WO2009145303A1 - チロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのプライマー - Google Patents

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WO2009145303A1
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佳代 檜山
一樹 中林
泰裕 大友
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シスメックス株式会社
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    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the present invention relates to a primer used for detecting mRNA of tyrosinase (hereinafter referred to as “TYR”). More specifically, the present invention relates to a primer suitable for detection of TYR mRNA in a sample, a primer set, and a method for detecting TYR mRNA.
  • TYR tyrosinase
  • TYR is a kind of enzyme that is expressed in animal and plant cells and catalyzes a reaction of oxidizing tyrosine to synthesize melanin. Recent studies have shown that TYR is useful as a molecular marker for detecting lymph node metastasis of melanoma. For example, in Non-Patent Document 1, it is possible to determine the presence or absence of lymph node metastasis of melanoma by preparing a measurement sample from lymph nodes collected from a living body and detecting TYR mRNA in the measurement sample by RT-PCR. It is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 uses RT-PCR that can detect a target nucleic acid with high sensitivity during detection, for example, micrometastasis of cancer cells to lymph nodes However, it took a very long time (about 2 to 4 hours) to detect.
  • the present invention provides a TYR mRNA detection primer, a TYR mRNA detection primer set, a TYR mRNA detection reagent kit, and a TYR mRNA detection method that can detect TYR mRNA in a shorter time than conventional techniques. With the goal.
  • a primer for detecting tyrosinase mRNA for detecting tyrosinase mRNA in a sample Comprising a first sequence at the 5 ′ end and a second sequence at the 3 ′ end,
  • the first sequence is (A1) having a length of 10 to 30 nucleotides, (B1) a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the complementary strand of the first region, which is a partial region of SEQ ID NO: 1,
  • the second sequence is (C1) having a length of 10 to 30 nucleotides, (D1) a sequence of a polynucleotide capable of hybridizing to a second region located 3 ′ end side of the first region in SEQ ID NO: 1,
  • the second region is (I) nucleotides 901 and 902 of SEQ ID NO: 1; or (ii) nucleotides 1118 and 1119 of SEQ ID NO: 1;
  • the primer set according to [2], dNTPs, Reagent for detecting tyrosinase mRNA comprising an enzyme having an action of synthesizing DNA using RNA as a template and an action of synthesizing DNA using DNA as a template while performing strand displacement, or RNA-dependent DNA polymerase and DNA-dependent DNA polymerase kit, [4] A step of reacting the sample, the primer set according to [2] above, and an RNA-dependent DNA polymerase to synthesize cDNA from tyrosinase mRNA in the sample, Reacting the primer set, a DNA-dependent DNA polymerase, and the cDNA synthesized in the step to amplify the cDNA, and detecting the cDNA amplified in the step; A method for detecting tyrosinase mRNA, comprising a step of detecting tyrosinase mRNA, and a template of DNA while performing DNA substitution and strand displacement using [5]
  • TYR mRNA detection primer, TYR mRNA detection primer set, TYR mRNA detection reagent kit and TYR mRNA detection method of the present invention can detect TYR mRNA in a short time.
  • detecting not only determines whether the target substance TYR mRNA is present in the sample, but also quantifies TYR mRNA in the sample. Including.
  • “primer” refers to identification of nucleic acid to be amplified in nucleic acid amplification techniques such as LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) method (see US Pat. No. 6,410,278 and US Pat. No. 6,974,670).
  • a polynucleotide having a function (hereinafter referred to as “primer function”) that can hybridize to the region and can serve as a starting point for an amplification reaction by a polymerase. Since the nucleic acid to be detected is mRNA, it can be detected by a nucleic acid amplification reaction (eg, RT-LAMP method) including a reverse transcription reaction.
  • Hybridization means that a part or all of a sequence of one polynucleotide is hydrogenated to a part or all of another polynucleotide based on the complementarity of the bases of the polynucleotide under stringent conditions. Refers to binding through a bond.
  • the “stringent condition” is a condition generally used by those skilled in the art when performing polynucleotide hybridization, and is a condition under which the primer of this embodiment can hybridize to TYR mRNA or its cDNA. If there is no particular limitation. It is known that the stringency during hybridization is a function of temperature, salt concentration, primer chain length, primer GC content, and concentration of chaotropic agent in the hybridization buffer. As stringent conditions, for example, conditions described in Sambrook, J. et al., 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, etc. can be used. .
  • “50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate, pH 7.6, 5 ⁇ Denhart's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / ml nucleic acid were added.
  • the hybridization temperature is 42 ° C. in the solution containing, ”but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence of TYR mRNA is a sequence corresponding to the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • thymine does not exist in mRNA and uracil is included instead, uracil is described as thymine (t) for convenience in SEQ ID NO: 1. This sequence is registered in the GenBank database as Accession No. NM_000372.
  • the primer according to one embodiment (Embodiment 1) of the present invention is a primer for detecting TYR mRNA for detecting tyrosinase mRNA in a sample, A first sequence on the 5 ′ end side and a second sequence on the 3 ′ end side,
  • the first sequence is (A1) having a length of 10 to 30 nucleotides, (B1) a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the complementary strand of the first region, which is a partial region of SEQ ID NO: 1,
  • the second sequence is (C1) having a length of 10 to 30 nucleotides, (D1) a sequence of a polynucleotide capable of hybridizing to a second region located 3 ′ end side of the first region in SEQ ID NO: 1,
  • the second region is (I) nucleotides 901 and 902 of SEQ ID NO: 1; or (ii) nucleotides 1118 and 1119 of SEQ ID NO: 1; It is the area
  • the primer of Embodiment 1 is particularly a primer that is suitably used for detection of TYR mRNA using the RT-LAMP method. According to the primer of Embodiment 1, since the first sequence is included on the 5 ′ end side and the second sequence is included on the 3 ′ end side, TYR mRNA can be detected efficiently and with good reproducibility. .
  • cDNA is synthesized from TYR mRNA by reverse transcription reaction (RT reaction), and then the synthesized cDNA is amplified by LAMP reaction.
  • RT reaction reverse transcription reaction
  • LAMP reaction LAMP reaction
  • a primer of Embodiment 1 for example, as schematically shown in FIG. 1, a partial region of TYR mRNA (“R1c” in FIG. 1).
  • R1c a partial region of TYR mRNA
  • a primer comprising a polynucleotide having a second sequence on the 3 ′ end side, which is a polynucleotide sequence capable of hybridizing to a region located in the region (“R2c” in FIG. 1).
  • the first sequence and the second sequence are each preferably preferably 10 nucleotides or more in length.
  • the length is preferably 30 nucleotides or less from the viewpoint of ensuring a hybridization temperature that is easy to operate.
  • the first sequence and the second sequence may be directly linked or may be linked via an intervening sequence.
  • the intervening sequence is preferably a sequence having low relevance to TYR mRNA or TYR cDNA. For example, 5′-tttt-3 ′ and the like can be mentioned.
  • the length of the intervening sequence is preferably 1 to 50 nucleotides, and more preferably 1 to 40 nucleotides.
  • the primer of Embodiment 1 can function as a reverse inner primer (hereinafter referred to as “RIP”) among the primers used in the RT-LAMP method.
  • RIP reverse inner primer
  • the primer (RIP) of Embodiment 1 the forward inner primer (hereinafter referred to as “FIP”), and the F3 primer can be used.
  • the present invention also includes a primer set for detecting TYR mRNA containing these primers.
  • the primer set for detecting TYR mRNA is a primer set for detecting TYR mRNA for detecting tyrosinase mRNA in a sample, Including a first primer, a second primer, and a third primer;
  • the first primer is the primer of Embodiment 1.
  • the second primer includes a third sequence on the 5 ′ end side and a fourth sequence on the 3 ′ end side,
  • the third sequence is (A2) having a length of 10 to 30 nucleotides, (B2) a polynucleotide sequence capable of hybridizing to a third region located 5 ′ end of the first region of SEQ ID NO: 1,
  • the fourth sequence is (C2) having a length of 10 to 30 nucleotides, (D2) a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the complementary strand of the fourth region located 5 ′ end of the third region of SEQ ID NO: 1,
  • the third primer is a primer comprising a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the complementary strand of the fifth region located 5 ′ end of the fourth region of SEQ ID NO: 1.
  • the primer set of the present embodiment since the first primer, the second primer, and the third primer are included, it is possible to detect TYR mRNA quickly, with high reproducibility.
  • the primer set of the present embodiment may further include a fourth primer that can hybridize to the sixth region located 3 ′ end side of the second region of SEQ ID NO: 1.
  • the primer set of this embodiment may further include a fifth primer that hybridizes to the seventh region located between the third region and the fourth region of SEQ ID NO: 1.
  • the primer set of the present embodiment may further include a sixth primer that hybridizes to the complementary region of the eighth region located between the first region and the second region of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a primer and a region where the primer hybridizes.
  • each region of F1, F2, L, F1, R1c, R2c and R3c is a region on TYR mRNA
  • each region of F3c, F2c, F1c, R1, M, R2 and R3 is This is a region on TYR cDNA which is a complementary strand of TYR mRNA.
  • F1 and F1c, F2 and F2c, F3 and F3c, R1 and R1c, R2 and R2c, and R3 and R3c are complementary to each other. These regions are selected in consideration of the detection efficiency, reproducibility, etc. of TYR mRNA.
  • RIP is the first primer
  • FIP is the second primer
  • F3 primer is the third primer
  • R3 primer is the fourth primer
  • loop primer F is the fifth primer
  • loop primer R is the sixth primer. It corresponds to each primer.
  • FIP (second primer) has a third sequence, which is a polynucleotide sequence hybridizable to region F1 (complementary region of F1c) of TYR cDNA, which is a complementary strand of TYR mRNA, on the 5 ′ end side. It is a polynucleotide having a fourth sequence on the 3 ′ end side, which is a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the region F2c of cDNA.
  • the third sequence and the fourth sequence may be directly linked or may be linked via the intervening sequence.
  • the lengths of the third and fourth sequences are the same as the lengths of the first and second sequences.
  • the F3 primer (third primer) consists of a polynucleotide capable of hybridizing to the region F3c located downstream (3 ′ end side) from F2c of TYR cDNA.
  • the primer set of the present invention may contain an R3 primer in addition to the FIP, RIP and F3 primers.
  • This R3 primer consists of a polynucleotide capable of hybridizing to the region R3c located downstream (3 ′ end side) of R2c of TYR mRNA.
  • the primer set of the present invention may contain a loop primer.
  • Loop primer F is a polynucleotide that can hybridize to region L located between F2 and F1 in TYR mRNA, and can hybridize to region M located between R1 and R2 in TYR cDNA And loop primer R, which is a simple polynucleotide.
  • the primer set of the present invention may contain one or both of these loop primers F and R.
  • the primer set of the present invention includes one or both of the loop primers F and R, according to such a primer set, it is possible to more rapidly amplify cDNA by the LAMP reaction.
  • the chain lengths of the F3 primer, R3 primer, loop primer F and R are not particularly limited as long as they are long enough to express the primer function. Since the chain length of a primer recognized by a known polymerase that catalyzes a nucleic acid synthesis reaction is 5 nucleotides or more, the chain length of each primer is preferably 5 to 100 nucleotides. In consideration of the specificity between the nucleotide sequence of the primer and the region where the primer hybridizes, the chain length of each primer is preferably 10 nucleotides or more, and preferably 30 nucleotides in consideration of the hybridization temperature of the primer. It is as follows. The chain length of FIP and RIP is preferably 20 to 200 nucleotides, more preferably 20 to 60 nucleotides.
  • the primer set of the present invention it is preferable that at least one of the above-mentioned primers hybridizes to a region containing an exon junction of TYR mRNA.
  • the TYR gene consists of 9 exons, and an intron is interposed between exons.
  • introns are removed by splicing, and exons are directly connected to each other. The joint where the exons and exons are connected is called an exon junction.
  • exon 1 and exon 2 are separated by an intron, but the intron is removed in mRNA synthesis, so in mRNA, the 3 ′ end of exon 1 and the 5 ′ end of exon 2 are adjacent. . Since SEQ ID NO: 1 consists of 5 exons, SEQ ID NO: 1 has the following 4 exon junctions (exon junctions 1 to 4).
  • Exon junction 1 of exons 1 and 2 1 901 and 902 binding part of SEQ ID NO: 1
  • Exon junction 2 of exon 2 and 3 1118 and 1119 binding part of SEQ ID NO 1 exons 3 and 4
  • Exon junction 3 with: 1266th and 1267th binding part of SEQ ID NO: 1
  • a primer capable of hybridizing to a region containing an exon junction hybridizes to mRNA of the TYR gene, but has a very low possibility of hybridizing to genomic DNA of the TYR gene. According to such a primer, it is possible to prevent nucleic acid from being non-specifically amplified during mRNA detection by RT-LAMP reaction.
  • the first hybrid to the TYR mRNA in the sample consists of the second sequence of RIP. It is considered to be a polynucleotide moiety. Therefore, in the primer set of the present invention, it is more preferable that the polynucleotide portion consisting of the second sequence of RIP hybridizes to a region containing exon junctions among the above-mentioned primers. That is, it is more preferable that the region R2c includes an exon junction. Thereby, it can avoid amplifying a nucleic acid non-specifically at the initial stage of reaction.
  • the primer set of the present invention is preferably an exon of the above exon junctions.
  • a primer that hybridizes to a region containing junction 1 or 2, more preferably a primer that hybridizes to a region containing exon junction 2 is included.
  • the primer of this embodiment and the specific region of TYR mRNA to which this primer hybridizes do not need to be completely complementary to each other, as long as both have complementarity to the extent that they can hybridize to each other. Good (this is also described in US Pat. No. 4,800,159). That is, in the case of a polynucleotide having a primer function, this primer has one or more mutations such as substitution, deletion, insertion, addition and the like in a sequence having complete complementarity with the specific region, It may be a polynucleotide having several.
  • the polynucleotide having this mutation preferably has a homology of 80% or more with respect to a polynucleotide having no mutation, more preferably 90% or more of homology, More preferably, it has a homology of 95% or more.
  • the primer In the RT-LAMP reaction, the primer is hybridized to TYR mRNA, which is the target nucleic acid, and then nucleic acid synthesis is performed starting from the 3 'end of the primer by the action of the polymerase. For this reason, it is considered that the higher the complementarity between the 3 'end portion of the primer and the TYR mRNA, the easier the nucleic acid synthesis reaction proceeds.
  • the primer of the present invention is preferably a polynucleotide in which 3 nucleotides at the 3 ′ end are completely complementary to the hybridizing region of the primer, and more preferably 5 nucleotides at the 3 ′ end are completely complementary. Polynucleotide.
  • the second sequence contains a sequence consisting of 3 consecutive nucleotides completely complementary to the sequence of the second region at the 3 ′ end.
  • it contains a sequence consisting of 5 consecutive nucleotides that are completely complementary to the sequence of the second region.
  • Each region of F3, F2, F1, R1c, R2c, R3c, L and M is set in the sequence of TYR mRNA shown in SEQ ID NO: 1. Specific examples of these areas are given below.
  • the primer can be designed based on each of the above regions. Specific examples of each primer are given below. The description in parentheses after the sequence indicates which region in the sequence of TYR mRNA (SEQ ID NO: 1) is the same sequence or complementary.
  • Sequence number 2 5'-AATGGAACGCCCGAGGGA-3 '(the same arrangement
  • Sequence number 3 5'-GACCTTTACGGCGTAATCCT-3 '(the same arrangement
  • Sequence number 4 5'-TATGCAATGGAACGCCCG-3 '(the same arrangement
  • Sequence number 5 5'-CAGCCATCAGTCTTTATGCAATG-3 '(the same arrangement
  • Sequence number 6 5'-TCTGCCTTGGCATAGACTCT-3 '(the same arrangement
  • Sequence number 7 5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3 ' (Sequence where the complementary sequence of the 1031-1054th region and the same sequence as the 971-992th region are linked)
  • Sequence number 8 5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCGGAAACCATGACAAATCCAGAAC-3 ' (Sequence where the complementary sequence of the 1031-1054th region is linked to the same sequence as the 986-1008th region)
  • Sequence number 9 5'-TACATCAGCTGAAGAGGGGAGCAGGGACCTTTACGGC-3 ' (Sequence where the complementary sequence of the 1015-1036th region and the same sequence as the 963-977th region are linked)
  • Sequence number 14 5'-CCAATATGAATCTGGTTCCATGGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3 ' (Sequence where the same sequence as the 1057-1080 region and the complementary sequence of the 1114-1133 region are linked)
  • SEQ ID NO: 15 5'-TTTGCCTGAGTTTGACCCAATAGGACTAGCAAATCCTTCC-3 ' (Sequence obtained by linking the same sequence as the 1041-1062th region and the complementary sequence of the 1114-1131th region)
  • Sequence number 16 5'-GCCTGAGTTTGACCCAATATGGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3 ' (Sequence where the same sequence as the 1044-1064th region and the complementary sequence of the 1114-1133th region are linked)
  • Sequence number 17 5'-CAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3 ' (Sequence obtained by linking the same sequence as the 1026-1049th region and the complementary sequence of the 1114-1133
  • Sequence number 56 5'-AAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAG-3 '(the same arrangement
  • Sequence number 57 5'-AGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3 '(the same arrangement
  • Sequence number 58 5'-GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAA-3 '(the same arrangement
  • a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 can hybridize to a region containing exon junction 1.
  • the primers of SEQ ID NOs: 14 to 18 can hybridize to a region containing exon junction 2.
  • the above primers can be used as a primer set including four kinds of primers by appropriately combining F3 primer, FIP, RIP and R3 primer according to the amplification region. Further, the loop primers F and R can be combined to be used as a primer set including six kinds of primers. Specific examples of such primer sets are shown in Table 1 below.
  • reverse transcriptase and strand displacement type DNA polymerase can be used. Also, instead of these two kinds of enzymes (reverse transcriptase and strand displacement type DNA polymerase), it has an action of synthesizing DNA using RNA as a template and an action of synthesizing DNA using DNA as a template while performing strand displacement.
  • One kind of enzyme may be used.
  • a buffer that gives conditions suitable for the enzyme reaction.
  • Each of the above substances can be stored in separate containers, but the reverse transcriptase and the strand displacement type DNA polymerase may be stored in the same container.
  • these reagents may be provided as a reagent kit including a part or all of the above-described reagents.
  • the method for detecting TYR mRNA of the present invention comprises: Use of the above-described primer set and RNA-dependent DNA polymerase and DNA-dependent DNA polymerase (the following “detection method of Embodiment 1”), or the above-described primer set and the action of synthesizing DNA using RNA as a template, Use of an enzyme having an action of synthesizing DNA using DNA as a template while performing strand displacement (the following “detection method of embodiment 2”) Can be implemented by
  • the detection method of the first embodiment is as follows.
  • (I-1) a step of reacting a sample, the above primer set, and an RNA-dependent DNA polymerase to synthesize cDNA from tyrosinase mRNA in the sample
  • (II-1) a step of amplifying cDNA by reacting the primer set, a DNA-dependent DNA polymerase, and the cDNA synthesized in the step (I-1);
  • the detection method of the second embodiment is as follows. (I-2) reacting the sample with the above-described primer set and an enzyme having an action of synthesizing DNA using RNA as a template and an action of synthesizing DNA using DNA as a template while performing strand displacement, Synthesizing cDNA using the tyrosinase mRNA in the sample as a template, further synthesizing and amplifying the cDNA using the cDNA as a template, and (II-2) detecting the cDNA amplified in the step, A method comprising a step of detecting tyrosinase mRNA in a sample.
  • Embodiments 1 and 2 are preferably performed using the RT-LAMP method from the viewpoint of detecting TYR mRNA with high efficiency, accuracy, and in a short time.
  • the primer set described above, an RNA-dependent DNA polymerase (hereinafter referred to as “reverse transcriptase”), and a DNA-dependent DNA polymerase having strand displacement activity (Hereinafter referred to as “strand displacement DNA polymerase”), dNTPs (including dATP, dGTP, dTTP, and dCTP) and a sample are mixed and reacted to detect TYR mRNA in the sample. . Therefore, in this case, the steps (I-1) and (II-1) are performed in one step.
  • the primer set described above, the action of synthesizing DNA using RNA as a template, and the action of synthesizing DNA using DNA as a template while performing strand displacement can be detected by mixing and reacting the enzyme provided with dNTPs and the sample.
  • a buffer that gives conditions suitable for the enzyme reaction in each step Is also preferably used.
  • samples used for TYR mRNA detection include tissues (lymph nodes, lymph fluid, blood, etc.) and stool collected from a living body.
  • the detection of TYR mRNA is performed by an amplification step [the above steps (I-1) and (II-1)] and a detection step [the above step (III-1). ] Is performed.
  • a sample containing TYR mRNA collected from a living body is mixed with the above-described primer set, reverse transcriptase, dNTPs, and strand displacement DNA polymerase. Then, the obtained mixture is heated to a certain temperature (for example, 65 ° C.) to perform RT reaction and LAMP reaction, and TYR cDNA is synthesized using TYR mRNA as a template, and the TYR cDNA is used using TYR cDNA as a template. Is further synthesized and amplified [the above steps (I-1) and (II-1)].
  • the mechanism of RT reaction and LAMP reaction is as follows. First, the second sequence of RIP hybridizes to the region R2c of TYR mRNA in the reaction solution. Subsequently, TYR cDNA is synthesized from the 3 ′ end of RIP using TYR mRNA as a template by reverse transcriptase. Thereby, a double-stranded nucleic acid composed of TYR cDNA (RIP extended chain) extended from RIP and TYR mRNA is synthesized.
  • TYR cDNA RIP extended chain
  • the R3 primer hybridizes to the region R3c of TYR mRNA.
  • TYR cDNA is synthesized by the strand displacement DNA polymerase using TYR mRNA as a template, while the RIP extension strand already bound to TYR mRNA is peeled off (replaced) from the 3 ′ end of the R3 primer.
  • the RIP extension chain Since the RIP extension chain is in a single-stranded state and has a sequence complementary to TYR mRNA, the RIP extension chain includes a region F2c complementary to the region F2 of TYR mRNA.
  • the fourth sequence of FIP hybridizes to the region F2c of this RIP extended chain.
  • DNA synthesis is performed from the 3 'end of FIP using a RIP extended strand as a template by a strand displacement DNA polymerase. Since the DNA synthesized here has a third sequence (the sequence of a polynucleotide that hybridizes to region F1) at the 5 ′ end, the polynucleotide comprising the third sequence hybridizes to region F1 on this DNA. Soybeans form a stem loop structure. In addition, since this DNA has a complementary sequence of the first sequence (sequence that hybridizes to region R1c) at the 3 ′ end, the complementary sequence of the first sequence hybridizes to region R1c on this DNA. A stem loop structure is formed. Therefore, this DNA has a dumbbell structure in which a stem loop structure is formed at both the 5 'end and the 3' end.
  • dumbbell DNA The DNA having the dumbbell structure (dumbbell DNA) is extended from the 3 ′ end by a strand-displacing DNA polymerase while the stem loop structure on the 5 ′ end side is released using another part in the dumbbell DNA as a template, and the extended strand is can get. Since this extended strand has sequences complementary to each other at the 5 'end, the 3' end and the center thereof, three stem loop structures are formed in the extended strand. Further, the extended strand is extended from the 3 'end by a strand displacement type DNA polymerase while releasing the stem loop structure using the other part in the extended strand as a template.
  • this amplification product is converted into a fluorescent intercalator, for example,
  • the amplification product can be detected by fluorescent staining with ethidium bromide, SYBR (registered trademark) GREEN I, Pico Green (registered trademark), etc., and generating fluorescence by irradiating ultraviolet rays.
  • the fluorescent staining may be performed by adding a fluorescent dye to the reaction solution after the amplification reaction [after the above step (II-1)].
  • the fluorescent dye is added to the reaction solution in advance, and the nucleic acid is added in the presence of the fluorescent dye. You may carry out by implementing amplification.
  • the detection step [the step (III-1)] it can be determined whether or not TYR mRNA is present in the sample depending on whether or not fluorescence is detected.
  • the amplification product can be quantified by measuring the fluorescence intensity of the reaction solution after the amplification reaction [after step (II-1)], and the TYR mRNA contained in the sample is quantified based on the quantification result. It is also possible to do.
  • the amount of TYR mRNA in the sample is measured by measuring the increase in fluorescence intensity of the reaction solution in real time and measuring the time to reach a certain fluorescence intensity. (Real-time RT-PCR method, real-time RT-LAMP method, etc.).
  • magnesium pyrophosphate insoluble in water is generated as a by-product.
  • the magnesium pyrophosphate increases as nucleic acid amplification proceeds, and the reaction solution becomes cloudy with this increase. Therefore, i) confirming the turbidity of the reaction solution visually, ii) measuring the turbidity by measuring the absorbance and scattered light intensity of the reaction solution, or iii) filtering the reaction solution with a colored filter, By confirming the residue above, the target nucleic acid can be detected (see WO 01/83817).
  • DNA amplification and turbidity in a closed system are monitored by monitoring turbidity changes in real time, as in the case of using the fluorescent dye.
  • the increase can be tracked. Therefore, in the detection step [the step (III-1)], it can be determined whether or not TYR mRNA is present in the sample based on whether or not the reaction solution becomes clouded. Further, the amplification product can be quantified by measuring the turbidity of the amplification product, and TYR mRNA contained in the sample can be quantified based on the quantification result.
  • amplification rise time When measuring the increase in turbidity in real time, it is possible to measure the time to reach a certain turbidity (hereinafter referred to as amplification rise time) and convert this time into the amount of TYR mRNA in the sample. It is.
  • the step (I-2) is an amplification step corresponding to the amplification step [the steps (I-1) and (II-1)] in the detection method of the first embodiment. is there.
  • DNA is synthesized using RNA as a template instead of the two kinds of enzymes (reverse transcriptase and strand displacement DNA polymerase) in the steps (I-1) and (II-1). It can be carried out in the same manner as steps (I-1) and (II-1) except that one kind of enzyme having the action and the action of synthesizing DNA using DNA as a template while performing strand displacement is used. it can.
  • the step (II-2) can be performed in the same manner as the detection step [the step (III-1)] in the detection method of the first embodiment.
  • the reagent used in the step (I-1), step (II-1) and step (I-2) can be provided as a reagent kit for mRNA detection.
  • a reagent kit for mRNA detection is an enzyme or RNA dependent having the above primer set, dNTPs, an action of synthesizing DNA using RNA as a template, and an action of synthesizing DNA using DNA as a template while performing strand displacement. And a DNA-dependent DNA polymerase.
  • Each reagent described above may be stored in a separate container. Further, the reverse transcriptase and the strand displacement type DNA polymerase may be accommodated in the same container. In addition, at least two types of reagents among dNTPs, buffers, and various primers may be accommodated in the same container.
  • Example 1 Whether or not TYR mRNA could be detected using the primer sets 1 to 45 shown in Table 1 was verified as follows.
  • each reagent was mixed so that it might become the following composition, and the buffer solution for RT-LAMP reaction was prepared.
  • each reagent was mixed so that it might become the following composition, and the enzyme liquid (3.04 microliters) was prepared.
  • RT-LAMP reaction buffer 14.0 ⁇ L Enzyme solution 3.0 ⁇ L Primer mix 5.0 ⁇ L 10 mM Tris HCl (pH 8.0) 1.0 ⁇ L RNA sample 2.0 ⁇ L
  • NC reaction solutions As a negative control (NC) corresponding to each of 45 types of reaction solutions, NC reaction solutions (45 types) to which 2.0 ⁇ L of ultrapure water was added instead of a 2.0 ⁇ L RNA sample were also prepared.

Abstract

　本発明は、ＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出する手段及び方法を提供する。ＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーとして、５'末端側に第一配列、３'末端側に第二配列を含み、第一配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、第二配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１において第一領域よりも３'末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であるプライマーを用いる。

Description

チロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのプライマー
　本発明は、チロシナーゼ（以下、「ＴＹＲ」という）のｍＲＮＡを検出するために用いられるプライマーに関する。さらに詳しくは、試料中のＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出に好適なプライマー、プライマーセット及びＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出方法に関する。
　ＴＹＲは、動物や植物の細胞で発現し、チロシンを酸化してメラニンを合成する反応を触媒する酵素の一種である。近年の研究により、ＴＹＲは、メラノーマのリンパ節転移を検出するための分子マーカーとして有用であることが分かってきた。例えば、非特許文献１には、生体から採取したリンパ節から測定試料を調製し、測定試料中のＴＹＲのｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲによって検出することによって、メラノーマのリンパ節転移の有無を判定できることが開示されている。
エブラハムセン(Abrahamsen)ら、「センチネル節におけるメラノーマｍＲＮＡマーカーの定量：シングルステップリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイの前臨床評価(Quantification of Melanoma mRNA Markers in Sentinel Nodes:Pre-Clinical Evaluation of a Single-Step Real-Time ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction Assay)」、２００４年８月、第６巻、第３号、ｐ．２５３-２５９
　上述の通り、ＴＹＲのｍＲＮＡは、メラノーマ等のがんの検出のための分子マーカーとして有用である。しかしながら、非特許文献１に記載の技術は、検出の際に、高感度に標的核酸を検出することができるＲＴ－ＰＣＲが用いられているため、例えば、がん細胞のリンパ節への微小転移をも検出できるが、検出までに非常に時間（２～４時間程度）がかかっていた。
　本発明は、従来の技術よりも短時間でＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出することができる、ＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマー、ＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーセット、ＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用試薬キット及びＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出方法を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は、
〔１〕　試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーであって、
　５’末端側に第一配列、３’末端側に第二配列を含んでなり、
　前記第一配列が、
（ａ１）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ１）　配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第二配列が、
（ｃ１）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ１）　配列番号１において第一領域よりも３’末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第二領域が、
（ｉ）　配列番号１の９０１及び９０２番目のヌクレオチド；又は
（ii）　配列番号１の１１１８及び１１１９番目のヌクレオチド；
を含む領域であるチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマー、
〔２〕　試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセットであって、
　第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含み、
　前記第一プライマーが、請求項１記載のプライマーであり、
　前記第二プライマーが、５’末端側に第三配列、３’末端側に第四配列を含み、
　前記第三配列が、
（ａ２）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ２）　前記配列番号１の第一領域よりも５’末端側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第四配列が、
（ｃ２）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ２）　前記配列番号１の第三領域よりも５’末端側に位置する第四領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第三プライマーが、前記配列番号１の第四領域よりも５’末端側に位置する第五領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列からなるプライマーであるチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセット、
〔３〕　前記〔２〕記載のプライマーセットと、
　ｄＮＴＰｓと、
　ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素、またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと
を含むチロシナーゼｍＲＮＡ検出用試薬キット、
〔４〕　試料と、前記〔２〕記載のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
　前記プライマーセットと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、前記工程で合成されたｃＤＮＡとを反応させて、前記ｃＤＮＡを増幅する工程、及び
　前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法、並びに
〔５〕　試料と、前記〔２〕記載のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するとともに、このｃＤＮＡを鋳型として当該ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する工程、及び
　前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法
に関する。
　本発明のＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマー、ＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーセット、ＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用試薬キット及びＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出方法によれば、短時間でＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出することができる。
プライマーと、プライマーがハイブリダイズする領域とを示した模式図である。
〔プライマー及びプライマーセット〕
　まず、ＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出するためのＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーを説明する。
　なお、本明細書において、「検出する」とは、標的とする物質であるＴＹＲ　ｍＲＮＡが試料中に存在するか否かを判定することだけでなく、試料中のＴＹＲ　ｍＲＮＡを定量することをも含む。
　本明細書において、「プライマー」とは、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（米国特許第６４１０２７８号公報及び米国特許第６９７４６７０号公報参照）等の核酸増幅技術において、増幅対象となる核酸の特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能（以下、「プライマー機能」という）を有するポリヌクレオチドをいう。検出対象となる核酸はｍＲＮＡであるため、逆転写反応を含む核酸増幅反応（例えば、ＲＴ－ＬＡＭＰ法等）により検出することができる。
　「ハイブリダイズ」とは、ストリンジェントな条件下で、ポリヌクレオチドの塩基同士の相補性に基づいて、あるポリヌクレオチドの一部又は全部の配列が別のポリヌクレオチドの一部又は全部の配列に水素結合を介して結合することをいう。
　「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行なう際に当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマーがＴＹＲ　ｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al., 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件等を用いることができる。より具体的には、「５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃」を例示することができるが、これに限定されない。
　ＴＹＲ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列に対応する配列である。なお、ｍＲＮＡにはチミンは存在せず、代わりにウラシルが含まれるが、配列番号１では便宜上ウラシルをチミン（ｔ）として表記してある。この配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_000372として登録されている。
　本発明の一実施形態（実施形態１）に係るプライマーは、試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーであって、
　５’末端側に第一配列、３’末端側に第二配列を含み、
　前記第一配列が、
（ａ１）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ１）　配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第二配列が、
（ｃ１）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ１）　配列番号１において第一領域よりも３’末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第二領域が、
（ｉ）　配列番号１の９０１及び９０２番目のヌクレオチド；又は
（ii）　配列番号１の１１１８及び１１１９番目のヌクレオチド；
を含む領域であることを特徴としている。
　本実施形態１のプライマーは、特に、ＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いたＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出に好適に用いられるプライマーである。本実施形態１のプライマーによれば、５’末端側に前記第一配列、３’末端側に前記第二配列を含んでいるため、ＴＹＲ　ｍＲＮＡを効率よく、かつ再現性よく検出することができる。
　前記ＲＴ－ＬＡＭＰ法においては、まずは逆転写反応（ＲＴ反応）によってＴＹＲ　ｍＲＮＡからｃＤＮＡが合成され、続いて合成されたｃＤＮＡがＬＡＭＰ反応により増幅される。
　かかるＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いたＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出では、本実施形態１のプライマーとして、例えば、図１に模式的に示されるように、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの一部の領域（図１中、「Ｒ１ｃ」）の相補領域（図１中、「Ｒ１」）にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第一配列を５’末端側に有し、ＴＹＲ　ｍＲＮＡにおいて前記領域Ｒ１ｃよりも下流（３’末端側）に位置する領域（図１中、「Ｒ２ｃ」）にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第二配列を３’末端側に有するポリヌクレオチドからなるプライマーを用いることができる。
　前記第一配列及び第二配列は、本実施形態１のプライマーと当該プライマーがハイブリダイズする領域との間のハイブリダイゼーションの特異性の観点から、それぞれ独立して、好ましくは１０ヌクレオチド以上の長さであり、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出に際して、操作が容易なハイブリダーゼーション温度を確保する観点から、好ましくは３０ヌクレオチド以下の長さである。
　本実施形態１のプライマーにおいては、第一配列と第二配列とは直接連結されていてもよく、介在配列を介して連結されていてもよい。介在配列としては、ＴＹＲ　ｍＲＮＡやＴＹＲ　ｃＤＮＡとは関連性の低い配列であることが好ましい。例えば、5'-tttt-3'等が挙げられる。介在配列の長さは、１～５０ヌクレオチドであることが好ましく、１～４０ヌクレオチドであることがより好ましい。
　本実施形態１のプライマーは、前記ＲＴ－ＬＡＭＰ法で用いられるプライマーのうち、リバースインナープライマー（以下、「ＲＩＰ」という）として機能することができる。
　ＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いてＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出するためには、前記実施形態１のプライマー（ＲＩＰ）と、フォワードインナープライマー（以下、「ＦＩＰ」という）と、Ｆ３プライマーとを用いることができる。本発明には、これらのプライマーを含むＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーセットも包含される。
　本発明の一実施形態に係るＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーセットは、試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用プライマーセットであって、
　第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含み、
　前記第一プライマーが、前記実施形態１のプライマーであり、
　前記第二プライマーが、５’末端側に第三配列、３’末端側に第四配列を含み、
　前記第三配列が、
（ａ２）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｂ２）　前記配列番号１の第一領域よりも５’末端側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第四配列が、
（ｃ２）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
（ｄ２）　前記配列番号１の第三領域よりも５’末端側に位置する第四領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
　前記第三プライマーが、前記配列番号１の第四領域よりも５’末端側に位置する第五領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列からなるプライマーであることを特徴としている。
　本実施形態のプライマーセットによれば、前記第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含むため、ＴＹＲ　ｍＲＮＡを高い効率で、迅速に、かつ再現性よく検出することが可能になる。
　本実施形態のプライマーセットは、前記配列番号１の第二領域よりも３’末端側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である第四プライマーをさらに含んでいてもよい。また、本実施形態のプライマーセットは、前記配列番号１の前記第三領域と前記第四領域との間に位置する第七領域にハイブリダイズする第五プライマーをさらに含んでいてもよい。さらに、本実施形態のプライマーセットは、前記配列番号１の前記第一領域と第二領域との間に位置する第八領域の相補領域にハイブリダイズする第六プライマーをさらに含んでいてもよい。
　以下、図１に基づいて、前記プライマーおよびプライマーセットをさらに説明する。
　図１は、プライマーと、プライマーがハイブリダイズする領域とを示した模式図である。なお、図１中、Ｆ１、Ｆ２、Ｌ、Ｆ１、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ及びＲ３ｃの各領域は、ＴＹＲ　ｍＲＮＡ上の領域であり、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｒ１、Ｍ、Ｒ２及びＲ３の各領域は、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの相補鎖であるＴＹＲ　ｃＤＮＡ上の領域である。また、Ｆ１とＦ１ｃ、Ｆ２とＦ２ｃ、Ｆ３とＦ３ｃ、Ｒ１とＲ１ｃ、Ｒ２とＲ２ｃ、及びＲ３とＲ３ｃは、それぞれ相補的である。これらの領域は、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出効率、再現性等を考慮して選択される。
　図１において、ＲＩＰは前記第一プライマー、ＦＩＰは前記第二プライマー、Ｆ３プライマーは前記第三プライマー、Ｒ３プライマーは前記第四プライマー、ループプライマーＦは前記第五プライマー、ループプライマーＲは前記第六プライマーにそれぞれ対応している。
　ＦＩＰ（第二プライマー）は、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの相補鎖であるＴＹＲ　ｃＤＮＡの領域Ｆ１（Ｆ１ｃの相補領域）にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第三配列を５’末端側に有し、ＴＹＲ　ｃＤＮＡの領域Ｆ２ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列である第四配列を３’末端側に有するポリヌクレオチドである。第三配列と第四配列とは、直接連結されていてもよく、前記介在配列を介して連結されていてもよい。また、ＦＩＰにおいて、第三配列及び第四配列の長さは、前記第一配列及び第二配列の長さと同様である。
　Ｆ３プライマー（第三プライマー）は、ＴＹＲ　ｃＤＮＡのＦ２ｃよりも下流（３’末端側）に位置する領域Ｆ３ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドからなる。
　さらに、本発明のプライマーセットは、ＦＩＰ、ＲＩＰ及びＦ３プライマーに加えて、Ｒ３プライマーを含んでいてもよい。このＲ３プライマーは、ＴＹＲ　ｍＲＮＡのＲ２ｃよりも下流（３’末端側）に位置する領域Ｒ３ｃにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドからなる。
　さらに、本発明のプライマーセットは、ループプライマーを含んでいてもよい。ループプライマーとしては、ＴＹＲ　ｍＲＮＡにおいてＦ２とＦ１との間に位置する領域Ｌにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマーＦ、ＴＹＲ　ｃＤＮＡにおいてＲ１とＲ２との間に位置する領域Ｍにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマーＲ等が挙げられる。本発明のプライマーセットは、これらのループプライマーＦ及びＲの一方又は両方を含んでいてもよい。
本発明のプライマーセットがループプライマーＦ及びＲの片方又は両方を含むものである場合、かかるプライマーセットによれば、ＬＡＭＰ反応によるｃＤＮＡの増幅をより迅速に行なうことが可能となる。
　Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー、ループプライマーＦ及びＲの鎖長は、プライマー機能を発現するに十分な長さであれば特に限定されない。核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は、５ヌクレオチド以上であることから、前記各プライマーの鎖長は、それぞれ、好ましくは５～１００ヌクレオチドである。また、プライマーのヌクレオチド配列とプライマーがハイブリダイズする領域との間の特異性を考慮すると、前記各プライマーの鎖長は、好ましくは１０ヌクレオチド以上、プライマーのハイブリダイゼーション温度を考慮すると、好ましくは３０ヌクレオチド以下である。また、ＦＩＰ及びＲＩＰの鎖長は、２０～２００ヌクレオチドが好ましく、２０～６０ヌクレオチドがより好ましい。
　本発明のプライマーセットでは、上述のプライマーのうち、少なくとも一つがＴＹＲ　ｍＲＮＡのエキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズすることが好ましい。ＴＹＲ遺伝子は、９個のエキソンからなり、エキソンとエキソンとの間にはイントロンが介在している。細胞内でＴＹＲ遺伝子からｍＲＮＡが合成される際はスプライシングによってイントロンが除去され、エキソン同士が直接連結される。このエキソンとエキソンとが連結されたつなぎ目の部分をエキソンジャンクションという。例えば、ゲノムではエキソン１とエキソン２とはイントロンによって隔離されているが、ｍＲＮＡ合成において前記イントロンは除去されるためｍＲＮＡではエキソン１の３’末端とエキソン２の５’末端とは隣接している。配列番号１は５個のエキソンからなるため、配列番号１には、以下の４個のエキソンジャンクション（エキソンジャンクション１～４）がある。
　エキソン１と２とのエキソンジャンクション１：配列番号１の９０１番目と９０２番目との結合部分
　エキソン２と３とのエキソンジャンクション２：配列番号１の１１１８番目と１１１９番目との結合部分
　エキソン３と４とのエキソンジャンクション３：配列番号１の１２６６番目と１２６７番目との結合部分
　エキソン４と５とのエキソンジャンクション４：配列番号１の１４４８番目と１４４９番目との結合部分
　エキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーは、ＴＹＲ遺伝子のｍＲＮＡにはハイブリダイズするが、ＴＹＲ遺伝子のゲノムＤＮＡにはハイブリダイズする可能性は極めて低い。このようなプライマーによれば、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応によるｍＲＮＡ検出の際に非特異的に核酸を増幅してしまうことを防止することが可能となる。
　また、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の反応機序（米国特許第６４１０２７８号公報及び米国特許第６９７４６７０号公報参照）によると、試料中のＴＹＲ　ｍＲＮＡに最初にハイブリダイズするのは、ＲＩＰの第二配列からなるポリヌクレオチド部分であると考えられる。したがって、本発明のプライマーセットでは、上述のプライマーのうち、ＲＩＰの第二配列からなるポリヌクレオチド部分がエキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズすることがより好ましい。すなわち、前記領域Ｒ２ｃがエキソンジャンクションを含むことがより好ましい。これにより、反応の初期の段階で非特異的に核酸を増幅してしまうことを避けることができる。
　ＴＹＲ　ｍＲＮＡと、試料中の他の遺伝子に由来するｍＲＮＡとの間の相同性や、検出速度、検出の再現性等の観点から、本発明のプライマーセットは、好ましくは上記のエキソンジャンクションのうちエキソンジャンクション１又は２を含む領域にハイブリダイズするプライマー、より好ましくはエキソンジャンクション２を含む領域にハイブリダイズするプライマーを含む。
　本実施形態のプライマーと、このプライマーがハイブリダイズするＴＹＲ　ｍＲＮＡの特定の領域とは、互いに完全に相補的である必要はなく、両者は、互いにハイブリダイズできる程度の相補性を有していればよい（このことは、米国特許第４８００１５９号公報にも記載されている）。すなわち、プライマー機能を有するポリヌクレオチドであれば、このプライマーは、上記特定の領域と完全な相補性を有する配列に置換、欠失、挿入、付加等のような変異を１又は複数個、すなわち、数個有するポリヌクレオチドであってもよい。この変異を有するポリヌクレオチドは、変異を有していないポリヌクレオチドに対して８０％以上の相同性を有していることが好ましく、９０％以上の相同性を有していることがより好ましく、９５％以上の相同性を有していることがさらに好ましい。
　ＲＴ－ＬＡＭＰ反応では、プライマーが目的の核酸であるＴＹＲ　ｍＲＮＡにハイブリダイズした後、ポリメラーゼの作用によってプライマーの３’末端を起点として核酸合成が行なわれる。このため、プライマーの３’末端部分とＴＹＲ　ｍＲＮＡとの間の相補性が高いほど、核酸合成反応が進行しやすくなることが考えられる。したがって、本発明のプライマーは、好ましくは３’末端の３ヌクレオチドが、当該プライマーのハイブリダイズする領域と完全に相補的なポリヌクレオチドであり、より好ましくは３’末端の５ヌクレオチドが完全に相補的なポリヌクレオチドである。
　なかでも、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出に際して、特異性を向上させる観点から、前記第二配列が、３’末端に、前記第二領域の配列に完全に相補的な連続した３ヌクレオチドからなる配列を含んでいることが好ましく、前記第二領域の配列に完全に相補的な連続した５ヌクレオチドからなる配列を含んでいることがより好ましい。
　Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、Ｌ及びＭの各領域は、配列番号１に示されるＴＹＲ　ｍＲＮＡの配列中に設定される。以下に、これらの領域の具体例を挙げる。
（Ｆ１）
　７９５～８１７番目の領域
　１００５～１０２４番目の領域
　１０１５～１０３６番目の領域
　１０１６～１０４０番目の領域
　１０３１～１０５４番目の領域
（Ｆ２）
　７３１～７５１番目の領域
　９６３～９７７番目の領域
　９６４～９８６番目の領域
　９７１～９９２番目の領域
　９７２～９９２番目の領域
　９８６～１００８番目の領域
（Ｆ３）
　７０３～７２２番目の領域
　９３１～９５３番目の領域
　９４５～９６２番目の領域
　９５０～９６２番目の領域
　９６６～９８５番目の領域
（Ｒ１ｃ）
　８２５～８４８番目の領域
　１０２６～１０４９番目の領域
　１０４１～１０６２番目の領域
　１０４４～１０６４番目の領域
　１０４４～１０６８番目の領域
　１０５７～１０８０番目の領域
（Ｒ２ｃ）
　８８６～９０８番目の領域
　１１１０～１１３３番目の領域
　１１１４～１１３１番目の領域
　１１１４～１１３３番目の領域
（Ｒ３ｃ）
　９１７～９３６番目の領域
　１１３５～１１５３番目の領域
　１１３８～１１５５番目の領域
　１１３８～１１５６番目の領域
　１１４１～１１６０番目の領域
　１１４２～１１６１番目の領域
（Ｌ）
　７５２～７７６番目の領域
　９８１～１００４番目の領域
　９８２～１００４番目の領域
　９８２～１００６番目の領域
　９８６～１０１０番目の領域
　９８７～１０１１番目の領域
　９８８～１０１１番目の領域
　９８８～１０１２番目の領域
　９８９～１０１１番目の領域
　９８９～１０１２番目の領域
　９８９～１０１３番目の領域
　９９０～１０１２番目の領域
　９９０～１０１３番目の領域
　９９０～１０１４番目の領域
　９９２～１０１５番目の領域
　９９３～１０１６番目の領域
　９９４～１０１６番目の領域
　９９５～１０１６番目の領域
　９９５～１０１８番目の領域
　９９６～１０１８番目の領域
　１０００～１０１９番目の領域
　１００１～１０２０番目の領域
　１００３～１０２２番目の領域
　１００４～１０２２番目の領域
　１００５～１０２４番目の領域
　１００６～１０２４番目の領域
　１００８～１０２７番目の領域
　１００９～１０２７番目の領域
　１００９～１０２８番目の領域
　１０１０～１０２９番目の領域
（Ｍ）
　８６０～８８４番目の領域
　１０６３～１０８７番目の領域
　１０６５～１０８９番目の領域
　１０６６～１０９０番目の領域
　１０６７～１０８９番目の領域
　１０６７～１０９０番目の領域
　１０６８～１０９１番目の領域
　１０６８～１０９２番目の領域
　１０６９～１０９１番目の領域
　１０６９～１０９２番目の領域
　１０６９～１０９３番目の領域
　１０７０～１０９３番目の領域
　１０７０～１０９４番目の領域
　１０７３～１０９７番目の領域
　１０７４～１０９８番目の領域
　１０７５～１０９９番目の領域
　１０８２～１１０４番目の領域
　１０８３～１１０５番目の領域
　１０８４～１１０５番目の領域
　１０８５～１１０７番目の領域
　本発明においては、前記プライマーは、上記の各領域に基づき設計することができる。以下に、各プライマーの具体例を挙げる。なお、配列の後の括弧内の記載は、各プライマーがＴＹＲ　ｍＲＮＡの配列（配列番号１）のどの領域と同じ配列であるか、又は相補的であるかを示したものである。
（Ｆ３プライマー）
　配列番号２：5'-AATGGAACGCCCGAGGGA-3'（950-967番目の領域と同じ配列）
　配列番号３：5'-GACCTTTACGGCGTAATCCT-3'（966-985番目の領域と同じ配列）
　配列番号４：5'-TATGCAATGGAACGCCCG-3'（945-962番目の領域と同じ配列）
　配列番号５：5'-CAGCCATCAGTCTTTATGCAATG-3'（931-953番目の領域と同じ配列）
　配列番号６：5'-TCTGCCTTGGCATAGACTCT-3'（703-722番目の領域と同じ配列）
（ＦＩＰ）
　配列番号７：5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3'
　（1031-1054番目の領域の相補配列と971-992番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
　配列番号８：5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCGGAAACCATGACAAATCCAGAAC-3'
　（1031-1054番目の領域の相補配列と986-1008番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
　配列番号９：5'-TACATCAGCTGAAGAGGGGAGCAGGGACCTTTACGGC-3'
　（1015-1036番目の領域の相補配列と963-977番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
　配列番号１０：5'-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3'
　（1031-1054番目の領域の相補配列と972-992番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
　配列番号１１：5'-AGAGGGGAGCCTTGGGGTTCAGGGACCTTTACGGC-3'
　（1005-1024番目の領域の相補配列と963-977番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
　配列番号１２：5'-ATTCTACATCAGCTGAAGAGGGGAGGGGACCTTTACGGCGTAATCCTG-3'
　（1016-1040番目の領域の相補配列と964-986番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
　配列番号１３：5'-GTCACACTTTTCTGCATCCCGCCCGGTGGGAACAAGAAATCCAG-3'
　（795-817番目の領域の相補配列と731-751番目の領域と同じ配列とを連結した配列）
（ＲＩＰ）
　配列番号１４：5'-CCAATATGAATCTGGTTCCATGGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
　（1057-1080番目の領域と同じ配列と、1114-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
　配列番号１５：5'-TTTGCCTGAGTTTGACCCAATAGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
　（1041-1062番目の領域と同じ配列と、1114-1131番目の領域の相補配列とを連結した配列）
　配列番号１６：5'-GCCTGAGTTTGACCCAATATGGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
　（1044-1064番目の領域と同じ配列と、1114-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
　配列番号１７：5'-CAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3'
　（1026-1049番目の領域と同じ配列と、1114-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
　配列番号１８：5'-GCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCGTGGACTAGCAAATCCTTCCAGTG-3'
　（1044-1068番目の領域と同じ配列と、1110-1133番目の領域の相補配列とを連結した配列）
　配列番号１９：5'-CAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCAGACAATCTGCCAAGAGGAGAAG-3'
　（825-848番目の領域と同じ配列と、886-908番目の領域の相補配列とを連結した配列）
（Ｒ３プライマー）
　配列番号２０：5'-GAGGCATCCGCTATCCCA-3'　（1138-1155番目の領域の相補配列）
　配列番号２１：5'-TTTGAGAGGCATCCGCTATC-3'　（1141-1160番目の領域の相補配列）
　配列番号２２：5'-GGCATCCGCTATCCCAGTA-3'　（1135-1153番目の領域の相補配列）
　配列番号２３：5'-AGAGGCATCCGCTATCCCA-3'　（1138-1156番目の領域の相補配列）
　配列番号２４：5'-CTTTGAGAGGCATCCGCTAT-3'　（1142-1161番目の領域の相補配列）
　配列番号２５：5'-TGGCTGTTGTACTCCTCCAA-3'　（917-936番目の領域の相補配列）
（ループプライマーＦ）
　配列番号２６：5'-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCA-3'（994-1016番目の領域の相補配列）
　配列番号２７：5'-CTGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3'（1009-1028番目の領域の相補配列）
　配列番号２８：5'-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCAT-3'（993-1016番目の領域の相補配列）
　配列番号２９：5'-TGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3'（1009-1027番目の領域の相補配列）
　配列番号３０：5'-GGAGCCTTGGGGTTCTGGAT-3'（1000-1019番目の領域の相補配列）
　配列番号３１：5'-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3'（995-1016番目の領域の相補配列）
　配列番号３２：5'-GGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTCC-3'（986-1010番目の領域の相補配列）
　配列番号３３：5'-GGGAGCCTTGGGGTTCTGGA-3'（1001-1020番目の領域の相補配列）
　配列番号３４：5'-GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGT-3'（996-1018番目の領域の相補配列）
　配列番号３５：5'-GCTGAAGAGGGGAGCCTTGG-3'（1010-1029番目の領域の相補配列）
　配列番号３６：5'-TCTGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3'（982-1006番目の領域の相補配列）
　配列番号３７：5'-GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3'（995-1018番目の領域の相補配列）
　配列番号３８：5'-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3'（989-1012番目の領域の相補配列）
　配列番号３９：5'-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTC-3'（987-1011番目の領域の相補配列）
　配列番号４０：5'-TGAAGAGGGGAGCCTTGGGG-3'（1008-1027番目の領域の相補配列）
　配列番号４１：5'-CTTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3'（990-1014番目の領域の相補配列）
　配列番号４２：5'-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3'（990-1012番目の領域の相補配列）
　配列番号４３：5'-AGGGGAGCCTTGGGGTTCT-3'（1004-1022番目の領域の相補配列）
　配列番号４４：5'-AGAGGGGAGCCTTGGGGTTC-3'（1005-1024番目の領域の相補配列）
　配列番号４５：5'-TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3'（990-1013番目の領域の相補配列）
　配列番号４６：5'-AGAGGGGAGCCTTGGGGTT-3'（1006-1024番目の領域の相補配列）
　配列番号４７：5'-TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGAT-3'（981-1004番目の領域の相補配列）
　配列番号４８：5'-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3'（988-1012番目の領域の相補配列）
　配列番号４９：5'-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3'（989-1011番目の領域の相補配列）
　配列番号５０：5'-CCTTGGGGTTCTGGATTTGTCATG-3'（992-1015番目の領域の相補配列）
　配列番号５１：5'-TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3'（982-1004番目の領域の相補配列）
　配列番号５２：5'-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3'（988-1011番目の領域の相補配列）
　配列番号５３：5'-TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3'（989-1013番目の領域の相補配列）
　配列番号５４：5'-AGGGGAGCCTTGGGGTTCTG-3'（1003-1022番目の領域の相補配列）
　配列番号５５：5'-TGAAGTTTTCATCTCCTGTCAGCTT-3'（752-776番目の領域の相補配列）
（ループプライマーＲ）
　配列番号５６：5'-AAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAG-3'（1082-1104番目の領域と同じ配列）
　配列番号５７：5'-AGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3'（1084-1105番目の領域と同じ配列）
　配列番号５８：5'-GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAA-3'（1085-1107番目の領域と同じ配列）
　配列番号５９：5'-AAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3'（1083-1105番目の領域と同じ配列）
　配列番号６０：5'-ATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3'（1066-1090番目の領域と同じ配列）
　配列番号６１：5'-AATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3'（1065-1089番目の領域と同じ配列）
　配列番号６２：5'-CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3'（1068-1092番目の領域と同じ配列）
　配列番号６３：5'-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3'（1069-1092番目の領域と同じ配列）
　配列番号６４：5'-GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3'（1070-1093番目の領域と同じ配列）
　配列番号６５：5'-TCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCA-3'（1073-1097番目の領域と同じ配列）
　配列番号６６：5'-CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3'（1068-1091番目の領域と同じ配列）
　配列番号６７：5'-TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3'（1067-1090番目の領域と同じ配列）
　配列番号６８：5'-TGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCT-3'（1063-1087番目の領域と同じ配列）
　配列番号６９：5'-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3'（1069-1091番目の領域と同じ配列）
　配列番号７０：5'-CATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGC-3'（1075-1099番目の領域と同じ配列）
　配列番号７１：5'-GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATT-3'（1070-1094番目の領域と同じ配列）
　配列番号７２：5'-CCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAG -3'（1074-1098番目の領域と同じ配列）
　配列番号７３：5'-TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3'（1067-1089番目の領域と同じ配列）
　配列番号７４：5'-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3'（1069-1093番目の領域と同じ配列）
　配列番号７５：5'-CCTAACTTACTCAGCCCAGCATCAT-3'（860-884番目の領域と同じ配列）
　上記のプライマーのうち、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列からなるプライマーは、エキソンジャンクション１を含む領域にハイブリダイズ可能である。
　配列番号１４～１８のプライマーは、エキソンジャンクション２を含む領域にハイブリダイズ可能である。
　上記のプライマーは、増幅領域に応じてＦ３プライマー、ＦＩＰ、ＲＩＰ及びＲ３プライマーを適宜組み合わせて４種類のプライマーを含むプライマーセットとして用いることができる。また、さらにループプライマーＦ及びＲを組み合わせて６種類のプライマーを含むプライマーセットとして用いることができる。このようなプライマーセットの具体例を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、公知のものを用いることができる。また、これら二種類の酵素（逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）の代わりに、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた一種類の酵素を用いてもよい。
　さらに、酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤をも用いることが好ましい。
　上述の物質はそれぞれ別々の容器に収容することができるが、逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを同一の容器に収容してもよい。また、ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、及び各種プライマーのうち少なくとも二種類の物質を同一の容器に収容してもよい。これらの試薬をユーザに提供する際は、上記の試薬の一部又は全部を含む試薬キットとして提供してもよい。
〔ＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出方法及びＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出用試薬キット〕
　つぎに、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出方法を説明する。本発明のＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出方法は、
　　上述のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを用いること（下記「実施形態１の検出方法」）、または
　　上述のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを用いること（下記「実施形態２の検出方法」）
により実施することができる
　前記実施形態１の検出方法は、
（Ｉ－１）　試料と、上述のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
（II－１）　前記プライマーセットと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、前記工程（Ｉ－１）で合成されたｃＤＮＡとを反応させてｃＤＮＡを増幅する工程、
（III－１）　前記工程（II－１）で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程、
を含む方法である。
　また、前記実施形態２の検出方法は、
（Ｉ－２）　試料と、上述のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するとともに、このｃＤＮＡを鋳型として当該ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する工程、及び
（II－２）　前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
を含む方法である。
　実施形態１及び２の検出方法は、高い効率で、正確にかつ短時間でＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出する観点から、ＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いて行なうことが好ましい。
　前記実施形態１の検出方法において、ＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いる場合、上述のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「逆転写酵素」という）と、鎖置換活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ」という）と、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを含む）と、試料とを混合して、反応させることにより試料中のＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出することができる。したがって、この場合、前記工程（Ｉ－１）及び（II－１）は、１ステップで行なわれる。
　一方、前記実施形態２の検出方法において、ＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いる場合、上述のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素と、ｄＮＴＰｓと、試料とを混合して、反応させることにより試料中のＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出することができる。
　逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、公知のものを用いることができる。
　さらに、実施形態１の検出方法の工程（Ｉ－１）及び（II－１）及び実施形態２の検出方法の工程（Ｉ－２）では、各工程における酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤をも用いることが好ましい。
　ＴＹＲ　ｍＲＮＡ検出に供される試料としては、生体から採取した組織（リンパ節、リンパ液、血液等）や便等が例示される。
　実施形態１の検出方法において、ＲＴ－ＬＡＭＰ法を用いる場合、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの検出は、増幅工程〔前記工程（Ｉ－１）及び（II－１）〕及び検出工程〔前記工程（III－１）〕を経て行なわれる。
　まず、生体から採取したＴＹＲ　ｍＲＮＡを含む試料と、上述のプライマーセット、逆転写酵素、ｄＮＴＰｓ及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを混合する。そして、得られた混合物を一定の温度（例えば、６５℃）まで加温してＲＴ反応及びＬＡＭＰ反応を行ない、ＴＹＲ　ｍＲＮＡを鋳型としてＴＹＲ　ｃＤＮＡを合成するとともに、このＴＹＲ　ｃＤＮＡを鋳型として当該ＴＹＲ　ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する〔前記工程（Ｉ－１）及び（II－１）〕。
　ＲＴ反応及びＬＡＭＰ反応の機序は、以下の通りである。
　まず、反応液中のＴＹＲ　ｍＲＮＡの領域Ｒ２ｃにＲＩＰの第二配列がハイブリダイズする。その後、逆転写酵素によってＲＩＰの３’末端からＴＹＲ　ｍＲＮＡを鋳型としてＴＹＲ　ｃＤＮＡが合成される。これにより、ＲＩＰから伸長したＴＹＲ　ｃＤＮＡ（ＲＩＰ伸長鎖）とＴＹＲ　ｍＲＮＡとからなる二本鎖核酸が合成される。
　次に、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの領域Ｒ３ｃにＲ３プライマーがハイブリダイズする。その後、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって、ＴＹＲ　ｍＲＮＡを鋳型として、Ｒ３プライマーの３’末端から、既にＴＹＲ　ｍＲＮＡと結合しているＲＩＰ伸長鎖が剥がされながら（置換されながら）、ＴＹＲ　ｃＤＮＡが合成される。
　前記ＲＩＰ伸長鎖は、一本鎖の状態になっており、ＴＹＲ　ｍＲＮＡと相補的な配列を有するため、ＲＩＰ伸長鎖にはＴＹＲ　ｍＲＮＡの領域Ｆ２に相補的な領域Ｆ２ｃが含まれている。このＲＩＰ伸長鎖の領域Ｆ２ｃにＦＩＰの第四配列がハイブリダイズする。
　その後、ＦＩＰの３’末端から鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによってＲＩＰ伸長鎖を鋳型としてＤＮＡ合成が行なわれる。ここで合成されたＤＮＡは、５’末端に第三配列（領域Ｆ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列）を持っているため、第三配列からなるポリヌクレオチドは、このＤＮＡ上の領域Ｆ１にハイブリダイズしてステムループ構造を形成する。また、このＤＮＡは、３’末端に第一配列の相補配列（領域Ｒ１ｃにハイブリダイズする配列）を持っているため、第一配列の相補配列は、このＤＮＡ上の領域Ｒ１ｃにハイブリダイズしてステムループ構造を形成する。したがって、このＤＮＡは５’末端と３’末端の両方でステムループ構造を形成したダンベル構造となる。
　前記ダンベル構造のＤＮＡ（ダンベルＤＮＡ）は、３’末端から当該ダンベルＤＮＡ中の他の部分を鋳型として５’末端側のステムループ構造が解かれながら鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、伸長鎖が得られる。この伸長鎖は、５’末端、３’末端及びこれらの中央にそれぞれ互いに相補的な配列を有するため、伸長鎖内では、３つのステムループ構造が形成される。さらに、前記伸長鎖は、３’末端から当該伸長鎖中の他の部分を鋳型としてステムループ構造を解きながら鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。この反応が実質的に等温下で繰り返されることにより、分子内に特定の配列を複数有する核酸が合成される（反応の詳細は米国特許第６４１０２７８号公報及び米国特許第６９７４６７０号公報参照）。
　このようにして得られた増幅産物中の核酸の大部分は、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）であるため、検出工程〔前記工程（III－１）〕では、この増幅産物を蛍光インターカレーター、例えば、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）　ＧＲＥＥＮ　Ｉ、Ｐｉｃｏ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）等で蛍光染色し、紫外線を照射することによって蛍光を生じさせることにより、当該増幅産物を検出することができる。
　蛍光染色は、増幅反応後〔前記工程（II－１）後〕の反応液に蛍光色素を添加することによって行なってもよく、あらかじめ反応液に蛍光色素を添加し、蛍光色素の存在下で核酸増幅を実施することにより行なってもよい。検出工程〔前記工程（III－１）〕では、蛍光が検出されるか否かにより、試料中にＴＹＲ　ｍＲＮＡが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅反応後〔前記工程（II－１）後〕の反応液の蛍光強度を測定することによって増幅産物の定量を行なうことができ、この定量結果に基づいて試料に含まれるＴＹＲ　ｍＲＮＡを定量することも可能である。特に、蛍光色素の存在下で核酸増幅を行なう場合は、反応液の蛍光強度の増大をリアルタイムに測定し、一定の蛍光強度に達するまでの時間を測定することによって、試料中のＴＹＲ　ｍＲＮＡの量に換算することもできる（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＬＡＭＰ法等）。
　また、前記工程（II－１）におけるＬＡＭＰ反応では、副産物として水に不溶なピロリン酸マグネシウムが生成する。前記ピロリン酸マグネシウムは核酸増幅が進むにつれて増加し、この増加に伴って反応液が白濁する。そのため、ｉ）反応液の濁りを目視により確認すること、ii）反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定すること、又はiii）反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより、標的核酸を検出することができる（国際公開第０１／８３８１７号を参照）。反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定する場合、前記蛍光色素を用いた場合と同様に、濁度変化をリアルタイムでモニターすることによって閉鎖系でＤＮＡの増幅と濁度の増加が追跡可能である。したがって、検出工程〔前記工程（III－１）〕では、反応液が白濁するか否かで、試料中にＴＹＲ　ｍＲＮＡが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅産物の濁度を測定することによって増幅産物の定量を行なうことができ、定量結果に基づいて試料に含まれるＴＹＲ　ｍＲＮＡを定量することも可能である。濁度の増大をリアルタイムに測定する場合は、一定の濁度に達するまでの時間（以下、増幅立ち上がり時間とする）を測定し、この時間を試料中のＴＹＲ　ｍＲＮＡの量に換算することも可能である。
　一方、実施形態２の検出方法においては、工程（Ｉ－２）は、前記実施形態１の検出方法における増幅工程〔前記工程（Ｉ－１）及び（II－１）〕に対応する増幅工程である。かかる工程（Ｉ－２）では、前記工程（Ｉ－１）及び（II－１）における二種類の酵素（逆転写酵素および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）の代わりに、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた一種類の酵素が用いられることを除き、前記工程（Ｉ－１）及び（II－１）と同様に行なうことができる。
　また、実施形態２の検出方法では、工程（II－２）は、前記実施形態１の検出方法における検出工程〔前記工程（III－１）〕と同様に行なうことができる。
　本発明においては、前記工程（Ｉ－１）、工程（II－１）及び工程（Ｉ－２）で用いられる試薬をｍＲＮＡ検出用試薬キットとして提供することができる。かかるｍＲＮＡ検出用試薬キットは、上述したプライマーセットと、ｄＮＴＰｓと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを含むものである。
　上述の各試薬はそれぞれ別々の容器に収容されていてもよい。また、逆転写酵素及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、同一の容器に収容されていてもよい。また、ｄＮＴＰｓ、緩衝剤、及び各種プライマーのうち少なくとも二種類の試薬が、同一の容器に収容されていてもよい。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
（実施例１）
　表１に示されるプライマーセット１～４５を用いてＴＹＲ　ｍＲＮＡを検出できるか否かを以下の通り検証した。
（１）試料調製
　５×１０１０コピー／μＬのＴＹＲ　ｍＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの超純水にて段階希釈し、２．５×１０３コピー／μＬのＴＹＲ　ｍＲＮＡ試料を調製した。
（２）反応液の調製
　表１に示されるＦ３プライマー、ＦＩＰ、ＲＩＰ及びＲ３プライマーを、下記組成となるように、緩衝液〔１０ｍＭ　トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕に添加し、プライマーミックスを調製した。
　　　１６μＭ　ＦＩＰ
　　　１６μＭ　ＲＩＰ
　　　　１μＭ　Ｆ３プライマー
　　　　１μＭ　Ｒ３プライマー
　　　１２μＭ　ループプライマーＦ
　　　１２μＭ　ループプライマーＲ
　　　１０ｍＭ　トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
　また、下記組成となるように、各試薬を混合し、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応用緩衝液を調製した。
　　　　　５３ｍＭ　トリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）
　　　　　１．８×　Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ　ｂｕｆｆｅｒ
　　　　　　　　　　　　(New England Biolabs製)
　　　１．４３ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（Invitrogen製）
　　　５．３６ｍＭ　ＭｇＳＯ４〔ナカライテスク（株）製〕
　　　８．９３ｍＭ　ＤＴＴ　〔和光純薬（株）製〕
　　　　　２体積％　Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Sigma製）
　次に、下記組成となるように、各試薬を混合し、酵素液（３．０４μＬ）を調製した。
　　　１０Ｕ／μＬ　ＡＭＶ逆転写酵素（Promega製） 　　　０．１４μＬ
　　　　８Ｕ／μＬ　ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ
　　　　　　　　　　（New England Biolabs製）　　　　　　２．２７μＬ
　　　４０Ｕ／μＬ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
　　　　　　　　　　（Promega製）　　　　　　　　　　　 ０．６３μＬ
　下記組成となるように、各試薬を混合し、２５μＬの反応液を調製した。なお、反応液は、４５種類のプライマーセットそれぞれについて調製された。
　　　ＲＴ－ＬＡＭＰ反応用緩衝液　　　　　　１４．０μＬ
　　　酵素液　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０μＬ
　　　プライマーミックス　　　　　　　　　　　５．０μＬ
　　　１０ｍＭ　トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）　　１．０μＬ
　　　ＲＮＡ試料　　　　　　　　　　　　　　　２．０μＬ
　４５種類の反応液のそれぞれに対応するネガティブコントロール（ＮＣ）として２．０μＬのＲＮＡ試料の代わりに超純水２．０μＬを添加したＮＣ用反応液（４５種類）も調製した。
（３）検出及び検出結果
　４５種類のプライマーセットのいずれかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ６５℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置〔テラメックス社製、商品名：ＬＡ－２００〕にセットした。その後、６５℃で前記チューブ内の反応液をインキュベーションし、ＬＡＭＰ反応を行なった。反応開始から反応液の濁度が０．１に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定は、１回行なった。また、ＲＮＡ試料を含む反応液の測定は、３回行なった（ｎ＝３）。ネガティブコントロールの場合の測定結果及びＲＮＡ試料を含む反応液の場合の測定結果の平均値を、表２に示す。表中、「ＮＣ」は、ネガティブコントロールの場合の測定結果を示す。また、表中、「－（ハイフン）」は６０分以内に濁度が０．１に達しなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示される結果から、ネガティブコントロールの場合、６０分以内に、非特異的な核酸増幅が起こらず、ＴＹＲ　ｍＲＮＡの存在を検出することができないことがわかる。しかしながら、ＲＮＡ試料を含む反応液の場合、６０分以内に反応液の濁度が０．１に達したため、本発明の一実施形態に係るプライマーセット１～４５のいずれを用いた場合であっても、ＴＹＲ　ｍＲＮＡを迅速に検出できることがわかった。

Claims (21)

  1. 　試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーであって、
    　５’末端側に第一配列、３’末端側に第二配列を含んでなり、
    　前記第一配列が、
    （ａ１）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
    （ｂ１）　配列番号１の一部の領域である第一領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
    　前記第二配列が、
    （ｃ１）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
    （ｄ１）　配列番号１において第一領域よりも３’末端側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
    　前記第二領域が、
    （ｉ）　配列番号１の９０１及び９０２番目のヌクレオチド；又は
    （ii）　配列番号１の１１１８及び１１１９番目のヌクレオチド；
    を含む領域である、プライマー。
  2. 　（Ａ１）配列番号１４～１９の何れかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ１）前記（Ａ１）のポリヌクレオチドにおいて一個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
    からなる、請求項１記載のプライマー。
  3. 　配列番号１の８８６～９０８番目の領域；
    　配列番号１の１１１０～１１３３番目の領域；
    　配列番号１の１１１４～１１３１番目の領域；及び
    　配列番号１の１１１４～１１３３番目の領域
    のいずれかにハイブリダイズする、請求項１記載のプライマー。
  4. 　前記第二配列が、３’末端に、前記第二領域の配列に完全に相補的な連続した３ヌクレオチドからなる配列を含んでいる、請求項１記載のプライマー。
  5. 　試料中のチロシナーゼのｍＲＮＡを検出するためのチロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセットであって、
    　第一プライマー、第二プライマー、及び第三プライマーを含み、
    　前記第一プライマーが、請求項１記載のプライマーであり、
    　前記第二プライマーが、５’末端側に第三配列、３’末端側に第四配列を含み、
    　前記第三配列が、
    （ａ２）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
    （ｂ２）　前記配列番号１の第一領域よりも５’末端側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
    　前記第四配列が、
    （ｃ２）　１０～３０ヌクレオチドの長さを有し、
    （ｄ２）　前記配列番号１の第三領域よりも５’末端側に位置する第四領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列であり、
    　前記第三プライマーが、前記配列番号１の第四領域よりも５’末端側に位置する第五領域の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの配列からなるプライマーである、チロシナーゼｍＲＮＡ検出用プライマーセット。
  6. 　前記第二プライマーが、
    （Ａ２）　配列番号７～１３の何れかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ２）　前記（Ａ２）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
    からなり、
    　前記第三プライマーが、
    （Ａ３）　配列番号２～６のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ３）　前記（Ａ３）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
    からなる、請求項５記載のプライマーセット。
  7. 　前記第二プライマーが、
    　配列番号１の７３１～７５１番目の領域；
    　配列番号１の９６３～９７７番目の領域；
    　配列番号１の９６４～９８６番目の領域；
    　配列番号１の９７１～９９２番目の領域；
    　配列番号１の９７２～９９２番目の領域；及び
    　配列番号１の９８６～１００８番目の領域；
    のいずれかの領域の相補領域にハイブリダイズする請求項５記載のプライマーセット。
  8. 　前記第三プライマーが、
    　配列番号１の７０３～７２２番目の領域；
    　配列番号１の９３１～９５３番目の領域；
    　配列番号１の９４５～９６２番目の領域；
    　配列番号１の９５０～９６２番目の領域；及び
    　配列番号１の９６６～９８５番目の領域；
    のいずれかの領域の相補領域にハイブリダイズする請求項５記載のプライマーセット。
  9. 　前記配列番号１の第二領域よりも３’末端側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である第四プライマーをさらに含む、請求項５記載のプライマーセット。
  10. 　前記第四プライマーが、
    （Ａ４）　配列番号２０～２５のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ４）　前記（Ａ４）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
    からなる、請求項９記載のプライマーセット。
  11. 　前記第四プライマーが、
    　配列番号１の９１７～９３６番目の領域；
    　配列番号１の１１３５～１１５３番目の領域；
    　配列番号１の１１３８～１１５５番目の領域；
    　配列番号１の１１３８～１１５６番目の領域；
    　配列番号１の１１４１～１１６０番目の領域；及び
    　配列番号１の１１４２～１１６１番目の領域；
    のいずれかにハイブリダイズする、請求項９記載のプライマーセット。
  12. 　前記配列番号１の前記第三領域と前記第四領域との間に位置する第七領域にハイブリダイズする第五プライマーをさらに含む請求項５記載のプライマーセット。
  13. 　前記第五プライマーが、
    （Ａ５）　配列番号２６～５５のいずれかに記載のポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ５）　前記（Ａ５）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド。
    からなる、請求項１２記載のプライマーセット。
  14. 　前記第五プライマーが、
    　配列番号１の７５２～７７６番目の領域；
    　配列番号１の９８１～１００４番目の領域；
    　配列番号１の９８２～１００４番目の領域；
    　配列番号１の９８２～１００６番目の領域；
    　配列番号１の９８６～１０１０番目の領域；
    　配列番号１の９８７～１０１１番目の領域；
    　配列番号１の９８８～１０１１番目の領域；
    　配列番号１の９８８～１０１２番目の領域；
    　配列番号１の９８９～１０１１番目の領域；
    　配列番号１の９８９～１０１２番目の領域；
    　配列番号１の９８９～１０１３番目の領域；
    　配列番号１の９９０～１０１２番目の領域；
    　配列番号１の９９０～１０１３番目の領域；
    　配列番号１の９９０～１０１４番目の領域；
    　配列番号１の９９２～１０１５番目の領域；
    　配列番号１の９９３～１０１６番目の領域；
    　配列番号１の９９４～１０１６番目の領域；
    　配列番号１の９９５～１０１６番目の領域；
    　配列番号１の９９５～１０１８番目の領域；
    　配列番号１の９９６～１０１８番目の領域；
    　配列番号１の１０００～１０１９番目の領域；
    　配列番号１の１００１～１０２０番目の領域；
    　配列番号１の１００３～１０２２番目の領域；
    　配列番号１の１００４～１０２２番目の領域；
    　配列番号１の１００５～１０２４番目の領域；
    　配列番号１の１００６～１０２４番目の領域；
    　配列番号１の１００８～１０２７番目の領域；
    　配列番号１の１００９～１０２７番目の領域；
    　配列番号１の１００９～１０２８番目の領域；及び
    　配列番号１の１０１０～１０２９番目の領域
    のいずれかにハイブリダイズする、請求項１２記載のプライマーセット。
  15. 　前記配列番号１の前記第一領域と第二領域との間に位置する第八領域の相補領域にハイブリダイズする第六プライマーをさらに含む、請求項５記載のプライマーセット。
  16. 　前記第六プライマーが、
    （Ａ６）配列番号５６～７５のいずれかに記載のポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ６）前記（Ａ６）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
    からなる、請求項１５記載のプライマーセット。
  17. 　前記第六プライマーが、
    　配列番号１の８６０～８８４番目の領域；
    　配列番号１の１０６３～１０８７番目の領域；
    　配列番号１の１０６５～１０８９番目の領域；
    　配列番号１の１０６６～１０９０番目の領域；
    　配列番号１の１０６７～１０８９番目の領域；
    　配列番号１の１０６７～１０９０番目の領域；
    　配列番号１の１０６８～１０９１番目の領域；
    　配列番号１の１０６８～１０９２番目の領域；
    　配列番号１の１０６９～１０９１番目の領域；
    　配列番号１の１０６９～１０９２番目の領域；
    　配列番号１の１０６９～１０９３番目の領域；
    　配列番号１の１０７０～１０９３番目の領域；
    　配列番号１の１０７０～１０９４番目の領域；
    　配列番号１の１０７３～１０９７番目の領域；
    　配列番号１の１０７４～１０９８番目の領域；
    　配列番号１の１０７５～１０９９番目の領域；
    　配列番号１の１０８２～１１０４番目の領域；
    　配列番号１の１０８３～１１０５番目の領域；
    　配列番号１の１０８４～１１０５番目の領域；及び
    　配列番号１の１０８５～１１０７番目の領域
    のいずれかの領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項１５記載のプライマーセット。
  18. 　請求項５記載のプライマーセットと、
    　ｄＮＴＰｓと、
    　ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと
    を含んでなるチロシナーゼｍＲＮＡ検出用試薬キット。
  19. 　前記第二プライマーが、
    （Ａ２）　配列番号７～１３の何れかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ２）　前記（Ａ２）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
    からなり、
    　前記第三プライマーが、
    （Ａ３）配列番号２～６のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
    （Ｂ３）前記（Ａ３）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマー機能を有するポリヌクレオチド
    からなる、請求項１８記載のチロシナーゼｍＲＮＡ検出用試薬キット。
  20. 　試料と、請求項５記載のプライマーセットと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程、
    　前記プライマーセットと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、前記工程で合成されたｃＤＮＡとを反応させて、前記ｃＤＮＡを増幅する工程、及び
    　前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
    を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法。
  21. 　試料と、請求項５記載のプライマーセットと、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する作用と鎖置換を行ないながらＤＮＡを鋳型にＤＮＡを合成する作用とを備えた酵素とを反応させて、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成するとともに、このｃＤＮＡを鋳型として当該ｃＤＮＡをさらに合成して増幅する工程、及び
    　前記工程で増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、前記試料中のチロシナーゼｍＲＮＡを検出する工程
    を含む、チロシナーゼｍＲＮＡの検出方法。
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