JP2009521227A - ヌクレオチドアナログ組込み用ポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本願は先行予備特許出願USSN60/753,670(出願日2005年12月22日、発明の名称「ヌクレオチドアナログ組込み用ポリメラーゼ(POLYMERASES FOR NUCLEOTIDE ANALOGUE INCORPORATION)」、発明者David K.Hanzelら)の優先権と特典を主張し、言及によりその開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
本発明の一部はNHGRI助成番号R01 HG003710−01として米国政府助成下に創出され、米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
本発明は活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入を改善し、活性部位領域でヌクレオチドアナログと配位するための特徴をもつポリメラーゼに関する。前記ポリメラーゼの作製方法、シーケンシングとDNA複製及び増幅における前記ポリメラーゼの使用方法、ポリメラーゼ活性の反応速度モデル、並びに前記モデルを使用するコンピューター実施方法も記載する。
Hubscherら(2002)EUKARYOTIC DNA POLYMERASES Annual Review of Biochemistry Vol.71:133−163 Steitz(1999)"DNA polymerases:structural diversity and common mechanisms"J Biol Chem 274:17395−17398 Alba(2001)"Protein Family Review:Replicative DNA Polymerases"Genome Biology 2(1):reviews 3002.1−3002.4 Burgersら(2001)"Eukaryotic DNA polymerases:proposal for a revised nomenclature"J Biol Chem.276(47):43487−90 Gillerら(2003)"Incorporation of reporter molecule−labeled nucleotides by DNA polymerases.I.Chemical synthesis of various reporter group−labeled 2’−deoxyribonucleoside−5’−triphosphates"Nucleic Acids Res.31(10):2630−2635 Augustinら(2001)"Progress towards single−molecule sequencing:enzymatic synthesis of nucleotide−specifically labeled DNA"J.Biotechnol.,86:289−301 Tononら(2000)"Spectral karyotyping combined with locus−specific FISH simultaneously defines genes and chromosomes involved in chromosomal translocations"Genes Chromosom.Cancer 27:418−423 Zhu and Waggoner(1997)"Molecular mechanism controlling the incorporation of fluorescent nucleotides into DNA by PCR."Cytometry,28:206−211 Yuら(1994)"Cyanine dye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes"Nucleic Acids Res.,22:3226−3232 Zhuら(1994)"Directly labeled DNA probes using fluorescent nucleotides with different length linkers."Nucleic Acids Res.22:3418−3422 Riedら(1992)"Simultaneous visualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy"Proc.Natl Acad.Sci.USA,89:1388−1392 Gardnerら(2004)"Comparative Kinetics of Nucleotide Analog Incorporation by Vent DNA Polymerase"J.Biol.Chem.,279(12),11834−11842 Gardner and Jack "Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase"Nucleic Acids Research,27(12)2545−2553
各種技術は実験結果を観測するためにラベルの核酸組込みに依存している。例えば、シーケンシング、核酸増幅及びニック翻訳反応の結果はいずれも一般に産物核酸を標識することによりモニターされる。これは例えば標識プローブを産物核酸と結合することにより、ラベルを産物核酸と共有又は非共有的に結合させることにより実施することが多い。他のアプローチでは、産物核酸の合成中にヌクレオチドアナログを産物核酸に組込む。これは一般に例えば組込み法や、所定のリアルタイムPCR(RT−PCR)及びリアルタイムLCR反応(RT−LCR)によりシーケンシングで実施される。アナログに付加したラベルはDNAに組込んでもよいし、ポリメラーゼの作用により放出してもよい。アナログ残基の産物核酸組込みをモニターするようにラベルの組込み又は放出をモニターすることができる。
活性部位への立体導入妨害の軽減又はアナログに相補的な特徴の付加によりヌクレオチドアナログと相互作用するように改変可能なDNAポリメラーゼは一般に入手可能である。DNAポリメラーゼは比較的最近になって各種系統発生関係に基づいて6つの主要なグループに分類されており、例えば大腸菌Pol I(クラスA)、大腸菌Pol II(クラスB)、大腸菌Pol III(クラスC)、ユリアーキオータPol II(クラスD)、ヒトPolβ(クラスX)、並びに大腸菌UmuC/DinB及び真核RAD30/色素性乾皮症変異体(クラスY)に分類される。最近の命名法の概要については、例えばBurgersら(2001)“Eukaryotic DNA polymerases:proposal for a revised nomenclature”J Biol Chem.276(47):43487−90参照。ポリメラーゼの概要については、例えばHubscherら(2002)EUKARYOTIC DNA POLYMERASES Annual Review of Biochemistry Vol.71:133−163;Alba(2001)“Protein Family Review:Replicative DNA Polymerases”Genome Biology 2(1):reviews 3002.1−3002.4;及びSteitz(1999)“DNA polymerases:structural diversity and common mechanisms”J Biol Chem 274:17395−17398参照。多数のポリメラーゼの基本作用メカニズムが決定されている。文字通り数百種のポリメラーゼの配列が公共入手可能であり、これらの多くのものの結晶構造が決定されており、あるいは相同ポリメラーゼについて解明された結晶構造との類似性に基づいて推測することができる。例えば、Φ29の結晶構造が入手可能である。
上記のように、本発明の各種ポリメラーゼは成長中のオリゴヌクレオチド鎖に1個以上のヌクレオチドアナログを組込むことができる。組込み後、アナログは成長中のオリゴヌクレオチドに含まれる天然ヌクレオチドと同一又は異なる残基を放出することができる(ポリメラーゼはアナログの任意非標準部分を組込むことができ、又はオリゴヌクレオチドへの組込み中にこれを開裂することができる)。本明細書において「ヌクレオチドアナログ」とは、特定用途で天然ヌクレオシド三リン酸(「ヌクレオチド」)と類似又は同様の方法で機能する化合物であり、それ以外には特定構造を意味しない。ヌクレオチドアナログは標準天然ヌクレオチド以外、即ちA、G、C、T、又はU以外のアナログであるが、オリゴヌクレオチドに組込まれると、オリゴヌクレオチド中に得られる残基はA、G、C、T又はU残基と同一になる(又は異なる)場合がある。
立体障害特徴を軽減するため及び/又は相補性特徴を付加するためのDNAポリメラーゼの改変
改変活性部位領域をもつ組換えポリメラーゼを作製するための突然変異誘発候補としてアミノ酸残基を簡便に同定するためにはポリメラーゼの構造データを使用することができる。例えば、ポリメラーゼの三次元構造分析により、天然ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又はそのアナログによる活性部位への接近を立体的に妨害する残基あるいは例えば電荷、疎水性、サイズ等の付加又は改変により、アナログの非天然特徴に相補的な特徴を導入するように突然変異させることが可能な残基を同定することができる。
例えば上記のようなポリメラーゼモデル及びモデル予想に従って、例えば相補性特徴を含む変異体を作製するように又は立体障害特徴を軽減するようにポリメラーゼを改変するために、本発明では場合により各種突然変異誘発法を使用する。一般に、このような突然変異体を作製するためには入手可能な任意突然変異誘発法を使用することができる。このような突然変異誘発法は場合により1種以上の該当活性(例えばヌクレオチドアナログに対するKm、Vmax、kcat等)について突然変異体核酸及びポリペプチドを選択する段階を含む。使用可能な方法としては限定されないが、部位特異的点突然変異誘発法、ランダム点突然変異誘発法、in vitro又はin vivo相同組換え法(DNAシャフリング)、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発法、ギャップ入り2本鎖DNAを使用する突然変異誘発法、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発法、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発法、全遺伝子合成による突然変異誘発法、縮重PCR法、2本鎖切断修復、及び当業者に公知の他の多くの方法が挙げられる。
ヌクレオチドアナログに対するポリメラーゼの活性が第1のDNAポリメラーゼ(例えば組換えポリメラーゼの誘導元である対応する野生型ポリメラーゼ)に比較して改変されているか否かを判定するために本発明のポリメラーゼをスクリーニング又は他の方法で試験することができる。例えば、ヌクレオチドアナログに対する組換えDNAポリメラーゼのkcat、Km、Vmax、kcat/Km、Vmax/Km、kpol、及び/又はKdを測定することができる。更に、天然ヌクレオチドに対する組換えDNAポリメラーゼのkcat、Km、Vmax、Vmax/Km、kcat/Km、kpol、及び/又はKdも測定することができる(例えばポリメラーゼはアナログ及び天然ヌクレオチド両者の組込み活性を含むことが望ましい)。
ヌクレオチドアナログに対するポリメラーゼの活性が第1のDNAポリメラーゼに比較して改変されているか否かを判定するためにはスクリーニング又は他のプロトコールを使用することができる。例えば、上記のようにヌクレオチドアナログに対する組換えDNAポリメラーゼのkcat、Km、Vmax、又はkcat/Kmを測定することができる。更に、天然ヌクレオチドに対する組換えDNAポリメラーゼのkcat、Km、Vmax、又はkcat/Kmも測定することができる(例えばポリメラーゼはアナログ及び天然ヌクレオチド両者の組込み活性を含むことが望ましい)。
本発明のポリメラーゼは用途に応じて天然又はヌクレオチドアナログに対する各種改変特性の任意のものを含むことができ、速度増加、組込まれた塩基の保持時間増加(又は速度低下)、プロセッシビティ増加等が挙げられる。例えば、より高レベルのヌクレオチドアナログ組込みが所望される場合には、所与ヌクレオチドアナログに対する対応する相同野生型ポリメラーゼよりもKmが低く、Vmaxが高く、及び/又はkcatが高くなるように本発明のポリメラーゼを選択する。所定態様では、(例えば組込みをモニターするために使用される装置の解像度に応じて)ポリメラーゼの総ヌクレオチド組込み速度を増減すること、又はプロセッシビティ、特異性等を改善することが望ましい。所定態様では、組換えポリメラーゼは対応する相同野生型ポリメラーゼに比較してヌクレオチドアナログの結合速度が増加、産物放出速度が増加、及び/又は分岐速度が低下している。本発明のポリメラーゼを選択するにはこれらの特徴の任意のものについてスクリーニングすることができる。
本明細書には改変活性部位領域の多数の特定例を記載する。「活性部位領域」は折り畳まれたポリメラーゼの三次元構造の活性部位を含むか又はその近位(例えば活性部位から約2nm以内)のポリメラーゼの部分である。本明細書にはΦ29DNAポリメラーゼの活性部位内又はその近位の構造改変の特定例を記載する。例えば、野生型Φ29DNAポリメラーゼに対して、これらの改変としてはΔ505−525の欠失、Δ505−525ドメイン内の欠失、K135A突然変異、(例えば本明細書に記載する別の突然変異と組み合わせた)L384R突然変異、E375H突然変異、E375S突然変異、E375K突然変異、E375R突然変異、E375A突然変異、E375Q突然変異、E375W突然変異、E375Y突然変異、E375F突然変異、E486A突然変異、E486D突然変異、K512A突然変異、表8に示す突然変異、及びその組み合わせの任意のものが挙げられる。例えば、ポリメラーゼは表8の組み合わせリストから選択される突然変異の組み合わせを含むことができる。
組換えDNAポリメラーゼは場合によりポリメラーゼに対して外来又は異種の他の特徴を含む。例えば、組換えポリメラーゼは場合により1個以上の外来アフィニティータグ(例えば6Hisタグ配列、GSTタグ、HAタグ配列、複数の6Hisタグ配列、複数のGSTタグ、複数のHAタグ配列、SNAPタグ等の精製又は基質結合タグ)を含む。例えばポリメラーゼを表面に結合する際にポリメラーゼ活性部位を方向付けるため及び/又は保護するために、これらの特徴及びポリメラーゼと表面の結合に関して有用な他の特徴を場合により付加する。他の有用な特徴としては、酵素の組換え二量体ドメインや、例えば活性部位に遠位のポリメラーゼと結合した大型の外部ポリペプチドドメインが挙げられる。例えば、Φ29では、活性部位は蛋白質のC末端領域に位置するので、付加表面結合エレメント(付加ドメイン、Hisタグ等)はポリメラーゼを表面に結合する際に活性部位を妨害しないように一般にN末端領域に配置される。
場合により鋳型核酸を複製するために、本発明のポリメラーゼと、天然及び/又はヌクレオチドアナログと、核酸鋳型(DNA又はRNA)を使用する。即ち、ポリメラーゼがプライマーを鋳型依存的に伸長するように、ポリメラーゼと、ヌクレオチドアナログと、場合により天然ヌクレオチド及び他の試薬と、鋳型と、複製開始部分の混合物を反応させる。複製開始部分は標準オリゴヌクレオチドプライマー、あるいは鋳型の成分とすることができ、例えば鋳型は自己プライミング1本鎖DNA、ニック入り2本鎖DNA等とすることができる。同様に、末端蛋白質を開始部分として使用することもできる。少なくとも1個のヌクレオチドアナログをDNAに組込むことができる。鋳型DNAは線状又は環状DNAとすることができ、所定用途では、環状鋳型が望ましい(例えばローリングサークル型複製や環状鋳型のシーケンシング)。場合により、組成物は自動DNA複製及び/又はシーケンシングシステムで利用することができる。
一般に、本発明のポリメラーゼをコードする核酸はクローニング、組換え、in vitro合成、in vitro増幅及び/又は他の利用可能な方法により作製することができる。本発明のポリメラーゼ(特定理論に結び付けるものではないが、例えば本発明のヌクレオチドアナログの立体障害を軽減するか、及び/又は相補性特徴を含む突然変異体ポリメラーゼ)をコードする発現ベクターを発現させるためには各種組換え法を使用することができる。核酸作製、発現及び発現産物の単離のための組換え法は例えばSambrook、Ausubel及びInnisに記載されている。
本発明は例えばシーケンシング、核酸増幅等の用途のために例えば1種以上のヌクレオチドアナログと共に本発明のポリメラーゼを含むキットも提供する。このようなキットはポリメラーゼの使用を可能にする方法でパッケージングされた本発明のポリメラーゼと、本発明の各種ヌクレオチドアナログ(例えばA、T、G、及びCに類似するヌクレオチドアナログ)のセットを含むことができ、例えばアナログの少なくとも1個は検出可能な部分をもち、好ましい側面では2個以上の検出可能な部分をもち、多くの場合には、場合により他のアナログの存在下で同定できるように、各々が検出可能な異なる標識基をもつ。所望用途に応じて、本発明のキットは場合により天然ヌクレオチド、対照鋳型、及び他の試薬(例えば緩衝溶液及び/又は例えば2価金属イオン即ちMg++、Mn++及び/又はFe++を含む塩類溶液、標準溶液(例えば検出器校正用色素標準))等の付加試薬を含む。このようなキットは一般に更に所望適用方法(例えば核酸シーケンシング、増幅等)に従って化合物及び他の試薬を使用するための説明書を含む。
本明細書に記載するように、本発明は例えば本明細書に記載するようなポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。立体障害又は相補性特徴を含むポリメラーゼ配列の例を本明細書(例えば表3)に示す。しかし、当業者に自明の通り、本発明はこれらの配列に限定されない。例えば、当業者に自明の通り、本発明は例えば本明細書に記載する機能をもつ多数の関連配列(例えば、表3のポリメラーゼの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド)も提供する。
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」(即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換)はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の1個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
本発明の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができる。更に、天然Φ29又はN62D突然変異体を除く表3に示す核酸と高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては表3の所与核酸配列と比較して1又は少数のサイレント又は保存核酸置換を含むものが挙げられる。
所定側面では、本発明は表3のポリメラーゼをコードする核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は野生型Φ29又はそのN62D突然変異体に対応する核酸に比較してユニークであり得る。例えばデフォルトパラメーターに設定したBLASTを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
2種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は2種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム(又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム)の1種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
別の側面では、本発明は例えば酵素反応速度をモデル化するためのコンピューター実施方法を含む。本方法では、鋳型重合反応中の離散時間ステップについて複数のポリメラーゼ状態遷移を定義する。最小離散時間ステップでは、モデル化される酵素速度反応に従って多くのポリメラーゼ状態遷移が禁止される。状態間の複数の速度遷移速度を定義し、所与核酸鋳型配列、反応混合物中のヌクレオチド及びポリメラーゼ状態遷移に基づいて最小離散時間ステップで可能な状態遷移の多次元確率行列を定義する。得られた多次元確率行列をコンピューター読み取り可能な媒体に保存する。
図1に模式的に示すΦ29ポリメラーゼの発現用ベクターを構築した。エキソヌクレアーゼ活性を低下させるために野生型Φ29(配列番号1)にN62D突然変異を導入し、GST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)、His、及びSタグを付加した。得られたタグ付きN62D Φ29アミノ酸配列を配列番号2として示す。ベクターの配列を配列番号14として示す。タグ付きN62D Φ29ポリメラーゼはベクター配列のヌクレオチド4839−7428によりコードされ、ポリメラーゼはヌクレオチド5700−7428に位置し、N62D突然変異はヌクレオチド5883−5885に位置する。ベクターの他の特徴としては、GST−His−Sタグ配列(ヌクレオチド4838−5699)、リボソーム結合部位(ヌクレオチド4822−4829)、T7プロモーター(ヌクレオチド4746−4758)、及びカナマイシン耐性マーカー(ヌクレオチド563−1375の相補配列)が挙げられる。
改変活性部位領域をもつ各種組換えΦ29ポリメラーゼを構築した。特定メカニズムに限定する意図はないが、改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減することができ、これらの基を相補する特徴(例えば正電荷アミノ酸側鎖)を提供することにより余分なリン酸基に配位することができ、及び/又は他の方法でポリメラーゼのヌクレオチドアナログ組込み能を強化することができる構造改変を以下に例証する。
実施例2に記載したように作製するか、又は本質的に任意の他の合理的もしくはランダム突然変異誘発ストラテジーにより作製した組換えポリメラーゼを場合により特性決定し、各種天然及び/又はヌクレオチドに対するその特性を決定する。組換えポリメラーゼを特性決定するための代表的な5段階プロトコールの1例を以下に記載する。
B列: dTTP、dATP、dGTP(Gフォークなし)、20μMのV;天然ヌクレオチド3種(dGTP、dTTP及びdATP)を使用するアッセイにより測定。
C列: A488dC4P、kel(bp/分);重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
D列: A488dC4P、Km; 重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
E列: A568dC4P、kel; 重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
F列: A568dC4P、Km; 重合速度のヌクレオチドアナログ濃度依存性を試験することにより測定。
G列: A488dC4P、10μMのV;低濃度(10μM)のアナログ1種と天然ヌクレオチド3種を使用するアッセイにより測定。
H列: A568dC4P、10μMのV;低濃度(10μM)のアナログ1種と天然ヌクレオチド3種を使用するアッセイにより測定。
I列: A488dA4P、A633dC4P、A546dG4P、A594dT4P、10μMのV;末端標識ヌクレオチドアナログ4種を使用するアッセイにより測定。
J列: プロセッシビティ(kb−1);プロセッシビティアッセイにより測定。
DNAプライマーをアニールさせたDNA鋳型(反復配列AGTCから主に構成される72ヌクレオチド環状DNA)の存在下でΦ29DNAポリメラーゼ(親酵素又は突然変異体)をプレインキュベートした。プレインキュベーションミックスには天然ヌクレオチド3種(dTTP、dATP及びdGTP)と10μM濃度の末端標識ヌクレオチドアナログ(A488dC4P又はA568dC4P)を加える。短時間プレインキュベーション後、MnCl2で反応を開始した。EDTAで反応を停止し、アガロースゲル電気泳動を使用して産物を分離し、SYBR Gold(Invitrogen)で染色した。DNAポリメラーゼにより生成されたDNAの平均長を測定し、これを使用して重合速度を推定した。例えば表2のG及びH列参照。
本アッセイでは全ヌクレオチドを末端標識(いずれも10μMのA488dA4P、A633dC4P、A546dG4P、A594dT4P)する以外は、基本的に上記「低濃度(10μM)のアナログ1種と天然ヌクレオチド3種を使用するアッセイ」なる表題のセクションに記載した通りの手順とする。例えば表2のI列参照。
天然ヌクレオチド3種(dTTP、dATP及びdGTP)をプレインキュベーションミックスに加え、DNAプライマーをアニールさせたDNA鋳型(G残基を含まない反復配列CATから主に構成される環状DNA)の存在下でΦ29DNAポリメラーゼ(親酵素又は突然変異体)をプレインキュベートした。その後の全段階は基本的に上記「低濃度(10μM)のアナログ1種と天然ヌクレオチド3種を使用するアッセイ」なる表題のセクションに記載した通りに実施した。例えば表2のB列参照。
DNAプライマーをアニールさせたDNA鋳型(反復配列AGTCから主に構成される72ヌクレオチド環状DNA)の存在下でΦ29DNAポリメラーゼ(親酵素又は突然変異体)をプレインキュベートした。プレインキュベーションミックスは更に天然ヌクレオチド3種(dTTP、dATP及びdGTP各20μM)と各種濃度の末端標識アナログ(A488dC4P又はA568dC4P)を加える。その後の全段階は基本的に上記「低濃度(10μM)のアナログ1種と天然ヌクレオチド3種を使用するアッセイ」なる表題のセクションに記載した通りに実施した。各アナログ濃度でDNAポリメラーゼにより生成されたDNA産物の平均長を測定し、結果を式:k=kel*[S]*(Kd+[S])−1(式中、kは実測重合速度であり、kelは飽和基質濃度における重合速度(kelは複数残基の組込みに相当する)であり、[S]は基質濃度である)にフィットさせた。例えば表2のC、D、E、及びF列参照。
DNAプライマーをアニールさせたDNA鋳型(反復配列AGTCから主に構成される72ヌクレオチド環状DNA)の存在下でΦ29DNAポリメラーゼ(親酵素又は突然変異体)をプレインキュベートした。短時間プレインキュベーション後、MnCl2、dNTP及びヘパリンを含有する開始ミックスで反応を開始した。反応にヘパリンを加えると、鋳型/プライマーからのポリメラーゼ解離後に重合を再開できなくなるので、生成された全DNA産物が連続重合試験の結果となる。20分間インキュベーション後、EDTAで反応を停止し、アガロースゲル電気泳動を使用して産物を分離し、SYBR Gold(Invitrogen)で染色した。基本的にBibillo A,Eickbush TH.J Biol Chem.2002 Sep 20;277(38):34836−45,Epub 2002 Jul5に記載されているようにDNA産物を分析した。結果を単一指数方程式:A*exp(−Poff*kb)(式中、Aは振幅であり、Poffは早期ポリメラーゼ解離確率であり、kbはDNA長(1000ヌクレオチド)である)にフィットさせた。鎖伸長確率(プロセッシビティ)はPoff値を1.0から引くことにより容易に計算することができる。例えば表2のJ列参照。
野生型Φ29及び代表的組換えポリメラーゼのアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を表3に示す。
代表的な組換えΦ29ポリメラーゼと各種ヌクレオチドアナログについてKmとVmaxを測定した。結果を表4に示す。
2 Alexa555−C2−dT4Pで測定。このアナログはδリン酸とラベル部分の間に2炭素リンカー(「C2」)をもち、下記構造:をもつ。
4 Alexa532−O−dG4Pで測定。
2 25μM A633dC4P+20μM dA,dG,dTTPの速度。
3 10μM Alexa488−O−dA4P、10μM FAM−Alexa532−O−dG4P、10μM FAM− Alexa594−O−dT4P、10μM Alexa633−O−dC4P+1 mM MnCl2の速度。ヌクレオチドアナログ4種の代表的組み合わせによるKm及びVmax両者の指標である。
4バックグラウンド突然変異(存在する場合)。組換えポリメラーゼは野生型Φ29ポリメラーゼ+突然変異1+突然変異2に対応する。
5固定化及び/又は精製用タグ。
本発明のポリメラーゼとしては、単独又は他の突然変異(例えば本明細書に記載する他の突然変異)との組み合わせとして表8に示す突然変異の任意のものを含むΦ29ポリメラーゼ(又はそのホモログ)が挙げられる。例えば、本発明のポリメラーゼとしては、場合により表8に特定するような突然変異の組み合わせを含むΦ29ポリメラーゼ(又はそのホモログ)が挙げられる。
ポリメラーゼ反応状態遷移を離散時間ステップについて確率行列に保存する。状態確率分布のベクトルは連続モデルに従う多数のポリメラーゼ状態から特定ポリメラーゼを発見する確率を表すことができる。状態分布ベクトルと状態遷移確率行列の線形代数乗算により、状態遷移確率行列の離散時間ステップに等しい時間経過の効果を表すポリメラーゼ状態分布の新しいベクトルが得られる。
C6 = 状態6のポリメラーゼを発見する確率。
K61 = 状態6から状態1へのポリメラーゼの遷移速度。
kij = 反応速度定数。
Pij = kijΔt反応速度定数。
Pij = i→j確率。
* K54≒0(ピロリン酸濃度として)。
↓
Rp = C6K61 − C1K16 =触媒速度。
Rp = 飽和まで増加するヌクレオチド濃度条件としてK61→∞, C6→ 0における(Rp)max。
(Rp)maxを求めるには、
ポリメラーゼ−鋳型−dNTP系の可能な全反応状態を捕えるための単一2−D行列を以下に示す。
...[ACGT]ACGT...
に作成される確率遷移行列は配列:
...[ACGTACGT]ACGT....
に作成される行列と等価になる。他方、配列:
...[AACCGGTT]AACC...
に作成される確率遷移行列は元の行列で許容されない多数の状態遷移(例えば鋳型配列中の「A」から別の「A」へのポリメラーゼ転位)を含むので異なる。更に、この反復配列は4個ではなく8個のワトソン・クリック塩基を含むので、656ではなく1,312状態の行列が作成される。
式中、P56TAxCは「TAxC」により表される付加ヌクレオチド−鋳型条件で状態5から状態6への転位を完了するポリメラーゼの確率である。K56TAxCはこの転位の遷移速度である。
鋳型ヌクレオチド:ACGT
TGCA。
同様に、全ミスマッチを等しく処理することができる。
K12AT0A=k12xZ0Z
K12CG0T=k12xZ0Z
K12CT0T=k12xY0Z
K12CT1C=k12xY1Y
X=任意変数
Y=任意ミスマッチ
Z=任意マッチ。
(1)行列を僅かに変更するだけで鋳型を伸長することができる。反復配列の各鋳型塩基が164状態を追加する。従来は、新しい状態を行列に組み入れる必要があった。
kinetic_matrix=rate_transition_matrix * conc_matrix
state_transition_probability_matrix=kinetic_matrix * time_step
となるように速度遷移行列を補完し、上記式では、速度遷移行列の各要素に濃度行列におけるその対応する依存変数を乗じている。このように、濃度依存状態遷移を捕える(例えばヌクレオチド取込み速度はヌクレオチド濃度に依存する)。濃度に依存しない行列の要素は変化させない。非線形濃度依存性は反応速度行列を定義する非線形式を使用して表すことができる。
状態遷移確率行列を特定指数乗(例えば100)に増加することにより、特定数の離散時間ステップ(例えば100時間ステップ)の時間経過をシミュレートする。
多数のポリメラーゼ−鋳型複合体を同時にベクトル化することによりシミュレーションの効率を更に改善することができる。
濃度低下に対する反応速度行列ジャンプをプロットする図9参照。
順方向合計転位率=C5.*C6.−C6.*k65
反応=(ミスマッチ率)/(合計率)
C5は状態5のポリメラーゼを含む全行列状態の濃度を表す(128頁参照)。
k56は対応する全順方向転位率の完全なセットである。
順方向ミスマッチ転位=C5 (m).*k56 (m)−C6 (m).*k65 (m)
(逆方向転位では、前のミスマッチを含むポリメラーゼ状態5にはならない。上記参照)。
1)まず、Patelら(1991)“Pre−Steady−State Kinetic Analysis of Processive DNA Replication Including Complete Characterization of an Exonuclease−Deficient Mutant” Biochemistry 30:511−525に示されているように、全速度定数をT7ポリメラーゼと等しくなるように設定する。
K61≧50μm−1s−1
K12=300μm−1s−1
K23≧9000μm−1s−1
K34=1200μm−1s−1
K645≧1000μm−1s−1
K16≧1000μm−1s−1
K21=100μm−1s−1
K32=18,000μm−1s−1
K43=18μm−1s−1
K54≧0.5μm−1s−1
(Vmax)native=50bps
(Vmax)analog=5bps
(km)native=0.2μm
(km)analog=6μm
2)dNTP濃度飽和(≧1mM)を使用し、(主に)k12と(必要に応じて)他の速度定数を変化させることによりVmax=50bpsを設定する。全アナログ遷移速度を天然dNTP遷移速度と同一に維持する。当面、解離を抑える(速度→0)。
3)アナログ−dNTP濃度飽和(≧1mM)を使用し、アナログのみのk45を変化させることによりVmax=5bpsを設定する。
4)天然dNTP濃度を0.2μmに設定し、V=25bpsとなるようにk61(天然のみ)を変化させることにより(km)native=0.2μmを設定する。
5)アナログdNTP濃度を6μmに設定し、V=2.5bpsとなるようにk61(アナログのみ)を変化させることにより(km)native=6μmを設定する。
天然dNTP
k61=365μm−1s−1
k12=60μm−1s−1
K23=9000μm−1s−1
k34=1200μm−1s−1
k45=1000μm−1s−1
k56=500μm−1s−1
k16=10μm−1s−1
k21=100μm−1s−1
k32=1800μm−1s−1
k43=18μm−1s−1
k54=0.5μm−1s−1
k65=100μm−1s−1
アナログdNTP
k61=1.1μm−1s−1
k12=60μm−1s−1
K23=9000μm−1s−1
k34=5.5μm−1s−1
k45=5.5μm−1s−1
k56=500μm−1s−1
k16=10μm−1s−1
k21=100μm−1s−1
k32=1800μm−1s−1
k43=18μm−1s−1
k54=0.1μm−1s−1
k65=100μm−1s−1。
全速度は今後の実験で更に校正されよう。
pol_index.m:DNA配列に基づいて必要な全行列指数リスト及びポインターを初期化する。
Pol_ratematrix.m:全ユニーク速度定数のリストを含むエクセルファイルを入力として取込み、DNA配列に基づいて遷移速度行列を作成する。
Pol_conmatrix.m:試薬濃度を取込み、
(全非対角線要素について)確率行列=time_step * rate_matrix * conc_matrix
となるように濃度行列を構築する。
Pol_dntp_concumption.m:連続モデルに基づいて試薬消費速度を計算する。
POL_dna.m:POL_DNA、POL_REAGENTS、POL_CURVEMAPの以前の全関数を統合し、
以前の全消費を追跡し、
DNA合成長分布を追跡し、
遊離鋳型、完成したdsDNA鋳型、現在処理中の鋳型、可能な複数濃度試験、ユーザー定義された反復DNA配列、有限長鋳型を追跡する。
pol_metal.m:POL_DNAの機能縮小版を使用したMg+消耗実験の完全態様。
Claims (55)
- 組換えDNAポリメラーゼを含有する組成物であって、組換えDNAポリメラーゼが野生型DNAポリメラーゼの野生型活性部位領域に相同の改変活性部位領域を含み、改変活性部位領域が改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか又はヌクレオチドアナログの1種以上の非天然特徴に相補的である1種以上の構造改変を野生型活性部位領域に対して含み、ヌクレオチドアナログに対する組換えDNAポリメラーゼの特性が野生型ポリメラーゼに比較して改変されている前記組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼがΦ29DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損Taqポリメラーゼ、DNA Pol Iポリメラーゼ、T7ポリメラーゼ、T5ポリメラーゼ、RB69ポリメラーゼ、T5ポリメラーゼ又はDNA Pol Iポリメラーゼのクレノウフラグメントに対応するフラグメントに相同である請求項1に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼが野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ29DNAポリメラーゼに相同である請求項1に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼがΦ29、B103、GA−1、PZA、Φ15、BS32、M2Y、Nf、G1、Cp−1、PRD1、PZE、SF5、Cp−5、Cp−7、PR4、PR5、PR722、又はL17に相同である請求項1に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼがその活性部位内又はその近位に野生型又はエキソヌクレアーゼ欠損Φ29DNAポリメラーゼに対して残基505−525の欠失、残基505−525内の欠失、K135A突然変異、E375H突然変異、E375S突然変異、E375K突然変異、E375R突然変異、E375A突然変異、E375Q突然変異、E375W突然変異、E375Y突然変異、E375F突然変異、E486A突然変異、E486D突然変異、K512A突然変異及びその組み合わせから選択される構造改変を含む請求項3に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼが更にL384R突然変異を含む請求項5に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼが更に表8から選択される別の突然変異又は突然変異組み合わせを含む請求項5に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼが野生型ポリメラーゼに対して組換えポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を低下させる構造改変を含む請求項1に記載の組成物。
- ポリメラーゼがΦ29DNAポリメラーゼに相同であり、構造改変がエキソヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸欠失又は改変である請求項8に記載の組成物。
- 改変が野生型Φ29DNAポリメラーゼに対するN62の突然変異に対応する請求項9に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼが1個以上の外来アフィニティータグ配列を含む請求項1に記載の組成物。
- アフィニティータグ配列が6Hisタグ配列、GSTタグ、HAタグ配列、複数の6Hisタグ配列、複数のGSTタグ、複数のHAタグ配列及びその組み合わせから選択される請求項11に記載の組成物。
- 組換えDNAポリメラーゼが表3から選択される請求項1に記載の組成物。
- ヌクレオチドアナログを含有する請求項1に記載の組成物。
- ヌクレオチドアナログがフルオロフォア又は色素部分を含む請求項14に記載の組成物。
- ヌクレオチドアナログがリン酸標識ヌクレオチドアナログである請求項14に記載の組成物。
- ヌクレオチドアナログがモノデオキシ又はジデオキシヌクレオチドアナログである請求項14に記載の組成物。
- ヌクレオチドアナログが3〜6個のリン酸基をもつ標識ヌクレオチドアナログである請求項14に記載の組成物。
- ヌクレオチドアナログが三リン酸塩、四リン酸塩、五リン酸塩又は六リン酸塩である請求項14に記載の組成物。
- 構造改変がヌクレオチドアナログのリン酸残基と結合する正電荷アミノ酸残基の付加を含む請求項18に記載の組成物。
- 改変特性がKm、kcat、Vmax、ヌクレオチドアナログの存在下における組換えポリメラーゼプロセッシビティ、ヌクレオチドアナログの存在下における組換えポリメラーゼによる平均鋳型読み取り長、ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼの特異性、ヌクレオチドアナログの結合速度、産物放出速度、及び分岐速度から選択される請求項1に記載の組成物。
- 改変特性がヌクレオチドアナログに対するKmの低下を含む請求項1に記載の組成物。
- 改変特性がヌクレオチドアナログに対するkcat/Km又はVmax/Kmの増加を含む請求項1に記載の組成物。
- 天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼの比活性が野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約5%高く、鋳型の存在下におけるプロセッシビティが天然ヌクレオチドの存在下における野生型ポリメラーゼよりも少なくとも5%高い請求項1に記載の組成物。
- 天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼのkcat/Km又はVmax/Kmが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約5%高い請求項1に記載の組成物。
- 天然ヌクレオチドに対する組換えポリメラーゼのkcat/Km又はVmax/Kmが野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約25%高い請求項1に記載の組成物。
- ヌクレオチドアナログとDNA鋳型を含有しており、組換えポリメラーゼが鋳型DNAに応答してヌクレオチドアナログをコピー核酸に組込む請求項1に記載の組成物。
- 鋳型が環状鋳型である請求項27に記載の組成物。
- 組成物がDNAシーケンシングシステムに存在している請求項1に記載の組成物。
- シーケンシングシステムがゼロモード導波管を含む請求項29に記載の組成物。
- DNAの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、アナログヌクレオチドを含む1個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階(なお、前記組換えDNAポリメラーゼは野生型DNAポリメラーゼの野生型活性部位領域に相同の改変活性部位を含み、改変活性部位は改変活性部位領域へのヌクレオチドアナログ導入の立体妨害を軽減するか又はヌクレオチドアナログの1種以上の非天然特徴に相補的である1種以上の構造改変を野生型活性部位に対して含む)と;
組換えポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させる段階を含む前記方法。 - DNAの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、リン酸標識アナログヌクレオチドを含む1個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階(なお、ヌクレオチドアナログに対する組換えポリメラーゼのKm値はヌクレオチドアナログに対する対応する相同野生型ポリメラーゼのKmよりも小さい)と;
ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を鋳型依存的に複製するように混合物を反応させることにより、得られるDNAに少なくとも1個のヌクレオチドアナログ残基を組込む段階を含む前記方法。 - DNAの作製方法であって、
鋳型と、鋳型と複合体化又は一体化する複製開始部分と、鋳型依存的ポリメラーゼ反応で前記部分を使用して鋳型の少なくとも一部を複製することが可能なポリメラーゼと、リン酸標識アナログヌクレオチドを含む1個以上のヌクレオチドを含有する反応混合物を準備する段階(なお、前記ポリメラーゼはΦ29DNAポリメラーゼに相同であり、A488dC4P、A568dC4P又は両者に対するKmはA488dC4P、A568dC4P又は両者に対するGST−N62D Φ29DNAポリメラーゼ突然変異体のKmの約75%未満である)と;
ポリメラーゼが鋳型の少なくとも一部を複製するように混合物を反応させる段階を含む前記方法。 - 複製開始部分がオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型における自己相補性領域、又は鋳型と結合するポリペプチドを含む請求項31、32又は33に記載の方法。
- アナログに対するポリメラーゼのKmが対応する野生型ポリメラーゼのKmの約75%未満である請求項31、32又は33に記載の方法。
- アナログに対するポリメラーゼのKmが対応する野生型ポリメラーゼのKmの約40%未満である請求項31、32又は33に記載の方法。
- アナログに対するポリメラーゼのKmが対応する野生型ポリメラーゼのKmの約15%未満である請求項31、32又は33に記載の方法。
- ヌクレオチドアナログに対するポリメラーゼのkcat/Km又はVmax/Kmがヌクレオチドアナログに対する野生型Φ29のkcat/Km又はVmax/Kmよりも高い請求項31、32又は33に記載の方法。
- ポリメラーゼが野生型Φ29DNAポリメラーゼに対して残基505−525の欠失、残基505−525内の欠失、K135A突然変異、E375H突然変異、E375S突然変異、E375K突然変異、E375R突然変異、E375A突然変異、E375Q突然変異、E375W突然変異、E375Y突然変異、E375F突然変異、E486A突然変異、E486D突然変異、K512A突然変異、及びその組み合わせから選択される構造改変を含む組換えDNAポリメラーゼである請求項31、32又は33に記載の方法。
- 組換えDNAポリメラーゼの作製方法であって、
第1のポリメラーゼを構造的にモデル化する段階と;
活性部位へのヌクレオチド接近に影響を与える1種以上の立体妨害特徴又は活性部位におけるヌクレオチドアナログの相補性特徴を同定する段階と;
少なくとも1種の立体妨害特徴を軽減もしくは排除するか又は少なくとも1種のヌクレオチドアナログ相補性特徴を付加するように第1のDNAポリメラーゼを突然変異させる段階と;
得られる組換えポリメラーゼのヌクレオチドアナログに対する活性が第1のDNAポリメラーゼに比較して改変されているか否かを試験する段階を含む前記方法。 - ヌクレオチドアナログに対する組換えDNAポリメラーゼのkcat、Km、Vmax、又はkcat/Kmを測定する段階を含む請求項40に記載の方法。
- 天然ヌクレオチドに対する組換えDNAポリメラーゼのkcat、Km、Vmax、又はkcat/Kmを測定する段階を含む請求項40に記載の方法。
- 組換えDNAポリメラーゼのライブラリーを作製する段階を含み、ライブラリーの複数のメンバーが1種以上の立体妨害特徴突然変異又は相補性特徴突然変異を含む請求項40に記載の方法。
- 改変活性を含む少なくとも1個のメンバーを同定するようにライブラリーをスクリーニングする段階を含む請求項43に記載の方法。
- 鋳型重合反応中の離散時間ステップについて複数のポリメラーゼ状態遷移を定義する段階と;
状態間の複数の速度遷移速度を定義する段階と;
所与核酸鋳型配列、反応混合物中のヌクレオチド及びポリメラーゼ状態遷移に基づいて、可能な状態遷移の多次元確率行列を作成する段階と;
コンピューター読み取り可能な媒体に多次元確率行列を保存する段階を含むコンピューター実施方法。 - ポリメラーゼ遷移状態がユーザー選択可能である請求項45に記載の方法。
- 状態間の速度遷移速度がヌクレオチド濃度、鋳型配列及び鋳型に沿うポリメラーゼの位置により異なる請求項45に記載の方法。
- 反応混合物中のヌクレオチドが1個以上のヌクレオチドアナログを含む請求項45に記載の方法。
- 状態間の速度遷移速度がポリメラーゼによるヌクレオチドアナログの使用中のポリメラーゼの配座遷移速度を含み、前記速度が天然ヌクレオチドの配座遷移速度に等しくなるように設定される請求項45に記載の方法。
- 多次元確率行列が鋳型配列、確率状態の標準化行列、及び反応混合物中のヌクレオチドに基づいて自動的に作成される請求項45に記載の方法。
- 可能な全ワトソン・クリック塩基対が全状態遷移で等しいと仮定することにより確率行列を単純化する請求項45に記載の方法。
- 確率行列の出力に基づいて、鋳型に沿うポリメラーゼの位置に起因する試薬濃度変化を考慮するために第2の試薬濃度行列を作成する請求項45に記載の方法。
- 複数鋳型について確率行列をベクトル化する段階と、得られたベクトル化確率行列に多次元確率行列を乗じ、状態分布行列を得る段階を含む請求項45に記載の方法。
- 鋳型配列内の反復配列を考慮するために確率行列の指数時間係数を定義する段階を含む請求項45に記載の方法。
- 連続モデル又は計数モデルを使用してポリメラーゼヌクレオチドミスマッチ率を定義する段階を含む請求項45に記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US8975216B2 (en) * | 2006-03-30 | 2015-03-10 | Pacific Biosciences Of California | Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same |
US20080050747A1 (en) * | 2006-03-30 | 2008-02-28 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing and using same |
CN101495656B (zh) | 2006-06-07 | 2017-02-08 | 纽约哥伦比亚大学理事会 | 采用带修饰的核苷酸通过纳米通道进行dna序列测定 |
AU2007309504B2 (en) * | 2006-10-23 | 2012-09-13 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing |
WO2009036246A2 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Immunotope, Inc. | Immunogens that induce cytotoxic t-lymphocytes and their use in prevention, treatment, and diagnosis of cancer |
EP2203566A4 (en) | 2007-09-28 | 2011-02-09 | Pacific Biosciences California | ERROR-FREE DNA AMPLIFICATION FOR CLONAL SEQUENCING |
EP2217928B1 (en) * | 2007-12-04 | 2017-08-09 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Alternate labeling strategies for single molecule sequencing |
US8652781B2 (en) | 2008-02-12 | 2014-02-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Cognate sampling kinetics |
CA2718404C (en) | 2008-03-13 | 2018-04-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Labeled reactants and their uses |
US7973146B2 (en) | 2008-03-26 | 2011-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Engineered fluorescent dye labeled nucleotide analogs for DNA sequencing |
EP2274449B1 (en) | 2008-03-28 | 2015-12-23 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Methods for nucleic acid sequencing |
EP2274446B1 (en) * | 2008-03-31 | 2015-09-09 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Two slow-step polymerase enzyme systems and methods |
US8420366B2 (en) * | 2008-03-31 | 2013-04-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing |
US9127259B2 (en) | 2008-03-31 | 2015-09-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Enzymes resistant to photodamage |
EP2942404B1 (en) | 2008-03-31 | 2016-11-23 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing |
CA2720247C (en) | 2008-03-31 | 2020-07-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Single molecule loading methods and compositions |
US9637380B2 (en) | 2008-03-31 | 2017-05-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nanoscale apertures having islands of functionality |
US8999676B2 (en) | 2008-03-31 | 2015-04-07 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Recombinant polymerases for improved single molecule sequencing |
US20100227327A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-09-09 | Xiaoliang Sunney Xie | Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
US20100036110A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Xiaoliang Sunney Xie | Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides |
AU2009288696A1 (en) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sequencing by cognate sampling |
WO2010062779A2 (en) * | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Kapabiosystems | Modified dna polymerases |
JP2012507986A (ja) | 2008-11-03 | 2012-04-05 | カパバイオシステムズ | キメラdnaポリメラーゼ |
WO2010059206A2 (en) | 2008-11-19 | 2010-05-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Modular nucleotide compositions and uses therefor |
CA2746632C (en) | 2008-12-11 | 2020-06-30 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Characterization of modified nucleic acids |
WO2010111686A2 (en) | 2009-03-27 | 2010-09-30 | Life Technologies Corp | Labeled enzyme compositions, methods & systems |
WO2010117420A2 (en) | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Fret-labeled compounds and uses therefor |
WO2010141390A2 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Life Technologies Corporation | Nucleotide transient binding for sequencing methods |
US8501406B1 (en) | 2009-07-14 | 2013-08-06 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Selectively functionalized arrays |
US9416409B2 (en) | 2009-07-31 | 2016-08-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
US8911972B2 (en) * | 2009-12-16 | 2014-12-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sequencing methods using enzyme conformation |
US9605307B2 (en) * | 2010-02-08 | 2017-03-28 | Genia Technologies, Inc. | Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer |
US9678055B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-06-13 | Genia Technologies, Inc. | Methods for forming a nanopore in a lipid bilayer |
US8324914B2 (en) | 2010-02-08 | 2012-12-04 | Genia Technologies, Inc. | Systems and methods for characterizing a molecule |
US20110192723A1 (en) * | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Genia Technologies, Inc. | Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore |
US20120202276A1 (en) | 2010-02-26 | 2012-08-09 | Life Technologies Corporation | Modified Proteins and Methods of Making and Using Same |
EP2539471B1 (en) * | 2010-02-26 | 2014-08-06 | Life Technologies Corporation | Method for sequencing using a modified polymerase |
WO2012009206A2 (en) | 2010-07-12 | 2012-01-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Sequencing reactions with alkali metal cations for pulse width control |
WO2012027618A2 (en) | 2010-08-25 | 2012-03-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Functionalized cyanine dyes |
US8936911B2 (en) | 2010-09-22 | 2015-01-20 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Purified extended polymerase/template complex for sequencing |
GB2500360B (en) | 2010-12-22 | 2019-10-23 | Genia Tech Inc | Nanopore-based single DNA molecule characterization, identification and isolation using speed bumps |
WO2012092265A1 (en) | 2010-12-27 | 2012-07-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sample preparation methods and compositions |
US8962242B2 (en) | 2011-01-24 | 2015-02-24 | Genia Technologies, Inc. | System for detecting electrical properties of a molecular complex |
US9110478B2 (en) | 2011-01-27 | 2015-08-18 | Genia Technologies, Inc. | Temperature regulation of measurement arrays |
EP2689028B1 (en) | 2011-03-23 | 2017-08-30 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Isolation of polymerase-nucleic acid complexes and loading onto substrates |
WO2013022778A1 (en) | 2011-08-05 | 2013-02-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing by electrochemical detection |
EP2742151B1 (en) | 2011-08-10 | 2017-10-25 | Life Technologies Corporation | Polymerase compositions |
WO2013056241A2 (en) | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Real-time redox sequencing |
WO2013096692A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Illumina, Inc. | Apparatus and methods for kinetic analysis and determination of nucleic acid sequences |
WO2013101743A2 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular, Inc. | Microorganism nucelic acid purification from host samples |
EP2802666B1 (en) | 2012-01-13 | 2018-09-19 | Data2Bio | Genotyping by next-generation sequencing |
US9528107B2 (en) | 2012-01-31 | 2016-12-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for selection of nucleic acids |
US8906660B2 (en) | 2012-02-01 | 2014-12-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Recombinant polymerases with increased phototolerance |
EP3222627B1 (en) | 2012-02-15 | 2019-08-07 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Polymerase enzyme substrates with protein shield |
US8986629B2 (en) | 2012-02-27 | 2015-03-24 | Genia Technologies, Inc. | Sensor circuit for controlling, detecting, and measuring a molecular complex |
CA2867489A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and composition for sequencing modified nucleic acids |
US10584377B2 (en) | 2012-05-02 | 2020-03-10 | Ibis Biosciences, Inc. | DNA sequencing |
US10202642B2 (en) | 2012-05-02 | 2019-02-12 | Ibis Biosciences, Inc. | DNA sequencing |
WO2013166305A1 (en) | 2012-05-02 | 2013-11-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Dna sequencing |
WO2013173844A1 (en) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Heteroarylcyanine dyes |
US9315864B2 (en) | 2012-05-18 | 2016-04-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Heteroarylcyanine dyes with sulfonic acid substituents |
WO2013185137A1 (en) | 2012-06-08 | 2013-12-12 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Modified base detection with nanopore sequencing |
EP2861768A4 (en) | 2012-06-15 | 2016-03-02 | Genia Technologies Inc | CHIP SETUP AND HIGH ACCURACY NUCLEIC ACID SEQUENCING |
WO2014043143A1 (en) | 2012-09-11 | 2014-03-20 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
EP2895620B1 (en) | 2012-09-11 | 2017-08-02 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
US9399766B2 (en) | 2012-10-01 | 2016-07-26 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Recombinant polymerases for incorporation of protein shield nucleotide analogs |
WO2014062835A1 (en) | 2012-10-16 | 2014-04-24 | Abbott Molecular Inc. | Methods and apparatus to sequence a nucleic acid |
US9605309B2 (en) | 2012-11-09 | 2017-03-28 | Genia Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using tags |
US9759711B2 (en) | 2013-02-05 | 2017-09-12 | Genia Technologies, Inc. | Nanopore arrays |
US9146248B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-09-29 | Intelligent Bio-Systems, Inc. | Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments |
CA2898459C (en) | 2013-03-14 | 2021-02-02 | Illumina, Inc. | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
US9290800B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-03-22 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Targeted rolling circle amplification |
US9591268B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-07 | Qiagen Waltham, Inc. | Flow cell alignment methods and systems |
US9422535B2 (en) | 2013-04-25 | 2016-08-23 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | phi29 DNA polymerase mutants having increased thermostability and processivity |
CN105378113B (zh) | 2013-05-06 | 2020-02-21 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 实时电子测序 |
CA2921620C (en) | 2013-08-19 | 2021-01-19 | Abbott Molecular Inc. | Next-generation sequencing libraries |
US9657281B2 (en) | 2013-09-30 | 2017-05-23 | Life Technologies Corporation | Polymerase compositions, methods of making and using same |
US9551697B2 (en) | 2013-10-17 | 2017-01-24 | Genia Technologies, Inc. | Non-faradaic, capacitively coupled measurement in a nanopore cell array |
EP3640349A3 (en) | 2013-10-23 | 2020-07-29 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | High speed molecular sensing with nanopores |
US9567630B2 (en) | 2013-10-23 | 2017-02-14 | Genia Technologies, Inc. | Methods for forming lipid bilayers on biochips |
WO2015074005A1 (en) | 2013-11-17 | 2015-05-21 | Quantum-Si Incorporated | Active-source-pixel, integrated device for rapid analysis of biological and chemical speciments |
WO2015095355A2 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Detection of an antibody against a pathogen |
EP3161157B1 (en) | 2014-06-24 | 2024-03-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital pcr barcoding |
US9765309B2 (en) | 2014-06-27 | 2017-09-19 | Illumina, Inc. | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
BR112016030008A2 (pt) | 2014-06-27 | 2017-10-24 | Abbott Lab | método para a detecção de infecção por pegivirus humano 2 em um indivíduo, para a detecção de ácido nucleico de pegivirus humano 2 e para a detecção de pegivirus humano 2 em uma amostra, e, composição |
KR20220165286A (ko) | 2014-08-08 | 2022-12-14 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 분자를 프로빙, 검출 및 분석하기 위한 외부 광원을 갖는 통합 디바이스 |
KR102452571B1 (ko) | 2014-08-08 | 2022-10-07 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 수신된 광자들의 시간 비닝을 위한 집적 디바이스 |
KR20220165282A (ko) | 2014-08-08 | 2022-12-14 | 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 | 분자들을 프로빙, 검출 및 분석하기 위한 광학계 및 검정 칩 |
WO2016028887A1 (en) | 2014-08-19 | 2016-02-25 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for enrichment of nucleic acids |
US10435685B2 (en) | 2014-08-19 | 2019-10-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for enrichment of nucleic acids |
EP3194643B1 (en) | 2014-09-17 | 2020-02-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Sequencing by synthesis using pulse read optics |
US9677057B2 (en) | 2014-09-30 | 2017-06-13 | Illumina, Inc. | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
WO2016153999A1 (en) | 2015-03-25 | 2016-09-29 | Life Technologies Corporation | Modified nucleotides and uses thereof |
WO2016077795A1 (en) | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Illumina, Inc. | Polymerases |
CN113403293B (zh) | 2014-12-16 | 2024-08-16 | 生命技术公司 | 聚合酶组合物和制造与使用其的方法 |
US10302972B2 (en) | 2015-01-23 | 2019-05-28 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Waveguide transmission |
WO2016154345A1 (en) | 2015-03-24 | 2016-09-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for single molecule composition loading |
US10174363B2 (en) | 2015-05-20 | 2019-01-08 | Quantum-Si Incorporated | Methods for nucleic acid sequencing |
MY183442A (en) * | 2015-06-03 | 2021-02-18 | Illumina Inc | Compositions, systems, and methods for sequencing polynucleotides using tethers anchored to polymerases adjacent to nanopores |
WO2017024049A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Single-molecule nanofet sequencing systems and methods |
WO2017027518A1 (en) | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Stratos Genomics, Inc. | Single molecule nucleic acid sequencing with molecular sensor complexes |
WO2017050723A1 (en) * | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Genia Technologies, Inc. | Pol7 polymerase variants |
US10280411B2 (en) | 2015-10-27 | 2019-05-07 | Pacific Biosciences of California, In.c | Methods, systems, and reagents for direct RNA sequencing |
EP3904528A1 (en) | 2015-11-16 | 2021-11-03 | Stratos Genomics Inc. | Dp04 polymerase variants |
US10731211B2 (en) | 2015-11-18 | 2020-08-04 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for loading of polymerase complexes |
US10814299B2 (en) | 2015-11-18 | 2020-10-27 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Loading nucleic acids onto substrates |
CN117024498A (zh) | 2015-11-20 | 2023-11-10 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 受保护的染料标记的试剂 |
EP3376997A4 (en) | 2015-11-20 | 2019-04-24 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | NUCLEOTIDE ANALOGUES LABELED, REACTION MIXTURES AND METHODS AND SYSTEMS FOR SEQUENCING |
US10730030B2 (en) | 2016-01-08 | 2020-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiple beads per droplet resolution |
CA3012705A1 (en) | 2016-02-17 | 2017-08-24 | Tesseract Health, Inc. | Sensor and device for lifetime imaging and detection applications |
US10544457B2 (en) | 2016-06-14 | 2020-01-28 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for enriching compositions for polymerase enzyme complexes |
EP3485037B1 (en) | 2016-07-18 | 2022-02-09 | F. Hoffmann-La Roche AG | Asymmetric templates and asymmetric method of nucleic acid sequencing |
CN109312391B (zh) | 2016-07-18 | 2022-06-03 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 生成用于单分子测序的单链环状dna文库的方法 |
US10711300B2 (en) | 2016-07-22 | 2020-07-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites |
US11543417B2 (en) | 2016-08-29 | 2023-01-03 | Oslo Universitetssykehus Hf | ChIP-seq assays |
CN110121506A (zh) | 2016-08-31 | 2019-08-13 | 生物蛋白有限公司 | 条件活性多肽及产生它们的方法 |
CN110139932B (zh) | 2016-12-19 | 2024-05-17 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 液滴加标的相邻性保留的标签化dna |
EP3555272A2 (en) * | 2016-12-19 | 2019-10-23 | Quantum-si Incorporated | Polymerizing enzymes for sequencing reactions |
CN118099177A (zh) | 2016-12-22 | 2024-05-28 | 宽腾矽公司 | 具有直接合并像素的整合式光电侦测器 |
WO2018191857A1 (zh) * | 2017-04-18 | 2018-10-25 | 深圳华大智造科技有限公司 | Phi29 DNA聚合酶及其编码基因与应用 |
US11708566B2 (en) | 2017-05-04 | 2023-07-25 | Stratos Genomics, Inc. | DP04 polymerase variants |
US20180363044A1 (en) * | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for improving the thermal stability of nucleic acid amplification reagents |
WO2018236918A1 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | MDA USING A BALL OLIGONUCLEOTIDE |
CN111133293A (zh) | 2017-07-24 | 2020-05-08 | 宽腾矽公司 | 手持式大规模并行生物光电仪器 |
US11104889B2 (en) * | 2017-07-28 | 2021-08-31 | Mgi Tech Co., Ltd. | Phi29 DNA polymerase mutant having increased thermal stability and use thereof |
EP3682025A1 (en) | 2017-09-14 | 2020-07-22 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Novel method for generating circular single-stranded dna libraries |
EP3682027A1 (en) | 2017-09-15 | 2020-07-22 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Hybridization-extension-ligation strategy for generating circular single-stranded dna libraries |
WO2019068797A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | CIRCULARIZATION METHODS FOR THE PREPARATION OF SAMPLE SAMPLES OF UNIQUE MOLECULES |
US11162138B2 (en) | 2017-10-30 | 2021-11-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Multi-amplitude modular labeled compounds |
EP3704247B1 (en) | 2017-11-02 | 2023-01-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
WO2019118372A1 (en) | 2017-12-11 | 2019-06-20 | Stratos Genomics, Inc. | Dpo4 polymerase variants with improved accuracy |
CN111836904A (zh) | 2017-12-21 | 2020-10-27 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于单向核酸测序的组合物和方法 |
US10655168B2 (en) | 2017-12-22 | 2020-05-19 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Modified biotin-binding proteins for immobilization |
US20190241944A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for deconvoluting partition barcodes |
EP3765632A4 (en) | 2018-03-13 | 2021-12-08 | Sarmal, Inc. | METHOD OF SINGLE MOLECULE SEQUENCING |
US11512002B2 (en) | 2018-04-18 | 2022-11-29 | University Of Virginia Patent Foundation | Silica materials and methods of making thereof |
JP7460555B2 (ja) | 2018-06-22 | 2024-04-02 | クアンタム-エスアイ インコーポレイテッド | 様々な検出時間の電荷貯蔵ビンを有する集積光検出器 |
US11332787B2 (en) | 2018-06-29 | 2022-05-17 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites |
US11479816B2 (en) | 2018-08-20 | 2022-10-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions |
JP2022512847A (ja) * | 2018-10-29 | 2022-02-07 | コデクシス, インコーポレイテッド | 操作されたdnaポリメラーゼバリアント |
EP3874036A1 (en) | 2018-10-31 | 2021-09-08 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
KR20210098844A (ko) | 2018-12-05 | 2021-08-11 | 일루미나, 인코포레이티드 | 중합효소, 조성물, 및 사용 방법 |
EP3674702A1 (en) | 2018-12-27 | 2020-07-01 | Imec VZW | Method for sequencing a polynucleotide using a biofet |
CA3145246A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | Quantum-Si Incorporated | Polymerizing enzymes for sequencing reactions |
US12006535B2 (en) | 2019-11-19 | 2024-06-11 | Sarmal, Inc. | Methods and devices for detecting SARS-COV-2 |
WO2021152586A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state |
AU2021219665A1 (en) * | 2020-02-10 | 2022-09-01 | BioSkryb Genomics, Inc. | Phi29 mutants and use thereof |
WO2021214766A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto |
WO2021248757A1 (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 深圳华大生命科学研究院 | 稳定且酶活性高的Phi29 DNA聚合酶及其编码基因与应用 |
CN113122517B (zh) * | 2021-03-24 | 2023-02-14 | 深圳清华大学研究院 | 聚合酶突变体及其应用 |
EP4347877A1 (en) | 2021-06-01 | 2024-04-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyte detection and probe resolution |
US12077789B2 (en) | 2021-08-14 | 2024-09-03 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
CN114940979B (zh) * | 2022-02-16 | 2024-01-23 | 杭州嵌化合生医药科技有限公司 | 一种利用遗传密码扩展提高阳离子-π相互作用的方法及应用 |
CN114891761B (zh) * | 2022-03-25 | 2024-01-12 | 上海威高医疗技术发展有限公司 | Tth DNA聚合酶突变体及其应用 |
WO2023215603A1 (en) | 2022-05-06 | 2023-11-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences |
WO2023220300A1 (en) | 2022-05-11 | 2023-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for in situ sequencing |
WO2024015962A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Blocked asymmetric hairpin adaptors |
US20240141427A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-05-02 | Illumina, Inc. | Polymerases, compositions, and methods of use |
WO2024076991A2 (en) * | 2022-10-03 | 2024-04-11 | Singular Genomics Systems, Inc. | Modified enzymes and uses thereof |
US20240263219A1 (en) | 2023-01-06 | 2024-08-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for in situ analysis of variant sequences |
US20240263220A1 (en) | 2023-02-03 | 2024-08-08 | 10X Genomics, Inc. | In situ analysis of variant sequences in biological samples |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002086088A2 (en) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Li-Cor, Inc. | Polymerases with charge-switch activity and methods of generating such polymerases |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4711955A (en) | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
US5198543A (en) | 1989-03-24 | 1993-03-30 | Consejo Superior Investigaciones Cientificas | PHI29 DNA polymerase |
US5001050A (en) | 1989-03-24 | 1991-03-19 | Consejo Superior Investigaciones Cientificas | PHφ29 DNA polymerase |
US5998580A (en) * | 1995-10-13 | 1999-12-07 | Fay; Frederick F. | Photosensitive caged macromolecules |
US6261797B1 (en) * | 1996-01-29 | 2001-07-17 | Stratagene | Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques |
AU721695B2 (en) * | 1996-08-16 | 2000-07-13 | Dong Wha Pharmaceutical Industrial Co., Ltd. | HBV polymerase, RNase H enzyme derived from HBV polymerase, processes for preparation and uses for screening antiviral agents thereof |
WO1999012558A1 (en) * | 1997-09-10 | 1999-03-18 | Allegheny University Of The Health Sciences | Inhibitors of collagen assembly |
CA2243985C (en) * | 1997-09-11 | 2004-08-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable dna polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes |
US6077940A (en) * | 1997-12-24 | 2000-06-20 | Genentech, Inc. | Free solution ligand interaction molecular separation method |
DE19810879A1 (de) * | 1998-03-13 | 1999-09-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymerasenchimären |
EP1159453B1 (en) | 1999-03-10 | 2008-05-28 | ASM Scientific, Inc. | A method for direct nucleic acid sequencing |
US7056661B2 (en) * | 1999-05-19 | 2006-06-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for sequencing nucleic acid molecules |
US20030077808A1 (en) * | 2000-01-31 | 2003-04-24 | Rosen Craig A. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
US20030140369A1 (en) * | 2000-02-29 | 2003-07-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel defense induced multi-drug resistance genes and uses thereof |
US20020012931A1 (en) * | 2000-03-27 | 2002-01-31 | Waldman Scott A. | High specificity marker detection |
US6917726B2 (en) | 2001-09-27 | 2005-07-12 | Cornell Research Foundation, Inc. | Zero-mode clad waveguides for performing spectroscopy with confined effective observation volumes |
US20030036181A1 (en) * | 2000-06-30 | 2003-02-20 | Okkels Jens Sigurd | Peptide extended glycosylated polypeptides |
DE10034804A1 (de) * | 2000-07-18 | 2002-01-31 | Bayer Ag | Verwendung von VLCFAE zum Identifizieren von herbizid wirksamen Verbindungen |
WO2002029027A1 (en) | 2000-10-04 | 2002-04-11 | Ahram Biosystems Inc. | Immobilized dna polymerase |
MXPA03009566A (es) | 2001-04-19 | 2004-12-06 | Scripps Research Inst | Metodos y composicion para la produccion de pares trna-aminoaciltrna sintetasa ortogonales. |
DK1421213T3 (da) | 2001-08-29 | 2010-06-07 | Ge Healthcare Bio Sciences | Mærkede nukleosidpolyphosphater |
US20050187718A1 (en) * | 2001-09-21 | 2005-08-25 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Novel purified polypeptides from Streptococcus pneumoniae |
EP1583843B1 (en) | 2002-12-20 | 2018-07-18 | QIAGEN GmbH | Single primer whole genome amplification |
WO2004092331A2 (en) | 2003-04-08 | 2004-10-28 | Li-Cor, Inc. | Composition and method for nucleic acid sequencing |
CA2520750A1 (en) | 2003-04-17 | 2004-11-04 | The Scripps Research Institute | Orthogonal aminoacyl-trna synthetase |
CN101076598B (zh) | 2003-07-07 | 2012-07-25 | 斯克利普斯研究院 | 正交赖氨酰-tRNA和氨酰-tRNA合成酶对的组合物及其应用 |
US20060160175A1 (en) | 2003-07-07 | 2006-07-20 | The Scripps Research Institute | Compositions of orthogonal leucyl-trna and aminoacyl-trna synthetase pairs and uses thereof |
EP1658366A4 (en) | 2003-07-07 | 2006-08-09 | Scripps Research Inst | COMPOSITIONS OF ORTHOGONAL GLUTAMYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASEPAARES AND THEIR USES |
US7405281B2 (en) | 2005-09-29 | 2008-07-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor |
WO2007075987A2 (en) | 2005-12-22 | 2007-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Active surface coupled polymerases |
EP1963536B1 (en) | 2005-12-22 | 2016-05-04 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Polymerases for nucleotide analogue incorporation |
WO2007075873A2 (en) | 2005-12-22 | 2007-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Protein engineering strategies to optimize activity of surface attached proteins |
AU2007309504B2 (en) | 2006-10-23 | 2012-09-13 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing |
US8906660B2 (en) | 2012-02-01 | 2014-12-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Recombinant polymerases with increased phototolerance |
US9399766B2 (en) | 2012-10-01 | 2016-07-26 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Recombinant polymerases for incorporation of protein shield nucleotide analogs |
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-
2020
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002086088A2 (en) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Li-Cor, Inc. | Polymerases with charge-switch activity and methods of generating such polymerases |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014515920A (ja) * | 2011-05-06 | 2014-07-07 | キアゲン ゲーエムベーハー | リンカーを介して結合した標識を含むオリゴヌクレオチド |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2633524A1 (en) | 2007-07-05 |
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