ES2253216T3 - Pares de cebadores de amplificacion y secuenciacion y uso de los mismos. - Google Patents
Pares de cebadores de amplificacion y secuenciacion y uso de los mismos.Info
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Abstract
Un conjunto de cebadores para amplificación o secuenciación de un polinucleótido diana que comprende: - un par de oligonucleótidos-cebadores que comprende un anclaje y un cebador oligonucleotídicos, en el que dicho anclaje tiene una estructura química de ácido nucleico que no es sustrato para una transcriptasa inversa o una ADN polimerasa, y/o tiene un extremo 3¿ que no es capaz de cebar la síntesis de ácidos nucleicos, en el que dicho cebador comprende una región de la secuencia del cebador que híbrida con una secuencia de ácido nucleico diana y tiene una estructura química de ácido nucleico que es sustrato para una transcriptasa inversa o una ADN polimerasa, y en el que dicho anclaje y dicho cebador incluyen cada uno una región de nucleótidos complementarios que se autoensamblan el uno con el otro para formar una estructura tallo cuando los oligonucleótidos de dicho anclaje y de dicho cebador se combinan, incluyendo dicha estructura tallo una región que es complementaria con un cebador universal; y - un cebador universal que es complementario con dicha región de dicha estructura tallo que es complementaria con el cebador universal.
Description
Pares de cebadores de amplificación y
secuenciación y uso de los mismos.
La presente invención se refiere a pares de
cebadores para PCR combinatoria de dos componentes y su uso en la
amplificación y secuenciación de secuencias de ácidos
nucleicos.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
un procedimiento de amplificación de ADN en el que se usan
cebadores oligonucleotidicos complementarios con los extremos
opuestos de una secuencia de un gen, para amplificar la secuencia
mediante ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y
extensión en presencia de una ADN polimerasa que tiene actividad a
temperaturas elevadas. Sin embargo, este procedimiento depende del
conocimiento de las secuencias de los extremos opuestos del gen
para diseñar cebadores que puedan hibridar con estas regiones. De
este modo, cada vez que se va a amplificar un gen, tienen que
sintetizarse cebadores oligonucleotidicos diferentes.
Alternativamente, si se deseara tener cebadores disponibles, se
necesitaría una biblioteca del orden de millones o billones de
oligonucleótidos convencionales para encontrar y amplificar con
éxito cada uno de los aproximadamente 100.000 genes humanos. Una
biblioteca ordenada de millones de cebadores de PCR está por encima
de las herramientas químicas, físicas y de organización disponibles
en la actualidad.
Existe una necesidad de una biblioteca de
cebadores para PCR prefabricados que contenga una cantidad
razonable de cebadores capaces de unirse a cada secuencia diana
presente en el genoma. La presente invención aborda esta
necesidad.
La presente invención se refiere a un conjunto de
cebadores para amplificación o secuenciación de un polinucleótido
diana que comprende un par de cebadores oligonucleotídicos y un
cebador universal como se recoge en la reivindicación 1.
Una realización de la presente invención es un
par de cebadores de amplificación que comprende un anclaje y un
cebador oligonucleotídicos, cuyo anclaje tiene una estructura
química de ácido nucleico que no es sustrato para transcriptasas
inversas o para ADN polimerasas; y/o que tiene un extremo 3' que no
es capaz de cebar la síntesis del ADN; teniendo el cebador una
estructura química de ácido nucleico que es sustrato para
transcriptasas inversas o ADN polimerasas; incluyendo cada anclaje
y cebador una región de nucleótidos complementarios que son capaces
de asociarse entre sí para formar una estructura de tallo que
incluye una región complementaria con un cebador universal.
Preferiblemente, la secuencia de anclaje y las regiones tallo se
conectan mediante un enlazador flexible. En un aspecto de esta
realización preferida, el enlazador flexible se selecciona entre el
grupo compuesto por polietilénglicol, polipropilénglicol,
polietileno, polipropileno, poliamidas y poliésteres.
Preferiblemente, el cebador comprende una región cola que se
extiende más allá de la longitud de la región tallo del anclaje. En
un aspecto de esta realización preferida, el cebador comprende una
o más bases modificadas. En otro aspecto de esta realización
preferida, el anclaje comprende uno o más enlaces del esqueleto
modificados. De forma ventajosa, el anclaje y dicho cebador tienen
cada uno entre 6 y 24 bases de longitud. Preferiblemente, el par
de cebadores está asociado con un cebador universal que es
complementario de una región de la estructura tallo.
Otra realización de la presente invención es un
par de cebadores de secuenciación que comprenden un anclaje y un
cebador oligonucleotídicos, cuyo anclaje tiene una estructura
química de ácido nucleico que no es sustrato para transcriptasas
inversas o ADN polimerasas y/o que tiene un extremo 3' que no es
capaz de cebar la síntesis del ácido nucleico; cuyo cebador tiene
una estructura química de ácido nucleico que es sustrato para
transcriptasas inversas o ADN polimerasas; y que cada anclaje y
cebador incluye una región de nucleótidos complementaria las cuales
son capaces de asociarse entre sí para formar una estructura tallo.
Preferiblemente, la secuencia de anclaje y las regiones tallo se
conectan mediante un enlazador flexible. En un aspecto de esta
realización preferida, el enlazador flexible se selecciona entre el
grupo compuesto por polietilénglicol, polipropilénglicol,
polietileno, polipropileno, poliamidas y poliésteres.
Preferiblemente, el cebador comprende una región cola que se
extiende más allá de la longitud de la región tallo del anclaje. En
un aspecto de esta realización preferida, el cebador comprende una
o más bases modificadas. En otro aspecto de esta realización
preferida, el anclaje comprende uno o más enlaces del esqueleto
modificados. De forma ventajosa, el anclaje y dicho cebador tienen
cada uno entre 6 y 24 bases de longitud. Preferiblemente, el par de
cebadores está asociado con un cebador universal que es
complementario de una región de la estructura tallo.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para amplificar una secuencia de ácido nucleico, que
comprende las etapas de: combinar una molécula de ácido nucleico
con un anclaje sentido (AS), cebador sentido (CS), anclaje
complementario (AC), cebador complementario (CC), cebador universal
sentido (CUS) y cebador universal complementario (CUC), donde
AS/CS forman un primer par de cebadores y AC/CC forman un segundo
par de cebadores mediante la asociación de sus regiones tallo
complementarias, en donde el CUC es complementario de la región
tallo de AS/CS, y en donde el CUC es complementario de la región
tallo de AC/CC, donde los pares de cebadores se seleccionan para
flanquear la secuencia del ARN y amplificar dicha secuencia de
ácido nucleico mediante amplificación mediada por enzima. De forma
ventajosa, la secuencia del ácido nucleico codifica un producto
génico terapéutico. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico
es ADN o ARN. En un aspecto de esta realización preferida, la
amplificación mediada por enzima es una amplificación por PCR.
Las Figuras 1A y 1B son diagramas esquemáticos de
los pares de cebadores de amplificación sentido y complementarios,
respectivamente. Cada par de cebadores se generan a partir de una
biblioteca de oligonucleótidos individuales que se combinan para
formar los pares de cebadores mostrados en la figura. Un
componente del par de cebadores se denomina anclaje (anclaje
sentido = AS; anclaje complementario = AC) y el otro componente se
denomina cebador (cebador sentido = CS; cebador complementario =
CC). Los dos componentes se unen de forma no covalente por una
región de oligonucleótidos complementarios denominada tallo. Los
anclajes pueden unirse a los tallos mediante un enlazador. El
cebador universal sentido (CUS) y el cebador universal
complementario (CUC) son complementarios de los tallos sentido y
complementario, respectivamente. Los pares de cebadores se adaptan
para amplificar una secuencia génica específica eligiendo las
secuencias oligonucleotídicas individuales apropiadas. El cebador
complementario ceba la síntesis de la primera cadena del ADNc y el
cebador sentido ceba la síntesis de la segunda cadena del
ADNc.
La Figura 2 es un diagrama esquemático de un par
de cebadores de amplificación que muestra el enlazador opcional,
tallo, cola opcional y cebador universal.
La Figura 3 es un diagrama esquemático del
procedimiento de la invención usando pares de cebadores de
amplificación generados a partir de una biblioteca de
oligonucleótidos individuales. AC y AS son oligonucleótidos que
comprenden una variedad de bases y enlaces modificados para una
afinidad de unión máxima y no son capaces de cebar la reacción de
amplificación del ácido nucleico (es decir, no contiene un grupo
3'-OH). Estos componentes pueden incluir un
enlazador flexible. CC y CS sirven como los cebadores de
amplificación y se incorporan a la molécula de ADN resultante. La
síntesis de la primera cadena del ADNc es cebada por el CC y la
síntesis de la segunda cadena del ADNc es cebada por el CS. AS y
AC son desplazados durante la reacción de amplificación. CUC y CUS
son cebadores universales complementarios de porciones de CC y CS,
respectivamente, que se incorporan al ADNc amplificado. CUC y CUS
ceban respectivamente la síntesis de las cadenas producto
complementaria y sentido. El producto final es un amplicón de
doble cadena que contiene el CUC y el CUS.
La presente invención proporciona pares de
cebadores de amplificación y secuenciación para su uso en la
amplificación o secuenciación de cualquier secuencia de ADN de
interés. Estos pares de cebadores pueden prepararse rápidamente,
usando un número asequible de componentes presintetizados presentes
en una biblioteca de cebadores y se usan para la síntesis y
detección de ácidos nucleicos La biblioteca de componentes es
adecuada para formar cualquier par de cebadores bajo solicitud. Para
amplificar cualquier secuencia de ácido nucleico deseada, se usan
dos pares de cebadores de amplificación, generándose cada uno a
partir de componentes oligonucleotídicos individuales. Todos los
posibles oligonucleótidos 6-mer,
8-mer, 12-mer o de otra longitud se
sintetizan mediante secuenciación automática de ADN convencional e
incluyen una región que es complementaria de un segundo conjunto de
oligómeros 6-mer, 8-mer,
12-mer (u oligómeros de otra longitud) de modo que
cuando se combinan dos de estos cebadores in vitro, se
autoensamblan mediante enlaces de hidrógeno de sus regiones
complementarias (apareamiento de bases de Watson y Crick). En una
realización de la invención, los oligonucleótidos de anclaje y
cebador tienen cada uno una longitud de entre 6 y aproximadamente
24 bases. Todos los posibles 8-mer, por ejemplo,
pueden estar representados en una biblioteca de tamaño modesto de
4^{8} (65.536) oligonucleótidos. Por otro lado, todos los
posibles 16-mer, necesitarían una biblioteca enorme
de 4^{18} (4 x 10^{8}) oligonucleótidos.
El término "oligonucleótido" se refiere a
una molécula compuesta por ADN, ARN o híbridos de ADN/ARN.
La expresión "análogo de oligonucleótido" se
refiere a una molécula que comprende una estructura similar a un
oligonucleótido, por ejemplo, que tiene un esqueleto y una serie de
bases, en la que el esqueleto y/o una o más de las bases pueden ser
diferentes a las estructuras encontradas en el ADN o ARN natural.
Los análogos de oligonucleótidos "no naturales" incluyen al
menos una base o estructura del esqueleto que no se encuentra en el
ADN o ARN natural. Los ejemplos de análogos de oligonucleótidos
incluyen, pero sin limitaciones, ADN, ARN, oligonucleótidos
fosforotioato, ácidos nucleicos peptídicos (ANP),
metoxietilfosforotioatos, oligonucleótidos que contiene
desoxiinosina o desoxi 5-nitroindol y
similares.
El término "esqueleto" como se usa en este
documento, se refiere a una molécula generalmente lineal capaz de
mantener una variedad de bases unidas a intervalos definidos.
Preferiblemente, el esqueleto mantendrá las bases con una geometría
que contribuya a la hibridación entre las bases sostenidas por un
polinucleótido diana.
La expresión "base no natural" se refiere a
una base distinta de A, C, G, T y U, e incluye bases degeneradas y
universales así como restos capaces de unirse de forma específica a
una base natural o a una base no natural. Las bases no naturales
incluyen, pero sin limitaciones, propinilcitosina, propiniluridina,
diaminopurina, 5-metilcitosina,
7-deazaadenosina y
7-deazaguanina.
La expresión "base universal" se refiere a
un resto que puede sustituirse por cualquier base. La base
universal no necesita contribuir a la hibridación, pero no debería
impedir significativamente la hibridación. Los ejemplos de bases
universales incluyen, pero sin limitaciones, inosina,
5-nitroindol y
4-nitrobencimidazol.
La expresión "base degenerada" se refiere a
un resto que es capaz de un apareamiento de bases bien con
cualquier purina o con cualquier pirimidina, pero no con purinas y
pirimidinas. Los ejemplos de bases degeneradas incluyen, pero sin
limitaciones,
6H,8H,3,4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxacin-7-ona
("P", un mimético de pirimidina) y
2-amino-6-metoxiaminopurina
("K", un mimético de purina).
La expresión "polinucleótido diana" se
refiere a ADN o ARN, por ejemplo como el que se encuentra en una
célula viva, con el que se pretende que se unan o reaccionen un
par de cebadores.
El término "biblioteca" se refiere a una
colección de componentes que pueden unirse para formar una
diversidad de moléculas diferentes. En la práctica de la invención,
una biblioteca comprende al menos dos conjuntos de oligonucleótidos,
diseñados de modo que los oligómeros del primer conjunto pueden
unirse a los oligómeros del segundo conjunto. Esta unión,
preferiblemente tiene lugar de forma espontánea con la adición de
los dos oligómeros.
La expresión "enlazador flexible" como se
usa en este documento se refiere a un grupo químico reactivo que
es capaz de unir de forma covalente un dominio de unión a un resto
de unión. Estos enlazadores liberan el estrés que de otro modo
podría producirse por la interposición de los restos de unión entre
dos dominios de unión que se unen a dos regiones adyacentes del
ácido nucleico diana. El enlazador flexible se selecciona
preferiblemente para que sea flexible, hidrófilo y de longitud
suficiente como para que el volumen de los restos de unión no
interfieren con la hibridación, reconocimiento de la ARNasa y/o
actividad ARNasa en el complejo. El enlazador puede estar conectado
a la base terminal del dominio de unión o puede estar conectado a
una o más bases del extremo. Típicamente, los enlazadores flexibles
adecuados son moléculas lineales en una cadena de al menos uno o
dos átomos, más típicamente una cadena polimérica orgánica de 1 a
12 átomos de carbono (y/u otros átomos del esqueleto) de longitud.
Los ejemplos de enlazadores flexibles incluyen polietilénglicol,
polipropilénglicol, polietileno, polipropileno, poliamidas,
poliésteres y similares.
La expresión "enlace del esqueleto
modificado" se refiere a enlaces internucleosídicos distintos a
los enlaces fosfodiéster. Los ejemplos de estos enlaces incluyen
fosforotioatos, fosforoditioatos, metilfosfonatos, morfolinos, MMI,
ácidos nucleicos peptídicos (ANP), 3'amidatos y similares.
El término "tallo" como se usa en este
documento se refiere a la estructura formada mediante la unión de
dos oligonucleótidos o de restos de unión de análogos de
oligonucleótidos.
En referencia a las Figuras
1A-1B, se usan dos pares de cebadores: un par
sentido y un par complementario. Cada par comprende un anclaje y un
cebador que están unidos mediante apareamiento de bases
complementarias en la región tallo. Las secuencias de AS, CS, AC y
CC se eligen a partir de una biblioteca de cebadores en base a la
secuencia de ácido nucleico exacta o la secuencia génica que se va
a amplificar. Las secuencias de cebadores CUS y CUC no son
específicas del gen. Estas secuencias de estos cebadores se basan
en las secuencias tallo sentido y tallo complementario comunes,
respectivamente. El CUS hibrida con toda o parte de la región tallo
de CS y CUC hibrida con toda o parte de la región tallo de CC. La
región de la "cola" que se muestra en la Figura 2 es opcional.
Los AS y CS se asocian mediante la hibridación de bases de la
secuencia tallo sentido y AC y CC se asocian de igual forma. Las
secuencias tallo son demasiado largas para las regiones
complementarias solapantes pequeñas como para interferir en el CUS
y CUC. Cualquier AS puede formar un tallo (hibrida para formar una
región dúplex corta) con cualquier CS debido a las secuencias tallo
complementarias. La formación del tallo no es posible entre
cualquier miembro de la biblioteca sentido y complementaria. De
este modo, AS sólo se emparejará con CS y AC sólo se emparejará con
CC.
Los componentes del anclaje de los pares de
cebadores preferiblemente contienen una o más bases modificadas y/o
bases degeneradas y/o bases universales, y también pueden contener
uno o más enlaces del esqueleto modificados, dando lugar a una
afinidad de unión máxima a una secuencia nucleotídica de interés.
Los anclajes pueden tener cualquier estructura química de ácido
nucleico (bases y/o enlaces modificados) que no sea sustrato para
transcriptasas inversas o ADN polimerasas, y/o no contenga un grupo
químico tal como un grupo 3'-OH, que es capaz de
cebar la síntesis de ADN. Por el contrario, los componentes
cebadores son mucho más "similares a ADN" y contienen
oligonucleótidos sustancialmente naturales (A, G, T, C, U) y
enlaces fosfodiéster ya que debería servir como molde para la
transcriptasa inversa y la ADN polimerasa. Los componentes
cebadores pueden comprender cualquier estructura química de ácido
nucleico (combinación de bases naturales, bases no naturales,
enlaces fosfodiéster, enlaces del esqueleto modificado) que actúa
como sustrato para la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa.
Cualquier experto en la materia pude determinar fácilmente la
capacidad de cualquier oligonucleótido o análogo de oligonucleótido
deseado para actuar como sustrato para la transcriptasa inversa y
la ADN polimerasa.
La secuencia del anclaje y la secuencia del
cebador pueden unirse a la región tallo mediante un enlazador
flexible opcional (Figura 2). Probablemente, un enlazador más
apropiado para los anclajes es el que relaja la cadena, aumenta la
afinidad de unión y mejora la actividad cebado/sustrato de
polimerasa de los complejos anclaje/cebador ensamblados. Los
cebadores también pueden comprender enlazadoras, aunque debería
usarse uno que pueda mantener la actividad polimerasa.
Conociendo la secuencia que se va a amplificar,
se seleccionan los oligonucleótidos AS, CS, AC y CC
complementarios apropiados a partir de la biblioteca y se combinan
para formar cebadores. Los pares de cebadores de amplificación
específicos de la secuencia génica se mezclan en tampón de reacción
de amplificación completo (por ejemplo, PCR), incluyendo los
cebadores universales. Típicamente, las proporciones de AS/CS y
AC/CC son de aproximadamente 1 a 10 o menores. De este modo,
típicamente AS/CS y AC/CC sólo catalizan la síntesis de la primera
y segunda cadena del ADNc. AC/CC se usan para la síntesis de la
primera cadena, mientras que AS/CS se usan para la síntesis de la
segunda cadena (Figura 3). Por el contrario, CUS y CUC sostienen la
reacción de amplificación y producen la mayoría del producto
amplicón final. Los AS y CS inmediatamente se combinan sólo entre
ellos mediante hibridación de las bases de la secuencia tallo
sentido y los AC y CC se combinan sólo entre si de la misma
forma.
La mezcla del ARN molde que se va a amplificar,
típicamente, ARN celular total o ARN poli (A+), se añade a la
reacción y el ARN diana se une mediante el complejo AC/CC en base a
la hibridación de la secuencia específica de secuencia génica
formada por el ensamblaje del complejo AC/CC. Típicamente, se añade
a la reacción una mezcla combinada de transcriptasa inversa/ADN
polimerasa termoestable (por ejemplo, la polimerasa Taq) que
se incuba a una temperatura adecuada para la transcripción inversa
del ARN (generalmente 37-55ºC) para producir la
primera cadena del ADNc. La síntesis de la primera cadena del ADNc
se ceba con la estructura AC/CC y el grupo 3'-OH de
CC se extiende mediante la transcriptasa inversa. El CC se consume
en la reacción y se convierte en el extremo 5' del producto de la
primera cadena del ADNc (Figura 3). El AC es desplazado por la
síntesis de la segunda cadena del ADNc y no participa en las rondas
de amplificación posteriores.
La síntesis de la segunda cadena del ADNc se ceba
con AS/CS y el 3'-OH de CS se extiende mediante la
ADN polimerasa (termoestable o de otro tipo). El CS se consume en
la reacción y se convierte en el extremo 5' del producto de la
segunda cadena (también conocida como la cadena "codificadora"
o "sentido"). El AS se desplaza durante la síntesis de la
cadena "no sentido" final y no participa en las rondas de
amplificación posteriores.
Se usa un programa convencional de termociclado
para amplificar el producto de ADN de doble cadena. Brevemente, la
temperatura de la reacción se eleva hasta 90-95ºC
para desnaturalizar los ácidos nucleicos. A continuación, la
temperatura se reduce hasta 50-65ºC para permitir
que los cebadores hibriden con los sitios de cebado complementarios
y, después, la temperatura se eleva hasta aproximadamente
68-74ºC para permitir que la ADN polimerasa
termoestable extienda los cebadores hibridados a lo largo de las
moléculas de ADN molde. El tiempo para cada temperatura está entre
aproximadamente 15 segundos y 2 minutos. A continuación, estas
etapas se repiten entre aproximadamente 25 y 35 veces para
amplificar el ADN de cadena doble.
Después del primer ciclo de desnaturalización, el
complejo AS/CS hibrida con la primera cadena del ADNc y se
extiende mediante la ADN polimerasa para producir la segunda cadena
del ADNc y da lugar a un producto de ADNc de doble cadena. Es
importante apuntar que CUS y CUC no coinciden con la secuencia
inicial del ARN y, de este modo, no participarán en la reacción
hasta después que de haya tenido lugar la síntesis de la primera y
segunda cadena del ADNc.
El cebado y la síntesis de la primera y segunda
cadena y el cebado y síntesis del amplicón final, consumen el CS y
el CC. La extensión de los grupos de cebado, típicamente
3'-OH, mediante la polimerasa hace que CS y CC sean
incorporados covalentemente a los extremos del ADNc producto. La
incorporación de las secuencias tallo de CS y de CC como los
extremos 5' del ADNc proporciona el sitio de cebado para CUS y CUC,
respectivamente, para unir y cebar la posterior amplificación del
ADNc. Los CUS y CUC se consumen mediante la reacción para producir
el amplicón final de ADN de doble cadena (Figura 3). Además, CS,
CC, CUS y/o CUC pueden tener unidos restos de "detección" para
facilitar la detección y/o captura del ADNc o del producto (o
productos) finales de amplificación del ADN. Los restos de
"detección" adecuados incluyen marcadores enzimáticos,
marcadores fluorescentes y marcadores radiactivos.
Se proporciona una biblioteca preformada de
cebadores oligonucleotídicos que comprende un primer conjunto de
cebadores oligonucleotídicos y un segundo conjunto de cebadores
oligonucleotídicos, teniendo los cebadores regiones tallo que
permiten la unión de los cebadores para formar un par de cebadores
de amplificación.
Separando conceptualmente el cebador de
amplificación en dos trozos, puede prepararse con antelación una
biblioteca de amplificación de gran amplitud, en lugar de
sintetizar una variedad de cebadores de amplificación según sea
necesario. Este sistema de par de cebadores es ventajoso con
respecto a un sistema de cebador único ya que se aumenta la
afinidad de unión. Una biblioteca completa de cada oligonucleótido
posible 17-mer, usando las cuatro bases naturales,
podría constar de 4^{11} (o aproximadamente 1,7 x 10^{10})
moléculas. Proporcionando los cebadores en dos componentes, por
ejemplo, una biblioteca de 8-mer y una biblioteca de
9-mer, ensambladas rápidamente cuando sea
necesario, el tamaño de la biblioteca necesaria se reduce a 4^{8}
+ 4^{9} ó 327.650 moléculas. La complejidad requerida de la
biblioteca aún se reduce más mediante la sustitución de algunas de
las bases naturales por una o más bases universales o degeneradas.
De este modo, por ejemplo, si la biblioteca 9-mer
consta de 5 bases universales seguidas de 4 bases naturales, el
número de componentes desciende a 4^{4} (256) y el tamaño total
de la biblioteca se reduce a 4^{8} + 4^{4}, aproximadamente
66.000 moléculas. La complejidad de la biblioteca también puede
reducirse dividiendo la molécula complementaria en tres o más
segmentos. Es posible sintetizar y mantener bibliotecas de este
tamaño, y ensamblar rápidamente cualquier par de cebadores deseados
sin necesidad para el cliente de sintetizar de novo
oligómeros largos. De este modo, una realización de la invención es
una biblioteca que comprende al menos dos conjuntos de oligómeros,
en la que los oligómeros se seleccionan entre cada conjunto y se
unen cuando sea necesario.
Al menos uno de los dominios de unión comprende
de aproximadamente 3 a aproximadamente 24 bases, preferiblemente
de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 bases. Por ejemplo, puede
construirse una biblioteca que tenga un conjunto de dominios de
unión 6-mer, cada uno de los cuales se une sólo a
una única secuencia 6-mer y un conjunto de dominios
de unión 8-mer, en el que sólo cuatro de las bases
son específicas de secuencia y las bases restantes son degeneradas
o universales. El primer conjunto contiene 4^{6} (4096)
secuencias posibles, mientras que el segundo conjunto contiene sólo
4^{4} (256) secuencias (suponiendo 4 bases "específicas" y 4
bases universales). Combinando oligómeros seleccionados de los
conjuntos primero y segundo según sea necesario, pueden generarse
4^{10} (10^{6}) secuencias diferentes usando sólo 4.352
moléculas. Por el contrario, una biblioteca completa de
14-mer requerirían 4^{14} (2,7 x 10^{8})
moléculas.
El primer oligonucleótido del cebador de dos
componentes (componente cebador P) comprende sólo enlaces
fosfodiéster naturales y puede contener una o más bases modificadas
(por ejemplo, bases universales y degeneradas como se define a
continuación). El segundo oligonucleótido (componente anclaje A) se
modifica para asegura una unión de alta afinidad a la secuencia
diana de ARN y contiene una o más bases modificadas y enlaces del
esqueleto modificados, por ejemplo, fosforotioatos,
desoxifosforotioatos, fosfodiésteres
2'-O-sustituidos y análogos desoxi,
fosforoditioatos 2'-O-sustituidos y
análogos desoxi, morfolino, ácidos nucleicos peptídicos (ANP; véase
la patente de EE.UU. Nº 5.539.082),
2'-O-alquil metilfosfonatos,
3'-amidatos, MMI, alquiléteres (véase Cook y col.,
documento U.S. 5.223.618) y otros como se describen en Cook y col.,
documento U.S. 5.378.825, Sanghvi y col. (documento U.S.
5.489.677), Cook y col. (documento U.S. 5.541.307 y similares.
Las bases universales adecuadas para su uso en la
presente invención incluyen, pero sin limitaciones,
desoxi-5-nitroindol,
desoxi-3-nitropirrol,
desoxi-4-nitrobenzimidazol,
desoxi-nebularina, desoxiinosina,
2'-OMe inosina, 2'-OMe
5-nitroindol, 2'-OMe
3-nitropirrol, 2'-F inosina,
2'-F nebularina, 2'-F
5-nitroindol, 2'-F
4-nitrobencimidazol, 2'-F
3-nitropirrol,
ANP-5-introindol,
ANP-nebularina, ANP-inosina,
ANP-4-nitrobencimidazol,
ANP-3-nitropirrol,
morfolino-5-nitroindol,
morfolino-nebularina,
morfolino-inosina,
morfolino-4-nitrobencimidazol,
morfolino-3-nitropirrol,
fosforamidato-5-nitroindol,
fosforamidato-nebularina,
fosforamidato-inosina,
fosforamidato-4-nitrobenzimidazol,
fosforamidato-3-nitropirrol,
2'-O-metoxietil inosina,
2'-O-metoxietil nebularina,
2'-O-metoxietil
5-nitroindol,
2'-O-metoxietil
4-nitro-bencimidazol,
2'-O-metoxietil-3-nitropirrol,
dímero desoxi R_{p}
MP-5-nitroindol y dímero
2'-OMe R_{p}
MP-5-nitroindol.
Las bases degeneradas adecuadas para su uso en la
presente invención incluyen, pero sin limitaciones, desoxi
P(A y G), desoxi K (U y C), 2'-OMe
2-aminopurina (U y C), 2'-OMe P (G
y A), 2'-OMe K (U y C),
2'-F-2-aminopurina
(U y C), 2'-F P (G y A), 2'-F K (U y
C), ANP-2-aminopurina (U y C),
APN-P (G y A), ANP-K (U y C),
morfolino-2-aminopurina (U y C),
morfolino-P (G y A), morfolino-K (U
y C), fosforamidato-2-aminopurina (C
y U), fosforamidato-P (G y A),
fosforamidato-K (U y C),
2'-O-metoxietil
2-aminopurina (U y C),
2'-O-metoxietil P (G y A),
2'-O-metoxietil K (U y C), dímero
desoxi R_{p} MP-KP, dímero desoxi R_{p}
MP-PK, dímero desoxi R_{p} MP-Kk,
dímero desoxi R_{p} MP-PP, dímero
2'-OMe R_{p} MP-KP, dímero
2'-OMe R_{p} MP-PK, dímero
2'-OMe R_{p} MP-KK y dímero
2'-OMe R_{p} MP-PP.
Los restos de unión se seleccionan para unir dos
oligómeros a partir de diferentes conjuntos mediante interacción
covalente o no covalente, por ejemplo, un par de unión no
covalente. Los restos de unión preferiblemente se seleccionan de
modo que los restos de unión presentes en los oligonucleótidos del
primer conjunto de una biblioteca no se unen entre sí, pero se
unen fácilmente con los restos de unión de los oligonucleótidos del
segundo conjunto, asegurándose de este modo que los
oligonucleótidos se unen en la orientación deseada. En una
realización, los restos de unión son oligonucleótidos o análogos de
oligonucleótido complementarios.
Los pares de cebadores de la invención también
pueden usarse para la secuenciación de ácidos nucleicos y son los
mismos que los que se usan para la amplificación de ácidos
nucleicos, excepto por que no incluyen los cebadores universales
complementarios o sentido mostrados en las Figuras 1A y 1B. Por
ejemplo, pueden usarse un par AS/CS anclaje/cebador como se muestra
en la Figura 1A o un par AC/CC anclaje/cebador como se muestra en
la Figura. 1B para cebar las reacciones de secuenciación que se
realizan a continuación como es bien conocido en la técnica.
Además, la estructura tallo de estos pares de cebadores de
secuenciación pueden o no incluir una región que es complementaria
con un cebador universal.
En las secuencias mostradas a continuación,
enlazador-L de Glen Research (espaciador 18, cat, nº
10-1918-90 o espaciador 9, cat. nº
10-1909-90), los nucleótidos en
minúsculas subrayados son secuencias especificas de gen y los
nucleótidos en mayúsculas subrayados son las regiones de la
secuencia tallo, en este ejemplo, todos los cebadores contienen
esqueletos de ADN sin modificar y contienen algunas bases
modificadas dé alta afinidad, tales como
C-5-propinil-C y
C-5-propinil-U. Los
anclajes contienen un esqueleto de azúcar modificado en
2'-OMe y
C-5-propinil-C. Las
regiones específicas de gen para este ejemplo tienen una longitud
total que oscila desde 12 bases (6 cada uno de los anclajes y
cebadores) a 24 bases (12 cada uno de los anclajes y cebadores). La
región tallo tiene 24 bases de longitud y los cebadores
universales (CUS y CUC) tienen 19 ó 14 bases de longitud.
\newpage
- FUP 100: 5'-GCCACCTGTGGTCCACCTG-3' (ID SEC Nº 1)
- FUP 112: 5'-GCCACCTGTGGTCC-3' (ID SEC Nº 2)
- FP 104: 5'-GCCACCTGTGGTCCCACCTGCTGAG gtagaa-3'(ID SEC Nº 3)
- FP 106: 5'-GCCACCTGTGGTCCACCTGCTGAG gtagaaatctgg-3' (ID SEC Nº 4)
- FA 108: 5'-ctgtct(L)CTCAGCAGGT-3' (ID SEC Nº 5)
- FA 110: 5'-cgacgactgtct(L)CTCAGCAGGT-3' (ID SEC Nº 6)
- RUP 101: 5'-CACTTGTGGCCCAGATAGG-3' (ID SEC Nº 7)
- RUP 113: 5'-CACTTGTGGCCCAG-3' (ID SEC Nº 8)
- RP 105: 5'-CACTTGTGGCCCAGATAGGAGGCT gcactc-3' (ID SEC Nº 9)
- RP 107: 5'-CACTTGTGGCCCAGATAGGAGGCT gcactccacgtc-3' (ID SEC Nº 10)
- RA 109: 5'-catggt(L)AGCCTCCTAT-3' (ID SEC Nº 11)
- RA 111: 5'-ttctaccatggt(L)AGCCTCCTA-3' (ID SEC Nº 12)
El ARN total celular o el poli(A+)
(0,1-2.000 ng) se añade en presencia de (por
reacción):
- Tris-HCl 10 mM, pH 8,3
- KCl 50 mM
- dATP, dGTP, dCTP, dTTP 200 \muM de cada uno
- CUS 0,2-1,0 \muM
- CUC 0,2-1,0 \muM
- AS, CS, AC y CC específicos del gen 0,02-0,1 \muM de cada uno
- Trancriptasa inversa 200 U/100 \mul
- ADN polimerasa termoestable 200 U/100 \mul
La PCR se realiza usando los parámetros descritos
anteriormente. El tamaño del producto final se verifica mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1%. El fragmento de PCR
amplificado se limpia y purifica usando un kit de limpieza de PCR
comercial (por ejemplo, Qiagen) y puede usarse para la transfección
in vitro o in vivo de células o tejidos.
Aunque los ejemplos descritos en este documento
se refieren a pares de cebadores de amplificación para la
amplificación por PCR de una secuencia de ácido nucleico, estos
pares de cebadores pueden usarse para cualquier actividad de cebado
con ADN o ARN polimerasa. Por ejemplo, estos pares de cebadores
pueden usarse en tecnologías de amplificación dependiente de
cebador sin termociclado que se usan para competir comercialmente
con la PCR, tales como amplificación por desplazamiento de la
cadena (ADC) (Walker, PCR Methods Appl. 3:
1-6, 1993; Spargo y col., Mol. Cell. Probes
10:247-256, 1996), replicación de secuencia
autosostenida (3SR) y replicación de secuencia autosostenida in
situ (IS-3SR) (Mueller y col., Histochem.
Cell Biol. 108:431-437, 1997),
amplificación por círculo rodante (RCA) (Lizardi y col., Nature
Genet. 19:225-232, 1998), y amplificación
basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) (Heim y col.,
Nucl. Acids Res. 26: 2250-2251, 1998;
Romano y col., Immunol. Invest. 26:
15-28, 1997).
Mientras que se han descrito en detalle
realizaciones particulares de la invención, será obvio para los
expertos en la materia que estas realizaciones son ejemplos en
lugar de limitaciones, y el alcance real de la invención es el que
se define en las siguientes reivindicaciones.
<110> OASIS BIOSCIENCES, INC.
\hskip1cmBrown, Bob D.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PARES DE CEBADORES DE AMPLIFICACIÓN Y
SECUENCIACIÓN Y USO DE LOS MISMOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> OASBIO.002VPC
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/128.378
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-04-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ versión 4.0 para Windows
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotidicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccacctgtg gtccacctg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccacctgtg gtcc
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccacctgtg gtcccacctg ctgaggtaga a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccacctgtg gtccacctgc tgaggtagaa atctgg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtctctca gcaggt
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacgactgt ctctcagcag gt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggc ccagacagg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggc ccag
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggc ccagatagga ggctgcactc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttgtggc ccagatagga ggctgcactc cacgtc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacggcagcc tcctat
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores oligonucleotídicos
sintéticos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctaccatg gtagcctcct a
\hfill19
Claims (21)
1. Un conjunto de cebadores para amplificación o
secuenciación de un polinucleótido diana que comprende:
- un par de
oligonucleótidos-cebadores que comprende un anclaje
y un cebador oligonucleotídicos, en el que dicho anclaje tiene una
estructura química de ácido nucleico que no es sustrato para una
transcriptasa inversa o una ADN polimerasa, y/o tiene un extremo 3'
que no es capaz de cebar la síntesis de ácidos nucleicos,
en el que dicho cebador comprende una región de
la secuencia del cebador que híbrida con una secuencia de ácido
nucleico diana y tiene una estructura química de ácido nucleico que
es sustrato para una transcriptasa inversa o una ADN polimerasa, y
en el que dicho anclaje y dicho cebador incluyen cada uno una
región de nucleótidos complementarios que se autoensamblan el uno
con el otro para formar una estructura tallo cuando los
oligonucleótidos de dicho anclaje y de dicho cebador se combinan,
incluyendo dicha estructura tallo una región que es complementaria
con un cebador universal; y
- un cebador universal que es complementario con
dicha región de dicha estructura tallo que es complementaria con
el cebador universal.
2. El conjunto de cebadores de la reivindicación
1, en el que dicha región tallo de dicha secuencia anclaje se
conecta con la restante secuencia anclaje mediante un enlazador
flexible.
3. El conjunto de cebadores de la reivindicación
2, en el que dicho enlazador flexible se selecciona entre el grupo
compuesto por polietilénglicol, polipropilénglicol, polietileno,
polipropileno, poliamidas y poliésteres.
4. El conjunto de cebadores de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que dicho cebador
comprende una región cola que se extiende más allá de la longitud
de dicha región tallo de dicho anclaje.
5. El conjunto de cebadores de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, en el que dicho par de
cebadores comprende una o más moléculas análogas a
oligonucleótidos.
6. El conjunto de cebadores de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en la que dicha región de
la secuencia del cebador comprende una o más bases
modificadas.
7. El conjunto de cebadores de la reivindicación
6, en el que dicha una o más bases modificadas es una base
universal.
8. El conjunto de cebadores de la reivindicación
7, en el que dicha base universal se selecciona entre el grupo
compuesto por inosina, 5-nitroindol,
3-nitropirrol y
4-nitrobencimidazol.
9. El conjunto de cebadores de la reivindicación
6, en el que dicha una o más bases modificadas es una base
degenerada.
10. El conjunto de cebadores de la reivindicación
9, en el que dicha base degenerada se selecciona entre el grupo
compuesto por
6H,8H-3,4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxacin-7-ona
("P", un mimético de pirimidina) y
2-amino-6-metoxiaminopurina
("K", un mimético de purina).
11. El conjunto de cebadores de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-10, en el que dicho anclaje
comprende uno o más enlaces del esqueleto modificados.
12. El conjunto de cebadores de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-11, en el que las secuencias
de dicho anclaje y dicho cebador tienen cada una entre 6 y 24 bases
nucleotídicas de longitud.
13. Uso de un conjunto de cebadores según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la
amplificación o secuenciación de una secuencia polinucleotídica
diana.
14. Un procedimiento para amplificar o secuenciar
una secuencia de ácido nucleico diana, que comprende las etapas
de:
- combinar un anclaje sentido (AS), cebador
sentido (CS), anclaje complementario (AC), cebador complementario
(CC), cebador universal sentido (CUS) y cebador universal
complementario (CUC), en el que dicho AS y dicho CS se
autoensamblan para formar un primer par de
oligonucleótido-cebador (AS/CS) y dicho AC y CC se
autoensamblan para formar un segundo par de
oligonucleótido-cebador (AC/CC) a través de la
asociación de sus regiones tallo complementarias, en el que dicho
CUS es complementario con la región tallo AS/CS y dicho CUC es
complementario con la región tallo AC/CC, y en el que dichos pares
de oligonucleótidos-cebadores se seleccionan según
la complementariedad con dicha secuencia de ácido nucleico
diana;
\newpage
- combinar dichos primer y segundo par de
oligonucleótido-cebador y dichos CUS y CUC con
dicho ácido nucleico diana; y
- amplificar dicha secuencia de ácido nucleico
diana a través de la amplificación mediada por enzima.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha secuencia de ácido nucleico diana es ADN.
16. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha secuencia de ácido nucleico diana es ARN.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que dicha amplificación utiliza una transcriptasa inversa.
18. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 14-17, en el que dicha
amplificación mediada por enzima se selecciona entre el grupo
compuesto por amplificación por PCR, SDA, 3SR,
IS-3SR, NASBA y amplificación por círculo
rodante.
19. El procedimiento de la reivindicación 18 en
el que dicha amplificación mediada por enzima es una amplificación
por PCR.
20. El procedimiento de la reivindicación 18 en
el que dicha amplificación mediada por enzima se selecciona entre
el grupo compuesto por amplificación 3SR, IS-3SR y
NASBA.
21. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que dicha amplificación mediada por enzima se selecciona entre
el grupo compuesto por amplificación SDA y por círculo rodante.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12837899P | 1999-04-08 | 1999-04-08 | |
| US128378P | 1999-04-08 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2253216T3 true ES2253216T3 (es) | 2006-06-01 |
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ID=22435077
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00920202T Expired - Lifetime ES2253216T3 (es) | 1999-04-08 | 2000-04-07 | Pares de cebadores de amplificacion y secuenciacion y uso de los mismos. |
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