxa de amplificação.

[0070] Várias investigações revelaram que a taxa do método e a sua sensibilidade podem ser realçadas quanto se tem um amplicon curto e desse modo em determinadas modalidades pode ser preferível encurtar o comprimento total dos iniciadores, incluindo a sua sequência de hibridização, e posicionar os iniciadores com somente uma abertura curta, tal como 10 ou 15 bases de nucleotídeo ou menos, entre a pri- meira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo. Em uma modalidade, a primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo são separadas por 0 a 15 ou 0 a 6 bases, e em determinadas modalidades elas são separadas por 3 a 15 ou 3 a 6 ba- ses, por exemplo 5, 7 ou 11 bases. Em uma modalidade adicional, as sequências de hibridização são sobrepostas, tal como por 1 a 2 bases.

[0071] Há uma série de considerações ao desenho da sequência das sonda de oligonucleotídeos para o uso no método. Em primeiro lu- gar, a região na primeira sonda de oligonucleotídeo que hibridiza à pri- meira sequência de detecção de um só cordão e a região na segunda sonda de oligonucleotídeo que hibridiza à segunda sequência de detec- ção de um só cordão são desenhadas tipicamente de maneira tal que não se sobrepõem ou têm uma sobreposição mínima, para permitir que ambas as sonda de oligonucleotídeos se liguem ao mesmo tempo a pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação. Elas também são desenhadas tipicamente para hibridizar principalmente à sequência que cai entre a posição do sítio de clivagem em uma cordão da espécie do produto de amplificação e a posição oposta ao sítio de clivagem no cordão complementar reverso ao mesmo, a fim de assegurar que uma ou mais espécies dentro do produto de amplificação sejam visadas efi- cientemente e que ambas as sondas de oligonucleotídeos se liguem ao mesmo cordão. Para qualquer par de iniciadores, um ou outro cordão pode ser selecionado como alvo pelas sondas de oligonucleotídeo. Dado que as sondas de oligonucleotídeos não são estendidas tipica- mente por uma polimerase no método, as sequências de hibridização são desenhadas com base na sequência relevante da espécie dentro do produto de amplificação, o que determina a sua Tm, %GC e os dados de desempenho experimentais obtidos.

Em uma modalidade, a sequên- cia de hibridização da primeira e da segunda sondas de oligonucleotí- deos tem um comprimento de 9 a 20 bases de nucleotídeo.

Em uma modalidade em que a primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo são separadas por 0 base, a sequência das regi- ões de hibridização de uma das sondas de oligonucleotídeo pode cor- responder a um dos iniciadores de oligonucleotídeo e a região de hibri- dização da outra sonda de oligonucleotídeo deve corresponder ao com- plemento reverso do outro iniciador de oligonucleotídeo.

No entanto, o comprimento das sequências de hibridização pode ser truncado a fim de otimizar as propriedades das sondas de oligonucleotídeos para a modalidade desejada do método e evitar quaisquer efeitos inibidores no caso em que toda ou uma parte da etapa b) é executada simultanea- mente com a etapa a). No caso em que a primeira ou a segunda sondas de oligonucleotídeos engloba uma sequência de reconhecimento e sítio de clivagem para a primeira ou segunda enzimas de restrição e a dita sonda de oligonucleotídeo é colocada em contato com a amostra simul- taneamente à execução da etapa a), o sítio de clivagem dentro da dita sonda é tipicamente bloqueado, por exemplo, pela inclusão de uma li- gação internucleotídeos modificada, por exemplo, uma ligação de fos- forotioato, durante a síntese química da sonda ou a introdução de uma incompatibilidade para remover a dita sequência de reconhecimento.

Com exceção das regiões de hibridização, há uma versatilidade consi- derável para a sequência das sondas de oligonucleotídeos e para quais- quer bases de nucleotídeos modificadas, ligações de nucleotídeos ou outras modificações que estes podem compreender.

As bases modifi- cadas que podem ser quimicamente introduzidas em oligonucleotídeos para alterar as suas propriedades e podem ser empregadas nas moda- lidades dos métodos, tais como 2-Amino-dA, 5-Metil-dC, Super T®, ba- ses de 2-Fluoro e G-clamp, conferem um aumento na Tm, ao passo que outras tais como Iso-dC e Iso-G, podem realçar a especificidade da li- gação sem aumentar a Tm. Outras modificações tais como a inosina ou sítios abásicos podem diminuir a especificidade da ligação. As modifi- cações conhecidas como propiciadoras de resistência à nuclease in- cluem o descolamento invertido e ddT e os espaçadores C3. As modifi- cações podem aumentar ou diminuir a Tm e prover o potencial para o controle dos eventos de hibridização nas modalidades do método. O uso de bases modificadas dentro das regiões de hibridização das sondas de oligonucleotídeos propicia uma oportunidade de melhorar o desempe- nho das sondas de oligonucleotídeos, tal como realçar a sua afinidade de ligação sem aumentar o comprimento da região de hibridização. Em uma modalidade, as bases modificadas dentro de uma ou ambas as sondas de oligonucleotídeos permitem que elas hibridizem mais eficaz- mente, e desse modo sejam mais competitivas, do que quaisquer espé- cies dentro do produto de amplificação com complementaridade à se- quência de detecção de um só cordão relevante.

[0072] Nas modalidades em que uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos é bloqueada na extremidade 3' da exten- são e não pode ser clivada e é colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a), tipicamente uma dita sonda de oligonucleotídeo vai compreender uma região 5' adicional, o que pro- picia a oportunidade para a estabilização da espécie de pré-detecção tal como descrito (vide a Figura 2). Em uma modalidade, uma dita sonda de oligonucleotídeo compreende a sequência exata de um dos iniciado- res de oligonucleotídeos, mas contém uma modificação na extremidade 3' para bloquear a sua extensão pela polimerase de DNA de desloca- mento de cordão e uma única ligação internucleotídeos de fosforotioato para bloquear o sítio de clivagem da enzima de restrição. Tal modali- dade simplifica o desenho do ensaio e assegura que nenhum motivo de sequência adicional seja introduzido que possa conduzir à amplificação de fundo não específica.

[0073] As primeiras e segundas sondas de oligonucleotídeos que produzem a espécie detectora são de preferência providas a um nível em que o número de cópias das espécies de detecção produzidas é suficientemente superior ao limite da detecção dos meios empregados para que a dita espécie detectora seja detectada de imediato. Além disso, a eficiência de hibridização pela primeira e/ou segunda sonda de oligonucleotídeo é influenciada por sua concentração. Tipicamente, a concentração de uma sonda de oligonucleotídeo colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a) pode ser simi- lar à concentração dos iniciadores de oligonucleotídeos, por exemplo, de 10 a 200 nM, embora isso deva ser considerado como não limitador. Em uma modalidade, a concentração de uma ou ambas as sondas de oligonucleotídeos é provida em excesso em relação à concentração de um ou ambos os iniciadores de oligonucleotídeos, ao passo que em uma outra modalidade a concentração de uma ou ambas as sondas de oli- gonucleotídeos é provida a uma concentração mais baixa do que um ou ambos os iniciadores de oligonucleotídeos. No caso em que uma ou ambas as sondas de oligonucleotídeos são colocadas em contato com a amostra subsequente à execução da etapa de amplificação a), uma concentração maior pode ser permitida tal como necessário para reali- zar uma hibridização mais eficiente, sem nenhuma consideração à ini- bição à etapa de amplificação a) que pode resultar.

[0074] As sequências de hibridização são uma característica chave dos iniciadores de oligonucleotídeos e das sondas de oligonucleotídeos para a execução do método. A hibridização se refere à hibridização es-

pecífica de sequência que é a capacidade de um iniciador de oligonu- cleotídeo ou da sonda de se ligar a um ácido nucleico ou a uma espécie alvo dentro do produto de amplificação em virtude do emparelhamento de bases da ligação de hidrogênio entre bases complementares na se- quência de cada ácido nucleico.

Os emparelhamentos de bases típicos são de Adenina-Timina (A-T), ou de Adenina-Uracil no caso de duplex híbridos de RNA ou RNA/DNA, e de Citosina-Guanina (C-G), embora uma faixa de análogos naturais e não naturais de bases de ácidos nu- cleicos também seja conhecida com preferências de ligação particula- res.

Além disso, na presente invenção, a região de complementaridade de uma sonda de oligonucleotídeo ou iniciador não precisa necessaria- mente compreender bases de ácidos nucleicos completamente naturais em uma sequência com complementaridade completa e exata à sua se- quência de hibridização no ácido nucleico ou na espécie alvo dentro do produto de amplificação; ao invés disto, para a execução do método as sondas/iniciadores de oligonucleotídeos só precisam ser capazes de hi- bridizar especificamente a sequência à sua sequência de hibridização alvo suficientemente para formar a sequência de cordão duplo neces- sária para o funcionamento correto do método, incluindo a clivagem pe- las enzima de restrição e a extensão pela polimerase de DNA de deslo- camento de cordão.

Portanto, tal hibridização pode ser possível sem uma complementaridade exata, e com bases não naturais ou sítios abá- sicos.

Em uma modalidade, as regiões de hibridização de um iniciador de oligonucleotídeo ou da sonda de oligonucleotídeo usada no método podem consistir em uma complementaridade completa à sequência da região relevante de ácido nucleico ou da espécie alvo dentro do produto de amplificação, ou em sua sequência complementar reversa, tal como apropriado.

Em outras modalidades, há um ou mais pares base sem complementaridade.

Em algumas circunstâncias pode ser vantajoso usar uma mistura de iniciadores e/ou sondas de oligonucleotídeos no método. Desse modo, a título de exemplo, no caso de um ácido nucleico alvo que compreende um único sítio de polimorfismo de nucleotídeo (SNP) que tem duas posições polimórficas, uma mistura 1:1 de inicia- dores de oligonucleotídeos e sondas de oligonucleotídeos que diferem nessa posição (cada componente tem uma complementaridade à base respectiva do SNP) pode ser usada. Durante a manufatura dos oligonu- cleotídeos é prática rotineira a randomização de uma ou mais bases durante o processo de síntese.

[0075] A pessoa versada na técnica irá compreender que os pro- cessos de amplificação que envolvem polimerases podem apresentar uma amplificação de fundo não específica, tal como aquela que resulta ab initio da síntese e/ou da ligação iniciador-iniciador. Embora o método da invenção exiba tipicamente uma amplificação mais rápida quando o comprimento do amplicon é desenhado tão curto quanto possível, por exemplo, ao minimizar as sequências de hibridização dos iniciadores, a abertura entre a primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo e o comprimento de qualquer região de estabiliza- ção, até a extensão possível, embora ainda retendo a função à tempe- ratura de reação em questão. Com amplicons mais curtos, o fundo não específico pode ser exacerbado devido ao fato que qualquer sequência necessária para produzir a espécie do produto de amplificação é provida pelos iniciadores de oligonucleotídeos. No caso em que um amplicon é produzido de uma maneira específica não visada que compreende o primeiro iniciador de oligonucleotídeo e o segundo iniciador de oligonu- cleotídeo "conectados" através de um DNA sintetizado ab initio ou uma ligação iniciador-iniciador, um resultado falso positivo pode ocorrer no método. O uso de duas sondas de oligonucleotídeos no presente mé- todo permite uma variedade de modalidades do método que engloba características adicionais para minimizar qualquer possibilidade de sinal de fundo específico não visado. Tais modalidades tornaram possível,

mediante o uso de duas sondas de oligonucleotídeos, apresentar uma vantagem substancial em relação aos métodos conhecidos a este res- peito.

[0076] Uma abordagem consiste em separar a primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo para prover uma ve- rificação da especificidade da sequência baseada no alvo ao usar as sondas de oligonucleotídeos do método. Desse modo, em uma modali- dade, a primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nu- cleico alvo são separadas por 3 a 15 ou por 3 a 6 bases, por exemplo 5, 7 ou 11 bases. Essa abertura entre os iniciadores apresenta a aber- tura de tamanho ideal para prover uma verificação adicional da especi- ficidade na espécie dentro do produto de amplificação enquanto que ainda mantém a taxa realçada de um amplicon curto. Desse modo, em uma modalidade, na etapa b) tanto a primeira quanto a segunda se- quência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie den- tro do produto de amplificação inclui pelo menos 3 bases da sequência que correspondem às ditas 3 a 15 ou 3 a 6 bases. Por exemplo, foi demonstrado o potencial de distinguir um produto de amplificação de- pendente de alvo específico dos produtos de amplificação de fundo es- pecíficos não visados, tal como mostrado no Exemplo 4 (Figura 8).

[0077] Em uma abordagem alternativa, a concentração do primeiro e/ou segundo iniciadores de oligonucleotídeos é diminuída para reduzir a probabilidade do fundo resultante da amplificação ab initio e da ligação iniciador-iniciador. A fim de assegurar que a taxa de amplificação seja mantida, os iniciadores de oligonucleotídeos adicionais que são bloque- ados na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA de deslo- camento de cordão podem ser usados. Nesta modalidade, embora o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeos não bloqueados estejam disponíveis a uma concentração suficiente para os eventos ini-

ciais de hibridização e extensão para produzir o amplicon do ácido nu- cleico alvo, a amplificação subsequente prossegue com os iniciadores bloqueados, que são de preferência providos a uma concentração maior, em que a clivagem dos iniciadores bloqueados ocorre antes de sua extensão e deslocamento de cordão a fim de remover a modificação de bloqueio 3' e permitir que o processo de amplificação prossiga sem nenhum detrimento (vide a Figura 4). Desse modo, em uma modalidade, a amostra é adicionalmente colocada em contato na etapa a) com: (A) um terceiro iniciador de oligonucleotídeo, em que o terceiro iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um cordão da sequência de reconheci- mento e um sítio de clivagem para a primeira enzima de restrição e uma região que pode hibridizar à primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo e em que o dito terceiro iniciador é bloqueado na extremi- dade 3' da extensão pela polimerase de DNA; e/ou (B) um quarto inici- ador de oligonucleotídeo, em que o quarto iniciador compreende na di- reção 5’ a 3’ uma cordão da sequência de reconhecimento e do sítio e clivagem para a segunda enzima de restrição e uma região que pode hibridizar ao complemento reverso da segunda sequência de hibridiza- ção no ácido nucleico alvo, e em que o dito quarto iniciador é bloqueado na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA.

Em uma mo- dalidade adicional, quando presente, o terceiro iniciador de oligonucle- otídeo é provido em excesso em relação ao primeiro iniciador de oligo- nucleotídeo e, quando presente, o quarto iniciador de oligonucleotídeo é provido em excesso em relação ao segundo iniciador de oligonucleo- tídeo.

Com a redução da concentração do primeiro e segundo iniciado- res de oligonucleotídeos substancialmente, deslocados pela presença do terceiro e quarto iniciadores de oligonucleotídeos, o benefício poten- cial máximo em termos da remoção de amplificação dependente do fundo não visado é obtido.

Com exceção da presença da modificação 3'

para bloquear a extensão de polimerase que pode ser obtida de imedi- ato através, por exemplo, do uso de um fosfato 3' ou modificação C-3 durante a síntese do iniciador de oligonucleotídeo, os mesmos parâme- tros de desenho que foram empregados para o primeiro e o segundo iniciadores se aplicam ao terceiros e ao quarto iniciadores.

[0078] As modalidades do método da invenção que propiciam a es- pecificidade realçada e a remoção da amplificação do fundo tal como descrito acima, conferem um rigor melhorado da verificação da sequên- cia, que permite reações a baixas temperaturas sejam executadas sem a perda da especificidade e/ou permitem uma multiplexação aumen- tada, onde múltiplas reações são executadas para a detecção simultâ- nea de múltiplos alvos. Os benefícios desta especificidade rigorosa tam- bém significam que o método pode tolerar uma faixa de temperatura ampla e condições subideais (por exemplo, concentrações de reagen- tes) sem perda da especificidade. Por exemplo, o método foi executado com um aumento ou uma diminuição de 20% na concentração de todos os componentes e o método foi executado com um período substancial à temperatura ambiente depois da execução da amplificação na etapa a) em cada caso sem nenhuma perda de especificidade observada. Por- tanto, tais modalidades representam vantagens importantes do método da invenção em relação aos métodos conhecidos, e significam que ele é idealmente adequado à exploração em um dispositivo de diagnóstico de baixo custo e/ou de um só uso.

[0079] A detecção da espécie detectora na etapa c) pode ser reali- zada por qualquer técnica que detecta de maneira diferencial a pre- sença da espécie detectora dos outros reagentes e componentes pre- sentes na amostra. Alternativamente, a presença ou o nível da espécie detectora pode ser inferida do esgotamento de um ou mais componen- tes da reação tais como a primeira ou segunda sondas de oligonucleo-

tídeos. A partir de uma ampla gama de técnicas físico-químicas dispo- níveis para o uso na detecção da espécie detectora, aquelas com capa- cidade de gerar um sinal sensível que só existe depois da hibridização da primeira sonda de oligonucleotídeo e da segunda sonda de oligonu- cleotídeo à espécie relevante no produto de amplificação são prioriza- das para o uso no método. Será aparente a um elemento versado na técnica que existe uma faixa de corantes colorimétricos ou fluorométri- cos que podem ser fixados de imediato à primeira sonda de oligonucle- otídeo e formar a base de sua detecção, tanto visualmente quanto ao usar uma instrumentação, tal como a absorbância ou a espectroscopia de fluorescência.

[0080] Desse modo, em uma modalidade, a porção que permite a detecção da primeira sonda de oligonucleotídeo, é um corante colorimé- trico ou fluorométrico ou uma porção que pode ser fixada a um corante colorimétrico ou fluorométrico tal como a biotina.

[0081] As modalidades do método que usam corantes colorimétri- cos têm a vantagem de não requerer um instrumento para executar a excitação com fluorescência e a detecção e permitir potencialmente que a presença do ácido nucleico alvo seja determinada pelo olho. A detec- ção colorimétrica pode ser obtida diretamente ao fixar um corante colo- rimétrico ou uma porção com capacidade de fixação a um corante colo- rimétrico à primeira sonda de oligonucleotídeo antes de seu uso no mé- todo, ou alternativamente ao fixar ou ligar especificamente o corante ou a porção ao fragmento da sonda depois da clivagem. Por exemplo, a primeira sonda de oligonucleotídeo pode conter uma porção de biotina que permite a sua ligação a um corante colorimétrico conjugado à strep- tavidina para a sua detecção subsequente. Tal exemplo de um corante colorimétrico que pode ser usado na detecção consiste em nanopartí- culas de ouro. Métodos similares podem ser empregados com uma va- riedade de outras porções intrinsecamente colorimétricas, das quais um número muito grande é conhecido, tais como nanopartículas de car- bono, nanopartículas de prata, nanopartículas de óxido de ferro, grânu- los de poliestireno, pontos de quantum, etc. Um corante de elevado co- eficiente de extinção também confere o potencial para a quantificação em tempo real sensível no método.

[0082] Uma série de considerações é levado em consideração ao escolher um corante apropriado para uma dada aplicação. Por exemplo, nas modalidades onde se pretende executar a detecção colorimétrica visível na solução, seria geralmente vantajoso escolher partículas com tamanhos maiores e/ou aquelas com um coeficiente de extinção mais elevado para facilitar a detecção, ao passo que as modalidades que in- corporam uma membrana de fluxo lateral destinada à detecção visível, podem ser beneficiadas pela capacidade de partícula de tamanhos me- nores de se difundir mais rapidamente ao longo de uma membrana. Em- bora vários tamanhos e formatos de nanopartículas de ouro sejam dis- poníveis, um número de outras porções colorimétricas de interesse tam- bém está disponível, as quais incluem microesferas/nanopartículas à base de poliestireno ou látex. As partículas desta natureza também são disponíveis em um número de cores, que podem ser úteis a fim de eti- quetar e detectar de modo diferencial espécies de detecção diferentes durante a execução do método, ou "multiplexar" o sinal colorimétrico produzido em uma reação de detecção.

[0083] A detecção fluorométrica pode ser obtida através do uso de qualquer corante que, sob um estímulo de excitação apropriado, emite um sinal fluorescente que conduz à detecção subsequente da espécie detectora. Por exemplo, as tinturas para a detecção de fluorescência direta incluem, sem limitação: pontos de quantum, corantes ALEXA, flu- oresceína, corantes ATTO, rodamina e vermelho texas. Nas modalida- des do método que usam uma porção de corante fluorescente fixada a uma sonda de oligonucleotídeo, também é possível executar a detecção baseada na transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), tal como usado em PCR quantitativa de Taqman ou estratégias baseadas em balizas moleculares para a detecção do ácido nucleico, por meio do que o sinal deve aumentar ou diminuir depois da fixação do corante à espécie detectora. Geralmente, quando uma abordagem fluo- rométrica é usada, um número de dispositivos de detecção diferentes pode ser usado para gravar a geração do sinal fluorescente, tais como, por exemplo, câmeras CCD, scanners de fluorescência, leitores de mi- croplacas baseados na fluorescência ou microscópios de fluorescência.

[0084] Em uma modalidade adicional, a porção que permite a de- tecção da primeira sonda de oligonucleotídeo é uma enzima que torna um sinal detectável, tal como um sinal colorimétrico ou fluorométrico, depois do contato com um substrato. Será aparente a um elemento ver- sado na técnica que um número de sistemas de substrato de enzima está disponível e eles são usados rotineiramente no campo do diagnós- tico, tal como em ELISA e na detecção de imuno-histoquímica. A pero- xidase de raiz forte (HRP) é um exemplo. A utilização de uma enzima fixada à primeira sonda de oligonucleotídeo para a detecção da espécie detectora na etapa c) oferece uma série de vantagens potenciais, tais como a sensibilidade realçada da detecção e o controle aumentado do desenvolvimento do sinal através de uma etapa separada que envolve a adição do substrato. Outras enzima colorimétricas apropriadas podem incluir: hidrolases, peptidases ou amilases, esterases (por exemplo, a carbóxi esterase), glicosidases (por exemplo, a galactosidase), e glicosil fosfatases (por exemplo, a fosfatase alcalina). Esta lista não deve ser considerada limitadora de nenhuma maneira.

[0085] Em uma outra abordagem, a presença da espécie detectora na etapa c) é detectada eletricamente, tal como por uma mudança na impedância ou uma mudança no sinal condutimétrico, amperométrico, voltamétrico ou potenciométrico, na presença da espécie detectora.

Desse modo, em uma modalidade, a espécie detectora é detectada por uma mudança no sinal elétrico. A mudança no sinal elétrico pode ser facilitada pela porção que permite a detecção da primeira sonda de oli- gonucleotídeo, tal como um grupo químico que conduz a uma mudança realçada no sinal elétrico. Uma vez que a detecção de sinal elétrico pode ser tão sensível, a dita porção de detecção pode ser simplesmente uma sequência de oligonucleotídeos, embora em determinadas modalidades o sinal seja realçado pela presença de grupos químicos conhecidos para realçar sinais elétricos, tais como metais, por exemplo, ouro e carbono.

[0086] Embora em uma modalidade a mudança do sinal elétrico que resulta da acumulação da espécie detectora possa ser detectada em uma reação aquosa durante a amplificação, em outras modalidades a detecção do sinal elétrico é facilitada pela localização da espécie detec- tora em um sítio particular para a sua detecção, tal como a superfície de uma sonda eletroquímica, em que a dita localização é mediada pela se- gunda sonda de oligonucleotídeo.

[0087] Outras técnicas que são empregadas rotineiramente para a detecção de ácidos nucleicos tais como a espécie detectora e também podem ser empregadas para a detecção no método incluem: a espec- trometria de massa (tal como MALDI ou LC-TOF), a espectroscopia ou espectrometria de luminescência, a espectroscopia ou espectrometria de fluorescência, a cromatografia líquida e a polarização de fluorescên- cia.

[0088] Em uma modalidade, a etapa c) produz um sinal colorimé- trico ou eletroquímico ao usar o carbono ou o ouro, de preferência o carbono.

[0089] Em uma modalidade, a espécie detectora é detectada pelo fluxo lateral de ácido nucleico. O fluxo lateral de ácido nucleico, no qual os ácidos nucleicos são separados de outros componentes da reação por sua difusão através de uma membrana, feita tipicamente de nitroce- lulose, é um método de detecção rápido e de baixo custo que pode ser acoplado com uma faixa de leituras de sinais, incluindo sinais colorimé- tricos, fluorométricos e elétricos.

O fluxo lateral de ácido nucleico é bem adequado para o uso na detecção da espécie detectora no método e oferece uma série de vantagens.

Em uma modalidade, a detecção de fluxo lateral de ácido nucleico é executada, em que a primeira sonda de oligonucleotídeo dentro da espécie detectora é usada para fixar um co- rante colorimétrico ou fluorométrico e a segunda sonda de oligonucleo- tídeo dentro da espécie detectora é usada para localizar o dito corante em um local definido na tira de fluxo lateral.

Desta maneira, a detecção rápida pode ser executada com os resultados visualizados pelo olho ou por um instrumento de leitura.

O fluxo lateral de ácido nucleico pode empregar um antígeno como a porção de detecção na segunda sonda de oligonucleotídeo com o anticorpo associado imobilizado na tira de fluxo lateral.

Alternativamente, no presente método a sequência de de- tecção específica através da hibridização da espécie de pré-detecção ou da espécie detectora na tira de fluxo lateral pode ser executada de imediato, provendo uma alternativa simples de baixo custo aos ensaios baseados em anticorpos com potencial de multiplexação melhorado.

Os métodos conhecidos, tal como a SDA, que não utilizam as duas sondas de oligonucleotídeos do presente método, geram tipicamente produtos de DNA de cordão duplo que não estão disponíveis para a detecção baseada na hibridização específica de sequência.

Ao contrário do pre- sente método, a espécie detectora é particularmente suscetível à detec- ção multiplex, em virtude do uso da detecção baseada na hibridização específica de localização.

As nanopartículas de carbono ou de ouro po- dem ser empregadas de imediato no fluxo lateral de ácido nucleico.

A localização da espécie detectora causa a concentração local de carbono ou de ouro, causando o surgimento de uma cor preta ou vermelha, res- pectivamente. Em uma modalidade, a primeira sonda de oligonucleotí- deo contém uma porção, tal como uma biotina, que permite a sua liga- ção a um corante colorimétrico antes da localização na tira pela hibridi- zação específica de sequência.

[0090] O posicionamento espacial da espécie detectora é associada proximamente com a técnica usada para a detecção da espécie detec- tora, uma vez que ele permite, por exemplo, a ligação baseada na hibri- dização da espécie detectora em um local particular. Além de facilitar a detecção rápida e específica, tal fixação física pode realçar o uso do método na detecção multiplex de múltiplos ácidos nucleicos alvo dife- rentes. Em uma modalidade, a segunda sonda de oligonucleotídeo é fixada em uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico ou na superfície de uma sonda eletroquímica, uma placa de 96 poços, grânulos ou uma su- perfície de disposição. Desse modo, pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação fica localizada no local físico da segunda sonda de oligonucleotídeo que é detectada de imediato depois da formação da espécie detectora em tal local. Alternativamente, pode ser vantajoso usar um oligonucleotídeo de um só cordão como a porção fixada à se- gunda sonda de oligonucleotídeo que permite a sua fixação a um mate- rial sólido. Desta maneira, a sequência de oligonucleotídeos fixada à fase sólida pode ser definida independentemente para a sequência de ácidos nucleicos alvo para realçar a eficiência da ligação. Desse modo, em uma modalidade, a porção que permite o fixação da segunda sonda de oligonucleotídeo a um material sólido é um oligonucleotídeo de um só cordão. O dito oligonucleotídeo de um só cordão pode ser desenhado para ter maior afinidade e eficiência de hibridização para realçar a exe- cução do método. Por exemplo, em determinadas modalidades do mé- todo, ao invés de fixar a segunda sonda de oligonucleotídeo à tira de fluxo lateral diretamente, um oligonucleotídeo separado com uma se- quência otimizada para a hibridização na tira é usado, o qual é capaz de hibridização eficiente à porção de oligonucleotídeo de um só cordão presente dentro da segunda sonda de oligonucleotídeo.

[0091] Em várias investigações, foi realçada de maneira significa- tiva a execução do método pelo fluxo lateral de ácido nucleico ao usar um oligonucleotídeo de um só cordão como porção de fixação da se- gunda sonda de oligonucleotídeo, o que provê a sequência de hibridiza- ção na tira a ser realçada. Por exemplo, uma sequência rica em G-C pode ser usada para a hibridização na tira, ou uma sequência mais longa com uma Tm mais elevada pode ser usada, a qual suplementa o comprimento da segunda sonda de oligonucleotídeo. Alternativamente, a dita porção de oligonucleotídeo de um só cordão pode compreender uma ou mais ligações de base modificada ou internucleotídeos para re- alçar a sua afinidade, tal como um PNA, LNA ou G-clamp. Foi observado que quando um motivo de sequência de repetição é usado na porção de oligonucleotídeo de um só cordão, um realce surpreendente da efici- ência de hibridização é observado, o qual não é predito pela sua Tm predita. Desse modo, em uma modalidade, a sequência da porção de oligonucleotídeo de um só cordão compreende três ou mais cópias de repetição do motivo de sequência de DNA de 2 a 4 bases. Por exemplo, nas várias investigações que usam tal motivo de sequência foi obser- vado um realce substancial na sensibilidade da detecção pelo fluxo la- teral de ácido nucleico, normalmente com um realce do sinal de 100 vezes ou mais.

[0092] Desse modo, em uma modalidade em que a presença da es- pécie detectora é detectada pelo fluxo lateral de ácido nucleico, o fluxo lateral de ácido nucleico utiliza um ou mais ácidos nucleicos que são capazes de hibridização específica de sequência à porção que permite a fixação da segunda sonda de oligonucleotídeo a um material sólido.

[0093] Uma vantagem adicional é conferida pelo desacopla- mento da sequência de ácido nucleico alvo do material sólido para a fixação ou do meio da detecção, e isto pode ser permitido pelo uso do oligonucleotídeo de um só cordão como a porção da detecção dentro da primeira sonda de oligonucleotídeo e/ou a porção de fixação com a segunda sonda de oligonucleotídeo. Desta maneira, o material sólido relevante para a fixação, ou o dispositivo que contém o dito material sólido, tal como a tira de fluxo lateral de ácido nucleico, e/ou o meios de detecção, pode ser otimizado e definido sem levar em consideração a sequência do ácido nucleico alvo a ser detectado. Tal aparelho de de- tecção "universal" pode ser usado de aplicação em aplicação e de alvo a alvo sem ter que ser alterado. Por exemplo, uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico com linhas impressas que correspondem a um con- junto compatível de sequências de oligonucleotídeos que têm a capaci- dade de hibridização na ira eficiente e nenhuma diafonia não intencional pode ser definida, otimizada e manufaturada com eficácia, independen- temente do desenvolvimento dos iniciadores de oligonucleotídeos e das sonda do método para a detecção de múltiplas sequências de ácidos nucleicos alvo.

[0094] Em uma série de modalidades, a detecção pode ser execu- tada de uma maneira quantitativa. Desse modo, o nível do ácido nu- cleico alvo de um só cordão na amostra pode ser quantificado na etapa c). A quantificação pode ser realizada, por exemplo, ao medir a espécie detectora colorimetricamente, fluorometricamente ou então eletrica- mente, durante o curso do tempo da reação em múltiplos pontos no tempo, ao invés de um único ponto extremo. As estratégias alternativas para a quantificação incluem a diluição sequencial da amostra, análoga à PCR digital de gotas. Em uma modalidade adicional, o nível do ácido nucleico alvo de um só cordão na amostra pode ser determinado de maneira semiquantitativa. Por exemplo, onde a intensidade de um sinal colorimétrico em uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico deve corres- ponder ao nível aproximado do ácido nucleico alvo de um só cordão na amostra. Alternativamente, pode ser usado um inibidor por meio do qual o número de cópias do ácido nucleico de um só cordão alvo deve exce- der um determinado número definido de cópias a fim de superar o inibi- dor e produzir um número detectável de cópias da espécie detectora.

[0095] No método da invenção, a segunda sonda de oligonucleotí- deo é fixada a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido. Opcionalmente, nas modalidades, um ou mais dos outros iniciadores e sondas de oligonucleotídeos também po- dem ser fixados a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido. Será aparente a um elemento versado na técnica que a fixação dos oligonucleotídeos a um material sólido pode ser realizada em uma variedade de maneiras diferentes. Por exemplo, um número de materiais sólidos diferentes está disponível, os quais foram ou podem ser fixados ou funcionalizados com uma densi- dade suficiente de grupos funcionais a fim de ser úteis com a finalidade de se fixar a ou de reagir com as sondas de oligonucleotídeos apropria- damente modificadas. Além disso, uma ampla gama de formatos, tama- nhos e formas de tais materiais sólidos está disponível, incluindo grânu- los, resinas, placas revestidas na superfície, slides e capilares. Os exemplos de tais materiais sólidos usados para a fixação covalente dos oligonucleotídeos incluem, sem limitação: slides de vidro, grânulos de vidro, micro grânulos magnéticos revestidos com polímero de núcleo de ferrita, micropartículas de sílica ou micropartículas de sílica magnéticas, micro tubos capilares à base de sílica, slides de polímeros 3D-reativos, poços de microplacas, grânulos de poliestireno, partículas de ácido poli(láctico) (PLA), micropartículas de poli(metacrilato de metila) (PMMA), resinas de vidro de poro controlado, superfícies de óxido de grafeno e superfícies de agarose funcionalizada ou de poliacrilamida.

Os polímeros tais como a poliacrilamida têm a vantagem adicional que um oligonucleotídeo funcionalizado pode ser fixado covalentemente du- rante a reação de polimerização entre monômeros (por exemplo, monô- meros de acrilamida) que é usada para produzir o polímero. Um oligo- nucleotídeo funcionalizado é incluído na reação de polimerização para produzir um polímero sólido que contém o oligonucleotídeo covalente- mente fixado. Tal polimerização representa um meio altamente eficiente de fixar o oligonucleotídeo a um material sólido com controle sobre o tamanho, o formato e a forma do material sólido fixado a oligonucleotí- deo produzido.

[0096] Tipicamente, a fim de fixar uma sonda de oligonucleotídeo a qualquer um de tais materiais sólidos, o oligonucleotídeo é sintetizado com um grupo funcional na extremidade 3' ou 5'; embora os grupos fun- cionais também possam ser adicionados durante o processo de produ- ção de oligonucleotídeo em quase qualquer posição da base. Uma rea- ção específica pode então ser executada entre o(s) grupo(s) funcio- nal(is) dentro de um oligonucleotídeo e um grupo funcional no material sólido relevante para formar uma ligação covalente estável, o que re- sulta em um oligonucleotídeo fixado a um material sólido. Tal oligonu- cleotídeo deve ser fixado tipicamente ao material sólido pela extremi- dade 5' ou 3'. A título de exemplo, duas químicas de fixação usadas geralmente e confiáveis utilizam um grupo tiol (SH) ou amina (NH3) e o grupo funcional no oligonucleotídeo. Um grupo tiol pode reagir com uma porção de maleimida no suporte sólido para formar um ligação de tioés- ter, ao passo que uma amina pode reagir com um ácido carboxílico mo- dificado por éster de succinimidila (éster de NHS) para formar uma liga- ção de amida. Um número de outras químicas também pode ser usado. Bem, como a conjugação química de uma sonda de oligonucleotídeo a um material sólido, é possível e potencialmente vantajoso sintetizar di- retamente as sondas de oligonucleotídeos em um material sólido para o uso na execução do método.

[0097] Em outras modalidades, a segunda sonda de oligonucleotí- deo é fixada a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido. Uma estratégia consiste em empregar um método de ligação por afinidade por meio do qual uma porção que permite a ligação específica pode ser fixada à sonda de oligonucleotídeo para facilitar a sua fixação ao ligando de afinidade relevante. Isto pode ser executado, por exemplo, ao usar a ligação de anticorpo-antígeno ou uma etiqueta de afinidade, tal como uma etiqueta de poli histidina, ou ao usar a hibridização à base de ácido nucleico em que o ácido nucleico complementar é fixado a um material sólido, por exemplo, uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico de nitrocelulose. Um exemplo de tal porção é a biotina, que tem a capa- cidade de se ligar com afinidade elevada à streptavidina ou à avidina que é ala própria fixado aos grânulos ou a uma outra superfície sólida.

[0098] A presença de dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes de sequência definida pode ser detectada na mesma amostra. Em uma modalidade do método, é executada uma série separada das etapas a), b) e c), ao usar iniciadores de oligonucleotídeos e sondas de oligonu- cleotídeos diferentes para cada um de dois ou mais ácidos nucleicos alvo, em que as etapas separadas podem ser realizadas simultanea- mente. Por exemplo, em uma modalidade, um conjunto de iniciadores de oligonucleotídeos e sondas de oligonucleotídeos deve ser usado para a detecção de um ácido nucleico alvo em uma amostra e um outro conjunto de iniciadores de oligonucleotídeos e sondas de oligonucleotí- deos deve ser usado para a detecção de um outro ácido nucleico alvo na mesma amostra. A detecção da espécie detectora produzida a partir de dois ou mais conjuntos de iniciadores/sondas diferentes pode ser in- dividualmente acoplada a um sinal particular, tais como corantes ou en- zimas colorimétricos ou fluorométricos diferentes, para permitir a detec- ção multiplex. Alternativamente, a detecção multiplex pode ser realizada pela fixação da segunda sonda de oligonucleotídeo a um material sólido, direta ou indiretamente através de uma porção que permite a sua fixa- ção a um material sólido. Tal abordagem utiliza a separação física da espécie detectora produzida pela série diferente de etapas a), b) e c), ao invés de se basear em um meio de detecção diferente. Desse modo, por exemplo, uma único corante poderia ser usado no fluxo lateral de ácido nucleico para detectar múltiplos ácidos nucleicos alvo diferentes em que cada espécie detectora diferente produzida é localizada em uma linha impressa particular na tira de fluxo lateral e a hibridização baseada na sequência direta ou indireta para a segunda sonda de oligonucleotí- deo forma a base da detecção diferencial. Alternativamente uma dispo- sição de detecção elétrica pode ser usada, na qual múltiplas segundas sondas de oligonucleotídeos diferentes são fixadas a uma região parti- cular da disposição e desse modo em uma reação multiplex na qual múltiplas espécies de detecção diferentes são produzidas ao mesmo tempo, e cada espécie detectora fica localizada através de hibridização a uma região distinta da disposição, permitindo a detecção multiplex.

[0099] Os processos de detecção acima, tais como o fluxo lateral de ácido nucleico e a detecção elétrica, e a sua capacidade de detectar de imediato múltiplos ácidos nucleicos alvo diferentes dentro da mesma amostra, são habilitados pelo requisito intrínseco do presente método para duas sondas de oligonucleotídeos. Dessa maneira, eles demons- tram de maneira intensa as vantagens do método da invenção em rela- ção aos métodos conhecidos.

[0100] A presente invenção é de ampla utilidade em vários campos e aplicações que requerem a detecção de um ácido nucleico alvo de sequência definida em uma amostra. Ela representa um meio rápido, barato e conveniente de determinação da presença de uma sequência de ácidos nucleicos alvo dentro de uma amostra. Por meio de uma lista de aplicações que não é de nenhuma limitadora, foi previsto que a in- venção poderia ser de valor em campos tais como; diagnóstico, forense, agrícola, saúde animal, meio ambiente, defesa, testes genéticos huma- nos, teste pré-natal, seleção de contaminação do sangue, farmacoge- nômico ou farmacocinético e pesquisa microbiológica, clínica e biomé- dica. Apropriadamente, a amostra é uma amostra biológica, tal como uma amostra humana. A amostra pode ser uma amostra humana, uma amostra forense, uma amostra agrícola, uma amostra veterinária, uma amostra ambiental ou uma amostra de biodefesa.

[0101] A detecção do ácido nucleico alvo pode ser usada para o diagnóstico, o prognostico ou o monitoramento da doença ou um estado doente tal como uma doença infecciosa, incluindo, mas sem ficar a elas limitada, HIV, influenza, RSV, Rhinovirus, norovirus, tuberculose, HPV, meningite, hepatite, MRSA, Ebola, clostridium difficile, vírus de Epstein- Barr, malária, peste, poliomielite, chlamydia, herpes, gonorreia, sa- rampo, caxumba, rubéola, cólera ou varíola, ou câncer, incluindo, mas sem ficar a eles limitado, o câncer coloretal, o câncer do pulmão, o cân- cer da mama, o câncer do pâncreas, o câncer da próstata, o câncer do fígado, o câncer da bexiga, a leucemia, o câncer do esôfago, o câncer do ovário, o câncer do rim, o câncer do estômago, ou melanoma, ou nos campos de testes genéticos humanos, teste pré-natal, seleção da con- taminação do sangue, farmacogenética ou farmacocinética.

[0102] A invenção é suscetível ao uso com uma ampla disposição de tipos de amostras tais como, por exemplo: cotonetes nasal ou aspi- rados, cotonetes nasofaringeais ou aspirados, cotonetes da garganta ou aspirados, cotonetes da bochecha ou aspirados, sangue ou uma amos- tra derivada do sangue, urina ou uma amostra derivada da urina, es- carro ou uma amostra derivada do escarro, fezes ou uma amostra deri- vada de fezes, fluido cerebrospinal (CSF) ou uma amostra derivada do CSF, e fluidos gástricos ou uma amostra derivada de fluidos gástricos,

amostras humanas ou animais derivadas de qualquer forma de biópsia de tecido ou de fluido corporal. O método também foi executado em uma ampla faixa de amostras que contêm pelo menos 10 a 20% dos espéci- mes clínicos a seguir: cotonete nasal em VTM, cotonete nasofaringeal em VTM, meio de preparação delgado, cotonete da garganta em Amies líquido, cotonete de ferida de HSV em meio M4, fluido sinovial, escarro processado através de 2M de NaOH/isopropanol seguido por grânulos de captura de DNA, cotonete retal em TE, a amostra de fezes proces- sada por homogeneização e grânulos de captura de DNA, CSF, coto- nete APTIMA, fluido amniótico, cotonete oral em Amies líquido, urina, cotonete VRE em TE, fluido pleural, sangue integral, plasma de K2EDTA, plasma de L.Heparin, e soro do sangue. Estes experimentos demonstraram a versatilidade notável do método a diferentes aplica- ções clínicas e falta de inibição observada em amostras relevantes. Isto é bastante contrastante com outros métodos que são inibidos pelos ini- bidores encontrados nos espécimes biológicos, tais como a heparina e o ácido fítico que inibem PCR e, portanto, demonstram um potencial no uso do método em um dispositivo de baixo custo ou de um só uso sem nenhuma necessidade quanto a procedimentos complexos de prepara- ção da amostra.

[0103] O ácido nucleico alvo pode ser (a) viral ou derivado de ma- terial de ácido nucleico viral (b) bacteriano ou derivado de material de ácido nucleico bacteriano (c) DNA livre de células circulante liberado de células do câncer, (d) DNA livre de células circulante liberado de células fetais ou (e) micro RNA ou derivado de micro RNA, inter alia.

[0104] O ácido nucleico alvo de um só cordão para o método pode ser de ocorrência natural ou não natural. O ácido nucleico alvo pode ser gerado in situ ou ser produzido a partir de um ácido nucleico natural antes da execução do método. Um ácido nucleico alvo de um só cordão para o método pode ser preparado por uma ou mais etapas adicionais executadas antes ou simultaneamente com a etapa a), em que as eta- pas adicionais podem englobar uma ou mais enzimas tais como as po- limerases e as enzimas de restrição.

A geração do ácido nucleico alvo para o método desta maneira tem uma série de vantagens potenciais, tais como a permissão de ensaios ainda mais altamente multiplexados e/ou a superação de fundo ab initio.

Uma conversão altamente especí- fica do material de ácido nucleico em uma amostra biológica pode, por exemplo, ser executada sem a amplificação antes da amplificação na etapa a). A amostra pode, por exemplo, ser tratada, purificada, sujeitada à troca de tampão, sujeitada à captura de exoma, parcialmente esgo- tada de material contaminante e/ou ser convertida em um ácido nucleico alvo de um só cordão para o método que contém um ou mais dNTPs modificados.

Contanto que o ácido nucleico alvo "real" na amostra a ser detectada seja convertido no ácido nucleico alvo "substituto" para a exe- cução do método com uma conversão confiável (que pode ser < 1:1, 1:1 ou 1:>1, isto é, possivelmente com algum elemento de amplificação) então a detecção do ácido nucleico alvo "substituto" irá permitir que o ácido nucleico "real" seja detectado e/ou quantificado.

Além disso, a pro- dução de um alvo substituto a partir de um alvo natural desta maneira pode ser usada para gerar de uma maneira específica um ácido nucleico alvo para o método com qualquer sequência desejada.

Em uma moda- lidade na qual o ácido nucleico alvo de um só cordão é derivado do RNA de cordão duplo depois da dissociação de dois cordões, por exemplo, pela invasão de cordão, dois ácidos nucleicos alvo de um só cordão complementares estão presentes e podem ser amplificados e detecta- dos em um processo recíproco pelos mesmos iniciadores e sondas de oligonucleotídeos.

Onde o alvo é o genoma de um vírus de RNA de um só cordão -ve, o transcrito de cordão +ve também pode estar presente na amostra e um cordão ou ambos os cordões podem ser amplificados e detectados como o ácido nucleico alvo de um só cordão no método ao usar os mesmos iniciadores e sondas de oligonucleotídeos.

[0105] Também foi previsto que a presente invenção tem o poten- cial de ser de utilidade na seleção de amostras para o DNA livre de cé- lulas e modificações epigenéticas tais como, por exemplo, a metilação de CpG de sequências de DNA. Tal modificação epigenética de genes alvo associados ao câncer particulares pode servir como biomarcadores úteis em um número de doenças e estados de doença. Dada a aprecia- ção crescente da importância da modificação epigenética na doença hu- mana, há um potencial para que a presente invenção seja usada para avaliar especificamente a modificação epigenética de biomarcadores particulares de ácidos nucleicos alvo com base na atividade diferencial da polimerase de DNA de deslocamento de cordão e/ou das enzima de restrição. Portanto, em uma modalidade, o ácido nucleico alvo contém um sítio de modificação epigenética, tal como a metilação. Alternativa- mente, o ácido nucleico "real" usado para produzir um ácido nucleico alvo "substituto" para a execução do método tal como descrito acima contém um sítio de modificação epigenética.

[0106] Um aspecto mais adicional da invenção refere-se a kits para o uso na detecção de ácidos nucleicos de sequência definida em uma amostra. Desse modo a invenção também provê um kit que compreende o que segue: a) um primeiro iniciador de oligonucleotídeo e um segundo ini- ciador de oligonucleotídeo, em que o dito primeiro iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um sequência de reconhecimento de enzima de res- trição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar a uma primeira sequência de hibridização em um ácido nucleico alvo de um só cordão de sequência definida, e o dito segundo iniciador compreende na direção a 5’ a 3’ uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar ao complemento reverso de uma segunda sequência de hibridização a montante da primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo; b) uma primeira enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica e é capaz de reconhecer a sequência de reconheci- mento e clivar o sítio de clivagem do primeiro iniciador e uma segunda enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica e é capaz de reconhecer a sequência de reconhecimento e clivar o sítio de clivagem do segundo iniciador; c) uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão; d) dNTPs; e) um ou mais dNTPs modificados; f) uma primeira sonda de oligonucleotídeo que por hibridizar a uma primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie no produto de amplificação produzido na presença do dito ácido nucleico alvo e que é fixada a uma porção que permite a sua de- tecção; e g) uma segunda sonda de oligonucleotídeo que pode hibridizar a uma segunda sequência de detecção de um só cordão a montante ou a jusante da primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma dita espécie no produto de amplificação e que é fixada a um material sólido ou a uma porção que permite a sua fixação a um material sólido.

[0107] Em uma modalidade, uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos do kit é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou pela segunda enzimas de restrição, por exemplo, devido à presença de uma ou mais incompatibilidades de sequências e/ou uma ou mais modificações, tal como uma ligação de fosforotioato.

[0108] Em uma modalidade, uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos do kit tem 5 ou mais bases de complemen- taridade à região de hibridização ou ao complemento reverso da região de hibridização do primeiro ou segundo iniciador.

[0109] Em uma outra modalidade, a primeira sonda de oligonucleo- tídeo do kit tem alguma complementaridade, por exemplo, 5 ou mais bases de complementaridade, à região de hibridização de um dentre o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeos, e/ou a segunda sonda de oligonucleotídeo do kit tem alguma complementaridade, por exemplo, 5 ou mais bases de complementaridade, ao complemento re- verso da região de hibridização do outro dentre o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeos.

[0110] Em outras modalidades, a primeira e/ou a segunda sondas de oligonucleotídeos podem ter alguma complementaridade ou comple- mentaridade reverso à abertura entre a primeira e a segunda sequên- cias de hibridização no ácido nucleico alvo tal como descrito acima.

[0111] O kit também pode compreender uma transcriptase reversa.

[0112] O kit pode ainda compreender um meio para detectar a pre- sença de uma espécie detectora produzida na presença do ácido nu- cleico alvo. Por exemplo, o kit também pode compreender uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico, uma sonda eletroquímica, uma placa de 96 poços, grânulos ou uma superfície de disposição, e/ou um corante colorimétrico ou fluorométrico e/ou um dispositivo para a detecção de uma mudança no sinal elétrico, e/ou carbono ou ouro.

[0113] Em várias modalidades, o ácido nucleico alvo e os compo- nentes dos kits, tais como o primeiro iniciador de oligonucleotídeo e/ou o segundo iniciador de oligonucleotídeo e/ou a primeira enzima de res- trição e/ou a segunda enzima de restrição e/ou a polimerase de DNA e/ou os dNTPs e/ou um ou mais dNTPs modificados e/ou a primeira sonda de oligonucleotídeo e/ou a segunda sonda de oligonucleotídeo e/ou a primeira ou a segunda sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma espécie dentro do produto de amplificação com- preendido no kit, são tal como definido no presente documento para os métodos da invenção. Por exemplo, o kit pode compreender qualquer combinação das características de tais componentes descritos no pre- sente documento tais como, sem limitação, o que segue: Uma dentre a primeira e a segunda sondas de oligonucleotídeos é bloqueada na ex- tremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser cli- vada pela primeira ou pela segunda enzimas de restrição opcionalmente devido à presença de uma ou mais incompatibilidades de sequências e/ou uma ou mais modificações, tal como uma ligação de fosforotioato; a primeira enzima de restrição e a segunda enzima de restrição são uma mesma enzima de restrição; um ou mais dNTPs modificados consistem em um dNTP modificado com alfa tiol; a porção que permite a detecção da primeira sonda de oligonucleotídeo é um corante colorimétrico ou fluorométrico ou uma porção que pode ser fixada a um corante colori- métrico ou fluorométrico, tal como o biotina; a porção que permite a fi- xação da segunda sonda de oligonucleotídeo a um material sólido é um oligonucleotídeo de um só cordão, o qual compreende opcionalmente três ou mais cópias de repetição de um motivo de sequência de DNA com 2 a 4 bases; o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotí- deos compreendem uma sequência de estabilização a montante da se- quência de reconhecimento da enzima de restrição e do sítio de cliva- gem, tal como na extremidade 5' e, por exemplo, com 5 ou 6 bases de comprimento; a região de hibridização do primeiro e/ou segundo inicia- dores de oligonucleotídeos tem entre 6 e 30, por exemplo, entre 9 e 16, bases de comprimento; e a primeira e a segunda sequências de hibridi- zação no ácido nucleico alvo são separadas por 0 a 15 ou 0 a 6 bases, em determinadas modalidades elas são separadas por 3 a 15 ou por 3 a 6 bases, por exemplo 5, 7 ou 11 bases, ou elas são sobrepostas tal como por 1 a 2 bases.

[0114] Os kits podem compreender um meio para detectar a pre-

sença de uma espécie detectora produzida na presença do ácido nu- cleico alvo, tal como uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico. Em uma modalidade adicional, o kit também compreende terceiro e/ou quarto ini- ciadores de oligonucleotídeos tal como definido no presente documento.

[0115] Os kits também podem incluir reagentes tais como tampões da reação, sais, por exemplo, íons de metais divalentes, aditivos e exci- pientes.

[0116] Os kits de acordo com a invenção podem ser fornecidos junto com instruções para a execução dos métodos de acordo com a inven- ção.

[0117] A invenção também provê o uso dos kits da invenção para a detecção de um ácido nucleico alvo de um só cordão de sequência de- finida em uma amostra.

[0118] Deve ser compreendido que todas as modalidades opcionais e/ou preferidas da invenção descritas no presente documento com rela- ção aos métodos da invenção também se aplicam com relação aos kits da invenção e ao uso dos mesmos, e vice-versa.

[0119] Tal como acima mencionado, os métodos e os kits da inven- ção são idealmente adequados para o uso em um dispositivo, tal como um dispositivo de diagnóstico de um só uso. Desse modo a invenção também provê um dispositivo que contém um kit tal como descrito acima, em particular um kit que compreende um meio para detectar a presença de uma espécie detectora produzida na presença do ácido nucleico alvo, tal como uma tira de fluxo lateral de ácido nucleico. O dispositivo pode ser um dispositivo automatizado, por exemplo, um dis- positivo acionado eletricamente, o dispositivo também pode compreen- der um meio de aquecimento e pode ser um dispositivo autocontido, isto é, um dispositivo que não requer nenhum instrumento de teste auxiliar.

[0120] O método da invenção também pode ser usado independen-

temente da etapa de detecção c) para amplificar um sinal do ácido nu- cleico de um ácido nucleico alvo de sequência definida, e tal método pode ser usado, por exemplo, se o sinal amplificado tiver que ser arma- zenado e/ou transportado para a detecção do ácido nucleico alvo em uma data futura e/ou um local alternativo caso requerido. O sinal ampli- ficado compreende a espécie de pré-detecção ou a espécie detectora produzida através da execução do método. Desse modo, em uma outra modalidade, a invenção provê um método de amplificação de um sinal do ácido nucleico de um ácido nucleico alvo de sequência definida em uma amostra, o qual compreende as etapas a) e todo ou uma parte, por exemplo, a parte i. ou ii., da etapa b) do método da invenção.

[0121] A invenção também provê o uso dos kits da invenção para amplificar um sinal do ácido nucleico de um ácido nucleico alvo de se- quência definida tal como definido acima.

[0122] Deve ser compreendido que todas as modalidades opcionais e/ou preferidas da invenção descritas no presente documento com rela- ção aos métodos da invenção para detectar a presença de um ácido nucleico alvo de sequência definida em uma amostra também se apli- cam com relação ao método para amplificar um sinal do ácido nucleico de um ácido nucleico alvo de sequência definida.

[0123] Os exemplos a seguir servem para ilustrar ainda mais vários aspectos e modalidades dos métodos descritos no presente documento. Estes exemplos não devem ser considerados como limitadores de ne- nhuma maneira.

EXEMPLOS Materiais e Métodos

[0124] Os materiais e métodos a seguir são usados nos exemplos abaixo a menos que esteja indicado de alguma outra maneira.

[0125] Oligonucleotídeos: A não ser que esteja indicado de alguma outra maneira, os oligonucleotídeos customizados foram manufaturados ao usar o método de fosforamidita pela Integrated DNA Technologies.

[0126] Fluxo lateral de ácido nucleico: As nanopartículas de car- bono foram conjugadas através da adsorção não covalente a várias pro- teínas de ligação de biotina, por exemplo, streptavidina. Tipicamente, uma suspensão de carbono coloidal foi preparada em tampão do borato seguida por sonicação ao usar um sonicador de sonda. O carbono foi adsorvido subsequentemente à proteína de ligação de biotina através de incubação à temperatura ambiente. O carbono foi usado diretamente nas misturas de reação ou aplicado a almofadas de conjugado de fibra de vidro. As tiras de fluxo lateral foram construídas ao combinar uma almofada de conjugado contendo açúcares liofilizados e aditivos usados para melhorar a aparência visual com uma almofada de amostra, uma membrana de nitrocelulose e uma almofada adsorvente (Merck Milli- pore) ao seguir as diretrizes do fabricante. Antes de seu uso em tiras de fluxo lateral, o(s) oligonucleotídeo(s) relevante(s) que contém(êm) o complemento reverso da sequência a ser detectada no método foi(ram) impresso(s) na membrana de nitrocelulose em um local definido e fi- xado(s) à membrana através de reticulação UV. Exemplo 1 Execução do método em que a segunda sonda de oligonucleotídeo é fixada a um material sólido, uma tira de fluxo lateral de nitrocelulose

[0127] Este exemplo demonstra a execução do método em que a segunda sonda de oligonucleotídeo é fixada a um material sólido, uma tira de fluxo lateral do nitrocelulose, e a primeira sonda de oligonucleo- tídeo não é colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa de amplificação a).

[0128] O primeiro iniciador de oligonucleotídeo com um compri- mento total de 24 bases foi desenhado de modo a compreender na di- reção 5' a 3': Uma região de estabilização de 7 bases; as 5 bases da sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que não é uma enzima de clivagem hidrolítica; e uma região de hibridização de 12 bases que compreende a sequência complementar reversa da primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo. O segundo iniciador oligonucleotídeo foi desenhado de modo a conter a mesma região de estabilização e sequência de reconhecimento da enzima de restrição, mas com a região de hibridização de 12 bases com capacidade de hi- bridização ao complemento reverso da segunda sequência de hibridiza- ção no ácido nucleico alvo. Neste exemplo, a primeira enzima de restri- ção e a segunda enzima de restrição são uma mesma enzima de restri- ção. A enzima de restrição é uma enzima de restrição de clivagem de cordão duplo assimétrica com um sítio de clivagem de cordão superior a jusante da sua sequência de reconhecimento de 5 bases. A primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo são se- paradas por 1 base.

[0129] Os iniciadores de oligonucleotídeos foram desenhados ao usar o ácido nucleico alvo, de maneira tal que a base do nucleotídeo a jusante do sítio de clivagem no complemento reverso dos iniciadores é a adenosina, de modo que o dATP de alfa tio é usado como dNTP mo- dificado no método. Uma modificação de fosforotioato é inserida pela polimerase de deslocamento de cordão para bloquear a clivagem do dito cordão complementar reverso.

[0130] A primeira sonda de oligonucleotídeo com um comprimento total de 20 bases foi desenhada de modo a compreender na direção 5' a 3': Uma região de complementaridade de 12 bases a pelo menos uma espécie no produto de amplificação; uma região de espaçador neutro de 6 bases; e uma modificação de biotina 3' adicionada durante a sín- tese, em que a dita modificação de biotina permite a fixação da primeira sonda de oligonucleotídeo a um corante colorimétrico, nanopartículas de carbono. O carbono adsorvido a uma proteína de ligação de biotina foi preparado e saturado com a primeira sonda de oligonucleotídeo. A segunda sonda de oligonucleotídeo com um comprimento total de 49 bases foi desenhada de modo a compreender, na direção 5' a 3': Um espaçador neutro que compreende 10 bases X de Timidina; repetições de 3 X de uma região de 13 bases com capacidade de hibridização à segunda sequência de detecção de um só cordão da primeira sequência de detecção de um só cordão em dito pelo menos uma espécie no pro- duto de amplificação. Cerca de 30 pmol da dita segunda sonda de oli- gonucleotídeo foram impressos na tira do fluxo do ácido nucleico.

[0131] Foram preparadas as reações contendo: 1,6 pmol do pri- meiro iniciador; 0,1 pmol do segundo iniciador; 250 µM de 2'-Deoxiade- nosina-5'-O-(1-tiotrifosfato)Sp-isômero (Sp-dATP-α-S) da Enzo Life Sci- ences; 60 µM de cada um de dTTP, dCTP e dGTP; 2 U da enzima de restrição; e 2 U de uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão de Bacillus. O alvo de ácido nucleico (um alvo de DNA de um só cordão) foi adicionado a vários níveis (+ + = 1 amol, + = 10 zmol, NTC = nenhum controle alvo) em um volume total da reação de 10 µl em um tampão de reação apropriado. As reações foram incubadas a 45°C por 7 minutos ou 10 minutos. 6,5 µl da mistura de reação final foram adicionados então a 60 µl do tampão de corrida de fluxo lateral contendo 0,056 mgml-1 do carbono conjugado antes de ser carregado na tira de fluxo lateral de ácido nucleico com a segunda sonda de oligonucleotídeo fixada ao mesmo em uma linha impressa.

[0132] A Figura 5 ilustra uma fotografia das tiras de fluxo lateral ob- tidas na execução do exemplo. Uma seta indica a posição onde a se- gunda sonda de oligonucleotídeo foi impressa na tira de nitrocelulose e desse modo onde o sinal positivo aparece. Uma linha preta clara que corresponde à presença do sinal de carbono foi observada somente na presença do ácido nucleico alvo em ambos os níveis alvo e em ambos os pontos no tempo, demonstrando a detecção rápida e sensível da se- quência do ácido nucleico alvo pelo método da invenção.

Exemplo 2 Execução do método em que a primeira sonda de oligonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou segunda enzima de restrição e é colocada em contato com a amostra na etapa a)

[0133] Este exemplo demonstra o desempenho das modalidades dos métodos em que a primeira sonda de oligonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou segunda enzima de restrição e ser colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a). Em tais modalidades, não foi observada nenhuma inibição significativa da taxa de amplificação, indicando que a espécie de pré-detecção se acu- mula em tempo real sem romper o processo de amplificação cíclica ideal. Não somente não foi observado qualquer efeito inibidor no pro- cesso de amplificação nas ditas modalidades, mas foi observado um realce surpreendente do sinal produzido que corresponder a uma quan- tidade aumentada da espécie detectora de pelo menos 100 vezes.

[0134] Exemplo 2.1: Uma variante do ensaio usado no Exemplo 1 foi desenhada, explorando a modalidade do método em que a primeira sonda de oligonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou se- gunda enzimas de restrição e ser colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a). Os mesmos iniciadores de oligonucleotídeos, enzimas de restrição, dNTPs, dNTPs modificados e polimerases que são empregados no Exemplo 1 foram usados, no en- tanto, uma primeira sonda de oligonucleotídeo alternativa foi desenhada com um comprimento total de 21 bases que compreende na direção 5' a 3': Uma modificação de biotina 5'; uma região neutra de 8 bases; uma região de 13 bases que pode ser hibridizada a pelo menos uma espécie no produto de amplificação; e uma modificação de fosfato 3', em que a modificação de biotina permite a fixação da primeira sonda de oligonu- cleotídeo a um corante colorimétrico, nanopartículas de carbono, e a modificação de fosfato bloqueia a sua extensão pela polimerase de DNA de deslocamento de cordão. O carbono adsorvido a uma proteína de ligação de biotina foi preparado e saturado com a primeira sonda de oligonucleotídeo.

[0135] Uma segunda sonda de oligonucleotídeo alternativa foi de- senhada com um comprimento total de 51 bases que compreende, na direção 5' a 3': Uma região de 14 bases que pode ser hibridizada à se- gunda sequência de detecção de um só cordão da primeira sequência de detecção de um só cordão em pelo menos uma dita espécie no pro- duto de amplificação; uma sequência de espaçador neutro de 6 bases; uma repetição da região de hibridização de 14 bases; uma segunda se- quência de espaçador neutro de 6 bases; e um espaçador de 10 bases X de Timidina. Cerca de 30 pmol da dita segunda sonda de oligonucle- otídeo foram impressos na tira do fluxo do ácido nucleico.

[0136] Foram preparadas reações contendo: 0,8 pmol do primeiro iniciador; 0,8 pmol do segundo iniciador; 0,6 pmol da primeira sonda de oligonucleotídeo; 300 µM de Sp-dATP-α-S; 60 µM de cada um de dTTP, dCTP e dGTP; 2 U da enzima de restrição; e 2 U de uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão de Bacillus. O alvo de ácido nucleico (um alvo de DNA de um só cordão) foi adicionado a vários níveis (+ + = 1 amol, + = 10 zmol, NTC = nenhum controle alvo) em um volume total da reação de 10 µl em um tampão de reação apropriado. As reações foram incubadas a 45°C por 6 minutos. 5 µl da mistura de reação final foram adicionados então a 60 µl de um tampão de corrida de fluxo lateral contendo 0,03 mgml-1 de carbono conjugado antes de ser carregado na tira de fluxo lateral de ácido nucleico. Uma reação de controle foi exe- cutada a fim de demonstrar que nenhuma espécie detectora é produzida onde nenhuma primeira sonda de oligonucleotídeo estava presente du- rante a reação. O nível equivalente (0,6 pmol) da sonda foi adicionado ao dito controle depois da etapa a) a fim de controlar qualquer impacto não intencional da presença da sonda durante a detecção lateral da tira do fluxo.

[0137] A Figura 6A apresenta uma fotografia das tiras de fluxo la- teral de ácido nucleico depois do seu desenvolvimento. O sinal claro que corresponde à deposição das nanopartículas de carbono foi observado em ambos os níveis alvo quando a primeira sonda de oligonucleotídeo foi provida durante a reação. Tal como esperado, nenhum sinal foi de- tectado em um ou outro nível alvo quando o primeiro oligonucleotídeo não foi provido durante a reação. Este experimento demonstra clara- mente o potencial de realçar substancialmente a produção da espécie detectora nas modalidades do método em que a primeira sonda de oli- gonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polime- rase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou segunda enzima de restrição e ser colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a). É digno de nota o fato que, ao contrário do Exemplo 1, uma concentração igual do primeiro e do segundo iniciado- res de oligonucleotídeos foi provida, o que permite um amplificação mais rápida.

[0138] Exemplo 2.2: Um ensaio separado foi desenhado em se- guida para demonstrar a versatilidade das ditas modalidades do método com um ácido nucleico alvo totalmente diferente. Os iniciadores de oli- gonucleotídeos e as sondas de oligonucleotídeo foram desenhados para o ácido nucleico alvo relevante, um DNA de um só cordão, de uma maneira similar ao que é descrito nos Exemplos 1 e 2.1.

[0139] Foram preparadas reações contendo: 0,8 pmol do primeiro iniciador; 0,4 pmol do segundo iniciador; 0,6 pmol da primeira sonda de oligonucleotídeo; 300 µM de Sp-dATP-α-S; 60 µM de cada um de dTTP,

dCTP e dGTP; 2 U da enzima de restrição; e 2 U de uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão de Bacillus. O alvo de ácido nucleico (um alvo de DNA de um só cordão) foi adicionado a vários níveis (+ = 1 amol, NTC = controle não alvo) em um volume total da reação de 10 µl em um tampão de reação apropriado. As reações foram incubadas a 45°C por 6 minutos. 5 µl da mistura de reação final foram adicionados então a 60 µl de um tampão de corrida de fluxo lateral contendo 0,08 mgml-1 de carbono conjugado antes de ser carregado na tira de fluxo lateral de ácido nucleico. Uma reação de controle foi executada, a qual compreende uma variante truncada da primeira sonda de oligonucleotí- deo que também foi colocada em contato com a amostra simultanea- mente à execução da etapa a).

[0140] A Figura 6B apresenta uma fotografia das tiras de fluxo late- ral de ácido nucleico depois do seu desenvolvimento. O sinal positivo claro era visível na presença do ácido nucleico alvo e não no controle alvo, o que demonstra o desenho e funcionamento corretos do ensaio e o potencial robusto das modalidades do método em que a primeira sonda de oligonucleotídeo é bloqueada na extremidade 3' da extensão pela polimerase de DNA e não pode ser clivada pela primeira ou se- gunda enzima de restrição e ser colocada em contato com a amostra simultaneamente à execução da etapa a). Tal como esperado, somente um sinal muito mínimo foi observado no ensaio de controle ao empregar uma forma truncada da primeira sonda de oligonucleotídeo, demons- trando a necessidade de uma hibridização correta da primeira sonda de oligonucleotídeo simultaneamente à execução da amplificação na etapa a) para a produção eficiente da espécie detectora. Exemplo 3 Execução do método em que a presença de dois ou mais ácidos nuclei- cos alvo diferentes de sequência definida é detectada na mesma amos- tra

[0141] Este exemplo demonstra o potencial do método para a de- tecção de dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes de sequência definida em uma amostra. O uso de duas sondas de oligonucleotídeos além dos iniciadores no método confere uma abordagem integral para a detecção do produto de amplificação no método que é idealmente adequado à detecção de dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes na mesma amostra. Neste exemplo, é demonstrada a capacidade de detectar de modo diferencial espécies de detecção alternativas com base na hibridização específica de sequência da segunda sonda de oli- gonucleotídeo.

[0142] Em primeiro lugar, a fim de demonstrar a capacidade do mé- todo de ser usado para a detecção de dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes, foram desenvolvidos conjuntos compatíveis de iniciado- res e sondas de oligonucleotídeos para uma detecção de dois alvos dis- tintos (A e B). Em cada caso, a primeira sonda de oligonucleotídeo foi desenhada de modo a conter as seguintes características na direção 5' a 3': uma modificação de biotina 5', uma região de estabilização de 7 bases, as 5 bases de um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição, uma região de 11 a 13 bases complementar à extremidade 3' de A ou B alvo que compreende uma ligação de fosforotioato no sítio de clivagem para a enzima de restrição, e uma modificação de fosfate 3'. As segundas sondas de oligonucleotídeos foram desenhadas de modo a conter na direção 5' a 3': Uma região de 12 a 14 bases complementar à extremidade 5' de A ou B alvo, um espaçador neutro de 5 bases X de Timidina, e uma porção de oligonucleotídeo de um só cordão de 12 ba- ses como a porção que permite a fixação da segunda sonda de oligo- nucleotídeo a um material sólido. A sequência da porção de fixação de oligonucleotídeo de um só cordão para cada alvo foi desenhada ao usar uma sequência diferente a fim de permitir a fixação de cada espécie detectora a um local diferente na tira de fluxo lateral. Foram preparadas tiras de fluxo lateral de ácido nucleico foram preparadas contêm pontos distintos de 30 pmol de um oligonucleotídeo que contém a sequência complementar reversa para cada porção de detecção de oligonucleotí- deo de um só cordão em locais separados.

[0143] Foram montadas reações contendo: 0,5 pmol da primeira sonda de oligonucleotídeo para o alvo A e o alvo B; 0,5 pmol do segundo iniciador de oligonucleotídeo para os alvos A e B, em 65 µl de um tam- pão apropriado que contém 0,032 mgml-1 de carbono adsorvido a uma proteína de ligação de biotina. Níveis diferentes de cada alvo (+ = 0,1 pmol; ++ = 1 pmol) foram adicionados às reações separadas individual- mente, e ambos os alvos foram adicionados em conjunto. Um controle não alvo (NTC) também foi executado.

[0144] A Figura 7A ilustra uma fotografia das tiras de fluxo lateral obtidas no experimento. Os pontos pretos claros que correspondem à deposição da espécie detectora contendo carbono foram observados em ambos os níveis alvo e para ambos os ensaios. Além disso, quando ambas as reações foram executadas ao mesmo tempo, o sinal que cor- responde aos alvos A e B foi observado. Nenhum sinal de fundo ou di- afonia entre os ensaios diferentes foram observados.

[0145] A fim de demonstrar a robustez do método, um experimento adicional foi realizado para desenvolver três ensaios separados para demonstrar o potencial do método para a detecção de três ácidos nu- cleicos alvo diferentes de sequência definida em uma amostra. Uma metodologia similar foi usada tal como descrito acima. A Figura 7B ilus- tra uma fotografia das tiras de fluxo lateral obtidas. Os alvos P1, P2 e P3 foram adicionados individualmente e em várias combinações tal como indicado. O complemento reverso à porção de detecção de oligo- nucleotídeo de um só cordão da segunda sonda de oligonucleotídeo foi impresso na tira de fluxo lateral de ácido nucleico em linhas separadas. O sinal preto indica a deposição da espécie detectora fixada a carbono localizada no local previsto em todos os casos para a detecção sensível rápida sem nenhuma diafonia não intencional entre o ensaio e nem qual- quer sinal de fundo. Um experimento equivalente que compreende qua- tro ensaios separados demonstra o potencial do método para a detec- ção de quatro ácidos nucleicos alvo diferentes (P1, P2, P3 e P4) de se- quência definida em uma amostra com os resultados indicados na Fi- gura 7C. Neste experimento de quatro alvos, P4 estava presente em todas as reações como um controle positivo e os outros alvos foram adicionados individualmente às reações separadas. As fotografias das tiras de fluxo lateral indicadas revelam faixas pretas claras nos locais previstos, que correspondem à presença da espécie detectora relevante ligada ao carbono. Tais ensaios multiplex demonstram o potencial do método a ser usado para testes de diagnóstico para as doenças que são causadas por um número de patógenos diferentes em que a detec- ção da presença da espécie detectora do ensaio do controle indicam que o método foi executado com sucesso e a visualização de uma ou mais das outras espécies de detecção na tira de fluxo lateral indica a presença do(s) patógeno(s) causador relevante em um espécime clínico apropriado. Embora deva ser raro em tais aplicações diagnósticas, tal como no campo de doenças infecciosas, para observar coinfecções em que mais de um patógeno está presente no mesmo espécime, o método da invenção é altamente versátil para qualquer combinação de alvos em uma reação multiplex a ser detectada. A Figura 7D ilustra os resultados de um experimento em que combinações diferentes de quatro alvos (P1, P2, P3 e P4) são adicionadas. A capacidade de detectar individualmente cada alvo e de detectar outros três alvos quando cada alvo é omitido sem fundo não específico demonstra a especificidade marcante de de- tecção do método da invenção.

[0146] Nos experimentos descritos acima e em vários outros expe- riências, também foram executados ensaios multiplex para a detecção de 3 a 5 alvos as concentrações alvo muito baixas, por exemplo, 1 zmol (600 cópias) ou 17 ymol (10 cópias). Neste exemplo, foi demonstrado claramente o potencial do método de detectar a presença de dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes de sequência definida em uma amostra, e o seu potencial para a detecção de sinal rápida de baixo custo, por exemplo, pelo fluxo lateral de ácido nucleico. Uma caracterís- tica incomum e vantajosa do método da invenção é que dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes de sequência definida podem ser de- tectados de imediato na mesma amostra. Para cada alvo adicional a ser detectado, um conjunto adicional dos iniciadores de oligonucleotídeos é requerido o que, nos métodos da técnica anterior sem ciclos de tempe- ratura, apresenta um desafio significativo na detecção da presença de dois ou mais ácidos nucleicos alvo diferentes, uma vez que os iniciado- res adicionais conduzem a uma maior propensão de formar produtos de amplificação não específicos. No método da invenção, este desafio é superado pelo realce da especificidade, tal como aquele que resulta do uso de bases modificadas, da seleção de enzima melhorada e da for- mação de uma espécie detectora ao usar as sondas de oligonucleotí- deos que exploram eventos de hibridização específica de sequência adi- cionais. Exemplo 4 Execução do método em que a primeira e a segunda sequências de hibridização no ácido nucleico alvo são separadas por 5 bases

[0147] Este exemplo demonstra a execução do método em que a primeira e a segundas sequências de hibridização no ácido nucleico alvo são separadas por 5 bases. A capacidade de usar a sequência de- rivada alvo que não está presente nos iniciadores de oligonucleotídeos e é produzida somente no produto de amplificação de uma maneira de- pendente do alvo quando os dois iniciadores de oligonucleotídeos são desenhados de modo a ter uma abertura entre a primeira e a segunda sequências de hibridização, confere o potencial de uma especificidade realçada nas modalidades do método que pode superar qualquer sinal de fundo que resulte da síntese ab initio ou da ligação iniciador-iniciador. Nas ditas modalidades, a hibridização específica de sequência da pri- meira ou segunda sonda de oligonucleotídeo é desenhada para explorar a abertura entre as duas regiões de hibridização a fim de que a espécie detectora seja produzida somente quando o produto de amplificação contenha a sequência derivada de alvo correta.

[0148] Neste exemplo, foi desenhada uma gama de ensaios para demonstrar a hibridização da segunda sonda de oligonucleotídeo a vá- rios produtos de amplificação diferentes que diferem somente na se- quência da abertura entre a primeira e a segunda sequências de hibri- dização dentro do ácido nucleico alvo. A segunda sonda de oligonucle- otídeo foi desenhada de modo a conter uma região de hibridização de 11 bases para pelo menos uma espécie no produto de amplificação em sua extremidade 5'. A dita região era composta de uma sequência de 7 bases que é a sequência complementar reversa do primeiro iniciador de oligonucleotídeo e uma sequência de 5 bases que é a sequência com- plementar reversa à sequência derivada de alvo adicional no produto de amplificação derivado da abertura entre os dois iniciadores. A segunda sonda de oligonucleotídeo também continha na direção 5' a 3' um espa- çador neutro de 5 bases X de Timidina e uma porção de oligonucleotí- deo de um só cordão de 12 bases para a sua fixação a um material sólido. Uma tira de fluxo de ácido nucleico de nitrocelulose impressa com 30 pmol de um oligonucleotídeo com a sequência reversa de com- plementaridade da dita porção foi preparada. A primeira sonda de oligo- nucleotídeo foi desenhada de modo a conter a mesma sequência que o segundo iniciador de oligonucleotídeo, mas com uma modificação de biotina 5', uma modificação de fosfato 3' e uma ligação internucleotídeos de fosforotioato na posição do sítio de clivagem da enzima de restrição.

Claims (1)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a detecção da presença de um ácido nucleico alvo de um só cordão de sequência definida em uma amostra, caracte- rizado pelo fato de que compreende: a) a colocação da amostra em contato com: i. um primeiro iniciador de oligonucleotídeo e um segundo iniciador de oligonucleotídeo, em que o dito primeiro iniciador compre- ende na direção 5' a 3' um cordão de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar a uma primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo, e o dito segundo iniciador compreende na direção 5’ a 3’ um cor- dão de um sítio de uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição e um sítio de clivagem e uma região que pode hibridizar ao complemento reverso de uma segunda sequência de hibridização a montante da primeira sequência de hibridização no ácido nucleico alvo; ii. uma polimerase de DNA de deslocamento de cordão; iii. dNTPs; iv. um ou mais dNTPs modificados; v. uma primeira enzima de restrição que não é uma en- zima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reconhecimento do primeiro iniciador e de clivar somente o cordão do primeiro iniciador do sítio de clivagem quando a dita sequência de reconhecimento e o sítio de clivagem têm cordões duplos, em que a clivagem do cordão complementar reverso é bloqueada devido à pre- sença de uma ou mais modificações incorporadas no dito cordão com- plementar reverso pela polimerase de DNA ao usar um ou mais dNTPs modificados; e vi. uma segunda enzima de restrição que não é uma en- zima de clivagem hidrolítica, mas é capaz de reconhecer a sequência de reconhecimento do segundo iniciador e clivar somente o cordão do