CN109957605A - 适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体涉及一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，包括如下步骤：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复；4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机测序。该方法可有效去除海洋软体动物体内所含杂质，可以显著提高PacBio测序聚合酶读长和数据产量。

Description

适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序 方法

技术领域

本发明涉及高通量测序文库构建领域，更具体地，涉及一种适用于PacBio 测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法。

背景技术

PacBio平台(PacBio核酸测序平台)采用的是单分子实时测序(Single MoleculeReal-Time)。PacBio平台的测序基于两个关键技术，第一，Pacific Biosciences公司发明的一种直径只有几十纳米的纳米孔，该纳米孔内只能容许 单分子核酸在DNA聚合酶作用下进行反应，检测纳米孔中合成过程的A、T、C、 G这四种荧光标记的脱氧核苷酸，即可实现核酸测序；第二，利用共聚焦显微 镜实时、快速地对集成在SMRT cell上的无数的纳米孔同时进行记录。PacBio 核酸测序平台，其平均读长可达10-20k，且测序不受AT和CG含量的影响，能 够对高GC含量或低GC含量的区域进行测序，相比二代测序有较大优势。

海洋动物与软体动物使用目前常规的PacBio基因组建库测序效果很差。海 洋软体动物体内含有一些杂质(比如有的物种蛋白含量高、有的物种糖分含量 高)影响了建库测序过程中酶的活性，从而造成PacBio Sequel测序过程中聚合 酶读长短和数据产出低的现象。现有技术中主要是在DNA提取时进行纯化去除 杂质。纯化方法主要是磁珠纯化和试剂盒纯化，磁珠纯化方便快捷但无法完全 去除海洋软体动物的杂质；目前市面上试剂盒大部分是针对二代小片段文库的， 会影响DNA片段的完整性，因此，使用试剂盒纯化回收率低、效果也不佳。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于PacBio测序平 台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，该方法可有效去除海洋软体动物体 内所含杂质，可以显著提高PacBio测序聚合酶读长和数据产量。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，包括如 下步骤：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行 核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复； 4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接 头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII 双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA 损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机 测序。

进一步地，所述切胶纯化的回收范围为5-50kb。

进一步地，所述加接头处理中，接头序列如为Seq ID No.1所示。

本发明的第二个目的在于提出一种用于PacBio测序平台的海洋动物与软体 动物文库构建试剂盒，包括：1)为ExoVII酶处理试剂，由ExoVII酶和ExoVII酶 切反应缓冲液组成；2)DNA损伤修复试剂，包括DNA损伤修复酶及其反应缓冲 液；3)末端修复处理试剂，包括DNA聚合酶及其反应缓冲液；4)加接头处理 试剂，包括连接酶、接头核酸片段、连接酶反应缓冲液；5)双酶切处理试剂， 由ExoIII酶和双酶切缓冲液组成；所述试剂盒还包括用于切胶纯化的核酸片段回 收系统。

进一步地，所述切胶纯化的回收范围为5-50kb。

进一步地，所述试剂盒还包括磁珠纯化试剂，包括磁珠溶液、清洗溶液、 洗脱液。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的方法针对因海洋软体动物含杂质量高而造成PacBio Sequel测序过 程中聚合酶读长短和数据产出低的问题，在建库过程中，在DNA打断与核酸外 切酶VII消化之间增加一步Blue Pippin切胶纯化DNA，可以有效去除海洋软体 动物所含的杂质，减少杂质对酶活性的干扰，显著提高PacBio Sequel测序聚合 酶读长和数据产量。

附图说明

图1为本发明的适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序 流程图。

图2为实施例1中海虾pacbio基因组20kb文库建库方法建库的文库检测结 果示意图.

图3为实施例1中海虾样品采用本发明的方法建库的文库检测结果示意图。

图4为实施例2中螺样1pacbio基因组20kb文库建库方法建库的文库检测 结果示意图.

图5为实施例2中螺样1采用本发明的方法建库的文库检测结果示意图。

图6为实施例2中螺样2pacbio基因组20kb文库建库方法建库的文库检测 结果示意图。

图7为实施例2中螺样2采用本发明的方法建库的文库检测结果示意图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明 的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所 有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

本发明针对因海洋软体动物含杂质量高而造成PacBio Sequel测序过程中聚 合酶读长短和数据产出低的问题，设计了一种适用于PacBio测序平台的海洋动 物与软体动物的建库测序方法，在DNA打断与核酸外切酶VII消化之间增加一 步Blue Pippin切胶纯化DNA，从而去除海洋软体动物所含的杂质，减少杂质对 酶活性的干扰。

具体地如图1所示，该方法是通过以下步骤实现的：

1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核 酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复； 4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接 头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII 双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA 损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上 机测序。

实施例1：

本实施例以海洋虾样本为例，提供一种适用于PacBio测序平台的海洋动物 与软体动物的建库方法(同时以海虾的pacbio基因组20kb文库建库方法作为对 比实验)，具体实验过程如下：

1.基因组DNA样本的打断

基因组DNA的打断使用gTube进行，具体操作流程如下：

1)取10μg的基因组DNA，使用无核酸酶水稀释至150μL，加入至gTube管中；

2)放置于Eppendorf 5424离心机上，使用3000rpm的速度，将基因组样本打 断至20KB；

3)使用0.45X AMPure PB磁珠进行纯化，最后使用30μL无核酸酶水洗脱。

2.Blue Pippin切胶回收

打断后的样本使用Blue Pippin进行切胶回收，具体操作流程如下：

1)选择“0.75％，DF Marker S1high-pass 5-10kb”程序进行片段回收；

2)回收范围设定为5-50kb；

3)回收产物使用1X AMPure PB磁珠进行纯化，最后使用38μL Elution Buffer 洗脱。

3.核酸外切酶VII消化

按表1所示配制反应体系，充分混匀，短暂离心后，放入Thermomixer中， 37℃温浴15min后置于冰上，完成ExoVII酶处理。

表1核酸外切酶VII消化反应体系

4.DNA损伤修复

按表2所示配制反应体系，充分混匀，瞬时离心，37℃孵育30min，置于冰 上。

表2DNA损伤修复反应体系

5.末端修复

1)按表3所示配制反应体系，充分混匀，瞬时离心，25℃孵育5min；

表3末端修复反应体系

2)使用0.45X AMPure PB磁珠进行纯化，最后使用23μL Elution Buffer洗 脱。

6.连接接头

预先从-20℃保存的试剂盒中，取出模板预制缓冲液、带标签序列的接头和 ATP，于室温解冻，并充分震荡混匀并离心备用；

根据表4配制反应体系，充分混匀，瞬时离心，25℃孵育过夜，65℃孵育10min 使连接酶失活。

表4

7.核酸外切酶消化

1)按表5所示体系配置反应：

表5

2)充分混匀，瞬时离心，37℃孵育1h；

3)使用0.45X AMPure PB磁珠进行纯化，最后使用30μL Elution Buffer洗脱。

8.Blue Pippin二次筛选目的片段

上步纯化后样本使用Blue Pippin进行筛选目的片段，具体操作流程如下：

2)选择“0.75％，DF Marker S1high-pass 5-10kb”程序进行片段回收；

2)依据2100检测的样品片段大小确定起始回收范围，要求起始回收片段 必须小于2100检测主峰大小；

3)回收产物使用1X AMPure PB磁珠进行纯化，最后使用37μL Elution Buffer 洗脱。

9.DNA二次损伤修复

1)按表6所示配置反应体系：

表6

2)充分混匀，瞬时离心，37℃孵育30min，置于冰上；

3)使用1X的AMPure PB磁珠进行纯化，最后使用12μL Elution Buffer洗 脱，12μL洗脱液即为构建好的文库。

10.文库质检

取1μL文库，稀释5倍，取2μL稀释液进行Qubit定量，计算文库浓度； 取1μL稀释液进行Agilent 2100检测，确定文库大小。

结果显示，采用本发明的方法构建的海虾DNA样品的文库的Qubit定量结果 为12.9ng/μL，pacbio基因组20kb文库建库方法构建的海虾DNA样品的文库的 Qubit定量结果为10.7ng/μL；pacbio基因组20kb文库建库方法和本发明的方法对 应的海虾FA检测图分别为图2和图3。采用两种方法构建的文库从文库检测结果 上未见明显差异。

11.上机测序

按照PacBio测序的操作说明进行上机测序。

表7

	数据量Gb	聚合酶读长bp
			实施例1的方法建库	4.84	8839
对比实验	0.74	9219

从表7可以看出，本发明的方法增加Blue Pippin纯化可以有效改善海洋动 物和软体动物的测序效果，数据量和聚合酶酶读长都显著增长。

实施例2：

本实施例以2份螺样本为例，提供一种适用于PacBio测序平台的海洋动物 与软体动物的建库方法(同时以螺的pacbio基因组20kb文库建库方法作为对比 实验)，具体实验过程同实施例1。

1、文库质检

取1μL文库，稀释5倍，取2μL稀释液进行Qubit定量，计算文库浓度；取1μL 稀释液进行Agilent 2100检测，确定文库大小。

结果显示，采用发明的方法构建的两份螺DNA样品的文库Qubit定量结果分 别为21.4ng/μL和15.5ng/μL，pacbio基因组20kb文库建库方法构建的两份螺DNA 样品的文库Qubit定量结果分别为75ng/μL和9.8ng/μL；pacbio基因组20kb文库建 库方法和本发明的方法对应的第一份螺样品FA检测图分别为图4和图5，pacbio 基因组20kb文库建库方法和本发明的方法对应的第二份螺样品FA检测图分别为 图6和图7。图上显示采用两种方法构建的文库从文库检测结果上未见明显差异。

2、上机测序

按照PacBio测序的操作说明进行上机测序。

表8

从表8可以看出，本发明的方法增加Blue Pippin纯化可以有效改善海洋动 物和软体动物的测序效果，数据量和聚合酶酶读长都显著增长。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。

Claims (6)

1.一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对打断的DNA大片段进行切胶纯化；2)对纯化的DNA大片段进行核酸外切酶VII消化；3)对核酸外切酶VII消化产物进行第一次DNA损伤修复；4)对第一次DNA损伤修复的产物进行末端修复处理和加接头处理；5)对加接头的产物进行外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理；6)对外切酶ExoIII和ExoVII双酶切处理的产物进行二次筛选目的片段；7)对二次筛选产物进行第二次DNA损伤修复，即获得适用于Pacbio平台的DNA大片段文库；8)文库质检；9)上机测序。

2.根据权利要求1所述的一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，其特征在于，所述切胶纯化的回收范围为5-50kb。

3.根据权利要求1所述的一种适用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物的建库测序方法，其特征在于，所述加接头处理中，接头序列如为Seq ID No.1所示。

4.一种用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物文库构建试剂盒，包括：1)为ExoVII酶处理试剂，由ExoVII酶和ExoVII酶切反应缓冲液组成；2)DNA损伤修复试剂，包括DNA损伤修复酶及其反应缓冲液；3)末端修复处理试剂，包括DNA聚合酶及其反应缓冲液；4)加接头处理试剂，包括连接酶、接头核酸片段、连接酶反应缓冲液；5)双酶切处理试剂，由ExoIII酶和双酶切缓冲液组成；其特征在于，所述试剂盒还包括用于切胶纯化的核酸片段回收系统。

5.根据权利要求4所述的一种用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物文库构建试剂盒，其特征在于，所述切胶纯化的回收范围为5-50kb。

6.根据权利要求4所述的一种用于PacBio测序平台的海洋动物与软体动物文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磁珠纯化试剂，包括磁珠溶液、清洗溶液、洗脱液。