CN105886607A

CN105886607A - 一种mthfr基因检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105886607A
Application number: CN201510973943.7A
Authority: CN
Inventors: 盛司潼; 邓波
Original assignee: Wuhan Kangxinrui Gene Health Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Kangxinrui Gene Health Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2035-12-22
Also published as: CN105886607B

Abstract

本发明涉及DNA检测技术领域，提供了一种MTHFR基因检测方法及试剂盒。所述方法包括以下步骤：利用MTHFR基因特异性引物对对待测样本进行PCR扩增，得含待测SNP位点的扩增产物；将步骤A产物直接与接头连接，形成待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；连接测序获得待测SNP位点的序列信息。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明的方法及试剂盒通过封闭待测序文库分子中的非特异性结合位点，降低了测序所得结果中的错误信号，提高了对MTHFR基因检测的准确性。

Description

一种 MTHFR 基因检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及DNA检测技术领域，更具体地说，涉及一种MTHFR基因检测方法及试剂盒。

背景技术

MTHFR为5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)，亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。MTHFR基因的缺陷对孕妇人群会引起神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病，自发性流产。

目前，针对市场上已有多种针对MTHFR C677T（rs1801133）和A1298C（rs1801131）进行检测的试剂盒和方法，大致可以分为以下几类：高分辨率融解曲线检测法（high resolution melting，HRM）、基于芯片技术的SNP分型方法、等位基因特异性扩增法（Amplification Refractory Mutation System Real Time PCR，ARMS-RT PCR）、Taqman荧光探针法、质谱法、高效液相层析法和基因测序法等。

其中，基因测序法又包括以Sanger技术为基础的第一代测序技术，和具有高通量、低成本特点的第二代高通量测序技术。第二代高通量测序技术包括连接测序法和合成测序法。其中，所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物（又称测序引物，其与待测序核酸片段所在链互补）和寡核苷酸探针（该探针的特定位置上带有荧光标记）进行连接反应，通过检测连接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信息。所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物互补结合至待测序核酸片段上，通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相应位置的序列信息。

在CN201410168995.2中，披露了一种基于连接测序技术的SNP分型方法，本申请发明人在利用该技术对MTHFR基因中的SNP位点进行检测时发现，所得测序结果中存在一定比例的错误信号，而这些错误信号将会干扰测序结果的分析，降低SNP位点检测的准确性。

因此需要一种新的MTHFR基因检测方法和试剂盒，以提高对MTHFR基因检测过程中正确信号的比例。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对MTHFR基因中的SNP位点检测准确率更高的SNP分型方法和试剂盒，旨在解决现有技术中测序结果中存在较高比例的错误信号的技术问题。

为了实现发明目的，一种MTHFR基因检测方法，包括以下步骤：

A、利用MTHFR基因特异性引物对对待测样本进行PCR扩增，得含待测SNP位点的扩增产物；

B、将含待测SNP位点的扩增产物直接与接头连接，形成待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；

C、利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；

D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。

其中，所述步骤C包括以下步骤：

C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；

C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；

C3、变性去除连接产物。

优选的，所述MTHFR基因特异性引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

优选的，所述MTHFR基因特异性引物对包括外引物对和内引物对；所述MTHFR基因内引物对中有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；所述步骤A包括以下步骤:

A1、利用MTHFR基因外引物对对待测样本进行PCR扩增，得第一次扩增产物；

A2、以第一次扩增产物为模板，利用MTHFR基因内引物对进行PCR扩增，得第二次扩增产物。

优选的，所述步骤B包括以下步骤：

B1、将含待测SNP位点的扩增产物直接与固定在微球上的接头连接，得固定在微球上的待测序文库分子；

B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。

优选的，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；

所述断裂剂，用于对核酸片段中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；

所述第一接头为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。

优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有2-15% PEG。更优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有5-10% PEG。

优选的，所述待测SNP位点为MTHFR C677T（rs1801133，以下简称133）和A1298C（rs1801131，以下简称131）。

优选的，当同时对上述两个待测SNP位点进行检测时，所述步骤A中含133位点的扩增产物和含131位点的扩增产物是在不同的扩增体系中进行扩增获得的。

更优选的，所述步骤B1是在不同的反应体系中进行的。

针对133，所述MTHFR基因特异性引物对上游引物可为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4；下游引物可为：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

针对131，所述MTHFR基因特异性引物对上游引物可为：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12；下游引物可为：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。

更优选的，所述MTHFR基因特异性引物对包括外引物对和内引物对。

更优选的，所述MTHFR基因内引物对中有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

更优选的，针对133，所述MTHFR基因内引物对为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7，所述MTHFR基因外引物对为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：5。

更优选的，针对131，所述MTHFR基因内引物对为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15，或SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：15，所述MTHFR基因外引物对为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：13，或SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：13。

优选的，所述接头含有标签序列，所述标签序列用于识别待测样本来源和所检测的SNP位点。

更优选的，所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间，更优选在1至5bp之间。

更优选的，针对133，所述锚定引物为SEQ ID NO：23，针对131，所述锚定引物为SEQ ID NO：24。。

更优选的，针对标签序列，所述锚定引物为SEQ ID NO：25。

为了更好的实现本发明的目的，本发明还提供了一种MTHFR基因特异性引物对，所述MTHFR基因特异性引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

优选的，所述MTHFR基因特异性引物对包括外引物对和内引物对。

为了更好的实现本发明的目的，本发明还提供了一种MTHFR基因检测试剂盒，包括MTHFR基因特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。

优选的，所述试剂盒还包括建库连接缓冲液，所述建库连接缓冲液中含有5-10% PEG。

优选的，所述试剂盒还包括锚定引物。

更优选的，针对标签序列，所述锚定引物为SEQ ID NO：25。

由上可知，本发明的MTHFR基因检测方法及试剂盒，通过封闭待测序文库分子中的非特异性结合位点，降低了连接测序所得结果中的错误信号，提高了对MTHFR基因检测过程中正确信号的比例，从而提高了对MTHFR基因中的SNP位点进行检测的准确性。

附图说明

图1是本发明一个具体实施例中第一接头的结构示意图。

图2是本发明一个具体实施例中第一接头的标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系图。

图3是本发明一个具体实施例中实验组测序流程图。

图4是本发明一个具体实施例中对照组测序流程图。

图5是本发明一个具体实施例中部分初步实验结果对照图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明提出第一典型实施例，一种MTHFR基因检测方法，包括以下步骤：

D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。

需要说明的是，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的有荧光标记的寡核苷酸探针相比，序列完全相同，差别仅在于有无荧光标记；即，所述无荧光标记的寡核苷酸探针序列为（N-N-N……-N）n，所述N为A、G、C或T，n为正整数。

所述可寻址的固定，是指能够确定位置信息的固定。即，固定载体上每一具体位置上所固定的待测序文库分子与其它具体位置上所固定的待测序文库分子是能够明确区分的。

每一次连接测序反应均包括以下步骤：锚定引物锚定，冲洗（除去多余的未锚定引物），探针连接，冲洗（除去多余探针、连接酶等），采图（获得探针上荧光标记所对应位置的序列信息），变性洗脱连接产物（以便下一次连接测序反应中锚定引物的锚定）。步骤C中的连接测序反应，因为使用的是无荧光标记的寡核苷酸探针，因此可不进行采图步骤，以减少实验步骤，提高实验效率。当然，如果进行采图步骤，可验证该次使用的荧光探针是否是无荧光标记的，起到一个再次确认的效果。

虽然，从理论上来说，步骤C中锚定引物与无荧光标记的寡核苷酸案子会被洗脱去除，无法起到封闭的作用，但是，本申请发明人在具体实验中对比发现，在连接测序前，增加一个使用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的探针进行一次连接测序反应的步骤，有效的减少在后续的连接测序中出现的错误信号，从而减少由测序初始结果到最终的序列信息的分析过程中的干扰信号，提高SNP位点检测的准确性。具体原因可能是非锚定引物的目标结合位点和/或非探针的目标结合位点，经过步骤C后被封闭，使得在后续的连接测序实验中，锚定引物和/或探针能够更多更准确的结合在目标结合位点上，从而减少了错误信号的产生，从而提高了对MTHFR基因检测过程中正确信号的比例，提高了对MTHFR基因中的SNP位点进行检测的准确性。

优选的，所述n在6-10之间；更优选在7-9之间。

更优选的，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与步骤D中的有荧光标记的寡核苷酸探针序列完全相同，差别仅在于有无荧光标记。本方案可有效降低无荧光标记的寡核苷酸探针的设计难度。

优选的，所述步骤C可包括以下步骤：

C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；

C3、变性去除连接产物。

对于步骤C3中变性去除连接产物需要说明的是，步骤C3所述连接产物为锚定引物与无荧光标记的寡核苷酸探针的连接产物，为单链核酸分子，可与待测序文库分子互补配对。所述变性既可以通过物理的方法实现，例如提高双链核酸分子（待测序文库分子与连接产物）所处的温度，也可以通过化学的方法实现，例如改变双链核酸分子（待测序文库分子与连接产物）所处的pH值。其中，采用化学方法，只需加入酸性或碱性的试剂即可，无需额外的加热部件，能够更简单有效的实现自动化。

优选的，所述步骤C3为：用0.05M-0.15M NaOH冲洗。

优选的，所述步骤B可有多种实施方案，以下将通过多个实施例来进行说明。

在本发明的第二典型实施例中，所述步骤B包括以下步骤：

B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。

在本发明的第三典型实施例中，所述步骤B包括以下步骤：

B1、将将含待测SNP位点的扩增产物直接与接头连接，然后将连接产物固定在微球上，得固定在微球上的待测序文库分子；

B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。

需要说明的是，在第二典型实施例和第三典型实施例中，所述接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。

所述接头可采用多种形式，包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。

所述平末端接头是指双链之间完全互补配对的双链核酸接头。优选的，所述平末端接头的两条链的5’末端均不含磷酸基团，其可避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续测序实验的干扰，提高MTHFR基因检测的准确率。

所述突出末端接头，是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列，而其余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端，也可以是含有两个突出末端的双突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所述突出末端接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续测序实验的干扰，提高MTHFR基因检测的准确率。在本实施例的具体实施方式中，所述接头优选为单突出末端接头，且该突出末端为其所在链的3’末端，碱基为T；该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。

所述分叉型接头包括互补区和分叉区，互补区双链的核苷酸互补配对，配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现，减少对后续测序实验的干扰，提高SNP分型检测的准确率。在本实施例的具体实施方式中，所述接头优选为互补区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T的T末端分叉接头；该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。

所述带茎环结构的接头，有多种实施方案。在一实施例中，该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子依次包括第一互补配对区、茎环区和第二互补配对区，第一互补配对区能够与第二互补配对区完全互补配对。在另一实施例中，带茎环结构的接头还可带有突出末端，该突出末端可位于单链核酸分子的3’端。突出末端4的存在能够防止接头自连现象的发生，减少对后续测序实验的干扰，提高SNP分型检测的准确率。该突出末端优选为T；该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接，提高连接效率。

所述修饰标记可为生物素、亲和素、链霉亲和素、抗原、抗体、受体、配体、多聚组氨酸、纳米金、碘乙酰、巯基、氨基、醛基、羧基、异硫氰基、硅烷基或丙烯酰胺，它们均能特异性的与相对应的基团或分子结合。

与第三典型实施例相比，第二典型实施例中的接头被预先固定在微球上，减少了连接产物与微球连接的步骤，实验效率更高。

因为固定有接头的微球的密度可能会与步骤B反应体系中的其他成分的密度不同，所以，在连接过程中，使整个反应体系周期性震荡，可有效提高固定在微球上的接头与步骤A所得扩增产物的连接效率，避免反应体系中各成分分层而引起的连接效率低现象的出现。

另外，在本发明中，因为步骤A所得的含待测SNP位点的扩增产物直接与步骤B中的接头连接，即不经纯化，直接进行连接反应，这使得反应体系较大，DNA分子浓度较低，连接效率不高。在本发明的一个优选实施例中，在所述步骤B的反应体系中加入PEG。

因为PEG既能够提高反应体系中发生反应的分子的有效密度，提高接头与相应的扩增产物之间接触的概率；又能提高反应体系的密度，防止固定有接头的微球沉降；本方案从两个方面有效提高了固定在微球上的接头与相应的扩增产物的连接效率。本方案中，PEG的具体浓度可根据所述步骤B中微球的密度和原反应体系的密度来计算，以使微球的密度与加入PEG后的反应体系的密度基本相同为宜。

在本发明的一个实施例中，所述MTHFR基因特异性引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。本方案中，通过MTHFR基因特异性引物对将可断裂位点或可切除序列引入到含待测SNP位点的扩增产物中。因此，含待测SNP位点的扩增产物能够被断裂剂切割，形成粘性末端。然后在步骤B中的接头上设置与粘性末端互不配对的片段，可有效提高步骤B中的连接效率。

在本发明的另一个实施例中，所述MTHFR基因特异性引物对包括外引物对和内引物对。本方案中，通过内外引物对的设置，所述步骤A可进行巢式PCR扩增，有效的提高所得含待测SNP位点的扩增产物中目标片段的纯度。

基于上述实施例，本发明提出另一实施例，所述MTHFR基因内引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。本方案中，将可断裂位点或可切除序列设置在内引物对上，则保证含待测SNP位点的扩增产物中目标片段上携带有可断裂位点或可切除序列。

基于上述实施例，本发明提出另一实施例，所述步骤A包括以下步骤:

需要说明的是，本方案中，第二次扩增产物可直接进入到步骤B中进行后续反应。另外，本方案采用两步式巢式PCR，可有效降低内外引物的设计难度，并减少第二次扩增产物中非目标产物的比例。

基于第二典型实施例，本发明又提出第四典型实施例，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；

需要说明的是，所述切割-连接反应体系为使连接酶和断裂剂同时具有活性的反应体系。

通过上述对PCR扩增引物和切割-连接反应体系的特殊设计，使得在建库过程中，PCR扩增后的切割和连接反应能在同一反应体系中进行；一旦断裂剂完成对可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端，第一接头即可在连接酶的作用下，与被切割后的扩增产物连接，省去了切割反应和连接反应中的纯化步骤，切割、连接反应在同一反应体系中进行；即，减少了建库的步骤，提高了建库效率。

另外，本方案中，当MTHFR基因特异性引物对中仅有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列时，所述第一接头仅与步骤A所得扩增产物中的目标分子的一端连接。本方案减少了试剂种类，库结构简单，可降低成本。

所述第一接头可为突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。

优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有PEG。PEG既能够提高反应体系中发生反应的分子的有效密度，提高接头与相应的扩增产物之间接触的概率；又能提高反应体系的密度，防止固定有接头的微球沉降；本方案从两个方面有效提高了固定在微球上的接头与相应的扩增产物的连接效率。本方案中，PEG的具体浓度和具体规格可根据所述步骤B1中微球的密度和原切割-连接反应体系的密度来计算，以使微球的密度与加入PEG后的切割-连接反应体系的密度基本相同为宜。

更优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有2%-15% PEG4000或2%-15% PEG6000或2%-15% PEG8000。

针对步骤B中接头与含待测SNP位点的扩增产物的连接，需要说明的是，步骤B中的接头可为一种接头分子，也可由两种接头分子组成。步骤B中的接头既可与步骤A所得扩增产物中的目标分子的一端连接，也可与步骤A所得扩增产物中的目标分子的两端连接，与目标分子两端连接的接头可为同一种接头分子，也可为不同的接头分子。

需要说明的是，当步骤B中的接头由两种接头分子组成时，仅有一种接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。

优选的，所述步骤B中的接头为一种接头分子，且仅与步骤A所得扩增产物中的目标分子的一端连接。本方案可减少试剂种类，简化待测序文库分子的结构，降低成本。

优选的，步骤B所述接头上含有标签序列，用于识别不同的SNP位点和/或样本来源。本方案中，所述标签序列为由若干个脱氧核糖核苷酸分子顺序连接而成的序列；本方案能够实现多个不同SNP位点的同时检测，更能够实现多样本多SNP位点的同时检测，可大大提高本发明的SNP分型方法的检测通量，提高检测效率。

优选的，所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间，更优选在1至5bp之间。因为最为常见的连接酶——T4连接酶最大限度能保证6个碱基正确互补配对，所以，本方案使得所述步骤D中的测序反应仅需进行一轮连接反应即可实现待测SNP位点的检测，能有效提高检测效率，降低检测成本。

本发明还提供了一种MTHFR基因检测试剂盒，包括MTHFR基因特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。

本发明的试剂盒能够有效的用于本发明的MTHFR基因检测方法中，有效的减少连接测序中出现的错误信号，从而减少由测序初始结果到最终的序列信息的分析过程中的干扰信号，提高待测SNP位点的准确性。

优选的，所述n在6-10之间；更优选在7-9之间。

优选的，所述试剂盒还包括变性缓冲液，所述变性缓冲液为0.05M-0.15M 的NaOH溶液。

优选的，所述试剂盒还包括连接酶和连接酶缓冲液。

更优选的，所述连接酶为T4连接酶。

需要说明的是，上述具体引物序列中，可断裂位点均为U，且均设计在上游引物上，因此，上游引物和下游引物可自由组合。当然，也可将可断裂位点仅设计在下游引物上，上下游引物同样可自由组合。另外，也可将可断裂位点同时设计在上游引物和下游引物上，只要组合后的引物对扩增的产物上的可断裂位点断裂后，形成的两个第一粘性末端之间不互不配对即可。

优选的，所述试剂盒还包括建库连接缓冲液。

更优选的，所述建库连接缓冲液中含有PEG。本方案的试剂盒可从防止微球沉降和提高连接底物分子的有效浓度两个方面来有效提高固定在微球上的接头与相应的扩增产物的连接效率。

需要说明的是，本方案中PEG的具体浓度和PEG的规格均可根据微球的密度和建库过程中原反应体系的密度来计算，以使微球的密度与加入PEG后的反应体系的密度基本相同为宜。

更优选的，所述连接缓冲液中含有2%-15% PEG4000或2%-15% PEG6000或2%-15% PEG8000。更优选的，所述连接缓冲液中含有5%-10% PEG6000。

优选的，所述试剂盒还包括接头。所述接头用于与含待测SNP位点的扩增产物连接。

更优选的，所述接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。

更优选的，所述接头可为一种接头分子，也可由两种接头分子组成。

需要说明的是，当接头由两种接头分子组成时，仅有一种接头上含有修饰标记，用于使其固定在微球上。

更优选的，所述接头上含有标签序列，用于识别不同的SNP位点和/或样本来源。

更优选的，所述接头为由SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22组成的双链核酸分子，所述接头中的NNNN为标签序列。

本方案能够实现多个不同SNP位点的同时检测，更能够实现多样本多SNP位点的同时检测，可大大提高本发明的SNP分型试剂盒的检测通量，提高检测效率。

优选的，所述试剂盒还包括锚定引物。

更优选的，所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间，更优选在1至5bp之间。因为最为常见的连接酶——T4连接酶最大限度能保证6个碱基正确互补配对，所以，本方案能有效提高检测效率，降低检测成本。

更优选的，针对133，所述锚定引物为SEQ ID NO：23，针对131，所述锚定引物为SEQ ID NO：24。

更优选的，针对标签序列，所述锚定引物为SEQ ID NO：25。

针对上述各技术方案，为进一步说明本发明所记载技术方案的技术效果及优越性，本发明给出下述具体实施例。

在一具体实施例中，以25个人的血液基因组DNA为模板，同时检测MTHFR基因的133和131位点。

其中，针对上述SNP位点，均分别设计了一对内引物和一对外引物。具体如下所述：

133内引物对为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7，133外引物对为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：5，131内引物对为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15，131外引物对为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：13。

一、含待测SNP位点的扩增产物的获得。

1、第一次PCR扩增

以25个人的血液基因组DNA为模板，利用上述的外引物对，分别对各SNP位点所在序列进行扩增，反应体系为：F引物（10μM），2μL；R引物（10μM），2μL；dNTP（各2.5mM），4μL；血液基因组DNA，50ng；Ex Taq（5U/μL），0.25μL；10×Ex Taq Buffer，5μL；ddH₂O加至50μL。

PCR反应条件如下：94℃ 3min；94℃ 15s，57℃ 20s，72℃ 45s；重复20个循环；72℃ 3min。

所得产物即为第一次PCR扩增产物。

2、第二次PCR扩增

以第一次PCR扩增产物为模板，利用上述的内引物对，分别对各SNP位点所在序列进行扩增，反应体系为：F引物（10μM），2μL；R引物（10μM），2μL；dNTP（各2.5mM），4μL；第一次PCR扩增产物，100ng；Ex Taq（5U/μL），0.25μL；10×Ex Taq Buffer，5μL；ddH₂O加至50μL。

PCR反应条件如下：95℃ 3min；94℃ 15s，57℃ 20s，72℃ 30s；重复30个循环；72℃ 3min。

所得产物即为第二次扩增产物。

第二次扩增完成后，经琼脂糖凝胶电泳检测，所有样本的第二次扩增产物中均含有目标分子，且凝胶电泳图显示无杂带，条带单一；说明第二次PCR扩增成功获得了所需的PCR扩增产物。

二、待测序文库分子的构建。

1、将第一接头固定在微球上。

为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源，本具体实施例在第一接头上设计了标签序列，第一接头的基本结构如图1所示（SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22），该接头中的NNNN为标签序列，标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系如图2所示。

将上述各第一接头分别与带有链霉亲和素修饰的Myone磁珠（Invitrogen）结合，使得上述各第一接头被分别固定在磁珠表面，反应体系及反应过程为：将200ng第一接头与4μL（约4×10⁷个磁珠）Myone磁珠螺旋振荡混匀，反应30min，以适量TE缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA）清洗两次，离心分离，将得到的磁珠以4μL结合缓冲液（10mM Tris-HCl，pH7.5；1mM EDTA；1M NaCl；0.01% Triton X-100）重悬保存，得固定有第一接头的磁珠。

2、第二次PCR扩增产物与固定在磁珠上的第一接头的连接。

按图2中的对应关系分别配置下述反应体系：步骤一所得扩增产物20μL；USER酶（1U/μL，NEB，Cat#M5505S），10μL；缓冲液，8μL；T4 DNA连接酶，2μL；固定有第一接头的磁珠，0.4μL；加ddH₂O至40μL。

其中，所述缓冲液为含400mM Tris、100mM MgCl2、100mM DTT、5mM ATP、25% PEG 6000，pH值7.8的溶液。

25℃反应20分钟，得连接产物，即待测序文库分子。

反应结束后，将50管连接产物合并成1管，2500g 离心3min，磁铁吸附磁珠，去上清，用50μL TE洗涤二次，并最终悬浮于50μL TE中，从而将待测序文库分子固定在磁珠上。

3、固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。

将步骤2所得产物点样至异硫氰基修饰的载样片（玻片），于37℃固定1h，即完成固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。

三、测序。

对步骤二所得的固定在固相载体上的待测序文库分子进行测序。

在本具体实施例中采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪Pstar II A测序仪，并采用连接测序法进行测序。测序过程中，针对133位点，所使用的锚定引物为SEQ ID NO：23，针对131位点，所使用的锚定引物为SEQ ID NO：24。另外，为了区分不同的样本来源，还需对第一接头上的标签序列进行检测，用于检测标签序列的锚定引物为SEQ ID NO：25。需要说明的是，SEQ ID NO：23-25的的5’端均被磷酸化修饰。

整体的测序顺序如图3所示。其中，待测SNP位点anchor混合物为SEQ ID NO：23、24这2种锚定引物按相同摩尔数混合所得的混合物。其中，Base1用于封闭锚定引物或探针与待测序文库分子上的非特异性结合位点，Base2用于检测待测SNP位点，Base3-6用于检测标签序列。

另外，本实施例同样步骤二所得产物，以图4中的测序顺序作为对比。即，未进行图3中的Base1。

图5示出了上述具体实施例中部分样本的待测SNP位点——131\133在实验组和对照组中的初步实验结果。其中，R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T,N=A/C/G/T；n表示信号太弱，无法判断是A、C、G和T中的哪一个。

由实验结果可知，相同样本在实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列类型均相同，但是它们的占比有明显区别；实验组中占比最高的SNP位点序列类型检出数均在93%以上，而对照组中占比最高的SNP位点序列类型检出数基本在75-85%之间。

另外，本发明人还将第二次扩增产物通过Sanger测序进行验证，结果显示，上述实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列类型均与Sanger测序结果完全一致。

以上，本发明的方法能够高效的同时对多个样品的多个SNP位点同时进行检测，并得到准确可信的结果，并且能够有效的降低连接测序所得结果中的错误信号，从而提高了MTHFR基因中的SNP位点检测的准确性。

另外，需要说明的是，本申请的发明人，在另一具体实施例中，直接用上述实施例中的133内引物对和131内引物对，对上述样本1-25进行PCR扩增，然后进行后续的步骤二、三，所得实验结果和上述具体实施例结果基本一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司

<120> 一种MTHFR基因检测方法及试剂盒

<130>

<160> 25

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cggucatccc tcgccttgaa ca 22

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggucagcca ctcactgttt tagttca 27

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgguccctat tggcaggtta cccc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgguctgaag cacttgaagg agaa 24

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtggaggga gcttatgg 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttctggacc tgagaggaga tc 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caagtgatgc ccatgtcggt 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agctgcgtga tgatgaaat 19

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggucactgc cctctgtcag gag 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgguggagct gaaggactac tacct 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgguggagga gctgaccagt gaa 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgguaaggag gagctgctga aga 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtctcccaac ttacccttct c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtctcccaac ttacccttct 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaacgaagac ttcaaagaca ct 22

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggttctcccg agaggtaa 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catccctcgc cttgaaca 18

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagccactca ctgttttagt tca 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cactgccctc tgtcaggag 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggagctgaag gactactacc t 21

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 21

cctccctgca gtctctatgg gcnnnnctgc tagtcgctga agtagtcggt 50

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 22

ctacttcagc gactagcagn nnngcccata gagactgcag gg 42

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctcccgcaga caccttc 17

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cttcactggt cagctcc 17

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcccatagag actgcag 17

Claims

1.一种MTHFR基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。

2.根据权利要求1所述的MTHFR基因检测方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤：

C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；

C3、变性去除连接产物。

3.根据权利要求1所述的MTHFR基因检测方法，其特征在于，所述MTHFR基因特异性引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

4.根据权利要求4所述的MTHFR基因检测方法，其特征在于，所述MTHFR基因特异性引物对包括外引物对和内引物对；所述MTHFR基因内引物对中有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；所述步骤A包括以下步骤:

5.根据权利要求3所述的MTHFR基因检测方法，其特征在于，所述步骤B包括以下步骤：

B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。

6.根据权利要求5所述的MTHFR基因检测方法，其特征在于，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；

7.根据权利要求6所述的MTHFR基因检测方法，其特征在于，步骤B1中所述连接缓冲液中含有5-10% PEG。

8.一种MTHFR基因检测试剂盒，其特征在于，包括MTHFR基因特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。

9.根据权利要求8所述的MTHFR基因检测试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因特异性引物对中至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

10.根据权利要求9所述的MTHFR基因检测试剂盒，其特征在于，所述MTHFR基因特异性引物对包括外引物对和内引物对；所述MTHFR基因内引物对中有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

11.根据权利要求8所述的MTHFR基因检测试剂盒，其特征在于，还包括建库连接缓冲液，所述建库连接缓冲液中含有5-10% PEG。