ES2875318T3 - Procedimiento para generar colecciones de ADN circular monocatenario para secuenciación de molécula única - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de preparación de un ácido nucleico diana para su secuenciación, que comprende (a) proporcionar una muestra que comprende el ácido nucleico diana; (b) poner en contacto la muestra con una molécula de adaptador que comprende dos hebras, que forman al menos una región de doble hebra y al menos una región sin doble hebra, comprendiendo la región sin doble hebra al menos un sitio de unión a cebador universal; (c) ligar la molécula de adaptador al ácido nucleico diana para formar una molécula de unión circular bicatenaria que comprende la región sin doble hebra con el al menos un sitio de unión a cebador universal, en el que el adaptador comprende dos regiones de doble hebra que flanquean al menos una estructura de tallo-bucle, comprendiendo cada estructura una región de tallo de doble hebra y una región de bucle sin doble hebra.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para generar colecciones de ADN circular monocatenario para secuenciación de molécula única Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la secuenciación de ácidos nucleicos y, más específicamente, a la preparación de moldes circulares para secuenciación de ácidos nucleicos.
Antecedentes de la invención
El uso de moldes circulares para secuenciación es conocido en la técnica. Por ejemplo, PACIFIC BIOSCIENCES usa un adaptador SMRTBELL para producir dichos moldes. Véanse las pat. de EE. UU. n.os 7.302.146 y 8.153.375. Los moldes monocatenarios circulares tienen varias ventajas en la secuenciación por síntesis: si una polimerasa de secuenciación puede realizar la replicación por círculo rodante, el molde se leerá múltiples veces y se leerán ambas hebras de Watson y Crick. Las múltiples lecturas de hebras emparejadas prometen un rendimiento de secuencias consenso más exacto. Sin embargo, los moldes circulares existentes se diseñan de modo que dos polimerasas de secuenciación se puedan unir a cada molde. Las dos polimerasas tienen el potencial de interferir entre sí y provocar un estancamiento o terminación de la síntesis, lo que genera datos de secuenciación subóptimos. La presente invención mejora la tecnología existente para posibilitar lecturas de secuenciación más exactas. En este contexto, el documento WO 2015/089333 ya divulga un procedimiento para identificar una variante de secuencia en una muestra de ácido nucleico que comprende una pluralidad de polinucleótidos, teniendo cada polinucleótido de la pluralidad un extremo 5' y un extremo 3', comprendiendo el procedimiento (a) circularizar polinucleótidos individuales de dicha pluralidad para formar una pluralidad de polinucleótidos circulares, teniendo cada uno un punto de unión entre el extremo 5' y el extremo 3'; (b) amplificar los polinucleótidos circulares de (a); (c) secuenciar los polinucleótidos amplificados para producir una pluralidad de lecturas de secuenciación (reiv. 1), en el que circularizar comprende la etapa de unir un polinucleótido adaptador tanto al extremo 5' como al extremo 3' de un polinucleótido en la pluralidad de polinucleótidos.
Sumario de la invención
En un modo de realización, la invención es un procedimiento de preparación de un ácido nucleico diana para su secuenciación, que comprende proporcionar una muestra que comprende el ácido nucleico diana; poner en contacto la muestra con una molécula de adaptador que comprende dos hebras, que forman al menos una región de doble hebra y al menos una región sin doble hebra, comprendiendo la región sin doble hebra al menos un sitio de unión a cebador universal; y ligar la molécula de adaptador al ácido nucleico diana para formar una molécula de unión circular bicatenaria que comprende la región sin doble hebra con el al menos un sitio de unión a cebador universal. El procedimiento puede comprender además poner en contacto la molécula de unión con una ADN polimerasa y un cebador universal complementario al sitio de unión a cebador; y extender el cebador universal, determinando, de este modo, la secuencia del ácido nucleico diana por medio de secuenciación por síntesis. El adaptador comprende dos regiones de doble hebra que flanquean al menos una estructura de tallobucle, comprendiendo cada estructura una región de tallo de doble hebra y una región de bucle sin doble hebra. Cada hebra del adaptador puede comprender un sitio de unión a cebador. Las dos hebras tienen el mismo sitio de unión a cebador o tienen diferentes sitios de unión a cebador. La ligación puede ser una ligación de extremos romos o una ligación de extremos cohesivos. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende una etapa preliminar de añadir de una manera independiente de molde, un nucleótido a los extremos 3' del ácido nucleico diana y un nucleótido complementario a los extremos 3' de la molécula de adaptador creando, de este modo, extremos cohesivos. En otros modos de realización, el procedimiento comprende una etapa preliminar de digerir el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una endonucleasa de restricción para generar extremos cohesivos compatibles. En otros modos de realización, el procedimiento comprende una etapa preliminar de digerir los extremos 3' del ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una exonucleasa. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana comprende al menos un nucleótido de fosforotioato cerca del extremo 3'. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador contienen bases uracilo y el procedimiento comprende, antes de la etapa b), una etapa de poner en contacto el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una N-glucosilasa y una AP-liasa. Por ejemplo, el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador se ponen en contacto con uracil-ADN-glucosilasa y endonucleasa VIII o uracil-ADN-glucosilasa y una poliamina y se exponen al calor. En algunos modos de realización, la polimerasa es una polimerasa de desplazamiento de hebra. En algunos modos de realización, la muestra comprende una pluralidad de ácidos nucleicos diana. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se fragmenta antes de comenzar las etapas del procedimiento.
En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se somete a reparación de extremos por una ADN polimerasa antes de comenzar las etapas del procedimiento. El adaptador puede comprender uno o más códigos de barras, identificador único (UID), identificador múltiple (MID) o una combinación de los mismos.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de un ácido nucleico diana para su secuenciación, que comprende proporcionar una muestra que comprende el ácido nucleico diana; poner en contacto la muestra con una molécula de adaptador que comprende dos hebras, que forman una doble hebra, en la que cada hebra comprende un sitio de unión a cebador universal; ligar la molécula de adaptador al ácido nucleico diana para formar una molécula de unión circular bicatenaria que comprende dos sitios de unión a cebador universal. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además poner en contacto la molécula de unión con una ADN polimerasa y cebadores universales complementarios a los sitios de unión a cebador; extender los cebadores universales determinando, de este modo, la secuencia del ácido nucleico diana por medio de secuenciación por síntesis. En algunos modos de realización, cada hebra tiene el mismo sitio de unión a cebador. En otros modos de realización, las dos hebras tienen diferentes sitios de unión a cebador. Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama de un procedimiento de la técnica anterior de ensamblaje de una molécula circular usando dos adaptadores de tallo-bucle.
La figura 2 es un diagrama de un procedimiento de la técnica anterior de ensamblaje de una molécula circular usando ligación con puente.
La figura 3 es un diagrama del procedimiento novedoso de ensamblaje de una molécula circular usando un adaptador bicatenario único.
La figura 4 es un diagrama del procedimiento novedoso de ensamblaje de una molécula circular usando un adaptador único que tiene dos regiones bicatenarias y dos regiones de tallo-bucle.
La figura 5 es un diagrama del procedimiento novedoso de ensamblaje de una molécula circular usando un adaptador único que tiene dos regiones bicatenarias que flanquean una región monocatenaria.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Las siguientes definiciones ayudan en el entendimiento de la presente divulgación.
El término "muestra" se refiere a cualquier composición que contiene o se supone que contiene ácido nucleico diana. Esto incluye una muestra de tejido o líquido aislado de un individuo, por ejemplo, piel, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, líquido sinovial, orina, lágrimas, glóbulos sanguíneos, órganos y tumores, y también para muestras de cultivos in vitro establecidos a partir de células extraídas de un individuo, incluyendo los tejidos incluidos en parafina fijados con formol (FFPET) y ácidos nucleicos aislados de los mismos. Una muestra también puede incluir material libre de células, tal como una fracción sanguínea libre de células que contenga ADN libre de células (ADNlc) o ADN tumoral circulante (ADNtc).
Un término "ácido nucleico" se refiere a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, tanto naturales como no naturales), siendo dichos polímeros ADN, ARN y sus subcategorías, tales como ADNc, ARNm, etc. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y, en general, contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque, en algunos casos, los análogos de nucleótidos pueden tener otros enlaces. Los ácidos nucleicos pueden incluir bases naturales (adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina), así como bases no naturales. Algunos ejemplos de bases no naturales incluyen las descritas, por ejemplo, en Seela et al., (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640. Las bases no naturales pueden tener una función particular, por ejemplo, incrementar la estabilidad de la doble hebra, inhibir la digestión con nucleasa o bloquear la extensión del cebador o la polimerización de la hebra.
Los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan de manera intercambiable. Polinucleótido es un ácido nucleico monocatenario o uno bicatenario. "Oligonucleótido" es un término usado a veces para describir un polinucleótido más corto. Un oligonucleótido puede estar compuesto por al menos 6 nucleótidos, por ejemplo, de al menos aproximadamente 10-12 nucleótidos, o de al menos aproximadamente 15-30 nucleótidos. Los oligonucleótidos se preparan por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, por un procedimiento que implica síntesis química directa como se describe en Narang et al. (1979) Meth. Enzymol.
68:90-99; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191.
Los términos "doble hebra" y "región bicatenaria" se usan de manera intercambiable para referirse a una región donde se hibridan dos hebras de ácido nucleico. Las hebras no necesitan ser perfectamente complementarias para mantener la doble hebra. Dependiendo de la secuencia, dos hebras de ácido nucleico pueden formar una estructura que contenga regiones de doble hebra y regiones sin doble hebra.
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido monocatenario que se hibrida con una secuencia en el ácido nucleico diana ("sitio de unión a cebador") y puede actuar como un punto de iniciación de la síntesis a lo largo de una hebra complementaria de ácido nucleico en condiciones adecuadas para dicha síntesis.
El término "adaptador" significa una secuencia de nucleótidos que se puede añadir a otra secuencia para importar propiedades adicionales a esa secuencia. Un adaptador típicamente es un oligonucleótido que puede ser mono o bicatenario, o puede tener tanto una porción monocatenaria como una porción bicatenaria.
El término "ligación" se refiere a una reacción de condensación que une dos hebras de ácido nucleico en la que un grupo 5'-fosfato de una molécula reacciona con el grupo 3'-hidroxilo de otra molécula. La ligación típicamente es una reacción enzimática catalizada por una ligasa o una topoisomerasa. La ligación puede unir dos hebras únicas para crear una molécula monocatenaria. La ligación también puede unir dos hebras, perteneciendo cada una a una molécula bicatenaria, uniendo así dos moléculas bicatenarias. La ligación también puede unir ambas hebras de una molécula bicatenaria a ambas hebras de otra molécula bicatenaria, uniendo así dos moléculas bicatenarias. La ligación también puede unir dos extremos de una hebra dentro de una molécula bicatenaria, reparando así una muesca en la molécula bicatenaria.
El término "código de barras" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se puede detectar e identificar. Los códigos de barras típicamente se incorporan a otros ácidos nucleicos. Los códigos de barras son lo suficientemente largos, por ejemplo, 2, 5, 10 nucleótidos, de modo que los ácidos nucleicos que incorporan los códigos de barras se pueden distinguir o agrupar de acuerdo con los códigos de barras.
El término "identificador múltiple" o "MID" se refiere a un código de barras que identifica una fuente de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, una muestra de la que se deriva el ácido nucleico). Todos o sustancialmente todos los ácidos nucleicos diana de la misma muestra compartirán el mismo MID. Los ácidos nucleicos diana de diferentes fuentes o muestras se pueden mezclar y secuenciar simultáneamente. Usando los MID, las lecturas de secuencia se pueden asignar a muestras individuales a partir de las que se originaron los ácidos nucleicos diana.
El término "identificador molecular único" o "UID" se refiere a un código de barras que identifica un ácido nucleico al que está fijado. Todos o sustancialmente todos los ácidos nucleicos diana de la misma muestra tendrán diferentes UID. Toda o sustancialmente toda la descendencia (por ejemplo, amplicones) derivada del mismo ácido nucleico diana original compartirá el mismo UID.
El término "cebador universal" y "sitio de unión de cebado universal" se refieren a un cebador y sitio de unión a cebador presentes en (típicamente, a través de añadirse artificialmente a) diferentes ácidos nucleicos diana. El sitio de cebado universal se añade al ácido nucleico diana usando adaptadores o cebadores específicos de diana (no universales) que tengan una región saliente hacia 5'. El cebador universal se puede unir a y dirigir la extensión del cebador desde el sitio de cebado universal.
El término "extremos cohesivos" se refiere a protuberancias monocatenarias en los extremos de un primer ácido nucleico bicatenario que puede formar una doble hebra con protuberancias monocatenarias en los extremos de un segundo ácido nucleico bicatenario de modo que los dos ácidos nucleicos se puedan unir, por ejemplo, por ligación, opcionalmente con extensión por polimerasa de los extremos. Los extremos cohesivos de las dos moléculas no necesitan ser perfectamente complementarios para que las dos moléculas se unan.
Los términos "secuencia diana", "ácido nucleico diana" o "diana" se refieren a una porción de la secuencia de ácido nucleico en la muestra que se va a detectar o analizar. El término diana incluye todas las variantes de la secuencia diana, por ejemplo, una o más variantes mutantes y la variante natural.
El término "secuenciación" se refiere a cualquier procedimiento de determinación de la secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico diana.
La presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un ácido nucleico diana para su secuenciación, que comprende
(a) proporcionar una muestra que comprende el ácido nucleico diana;
(b) poner en contacto la muestra con una molécula de adaptador que comprende dos hebras, que forman al menos una región de doble hebra y al menos una región sin doble hebra, comprendiendo la región sin doble hebra al menos un sitio de unión a cebador universal; y
(c) ligar la molécula de adaptador al ácido nucleico diana para formar una molécula de unión circular bicatenaria que comprende la región sin doble hebra con el al menos un sitio de unión a cebador universal. El procedimiento puede comprender además las etapas de
(d) poner en contacto la molécula de unión con una ADN polimerasa que puede ser una polimerasa de desplazamiento de hebra y un cebador universal complementario al sitio de unión a cebador; y
(e) extender el cebador universal, determinando, de este modo, la secuencia del ácido nucleico diana por medio de secuenciación por síntesis.
El adaptador comprende dos regiones de doble hebra que flanquean al menos una estructura de tallo-bucle, comprendiendo cada estructura una región de tallo de doble hebra y una región de bucle sin doble hebra. Cada hebra del adaptador puede comprender un sitio de unión a cebador.
La ligación puede ser una ligación de extremos romos o preferentemente una ligación de extremos cohesivos. En este caso, el procedimiento según la invención puede comprender, antes de la etapa b), una etapa de añadir de una manera independiente de molde, un nucleótido a los extremos 3' del ácido nucleico diana y un nucleótido complementario a los extremos 3' de la molécula de adaptador creando, de este modo, extremos cohesivos. El procedimiento según la invención también puede comprender, antes de la etapa b), una etapa de digerir el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una endonucleasa de restricción para generar extremos cohesivos compatibles. El procedimiento según la invención también puede comprender, antes de la etapa b), una etapa de digerir los extremos 3' del ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una exonucleasa. A continuación, el ácido nucleico diana puede comprender al menos un nucleótido de fosforotioato. El ácido nucleico diana y la molécula de adaptador pueden contener bases uracilo y el procedimiento puede comprender, antes de la etapa b), una etapa de poner en contacto el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una N-glucosilasa y una AP-liasa. Que pueden ser uracil-ADN-glucosilasa y endonucleasa VIII. El ácido nucleico diana y la molécula de adaptador se pueden poner en contacto con uracil-ADN-glucosilasa y un compuesto de poliamina a temperatura elevada.
La muestra puede comprender una pluralidad de ácidos nucleicos diana. El ácido nucleico diana se fragmenta antes de la etapa b) y se puede someter a reparación de extremos por una ADN polimerasa antes de la etapa b). El adaptador puede comprender uno o más códigos de barras que pueden incluir uno o más de un identificador único (UID), identificador múltiple (MID) o una combinación de los mismos.
La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de un ácido nucleico diana para su secuenciación, que comprende
(a) proporcionar una muestra que comprende el ácido nucleico diana;
(b) poner en contacto la muestra con una molécula de adaptador que comprende dos hebras que forman una doble hebra, en la que cada hebra comprende un sitio de unión a cebador universal; y
(c) ligar la molécula de adaptador al ácido nucleico diana para formar una molécula de unión circular bicatenaria que comprende dos sitios de unión a cebador universal.
El procedimiento puede comprender además las etapas de
(d) poner en contacto la molécula de unión con una ADN polimerasa y cebadores universales complementarios a los sitios de unión a cebador; y
(e) extender los cebadores universales, determinando, de este modo, la secuencia del ácido nucleico diana por medio de secuenciación por síntesis.
Cada hebra puede tener el mismo sitio de unión a cebador o uno diferente.
La presente invención proporciona además una composición para secuenciar un ácido nucleico diana que comprende una molécula circular bicatenaria que consiste en el ácido nucleico diana ligado a un adaptador que comprende dos hebras, en el que las hebras forman al menos una región de doble hebra y al menos una región sin doble hebra, conteniendo cada hebra en la región sin doble hebra sitios de unión a cebador universal. La composición puede comprender además un cebador universal o una ácido nucleico polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra o ambos.
En algunos modos de realización, la presente invención es un procedimiento que convierte un ácido nucleico diana bicatenario en un molde de hebra bloqueada circular útil en la secuenciación. El uso de moldes circulares es conocido en la técnica y tiene varias ventajas en las aplicaciones de secuenciación por síntesis. Véanse las pat. de EE. UU. n.os 7.302.146 y 8.153.375. Si se usa una polimerasa de desplazamiento de hebra, participará en la replicación por círculo rodante, es decir, desplazará continuamente la hebra naciente y realizará múltiples tandas de copias del molde circular. La capacidad de secuenciar (leer) la diana múltiples veces y comparar ambas hebras de Watson y Crick de un ácido nucleico enlazadas en la estructura circular permite generar secuencias consenso libres de errores o con pocos errores.
Sin embargo, con referencia a la figura 1, los moldes circulares existentes se diseñan para que tengan un adaptador 100 ligado a ambos extremos del ácido nucleico diana 102 de modo que la molécula circular 104 resultante contenga dos secuencias de adaptador 100. (Figura 1). Cada adaptador tiene un sitio de unión para el cebador de secuenciación que permite la unión de dos cebadores y dos ADN polimerasas a cada molde circular. Una vez que ha comenzado la reacción de secuenciación, las dos polimerasas tienen el potencial de interferir entre sí y provocar un estancamiento o terminación de la síntesis, lo que disminuye la longitud de lectura y el rendimiento de los datos de secuenciación. Esto es especialmente problemático con moldes más cortos donde dos polimerasas se ponen en relativa proximidad entre sí.
Una forma de ensamblar moléculas circulares para la secuenciación ha sido convertir cada una de las dos hebras del ácido nucleico diana bicatenario en una molécula circular separada que tenga una secuencia de adaptador único. Véase el documento US20120003675 y la patente de EE. UU. n.° 7.883.849. Este enfoque requiere la complementariedad entre los brazos del adaptador y el ácido nucleico diana de modo que la hebra única se pueda enlazar en un círculo. Este enfoque no es práctico para crear una colección de una pluralidad de ácidos nucleicos de secuencia desconocida.
La presente invención es un procedimiento novedoso que permite la formación de una colección de moléculas circulares que, independientemente de la secuencia, comprenden un sitio de unión a cebador único para la polimerasa de secuenciación. (Figuras 3, 4 y 5). La presente invención es un procedimiento novedoso que puede incrementar la calidad, longitud de lectura y eficacia de la secuenciación. En los modos de realización de la invención, cada ácido nucleico diana bicatenario se conjuga a un adaptador único. La molécula bicatenaria circular resultante comprende dos hebras, teniendo cada una un sitio de unión a cebador único donde se va a iniciar la secuenciación.
La presente invención comprende modificar y secuenciar un ácido nucleico diana en una muestra. En algunos modos de realización, la muestra se deriva de un sujeto o un paciente. En algunos modos de realización, la muestra puede comprender un fragmento de un tejido sólido o un tumor sólido derivado del sujeto o del paciente, por ejemplo, por biopsia. La muestra también puede comprender líquidos corporales (por ejemplo, orina, esputo, suero, plasma o linfa, saliva, esputo, sudor, lágrima, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido quístico, bilis, líquido gástrico, líquido intestinal y/o muestras fecales). La muestra puede comprender sangre completa o fracciones sanguíneas donde puedan estar presentes células tumorales. En algunos modos de realización, la muestra, especialmente una muestra líquida, puede comprender material libre de células, tal como ADN o ARN libre de células, incluyendo ADN tumoral libre de células o ARN tumoral libre de células. En algunos modos de realización, la muestra es una muestra libre de células, por ejemplo, fracción sanguínea libre de células donde está presente ADN tumoral libre de células o ARN tumoral libre de células. En otros modos de realización, la muestra es una muestra cultivada, por ejemplo, un cultivo o sobrenadante de cultivo que contiene o se sospecha que contiene un agente infeccioso o ácidos nucleicos derivados del agente infeccioso. En algunos modos de realización, el agente infeccioso es una bacteria, un protozoo, un virus o un micoplasma.
El ácido nucleico diana se aísla, es decir, se separa de otros componentes tisulares y celulares para posibilitar que se produzcan las reacciones enzimáticas descritas en el presente documento. El aislamiento se puede realizar por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica.
Un ácido nucleico diana es el ácido nucleico de interés que puede estar presente en la muestra. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es un gen o un fragmento génico. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana contiene una variante genética, por ejemplo, un polimorfismo o una mutación, incluyendo un polimorfismo o variante mononucleotídica (SNP o SNV), o un reordenamiento genético que da como resultado una fusión génica. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana comprende un biomarcador, es decir, un gen o variante génica asociada con una enfermedad o afección. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana es característico de un organismo particular y ayuda en la identificación del organismo patógeno o una característica del organismo patógeno, por ejemplo, sensibilidad a fármacos o resistencia a fármacos. Aún en otros modos de realización, el ácido nucleico diana es característico de un sujeto humano, por ejemplo, la secuencia de HLA o KIR que define el genotipo de HLA o KIR único del sujeto.
En un modo de realización de la invención, un ácido nucleico diana bicatenario se convierte en la configuración de molde de la invención. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana se produce en la naturaleza en una forma monocatenaria (por ejemplo, ARN, incluyendo ARNm, microARN, ARN vírico; o ADN vírico monocatenario). El ácido nucleico diana monocatenario se convierte en una forma bicatenaria antes del comienzo de las demás etapas del procedimiento descrito en el presente documento. Los ácidos nucleicos diana más largos se pueden fragmentar, aunque, en algunas aplicaciones, se pueden desear ácidos nucleicos diana más largos para lograr una lectura más larga. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se fragmenta de forma natural, por ejemplo, ADN libre de células (ADNlc) circulante o ácido nucleico degradado químicamente, tal como el encontrado en muestras conservadas químicamente (tejidos incluidos en parafina fijados con formol, FFPET).
En los modos de realización de la presente invención, la molécula de adaptador se liga a una molécula del ácido nucleico diana. Ambos extremos del ácido nucleico diana se ligan a los extremos de un adaptador único formando, de este modo, una molécula de unión. La composición de la mezcla de reacción es tal que la cinética de la reacción de ligación favorece la ligación de un ácido nucleico diana a un adaptador único. La ligación a un adaptador único se favorece sobre la autocircularización y ligación a dos adaptadores. En algunos modos de realización, la concentración del ácido nucleico diana en la muestra se estima o cuantifica y se añade una cantidad molar adecuada del adaptador. En algunos modos de realización, la proporción de diana con respecto a adaptador es 1/20, 1/200 o 1/400. Un experto en la técnica entenderá que una ligación de extremos cohesivos es más eficaz y requerirá una concentración más pequeña del adaptador en comparación con la ligación de extremos romos.
En algunos modos de realización, el adaptador y el ácido nucleico diana o solo el adaptador se pretratan para permitir la formación de la molécula de unión, pero prevenir la autoligación, incluyendo la dimerización del adaptador y la autocircularización del ácido nucleico diana. En algunos modos de realización, el adaptador se modifica con un grupo 3'-fosfato para prevenir la dimerización. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana se trata con fosfatasa alcalina para retirar el grupo 5'-fosfato y prevenir la autocircularización.
En algunos modos de realización, la ligación se produce en dos etapas: la primera etapa es la ligación del adaptador y la segunda etapa es la autocircularización de la molécula de unión ligada. En algunos modos de realización, los adaptadores no ligados se separan de las moléculas de unión después de la primera etapa. En algunos modos de realización, la separación es por cromatografía o electroforesis. En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos diana no ligados o los adaptadores no ligados se retiran después de la etapa de ligación final, por ejemplo, por digestión con exonucleasa. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana autocircularizado no se retira, ya que no contiene ningún sitio de unión a cebador y no interferirá en las etapas posteriores del procedimiento.
La ligación puede ser una ligación de extremos romos o una ligación de extremos cohesivos más eficaz. El ácido nucleico diana o los adaptadores se pueden volver de extremos romos por relleno de hebra, es decir, extendiendo el extremo 3' por una ADN polimerasa para eliminar cualquier protuberancia hacia a 5'.
En algunos modos de realización, los extremos de los adaptadores y el ácido nucleico diana se pueden volver cohesivos por adición de un nucleótido único al extremo 3' del adaptador y un nucleótido complementario único a los extremos 3' del ácido nucleico diana, por ejemplo, por una ADN polimerasa o una transferasa terminal. Aún en otros modos de realización, los adaptadores y el ácido nucleico diana pueden adquirir extremos cohesivos por digestión con endonucleasas de restricción. La última opción es más ventajosa para las secuencias diana conocidas que se sabe que contienen el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se puede poner en contacto con una exonucleasa en las condiciones favorables para la retirada de uno o más nucleótidos de un extremo de una o ambas hebras del ácido nucleico diana, creando así extremos cohesivos. En algunos modos de realización, la digestión con exonucleasa de los extremos del ácido nucleico diana se puede controlar, por ejemplo, controlando el tiempo de digestión o a través de la incorporación de nucleótidos resistentes a exonucleasa. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se copia o amplifica usando un cebador que contiene uno o más nucleótidos de fosforotioato resistentes a exonucleasa. En un modo de realización, los extremos cohesivos se crean en el ácido nucleico diana por una combinación de una glucosilasa y una AP-liasa. En ese modo de realización, el ácido nucleico diana contiene un nucleótido adecuado para la escisión de base por la glucosilasa (por ejemplo, una base de desoxiuridina adecuada para su escisión por uracil-N-ADN-glucosilasa). En algunos modos de realización, la reacción de escisión de base está seguida de la ruptura térmica o enzimática de la cadena principal de fosfodiéster en el sitio abásico. En algunos modos de realización, la muestra se pone en contacto con endonucleasa VIII en las condiciones que favorecen la escisión endonucleolítica del sitio abásico. En otros modos de realización, el ADN con el sitio abásico se somete a degradación térmica. En algunos modos de realización, se pueden añadir potenciadores no enzimáticos de degradación térmica de ADN abásico, tales como compuestos de poliamina, véase la patente de EE. UU. n.° 8.669.061.
En cada uno de los modos de realización anteriores, la molécula de adaptador puede adquirir los extremos deseados (romos, extensión de base única o protuberancia de múltiples bases) a través del diseño y la síntesis in vitro de los oligonucleótidos adaptadores descritos adicionalmente a continuación.
En algunos modos de realización, se pueden requerir otras etapas enzimáticas para lograr la ligación. En algunos modos de realización, puede ser necesaria una polinucleótido cinasa para añadir 5'-fosfatos a una o ambas de las moléculas de ácido nucleico diana y moléculas de adaptador.
La presente invención comprende el uso de moléculas de adaptador que se van a ligar a uno o ambos extremos del ácido nucleico diana. En algunos aspectos que no pertenecen a la presente invención, el adaptador comprende dos hebras complementarias que forman una estructura bicatenaria. Por ejemplo, con referencia a la figura 3, un fragmento de a Dn bicatenario 122 que tiene una hebra positiva 122a y una hebra negativa 122b se puede desnaturalizar opcionalmente para proporcionar dos moléculas monocatenarias (es decir, la hebra positiva 122a y la hebra negativa 122b). Después de esto, el fragmento de ADN bicatenario 122 (o cada una de la hebra positiva 122a y la hebra negativa 122b) se puede combinar con un adaptador 124 (por ejemplo, por medio de ligación) para proporcionar la molécula circular bicatenaria 126. En un aspecto, cada hebra del adaptador 124 puede incluir un sitio de unión a cebador único 128 donde se va a iniciar la secuenciación.
Volviendo a la figura 4, en algunos modos de realización, un adaptador 130 tiene una estructura similar a cruz que incluye una primera hebra 130a y una segunda hebra 130b. Cada una de las hebras 130a y 130b puede adoptar una estructura secundaria de tallo-bucle 132 que comprende al menos una región bicatenaria 134 y al menos una región monocatenaria 136. La región bicatenaria 134 comprende una región de autocomplementariedad al menos parcial que garantiza la estabilidad de la estructura secundaria en las condiciones de reacción empleadas en el presente documento. En otro aspecto, los extremos de las hebras 130a y 130b pueden ser al menos parcialmente complementarios entre sí para proporcionar la estructura similar a cruz mostrada en la figura 4. Aún en otro aspecto, cada hebra del adaptador 130 puede incluir un sitio de unión a cebador único 138 donde se va a iniciar la secuenciación. En un ejemplo, el sitio de unión a cebador 138 se puede localizar dentro de la región monocatenaria 136 de la estructura de tallo-bucle 132. El adaptador 130 se puede combinar con un fragmento de ADN bicatenario 140 que tiene una hebra positiva 140a y una hebra negativa 140b para proporcionar la molécula bicatenaria 142.
En referencia a la figura 5, en algunos aspectos que no pertenecen a la presente invención, un adaptador 144 comprende dos hebras 144a y 144b que comparten al menos una región de complementariedad sustancial que forma al menos una región bicatenaria 146; y que tienen al menos una región de poca o ninguna complementariedad que forma al menos una región monocatenaria 148. En algunos modos de realización, el adaptador 144 está compuesto por dos hebras que forman una estructura que consiste en dos regiones bicatenarias 146 que flanquean una región monocatenaria 148. Como en el caso del adaptador 130 en la figura 4, cada hebra del adaptador 144 en la figura 5 puede incluir un sitio de unión a cebador único (no mostrado) donde se va a iniciar la secuenciación. En un ejemplo, el sitio de unión a cebador se puede localizar dentro de la región monocatenaria 148. El adaptador 144 se puede combinar con un fragmento de ADN bicatenario 150 que tiene una hebra positiva 150a y una hebra negativa 150b para proporcionar la molécula bicatenaria 152.
En algunos modos de realización, la región bicatenaria del adaptador se usa para la ligación a un ácido nucleico diana bicatenario o uno monocatenario. En otros modos de realización, la porción monocatenaria del adaptador se liga a un ácido nucleico diana bicatenario o uno monocatenario.
En algunos modos de realización, la ligación de ácidos nucleicos monocatenarios se realiza usando oligonucleótidos puente, véase, por ejemplo, la pub. de solicitud de EE. UU. n.° 20120003657. Por ejemplo, con referencia a la figura 2, un fragmento de ADN bicatenario 108 que tiene una hebra positiva 108a y una hebra negativa 108b se puede desnaturalizar para proporcionar dos moléculas monocatenarias. Después de esto, un primer oligonucleótido puente 110 que es complementario a los extremos 112 de la hebra positiva 108a se puede hibridar a la hebra positiva 108a seguido de ligación intramolecular de los extremos de la hebra positiva 108a para proporcionar un producto circularizado 114. De forma similar, un segundo oligonucleótido puente 116 que es complementario a los extremos 118 de la hebra negativa 108b se puede hibridar a la hebra negativa 108b seguido de ligación intramolecular de los extremos de la hebra negativa 108b para proporcionar un producto circularizado 120. En otros modos de realización, la ligación de ácidos nucleicos monocatenarios o ácidos nucleicos parcialmente monocatenarios se realiza usando regiones monocatenarias en los extremos 5' y 3' (protuberancias), véase, por ejemplo, la pub. de solicitud de EE. UU. n.° 20140193860.
En algunos modos de realización, el adaptador comprende uno o más códigos de barras: un ID de muestra múltiple (MID), un ID único (UID) o una combinación de un UID y un MID. En algunos modos de realización, se usa un código de barras único, como tanto UID como MID.
En algunos modos de realización, cada hebra del adaptador comprende un sitio de unión a cebador para un cebador universal, por ejemplo, un cebador de secuenciación universal. En algunos modos de realización, un sitio de unión a cebador se localiza en cada hebra en la porción monocatenaria de la molécula de adaptador (figuras 4, 5). En algunos modos de realización, un sitio de unión a cebador se localiza en cada hebra en la porción bicatenaria de la molécula de adaptador (figura 3). Los sitios de unión localizados en hebras separadas no son idénticos, es decir, cada hebra tiene un sitio de unión para un cebador diferente. En algunos modos de realización, solo una hebra del adaptador lleva un sitio de unión a cebador.
En algunos modos de realización, las moléculas de adaptador se ensamblan in vitro combinando dos oligonucleótidos artificiales sintetizados in vitro. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos son secuencias naturales sintetizadas in vitro que se sabe que poseen la estructura secundaria deseada. En algunos modos de realización, los oligonucleótidos son moléculas naturales aisladas o moléculas no naturales aisladas. En algunos modos de realización, la invención utiliza enzimas. Las enzimas incluyen una ADN polimerasa (incluyendo la polimerasa de secuenciación), una ADN ligasa, una polinucleótido cinasa, una transferasa terminal, opcionalmente uracil-N-ADN-glucosilasa, exonucleasa y endonucleasa, es decir, AP-liasa.
En algunos modos de realización, se secuencia la molécula de unión circular que contiene el ácido nucleico diana. El cebador universal se puede extender con una polimerasa de secuenciación determinando, de este modo, la secuencia del ácido nucleico diana bicatenario. En algunos modos de realización, la secuenciación es secuenciación por síntesis, incluyendo secuenciación de molécula única o cualquier secuenciación de ácidos nucleicos o derivados de ácido nucleico. La tecnología de secuenciación puede incluir el sistema PacBio® RS, un sistema de secuenciación por nanoporos o un sistema de secuenciación de reconocimiento de túnel o cualquier sistema de secuenciación donde la lectura continua de un molde sea posible y deseada. Cada hebra se secuencia independientemente. En algunos modos de realización, cada hebra se secuencia múltiples veces en una lectura única, por ejemplo, por replicación por círculo rodante.
En algunos modos de realización, los datos de secuenciación se corrigen para determinar errores usando códigos de barras presentes en los adaptadores. En algunos modos de realización, se usan ID moleculares únicos (UID) para eliminar errores de secuenciación presentes en algunas, pero no en todas las copias de la misma molécula original como se identifica por el UID. En algunos modos de realización, se usan UID para obtener una secuencia consenso usando datos de secuencia de ambas hebras de una molécula diana única como se identifica emparejando los dos UID presentes en el adaptador.
En algunos modos de realización, la ADN polimerasa posee actividad de desplazamiento de hebra y no tiene actividad 5'-3-exonucleasa. En algunos modos de realización, se usan la polimerasa de Phi29 y sus derivados. Véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.001.050, 5.576.204, 7.858.747 y 8.921.086.
En algunos modos de realización, la invención también utiliza una ADN ligasa. En algunos modos de realización, se usa ADN ligasa T4 o ADN ligasa de E. coli.
En algunos modos de realización, la invención también utiliza una ADN polimerasa independiente de molde, por ejemplo, una transferasa terminal. En algunos modos de realización, la invención usa una transferasa terminal de mamífero.
Ejemplos
Ejemplo 1 (profético). Preparación de moléculas de unión circulares usando un adaptador bicatenario En este experimento, se obtiene el ADN diana bicatenario. El ADN se fragmenta a un tamaño adecuado in vitro o se fragmenta de forma natural. Un adaptador es una molécula bicatenaria que comprende un sitio de unión a cebador en cada hebra. (Figura 3). El adaptador y las moléculas de ácido nucleico diana están presentes en una concentración relativa de 200/1, lo que favorece la ligación de un adaptador único a cada molde. Ambos extremos del ácido nucleico diana se rellenan y se vuelven romos por una ácido nucleico polimerasa. Opcionalmente, se añade un nucleótido único a los extremos 3' de la molécula de adaptador y se añade un nucleótido único complementario al ADN diana. Estas etapas se realizan usando el kit KAPA HyperPlus. (Kapa Biosystems, Wilmington, Mass). Se liga un adaptador único a cada ADN diana para crear una molécula de unión. Un cebador de secuenciación único es complementario al mismo sitio de unión a cebador en ambas hebras del adaptador o dos sitios de unión son diferentes y cada uno es complementario a uno de los dos cebadores. La secuenciación prosigue como se pretende por el fabricante del instrumento de secuenciación. Los datos de secuenciación se corrigen para determinar errores eliminando las variaciones de secuenciación presentes en algunas, pero no en todas las copias de la misma molécula original como se identifica por el UID. Los datos de secuenciación se corrigen además obteniendo una secuencia consenso usando datos de secuencia de ambas hebras de una molécula diana única como se identifica emparejando los dos UID presentes en el adaptador. Ejemplo 2 (profético). Preparación de moléculas de unión circulares usando un adaptador de tallo-bucle.
En este experimento, se obtiene el ADN diana bicatenario. El adaptador es una molécula bicatenaria que tiene dos regiones bicatenarias que flanquean una región monocatenaria, en la que cada hebra forma una estructura de tallo-bucle. (Figura 4). El adaptador y el ácido nucleico diana se procesan y ligan como se describe en el ejemplo 1. Se liga un adaptador único a cada ADN diana para crear una molécula de unión. Un cebador de secuenciación único es complementario al mismo sitio de unión a cebador en la porción de bucle de ambas hebras del adaptador o dos sitios de unión son diferentes y cada uno es complementario a uno de los dos cebadores. La secuenciación prosigue como se pretende por el fabricante del instrumento de secuenciación. Los datos de secuenciación se corrigen para determinar errores eliminando las variaciones de secuenciación presentes en algunas, pero no en todas las copias de la misma molécula original como se identifica por el UID. Los datos de secuenciación se corrigen además obteniendo una secuencia consenso usando datos de secuencia de ambas hebras de una molécula diana única como se identifica emparejando los dos UID presentes en el adaptador.
Ejemplo 3 (profético) Preparación de moléculas de unión circulares usando un adaptador parcialmente monocatenario.
En este experimento, se obtiene el ADN diana bicatenario. El adaptador es una molécula bicatenaria que tiene dos regiones bicatenarias que flanquean una región monocatenaria donde las hebras no se hibridan entre sí. (Figura 5). El adaptador y el ácido nucleico diana se procesan y ligan como se describe en el ejemplo 1. Se liga un adaptador único a cada ADN diana para crear una molécula de unión. Un cebador de secuenciación único es complementario al mismo sitio de unión a cebador en la porción no hibridada de ambas hebras del adaptador o dos sitios de unión son diferentes y cada uno es complementario a uno de los dos cebadores. La secuenciación prosigue como se pretende por el fabricante del instrumento de secuenciación.
Los datos de secuenciación se corrigen para determinar errores eliminando las variaciones de secuenciación presentes en algunas, pero no en todas las copias de la misma molécula original como se identifica por el UID. Los datos de secuenciación se corrigen además obteniendo una secuencia consenso usando datos de secuencia de ambas hebras de una molécula diana única como se identifica emparejando los dos UID presentes en el adaptador.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de preparación de un ácido nucleico diana para su secuenciación, que comprende (a) proporcionar una muestra que comprende el ácido nucleico diana;
(b) poner en contacto la muestra con una molécula de adaptador que comprende dos hebras, que forman al menos una región de doble hebra y al menos una región sin doble hebra, comprendiendo la región sin doble hebra al menos un sitio de unión a cebador universal;
(c) ligar la molécula de adaptador al ácido nucleico diana para formar una molécula de unión circular bicatenaria que comprende la región sin doble hebra con el al menos un sitio de unión a cebador universal, en el que el adaptador comprende dos regiones de doble hebra que flanquean al menos una estructura de tallo-bucle, comprendiendo cada estructura una región de tallo de doble hebra y una región de bucle sin doble hebra.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además
(d) poner en contacto la molécula de unión con una ADN polimerasa, que es preferentemente una polimerasa de desplazamiento de hebra y un cebador universal complementario al sitio de unión a cebador; (e) extender el cebador universal, determinando, de este modo, la secuencia del ácido nucleico diana por medio de secuenciación por síntesis.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que cada hebra del adaptador comprende un sitio de unión a cebador.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende, antes de la etapa b), una etapa de añadir de una manera independiente de molde, un nucleótido a los extremos 3' del ácido nucleico diana y un nucleótido complementario a los extremos 3' de la molécula de adaptador creando, de este modo, extremos cohesivos.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende, antes de la etapa b), una etapa de digerir el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una endonucleasa de restricción para generar extremos cohesivos compatibles.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende, antes de la etapa b), una etapa de digerir los extremos 3' del ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con una exonucleasa.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador contienen bases uracilo y el procedimiento comprende, antes de la etapa b), una etapa de poner en contacto el ácido nucleico diana y la molécula de adaptador con uracil-ADN-glucosilasa y endonucleasa VIII.
8. El procedimiento de la reivindicación 1-7, en el que el adaptador comprende uno o más códigos de barras, preferentemente un identificador único (UID), identificador múltiple (MID) o una combinación de los mismos.
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