CN113624980B - 基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法及试剂盒 - Google Patents

基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法，包括以下步骤：向含有待测蛋白的溶液中加入功能模板和引物，并进行混合，再加入DNA聚合酶进行扩增随后加入5’端修饰有荧光基团且3’端修饰有淬灭基团的分子信标、切刻内切酶I和切刻内切酶II，得到反应液；无需孵育，直接将反应液(扩增与切割仍在进行)进行荧光检测，进行实时监测，根据荧光强度与蛋白质的浓度关系式计算出蛋白质的浓度；该检测方法无需任何分离，条件温和(37度恒温)，操作简单(两步混合)，检测所需时间短(即时读出)，检测效率和检测灵敏度高(低至fM级，10‑15)，能够实现对不同蛋白质的检测，在蛋白质检测领域具有很大的应用潜力。

Description

基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法及试 剂盒
技术领域
本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法。
背景技术
核酸等温扩增技术，如链置换放大(SDA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)等，自20世纪90年代以来，正逐渐发展成为聚合酶链反应(PCR)的替代品。由于其反应条件温和，即使在细胞表面或活细胞中也能进行，并且等温扩增在现场检测和原位监测方面也具有很大潜力。其中，指数扩增反应(exponential amplification reaction，EXPAR)是一种独特的等温扩增方法，它在功能模板(Template)、引物(Primer)、DNA聚合酶和某些缺口内切酶存在下，以指数形式扩增出寡核苷酸(ssDNA)，作为后续信号输出或其他放大过程的触发因子。功能模板和引物具有有限的互补序列，Tm值接近反应温度，使得二者不会在无目标物情况下发生自发杂交，以保证背景相对较低。而所扩增出的寡核苷酸与功能模板序列互补部分通常设计得相对较短，使之容易从功能模板上释放出来。由于具有高催化活性和较强的链置换活性，Klenow Fragment3’→5’exo-(Kfexo-)和vent3→5’exo-在EXPAR反应中被广泛应用。为了与DNA聚合酶的反应温度一致，可以选择不同的切刻内切酶，如在37℃时，DNA聚合酶选择Kfexo-，经常运用到的切刻内切酶为Nt.BbvCI、Nb.BbvCI、AlwI、Nt.BsmAI等，而在65℃时，vent3→5’exo-作为DNA聚合酶，Nt.BstNBI、BSQI、Nt.BSQI、BsmAI等常备被用作此温度下的切刻内切酶，这种扩增过程在几十分钟内所合成的寡核苷酸呈指数累积，满足检测灵敏度和即时性的要求。因此，EXPAR已成功地实现多种生物标志物的检测。然而，目前EXPAR主要用于核酸的检测，用于蛋白质的检测应用很少，且多是仅依靠适配体实现的蛋白质识别与结合，因此极大地阻碍了其应用。
发明内容
针对指数扩增反应(EXPAR)主要用于核酸的检测，很少有用于蛋白质的检测应用，因此极大地阻碍了其应用的问题，本发明提供了一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法。
本发明采用以下技术方案：一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法，包括以下步骤：
向含有待测蛋白质的溶液中加入功能模板(Template)和引物(Primer)，并进行混合，再加入DNA聚合酶进行扩增得到体系1；
向体系1中加入5’端修饰有荧光基团且3’端修饰有淬灭基团的分子信标(MB)、切刻内切酶I和切刻内切酶II，混匀得到反应液；
无需孵育，直接将反应液(扩增与切割仍在进行)进行荧光检测，进行实时监测，根据荧光强度与蛋白质的浓度关系式计算出蛋白质的浓度。
进一步限定，所述功能模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，3’端连接有亲和配体；引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，5’端连接有亲和配体。
进一步限定，所述分子信标为发夹结构，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’端修饰有荧光基团且3’端修饰有淬灭基团。
进一步限定，所述亲和配体为生物素、适配体或抗体中的一种。
进一步限定，所述DNA聚合酶为Klenow Fragment3’→5’exo-，所述切刻内切酶I为Nb.BbvCI，所述切刻内切酶II为Nt.BsmAI。
进一步限定，所述待测蛋白质可为链霉亲和素、血小板衍生生长因子BB、凝血酶、甲胎蛋白或前列腺特异性抗原中的一种。
本发明的工作原理为：将待测蛋白质的信号通过结合诱导DNA组装(Binding-induced DNA assembly，BINDA)成比例转换为EXPAR活性结构，再利用指数扩增反应(EXPAR)扩增出特定的寡核苷酸(ssDNA)，将蛋白质信号转化为待测的核酸信号(第一级扩增)，同时，加入的两端分别修饰荧光基团和猝灭基团的分子信标，在与ssDNA互补后打开其发夹结构，分子信标内被猝灭的荧光得以恢复，并且形成特定的切刻内切酶识别位点，切刻内切酶可对其进行识别和循环切割，导致分子信标断裂再次释放出ssDNA使其可以继续打开其余分子信标的发卡架构，进而得到循环放大的荧光信号输出(第二级扩增)，最终实现蛋白质的高灵敏检测。
检测过程中涉及的反应过程如下：
(1)蛋白质与功能模板和引物上的亲和配体结合，依靠蛋白质形成类似闭环的较稳定的双链结构，作为启动EXPAR的活性结构；
(2)在37℃时，DNA聚合酶在功能模板上发生扩增，切刻内切酶I和切刻内切酶II可以在特定的位点上进行切割，而由于所扩增出的寡核苷酸(ssDNA)与功能模板的互补较短，因此会从功能模板上解旋释放出来，剩下原本的双链EXPAR活性结构；
(3)然后，在DNA聚合酶、切刻内切酶I缺口作用下循环产生大量寡核酸(ssDNA)，通过碱基互补配对打开分子信标的发夹结构，从而使得原本被猝灭的荧光得以恢复，并通过切刻内切酶II导致分子信标断裂再次释放出ssDNA，使其可以继续打开其余分子信标的发卡架构，实现循环放大的荧光信号输出。
本发明的有益效果为：该检测方法无需任何分离，条件温和(37度恒温)，操作简单(两步混合)，检测所需时间短(即时读出)，检测效率和检测灵敏度高(低至fM级，10-15)，能够实现对不同蛋白质的检测，在蛋白质检测领域具有很大的应用潜力。
本发明还公开了一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的试剂盒，该试剂盒包括功能模板、引物、DNA聚合酶、分子信标、切刻内切酶I以及切刻内切酶II。
进一步限定，所述功能模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，3’端连接有亲和配体；引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，5’端连接有亲和配体，所述分子信标的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’端修饰有荧光基团且3’端修饰有淬灭基团。
进一步限定，所述亲和配体为生物素、适配体或抗体中的一种。
进一步限定，所述DNA聚合酶为Klenow Fragment3’→5’exo-，所述切刻内切酶I为Nb.BbvCI，所述切刻内切酶II为Nt.BsmAI。
附图说明
图1为实施例1中链霉亲和素检测的信号组和对照组中荧光强度随时间的变化趋势图；
图2为实施例1中各DNA原料或生成物质的电泳图表征；
图3为实施例2中不同链霉亲和素浓度检测的实时荧光强度监测图；
图4为实施例2中链霉亲和素在1fM–1nM浓度范围内的线性拟合图；
图5为实施例3中不同血小板衍生生长因子BB浓度检测的实时荧光强度监测图；
图6为实施例3中不同血小板衍生生长因子BB浓度溶液检测的终点荧光强度趋势图；
图7为实施例4中不同凝血酶浓度检测溶液的实时荧光强度监测图；
图8为实施例4中不同凝血酶浓度溶液的终点荧光强度趋势图；
图9为实施例5中不同前列腺特异性抗原浓度溶液检测的实时荧光强度监测图；
图10为实施例5中不同前列腺特异性抗原浓度溶液的终点荧光强度趋势图；
图11为实施例6中不同甲胎蛋白浓度溶液检测的实时荧光强度监测图；
图12为实施例6中不同甲胎蛋白浓度溶液的终点荧光强度趋势图；
图13为实施例5中PSA的选择性测试结果图：将所构建的PSA特异性检测体系用于检测其他干扰蛋白(浓度为10×PSA浓度)的终点荧光强度趋势图；
图14为实施例6中AFP的选择性测试结果图：将所构建的AFP特异性检测体系用于检测其他干扰蛋白(浓度为10×PSA浓度)的终点荧光强度趋势图。
图15为本发明的检测原理图。
具体实施方式
以下各实施例中，功能模板和引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，SEQ ID NO.1具体为GCAGTCTCTAATACCTCAGCAATTCGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，3’端修饰有亲和配体，亲和配体可以根据目标物选择生物素、适配体或抗体中的一种；SEQID NO.2具体为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCCG，5’修饰有亲和配体，亲和配体可以根据目标物选择生物素、适配体或抗体中的一种，分子信标的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为CTAGCAGTCTCTAATACCTCAGCGCTAG，5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1。
链霉亲和素的英文简称为SA，血小板衍生生长因子BB的英文简称为PDGF-BB，凝血酶的英文简称为thrombin，甲胎蛋白的英文简称为AFP，前列腺特异性抗原的英文简称为PSA；生物素的英文名称为Biotin。
Nb.BbvCI来源于NEB(北京)公司，货号为#R0631L或#R0631S；Nt.BsmAI来源于NEB(北京)公司，货号为#R0121S。
Klenow Fragment3’→5’exo-英文简称Kf exo-。
实施例1
本实施例用于荧光可行性分析，本实施例设置对照组和实验组，本实施例对链霉亲和素进行检测，功能模板和引物上修饰的亲和配体为生物素，具体检测方法如下：
S1：对照组中没有链霉亲和素，其余添加物以及操作步骤与实验组一致；实验组的操作步骤如下：向含有链霉亲和素的溶液中加入功能模板和引物后混合，随后加入DNA聚合酶在37℃下进行扩增，得到扩增溶液；
S2：向扩增溶液中加入分子信标、切刻内切酶I和切刻内切酶II，混合后，溶液仍在继续扩增和切割，最后进行荧光检测。
荧光强度随时间的变化如图1所示，图1中水平线为对照组，倾斜曲线为实验组；采用电泳将上述方法中各原料或生成的各个物质进行表征，结果如图2所示，图2中从左到右依次为1-10泳道，其所含物质如图中所示。
由图1可知，在无链霉亲和素时，几乎无信号，加入链霉亲和素后，启动目标物识别与信号扩增，荧光信号明显恢复，证明实施例1所公开的检测方法对蛋白质链霉亲和素具有良好的响应，并且两级扩增的引入，成功使得其获得了极强的荧光输出信号。
由图2可知，链霉亲和素与功能模板和引物成功识别并结合(泳道6)；并且在无链霉亲和素时，功能模板和引物间无反应(泳道5)；在引入第一级扩增后，有大量寡核苷酸(ssDNA)生成，作为下一级扩增反应的触发因子(泳道7)；在引入第二级扩增后，其产物明显增多，并且能够高效地打开分子信标，释放强的荧光信号(泳道10)；
综上所述，实施例1所公开的检测方法具有良好的检测结，且具有可行性。
实施例2
本实施例中检测不同浓度的链霉亲和素溶液，功能模板和引物上修饰的亲和配体为生物素，具体如下：
S1：配置不同浓度的SA溶液，分别为20nM，5nM，500pM，50pM，5pM，500fM，50fM；
S2：再向各离心管中分别加入2μL浓度分别为50fM，500fM，5pM，50pM，500pM，5nM的SA，和10μL浓度为5nM的SA，以及5μL浓度为20nM的SA，使得其反应终浓度分别为1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，500pM，1000pM；
S3：向含有不同浓度SA的离心管中加入功能模板和引物，并进行混合，再加入DNA聚合酶在37℃下扩增；
S4：加入分子信标、切刻内切酶I和切刻内切酶II，并向各离心管中加入超纯水保持每组反应的总体积为100μL，此时SA的反应终浓度分别为1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，500pM，1000pM，功能模板和引物的终浓度均为2nM，分子信标终浓度为200nM，DNA聚合酶终浓度为0.05U/μL，切刻内切酶I和切刻内切酶II的终浓度均为0.2U/μL；
S5：轻微混匀后，无需等待，直接放入酶标仪(37℃)进行荧光检测。
图3为检测结果图，图3中左上角的方框里从下到上的曲线对应的SA的反应终浓度分别是0fM、1fM，10fM，100fM、1000fM；图3中从下到上的粗线条对应SA的反应终浓度分别为0pM，1pM，100pM，500pM，1000pM；由此可知SA检测浓度可达到1fM。
对上述各SA的反应终浓度以及荧光强度进行拟合，结果如图4所示；当SA的反应终浓度在1fM-1nM(1fmol/L-1nmol/L)范围内时，得到y＝8.46cSA+815，R2＝0.991，实际检测中根据荧光强度即可得到SA浓度。
实施例3
与实施例2不同的是，本实施例检测对象为PDGF-BB，功能模板和引物上连接的亲和配体为PDGF-BB适配体，PDGF-BB适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为ACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；
检测组中PDGF-BB的反应终浓度依次为0fM(即对照组)、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM以及1nM，其检测的实时监测结果如图5所示，图5中曲线从下到上对应的PDGF-BB的反应终浓度依次为0fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM以及1nM，即从下到上对应的PDGF-BB的反应终浓度运来越大；
由图5可知，PDGF-BB的可检测浓度为10fM-1nM(10fmol/L-1nmol/L)；各浓度对应的终点荧光强度如图6所示，由图6可知，随着目标物PDGF-BB浓度增加，荧光强度越来越强。
实施例4
与实施例2不同的是，本实施例检测对象为凝血酶，功能模板上连接的亲和配体为凝血酶适配体1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；引物上连接的亲和配体为凝血酶适配体2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为GGTTGGTGTGGTTGG；
检测组中凝血酶的反应终浓度依次为0fM(即对照组)、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM以及1nM，其检测的实时监测结果如图7所示，图7中曲线从下到上对应的PDGF-BB的反应终浓度依次为0fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM以及1nM，由图7可知，凝血酶的可检测浓度为10fM-1nM(10fmol/L-1nmol/L)；各浓度对应的终点荧光强度如图8所示，由图8可知，随着目标物凝血酶浓度增加，荧光强度来越强。
实施例5
与实施例2不同的是，本实施例检测对象为PSA，功能模板和引物上修饰的亲和配体为PSA特异性抗体(anti-PSA)，检测组中PSA的反应终浓度依次为0pM(即对照组)、1pM、10pM、100pM以及1nM，其检测的实时监测结果如图9所示，图9中曲线从下到上对应的PSA的反应终浓度依次为0pM、1pM、10pM、100pM以及1nM(1000pM)，即下到上对应的PSA的反应终浓度逐渐增大；由图9可知，PSA的可检测浓度为pM-1nM(1pmol/L-1nmol/L)；各浓度对应的终点荧光强度如图10所示，由图10可知，随着目标物PSA浓度增加，荧光强度越来越强。
此外，为了验证PSA检测体系的特异性，我们选择了多种血清中常见的干扰蛋白，血红蛋白(HEMO)、免疫球蛋白G(IgG)、人血清蛋白(HSA)、粘蛋白(Mucin)、凝血酶(Thrombin)，以10倍于PSA的浓度加入检测体系中，其对应的终点荧光强度如图13所示，PSA的荧光信号明显强于其他组分，各干扰蛋白对检测都无明显影响，证明所构建的体系对于PSA检测的特异性较好。
实施例6
与实施例2不同的是，本实施例检测对象为AFP，功能模板和引物上修饰的亲和配体为AFP特异性抗体(anti-AFP)，检测组中AFP的反应终浓度依次为0pM(即对照组)、1pM、10pM、100pM以及1nM，其检测的实时监测结果如图11所示，图11中曲线从下到上对应的PSA的反应终浓度依次为0pM、1pM、10pM、100pM以及1nM(1000pM)，即下到上对应的PSA的反应终浓度逐渐增大；
由图11可知，AFP的可检测浓度为1pM-1nM(1pmol/L-1nmol/L)；各浓度对应的终点荧光强度如图12所示，由图12可知，随着目标物AFP浓度增加，荧光强度越来越强。
此外，为了验证AFP检测体系的特异性，我们选择了多种血清中常见的干扰蛋白，血红蛋白(HEMO)、免疫球蛋白G(IgG)、人血清蛋白(HSA)、粘蛋白(Mucin)、凝血酶(Thrombin)，以10倍于AFP的浓度加入检测体系中，其对应的终点荧光强度如图14所示，AFP的荧光信号明显强于其他组分，各干扰蛋白对检测都无明显影响，证明所构建的体系对于AFP检测的特异性较好。
实施例7
一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的试剂盒，该试剂盒包括功能模板、引物、DNA聚合酶、分子信标、切刻内切酶I以及切刻内切酶II；使用时直接将各物质干粉溶解并混匀，然后向试剂盒内加入待测蛋白质溶液，进行荧光检测即可。
功能模板和引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，SEQ IDNO.1，具体为GCAGTCTCTAATACCTCAGCAATTCGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，3’端修饰有亲和配体(生物素、适配体或抗体)；SEQ ID NO.2，具体为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCCG，5’端修饰有亲和配体(生物素、适配体或抗体)；分子信标的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为CTAGCAGTCTCTAATACCTCAGCGCTAG，5’端修饰有FAM，3’端修饰有BHQ1。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gcagtctcta atacctcagc aattcggcct tttttttttt ttttttttt 49
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
tttttttttt tttttttttt ggccg 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
ctagcagtct ctaatacctc agcgctag 28
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
acaggctacg gcacgtagag catcaccatg atcctg 36
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
ggttggtgtg gttgg 15

Claims (5)

1.一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向含有待测蛋白质的溶液中加入功能模板和引物，并进行混合，再加入DNA聚合酶进行扩增得到体系1；
向体系1中加入5’端修饰有荧光基团且3’端修饰有淬灭基团的分子信标、限制性核酸内切酶I和限制性核酸内切酶II，混匀得到反应液；
无需孵育，直接将反应液进行荧光检测，进行实时监测，根据荧光强度与蛋白质的浓度关系式计算出蛋白质的浓度；
其中，所述功能模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，3’端连接有亲和配体；引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，5’端连接有亲和配体，所述分子信标为发夹结构，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’端修饰有荧光基团且3’端修饰有淬灭基团；蛋白质与功能模板和引物上的所述亲和配体结合，依靠蛋白质形成类似闭环的较稳定的双链结构，作为启动后续指数等温扩增的活性结构；
所述DNA聚合酶为Klenow Fragment3’→5’ exo-，所述限制性核酸内切酶I为Nb.BbvCI，所述限制性内切酶II为Nt.BsmAI。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和配体为生物素、适配体或抗体中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测蛋白质可为链霉亲和素、血小板衍生生长因子BB、凝血酶、甲胎蛋白或前列腺特异性抗原中的一种。
4.一种基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括功能模板、引物、DNA聚合酶、分子信标、限制性核酸内切酶I以及限制性核酸内切酶II；
其中，所述功能模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，3’端连接有亲和配体；引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，5’端连接有亲和配体，所述分子信标的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，5’端修饰有荧光基团且3’端修饰有淬灭基团；蛋白质与功能模板和引物上的所述亲和配体结合，依靠蛋白质形成类似闭环的较稳定的双链结构，作为启动后续指数等温扩增的活性结构；
所述DNA聚合酶为Klenow Fragment3’→5’ exo-，所述限制性核酸内切酶I为Nb.BbvCI，所述限制性核酸内切酶II为Nt.BsmAI。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和配体为生物素、适配体或抗体中的一种。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103305612A (zh) * 2013-06-04 2013-09-18 西安交通大学 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102879580A (zh) * 2011-07-11 2013-01-16 上海生物芯片有限公司 微量蛋白检测方法
CN103571962B (zh) * 2013-11-18 2015-06-10 青岛科技大学 一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法
CN104789667B (zh) * 2015-04-08 2018-04-17 西安交通大学 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法
CN105256033B (zh) * 2015-10-22 2019-01-29 西安交通大学 基于恒温级联核酸扩增的汞离子检测试剂盒及其检测方法
CN105624165B (zh) * 2016-01-05 2018-11-30 山东大学 基于自锁式适体探针的级联扩增策略的生物分子检测方法
CN110023507B (zh) * 2016-09-27 2024-01-23 纽丽生物科技有限公司 检测小rna或与小rna相关的蛋白质的方法
GB201812149D0 (en) * 2018-07-25 2018-09-05 Sense Biodetection Ltd Nucleic acid detection method
CN111560377A (zh) * 2020-05-15 2020-08-21 四川大学华西医院 一种多价核酸及其在制备malat1检测试剂盒中的用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103305612A (zh) * 2013-06-04 2013-09-18 西安交通大学 一种基于恒温级联核酸扩增的铅离子检测试剂盒及其检测方法

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