CN111321201B

CN111321201B - 制备用于测序的核酸的方法及其应用

Info

Publication number: CN111321201B
Application number: CN201911373203.4A
Authority: CN
Inventors: 潘伟业; 王亚蕾; 杨新芳; 李艳秋; 张介中; 李志民; 李大为; 玄兆伶; 王海良; 王娟
Original assignee: Anouta Gene Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Anouta Gene Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN111321201A

Abstract

本发明公开了制备用于测序的核酸的方法及其应用，其中，制备用于测序的核酸的方法包括：提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；提供第二序列，所述第二序列包括：中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点；以及将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。

Description

制备用于测序的核酸的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及基因检测领域。

背景技术

Pacbio(PB)测序使用phi29进行基础改造，使测序酶的行进速度减慢，从而能从连续录像中得到更精确的碱基区分度，但这种改造也引入了更高的嘌呤-嘧啶的行进速度差异。聚合酶对嘌呤的偏好性是一个受到广泛报道的现象，而DNA双链的嘌呤-嘧啶的互补特性，引起了DNA双链上的嘌呤-嘧啶不平衡的特性。对于PB平台使用聚合酶实时连续合成的特性，必然会导致嘌呤-嘧啶不平衡的互补双链上聚合酶在一条链上运行较快，一条运行较慢，其差异取决于嘌呤-嘧啶的比例差异。PB使用的文库结构是SMRTbell结构，测序引物(聚合酶起始)区域位于接头单链环区。PB的操作规范，是用测序引物和SMRTbell环进行退火，再使聚合酶结合到测序引物结合区，这样基于SMRTbell的接头会结合在DNA双链分子的两端，从而避免不了有两个测序聚合酶落在一个测序分子上。基于聚合酶对嘌呤的偏好性，必然会导致在测序分子上的两个酶互相追赶，因为其中一个酶会固定在ZMW的底部，当两个酶接近的时候，会产生的结果有2种：1)同时产生两个荧光信号，这两种信号互相重叠干扰，影响有效信号的产出比例；2)置后酶分子顶开了前方的固定在ZMW上的酶分子，或前置分子限制了固定在ZMW上酶分子的速度，使运行速度变慢，增加DNA链脱落的概率，测序信号从而中止，影响了测序文库的结构。

由此，用于PB平台的测序文库的构建方法有待优化。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备用于测序的核酸的方法，在一端的接头上具有引物结合位点，使聚合酶只能结合到一端的接头上进行测序，文库结构好，测序数据产出量大。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备用于测序的核酸的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；提供第二序列，所述第二序列包括：中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点；以及将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。

根据本发明实施例的制备用于测序的核酸的方法，在一端的接头上具有引物结合位点，使聚合酶只能结合到一端的接头上进行测序，文库结构好，测序数据产出量大。

另外，根据本发明上述实施例的制备用于测序的核酸的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述接头段呈发夹型结构。

根据本发明的实施例，所述第一重组酶识别序列和所述第二重酶识别序列均选自下列序列的至少一种：LoxP位点序列、Lox66位点序列、Lox511位点序列、Lox2272位点序列、Lox2372位点序列、Lox5171位点序列、Loxm2位点序列、LoxFas位点和frt位点。

根据本发明的实施例，所述第一序列为环状序列。

根据本发明的实施例，所述第一序列含有单向第一重组酶识别序列。

根据本发明的实施例，所述第一序列含有双向第一重组酶识别序列。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：预处理，所述预处理包括：在所述靶序列进行末端修复和加碱基A处理；将处理后的序列与所述第一重组酶识别序列连接；将连接后的序列进行环化处理，以便得到所述第一序列。

根据本发明的实施例，所述处理后的序列的一端或两端与所述第一重组酶识别序列相连。

根据本发明的实施例，所述引物结合位点为通用引物结合位点。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于测序的核酸组合物。根据本发明的实施例，该组合物包括前述的用于测序的核酸。

根据本发明实施例的用于测序的核酸组合物，其中核酸在一端的接头上具有引物结合位点，使聚合酶只能结合到一端的接头上进行测序，文库结构好，测序数据产出量大。其中，需要说明的是，该组合物中用于测序的核酸具有前述用于测序的核酸的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。

根据本发明的实施例，该组合物进一步包括：具有链置换活性的核酸聚合酶。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了现有的SMRT bell文库的结构示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的SMRT bell文库的结构示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的测序数据产量示意图，其中，A为SMRTbell的两端接头均添加聚合酶的测序数据产量，B为SMRTbell的一端接头均添加聚合酶的测序数据产量；

图4显示了根据本发明一个实施例的文库结构示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的构建文库的流程示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的重组反应的流程示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的接头结构示意图，其中，A为PB公司官方的接头，B为发明人自行设计的接头；

图8显示了根据本发明一个实施例的聚合酶读长结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；

图9显示了根据本发明一个实施例的下机数据结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；

图10显示了根据本发明一个实施例的聚合酶读长结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；

图11显示了根据本发明一个实施例的下机数据结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；

图12显示了根据本发明一个实施例的HQ区域起始位点分布结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；

图13显示了根据本发明一个实施例的制备用于测序的核酸的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

目前PB官方构建的两端加有相同接头序列的SMRT bell文库，如图1所示，会出现两端都结合上测序酶情况，由于两个测序酶的行进速度不同，导致两个酶在一定时间内追赶上，进而导致测序酶读长低。发明人发现，通过改造SMRTbell的两段的接头结构，使两端接头都能结合上聚合酶的结构，变为如图2所示的只有一边能结合上测序引物-聚合酶的结构，从而使同时在测序分子上运行的酶只有一个，解决上述的测序酶冲突的问题，防止聚合酶过快进入低质量区或者过快掉下来，从而，能产生更高质量的数据和在链上维持更长的时间，从而提高整体的数据产出，发明人分别在SMRTbell的两端接头和一端接头添加聚合酶，在一个实施例中，数据产出量表1和如图3所示，一端添加聚合酶的数据产生量显著增加。

表1

	一端接头添加聚合酶	两端接头添加聚合酶
			聚合酶读长(平均值)	20805	18116
聚合酶读段N50	34491	32312
			下机序列长度(平均值)	19791	16068
下机序列N50	33589	28923

为了实现只在序列的一端添加聚合酶，发明人尝试了多种方法，发现以基因重组的方式，将靶序列重组至不对称的接头结构中，能高效地在靶序列两端添加不对称，从而仅在单端接头添加聚合酶。下面为了便于解释说明，以Cre-Lox重组系统为了，对该重组反应进行解释说明，在此需要说明的是，采用Cre-Lox重组系统为例，仅是便于说明的需要，适于本发明实施例的重组系统包括但不限于Cre-Lox重组系统。

Cre-Lox重组是一种用于在细胞DNA的特定位点上进行删除、插入、转座和倒位操作的位点特异性重组酶技术，自然界中特异性存在于P1噬菌体中，在P1噬菌体溶源期间，Cre-lox系统就会发挥功能：帮助环化线性的噬菌体DNA、分开复制后连结的两个质粒DNA分子使其平均分配到两个子细胞中，还可能作为备选的复制方式来维持质粒DNA的拷贝数。目前cre-lox系统主要用于神经生物学领域。

当一个基因组中含有loxP位点的细胞表达Cre蛋白时，DNA重组就可能会发生在loxP位点之间。loxP是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列。序列由8bp的不对称序列(决定了loxP序列的方向)，和不对称序列两边的两段13bp对称序列组成。在基因操作中loxP序列一般成对使用，被一对loxP序列包围的序列称为floxed序列。如果floxed序列两侧的loxP序列方向相同，floxed序列将会被删除；而如果两侧的loxP序列方向相反，floxed序列将会发生倒位。如果有另一段外源的floxed序列，两者可能发生重组。

参考图5和6，根据本发明的实施例，loxP的序列可以如下：

Lox71(LE site)sequence：TACCGTTCGTATANNNTANNNTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO：3)

Lox66(RE site)sequence：ATAACTTCGTATANNNTANNNTATACGAACGGTA(SEQ ID NO：4)

Lox66R sequence：ATGGCAAGCATATNNNATNNNATATGCTTCAATA(SEQ ID NO：5)

发明人使用突变的loxP序列，使重组反应单向进行达到稳定状态，组合cre重组酶使得三代建库大片段模板两端加上不对称的接头结构，构建单一结构文库，从而避免测序酶过快的掉下来，使其在链上维持更长时间，最大程度上提高整体数据产出。文库结构如图4所示，两端接头的结构不对称。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备用于测序的核酸的方法。根据本发明实施例的制备用于测序的核酸的方法，在一端的接头上具有引物结合位点，使聚合酶只能结合到一端的接头上进行测序，酶的读长更长，文库结构好，测序数据产出量大，质量更高。

参考图13，根据本发明的实施例，对制备用于测序的核酸的方法进行解释说明，该方法包括：

S100提供第一序列

根据本发明的实施例，提供第一序列，该第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列。由此，通过第一重组酶识别序列将第一序列插入到接头序列中。

环化后的核酸片段由于lox序列的存在产生了方向，经过重组酶切割lox序列得到了非对称末端，从而可与另外一段经过切割后存在非对称末端的序列完成重组，实现片段插入。进而，根据本发明的实施例，该第一序列为环状序列。

通常，靶序列为线性，需要对靶序列进行预处理，使其成为环状序列。根据本发明的实施例，该方法进一步包括：预处理。进一步地，根据本发明的实施例，该预处理包括：在靶序列进行末端修复和加碱基A处理；将处理后的序列与第一重组酶识别序列连接；将连接后的序列进行环化处理，得到第一序列。

其中，需要说明的是，参考图5，处理后的靶序列可能在一端与第一重组酶识别序列连接，也就是该第一序列含有单向第一重组酶识别序列；也可能在两端均与第一重组酶识别序列连接，也就是，该第一序列含有双向第一重组酶识别序列。由此，使单端加载第一重组酶识别序列的产物和双端加载第一重组酶识别序列的产物均能用于后续的重组反应，充分利用靶序列，避免靶序列的浪费。

S200提供第二序列

根据本发明的实施例，提供第二序列，该第二序列包括：中间段和两个接头段。根据本发明的实施例，该中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且该第一重组酶识别序列与第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列。根据本发明的实施例，该两个接头段分别位于中间段的端部，且每个接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点。由于第一重组酶识别序列与第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列，使第一序列的第一重组酶识别序列与第二序列的第二重酶识别序列能够进行重组反应，并且第二序列包含两个不对称的接头，避免两端接头均可以结合上聚合酶。

根据本发明的实施例，PB公司的三代测序通常采用的接头为发夹型结构，由此该接头段也呈发夹型结构。

根据本发明的实施例，该第一重组酶识别序列和该第二重酶识别序列均选自下列序列的至少一种：LoxP位点序列、Lox66位点序列、Lox511位点序列、Lox2272位点序列、Lox2372位点序列、Lox5171位点序列、Loxm2位点序列、LoxFas位点和frt位点。

根据本发明的实施例，该引物结合位点为通用引物结合位点。

S300重组反应

参考图6，根据本发明的实施例，将第一序列和第二序列接触，进行重组反应，获得所述用于测序的核酸，该用于测序的核酸含有所述靶序列。由此，通过第一序列的第一重组酶识别序列与第二序列的第二重酶识别序列进行重组反应，使第一序列重组至第二序列上，而第二序列包含两个不对称的接头，从而，在第一序列两端加载上不对称的接头，使仅有一端接头可以结合上聚合酶。

根据本发明的实施例，该组合物进一步包括：具有链置换活性的核酸聚合酶。由此，该聚合酶适于用于PacBio测序平台。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Pacific公司。

实施例1

1、利用本发明实施例的方法构建测序文库，方法如下：

(1)取8μg提取的小鼠肺基因组DNA，酶切打断成30-40K的大片段，进行末端修复及加A处理，反应试剂包括T4 DNAP、T4 PNK、HemoklenTaq及通用缓冲液。

(2)基因组末端修复产物与偶联黏性末端的lox66序列连接，反应试剂包扩T4 DNA连接酶及Transformer缓冲液。

(3)将连接产物利用Ampure纯化磁珠进行纯化，得到纯化后的产物。

(4)连接产物UDG切割及环化，试剂包含但不限于T4 DNA连接酶、UDG酶及配套缓冲液。

(5)消化，试剂包括T4外切酶7及配套缓冲液。

(6)消化产物与hetero-adapter位点特异性重组，试剂包含但不限于Cre重组酶及配套缓冲液。

(7)片段筛选，得到重组后两端连接有不对称接头的测序上机样本1，其中，两端接头的序列和结构如图7所示，其中一端为PB官方接头，一端为自行设计的接头，接头序列如下所示：

PB官方接头序列：

5'-ATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT-3'(SEQ ID NO：1)

新合成接头序列：

5'-ATCTCTCTCATTCAACAACAAAAAACAGAAGAAGTAGAGAGAGAT-3'(SEQ ID NO：2)

2、利用PB建库流程构建测序文库，方法如下：

(1)酶切打断：

取8μg提取的小鼠肺基因组DNA，酶切打断成30-40K的大片段，使用PB磁珠纯化后进行文库构建。

(2)文库构建：

文库构建步骤详见PB建库流程《Procedure&Checklist-Preparing gDNALibraries Using the

Express Template Preparation Kit 2.0》。

接头连接步骤中使用PB公司的官方接头。

(3)文库片段筛选：

利用BluePippin进行片段筛选：0.75％MarkerU1；筛选范围：40K-80K，得到上机样本2。

(4)文库质检：

文库稀释后,使用Qubit检测文库浓度，使用Agilent 4200检测文库大小。

3、上机测序

分别将步骤“1”的样本1和步骤“2”的样本2上sequelⅡ平台进行测序，测序数据

质量如下所示：

表2：

由表2和图8和9文库质控数据分析可得，与对照组(样品2)相比，样品1的酶读长、subreads分布均优于样品2(PB)，说明核酸序列通过不对称接头单端添加聚合酶能够提高酶读长，产生更高质量的数据。

实施例2

1、利用本发明实施例的方法构建测序文库，方法如下：

(1)取8ug提取的小鼠肺基因组DNA，酶切打断成10-15K的大片段，进行末端修复及加A处理，反应试剂包括T4 DNAP、T4 PNK、HemoklenTaq及通用缓冲液。

(2)基因组末端修复产物与藕连黏性末端的lox66序列连接，反应试剂包扩T4 DNA连接酶及Transformer缓冲液。

(5)消化，反应试剂包括T4外切酶7及配套缓冲液。

(6)消化产物与hetero-adapter位点特异性重组，试剂包含但不限于Cre重组酶及配套缓冲液，得到重组后两端连接有不对称接头的测序上机样本1，其中，两端接头的序列和结构如图6所示。

(7)片段筛选，利用Sage ELF进行10-15kb片段筛选：0.75％1-18kb v2；取筛选后10-13K样品进行纯化，得到样品1。

(8)文库质检，文库稀释后，使用Qubit检测文库浓度，使用Agilent 4200检测文库大小。

2、利用PB建库流程构建测序文库，方法如下：

(1)酶切打断：

取8ug提取的小鼠肺基因组DNA，酶切打断成30-40K的大片段，使用PB磁珠纯化后进行文库构建。

(2)文库构建：

文库构建步骤详见PB建库流程《Procedure&Checklist-Preparing HiFi

Libraries using SMRTbell Template Prep Kit 1.0》，接头连接步骤中使用PB提供的接头。

(3)文库片段筛选：

利用Sage ELF进行10-15kb片段筛选：0.75％1-18kb v2；取筛选后10-13K样品进行纯化，得到样品2。

(4)文库质检：

文库稀释后，使用Qubit检测文库浓度，使用Agilent 4200检测文库大小。

3、上机测序：

根据文库大小，确定样品1和2的上机浓度后，经AB操作后在上sequelⅡ平台上测序，结果如下：

综合表3及图10-12库质控数据分析可得，与对照组(样品2)相比，样品1的酶读长、subreads均提高，说明两端连接有不同接头序列的新结构HIFI文库能够提高酶读长，且高质量HQ station提前了，能够提高数据产出。

表3：不同类型接头构建的HIFI文库测序质控结果

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司

<120> 制备用于测序的核酸的方法及其应用

<130> 1913

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PB接头

<400> 1

atctctctct tttcctcctc ctccgttgtt gttgttgttg agagagat 48

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 新合成接头

<400> 2

atctctctca ttcaacaaca aaaaacagaa gaagtagaga gagat 45

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lox71

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

taccgttcgt atannntann ntatacgaag ttat 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lox66

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

ataacttcgt atannntann ntatacgaac ggta 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lox66R

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

atggcaagca tatnnnatnn natatgcttc aata 34

Claims

1.一种制备用于测序的核酸的方法，其特征在于，包括：

提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；

提供第二序列，所述第二序列包括：

中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；

两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，所述接头段呈发夹型结构，且其中仅一个接头段含有至少一个引物结合位点，即提供两个不对称的接头段，以便只在含有至少一个引物结合位点的接头段添加一个聚合酶；以及

将所述靶序列与所述第一重组酶识别序列连接，以便得到所述第一序列，所述靶序列的一端或两端与所述第一重组酶识别序列相连；

将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一重组酶识别序列和所述第二重酶识别序列均选自下列序列的至少一种：LoxP位点序列、Lox66位点序列、Lox511位点序列、Lox2272位点序列、Lox2372位点序列、Lox5171位点序列、Loxm2位点序列、LoxFas位点和frt位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一序列为环状序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：预处理，所述预处理包括:

在所述靶序列进行末端修复和加碱基A处理；

将处理后的序列与所述第一重组酶识别序列连接；以及

将连接后的序列进行环化处理，以便得到所述第一序列。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述处理后的序列的一端或两端与所述第一重组酶识别序列相连。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一序列含有双向第一重组酶识别序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一序列含有单向第一重组酶识别序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物结合位点为通用引物结合位点。