CN113122517B - 聚合酶突变体及其应用 - Google Patents

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CN113122517B CN202110316008.9A CN202110316008A CN113122517B CN 113122517 B CN113122517 B CN 113122517B CN 202110316008 A CN202110316008 A CN 202110316008A CN 113122517 B CN113122517 B CN 113122517B
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Abstract

本申请公开了聚合酶突变体及其应用。该聚合酶突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过以下突变后的氨基酸序列：第368位的苏氨酸突变为苯丙氨酸、第372位的苏氨酸突变为亮氨酸、第375位的谷氨酸突变为丝氨酸或赖氨酸、第478位的赖氨酸突变为酪氨酸、第484位的丙氨酸突变为谷氨酸、第512位的赖氨酸突变为酪氨酸。该聚合酶突变体至少具有如下有益效果：发明人意外地发现，具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的Phi29聚合酶的上述位点发生突变后获得的突变体对于分子结构更复杂、分子量更大的核苷酸类似物底物具有更高的利用效率，可以有效利用核苷酸类似物进行模板DNA的复制和延伸。

Description

聚合酶突变体及其应用
技术领域
本申请涉及测序技术领域，尤其是涉及聚合酶突变体及其应用。
背景技术
自1977年第一代测序技术的发明，测序技术已历经三代更迭发展。为适应广大的市场需求，纳米孔测序技术，凭借其小型化、自动化、低成本、高通量、高灵敏度等诸多优势，成为世界公认的第四代测序技术。与传统的测序技术不同，纳米孔测序可以在不对DNA进行生物或化学处理的前提下，直接采用物理办法读出DNA序列。其原理可以描述为：单个碱基通过纳米孔通道时，会引起通道电学参数的变化，对于A、C、T、G四种不同的碱基，其化学性质的差异所引起的电学参数的变化量也不同，对这些变化进行检测可以得到相应碱基的类型从而实现测序。
DNA链高速通过纳米孔的特性使得纳米孔测序成为可能，但其速度一般在微秒级别，过快的速度使得检测的信号质量较低甚至无法被检测到。相比较而言，DNA与DNA酶发生结合时，受酶催化反应的速度限制，其速度在毫秒级别左右，这提示可以通过DNA酶来控制DNA链在纳米孔中的通过速率，从而提高检测信号质量。因此，研发人员尝试将DNA外切酶与纳米孔复合，当DNA链靠近纳米孔时，DNA外切酶将核苷酸逐个剪下，剪下的核苷酸在电压驱动下通过纳米孔，相比于直接以DNA链通过的方式，速率放缓，对不同核苷酸的检测信号更容易区分。但利用外切酶测序过程中仍有许多需要改进的地方。因此，更多的研究针对DNA聚合酶控制DNA的通过速率。例如，有报道提出一种使用经过修饰的核苷酸类似物和纳米孔进行边合成边测序的方法，在该方法中，DNA聚合酶和纳米孔复合，当DNA模板链上具有部分杂交的引物并与纳米孔接触时，DNA聚合酶催化经过修饰的核苷酸类似物合成互补链，通过对该过程中引起的纳米孔电学参数的变化进行检测以完成测序。
Phi29 DNA聚合酶即嗜热脂肪芽孢杆菌的噬菌体Phi29中的p2蛋白。体外条件下，Phi29能够催化寡核苷酸引物起始的延伸反应，而且特有的结构域组成和折叠使其具有高保真性和卓越的链置换能力，在众多的商业化酶中，持续合成能力最高(>70kb)、延伸速率最快(50-200bp/s)。然而，相比于一般的核苷酸，上述纳米孔测序方法中所采用的核苷酸类似物的分子结构与天然核苷酸底物明显不同，野生型Phi29 DNA聚合酶对经修饰的核苷酸类似物底物的利用效率较低。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种能够对核苷酸类似物具有较高利用效率的聚合酶突变体及其应用。
本申请的第一方面，提供聚合酶突变体，该聚合酶突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过以下突变后的氨基酸序列：第368位的苏氨酸突变为苯丙氨酸(T368F)、第372位的苏氨酸突变为亮氨酸(T372L)、第375位的谷氨酸突变为丝氨酸或赖氨酸(E375S或E375K)、第478位的赖氨酸突变为酪氨酸(K478Y)、第484位的丙氨酸突变为谷氨酸(A484E)、第512位的赖氨酸突变为酪氨酸(K512Y)。
其中，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列如下：
MKHMPRKMYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIKGTGSGALKTLESIVGDLEKADELKRKYGSASAVRRLPVEELRELGFSDDEIAEIKGIPKKLREAFDLETAAELYERYGSLKEIGRRLSYDDLLELGATPKAAAEIKGPEFKFLLNIEGVGPKLAERILEAVDYDLERLASLNPEELAEKVEGLGEELAERVVYAARERVESRRKSGRQERSEEEWKEWLERKVGEGRARRLIEYFGSAGEVGKLVENAEVSKLLEVPGIGDEAVARLVPGYKTLRDAGLTPAEAERVLKRYGSVSKVQEGATPDELRELGLGDAKIARILGLRSLVNKRLDVDTAYELKRRYGSVSAVRKAPVKELRELGLSDRKIARIKGIPETMLQVRGMSVEKAERLLERFDTWTKVKEAPVSELVRVPGVGLSLVKEIKAQVDPAWKALLDVKGVSPELADRLVEELGSPYRVLTAKKSDLMRVERVGPKLAERIRAAG。
根据本申请实施例的聚合酶突变体，至少具有如下有益效果：
发明人意外地发现，具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的Phi29EL聚合酶的上述位点发生突变后获得的突变体对于分子结构更复杂、分子量更大的核苷酸类似物底物具有更高的利用效率，可以有效利用核苷酸类似物进行模板DNA的复制和延伸。
根据本申请的一些实施方式，该聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2～3中任一种所示。
其中，SEQ ID No.2所示的氨基酸序列如下：
MKHMPRKMYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWFYIKLTSSGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPYKLGYWEHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGYLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIKGTGSGALKTLESIVGDLEKADELKRKYGSASAVRRLPVEELRELGFSDDEIAEIKGIPKKLREAFDLETAAELYERYGSLKEIGRRLSYDDLLELGATPKAAAEIKGPEFKFLLNIEGVGPKLAERILEAVDYDLERLASLNPEELAEKVEGLGEELAERVVYAARERVESRRKSGRQERSEEEWKEWLERKVGEGRARRLIEYFGSAGEVGKLVENAEVSKLLEVPGIGDEAVARLVPGYKTLRDAGLTPAEAERVLKRYGSVSKVQEGATPDELRELGLGDAKIARILGLRSLVNKRLDVDTAYELKRRYGSVSAVRKAPVKELRELGLSDRKIARIKGIPETMLQVRGMSVEKAERLLERFDTWTKVKEAPVSELVRVPGVGLSLVKEIKAQVDPAWKALLDVKGVSPELADRLVEELGSPYRVLTAKKSDLMRVERVGPKLAERIRAAG。
SEQ ID No.3所示的氨基酸序列如下：
MKHMPRKMYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWFYIKLTSKGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPYKLGYWEHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGYLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIKGTGSGALKTLESIVGDLEKADELKRKYGSASAVRRLPVEELRELGFSDDEIAEIKGIPKKLREAFDLETAAELYERYGSLKEIGRRLSYDDLLELGATPKAAAEIKGPEFKFLLNIEGVGPKLAERILEAVDYDLERLASLNPEELAEKVEGLGEELAERVVYAARERVESRRKSGRQERSEEEWKEWLERKVGEGRARRLIEYFGSAGEVGKLVENAEVSKLLEVPGIGDEAVARLVPGYKTLRDAGLTPAEAERVLKRYGSVSKVQEGATPDELRELGLGDAKIARILGLRSLVNKRLDVDTAYELKRRYGSVSAVRKAPVKELRELGLSDRKIARIKGIPETMLQVRGMSVEKAERLLERFDTWTKVKEAPVSELVRVPGVGLSLVKEIKAQVDPAWKALLDVKGVSPELADRLVEELGSPYRVLTAKKSDLMRVERVGPKLAERIRAAG。
其中，上述的聚合酶突变体中，突变前的Phi29EL聚合酶(SEQ ID No.1)中，在Phi29聚合酶的C端通过连接肽嵌合有坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V的E～L的HhH基序。该拓扑异构酶V的E～L的HhH基序的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示：
LKTLESIVGDLEKADELKRKYGSASAVRRLPVEELRELGFSDDEIAEIKGIPKKLREAFDLETAAELYERYGSLKEIGRRLSYDDLLELGATPKAAAEIKGPEFKFLLNIEGVGPKLAERILEAVDYDLERLASLNPEELAEKVEGLGEELAERVVYAARERVESRRKSGRQERSEEEWKEWLERKVGEGRARRLIEYFGSAGEVGKLVENAEVSKLLEVPGIGDEAVARLVPGYKTLRDAGLTPAEAERVLKRYGSVSKVQEGATPDELRELGLGDAKIARILGLRSLVNKRLDVDTAYELKRRYGSVSAVRKAPVKELRELGLSDRKIARIKGIPETMLQVRGMSVEKAERLLERFDTWTKVKEAPVSELVRVPGVGLSLVKEIKAQVDPAWKALLDVKGVSPELADRLVEELGSPYRVLTAKKSDLMRVERVGPKLAERIRAAG。
在利用聚合酶进行纳米孔测序时，较高的盐浓度对于减缓过孔速率有重要作用，能够有效提高检测分辨率。但是，常规的聚合酶在高盐浓度条件下活性降低，因此，通过引入坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V的HhH基序提高Phi29聚合酶对高盐溶液的耐受性，保证测序质量和速度。
本申请的第二方面，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸包括：
(a)编码上述的聚合酶突变体的核苷酸序列；
(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
根据本申请的一些实施方式，分离的多核苷酸的序列如SEQ ID No.5～6中任一种所示。
本申请的第三方面，提供重组载体，该重组载体包括上述的多核苷酸。
本申请的第四方面，提供宿主细胞，该宿主细胞包括上述的重组载体，或包括上述的多核苷酸。
本申请的第五方面，提供上述的聚合酶突变体在核酸的复制、扩增或测序中的应用。
本申请的第六方面，提供DNA模板的测序方法，该测序方法包括以下步骤：
(1)提供DNA模板、引物、核苷酸底物及上述的聚合酶突变体；
(2)在聚合酶突变体催化下，引导核苷酸底物掺入DNA模板，确定核苷酸底物的掺入顺序。
其中，引物是指天然或人工合成的寡核苷酸，在适当条件下(例如在缓冲液中提供核苷酸底物、聚合酶等反应原料并提供特定的温度条件)能够作为核酸合成的起始点进行延伸，从而使核苷酸底物掺入DNA模板，合成DNA模板的互补链。核苷酸底物是指由戊糖、磷酸酯及含氮杂环碱基形成的核苷酸单元或这些核苷酸单元的修饰产物。修饰产物具体是指通过对核苷酸进行修饰标记，以使不同类别的核苷酸(包括脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧尿苷)的大小、质量、电荷量等产生明显区别，从而提高检测过程中不同类别核苷酸之间的区分度。一方面，核苷酸类似物可以是包含多个磷酸基团的核苷酸，具体可以是二磷酸核苷酸、三磷酸核苷酸、四磷酸核苷酸、五磷酸核苷酸、六磷酸核苷酸等多磷酸核苷酸。另一方面，为了增强对核苷酸类似物的鉴别，多磷酸核苷酸上还可以进一步针对不同碱基在磷酸基团上引入不同长度/质量的标签，具体的标签可以是任选的聚合物接头如聚乙二醇或其衍生物，以及染料分子如香豆素等。
根据本申请的一些实施方式，在掺入过程中，聚合酶突变体复合在纳米孔上或与纳米孔处于相对接近的位置。其中，纳米孔(nanopore)是指具有纳米尺度孔隙的材料，具体可以包括生物纳米孔、固态纳米孔、以及生物纳米孔和固态纳米孔的复合纳米孔。生物纳米孔具体可以例举出包括但不限于金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白纳米孔(α-HL)、耻垢分枝杆菌孔道蛋白A(MspA)、噬菌体Phi29连接器(Phi29 connector)。固态纳米孔具体可以例举出包括但不限于以氮化硅、二氧化硅、氧化铝、玻璃毛细管、二硫化钼、石墨烯等材料制备得到的纳米孔。
根据本申请的一些实施方式，确定核苷酸底物的掺入顺序的具体方法包括但不限于根据不同的核苷酸底物的化学性质的差异，分析掺入过程中体系的电学信号和/或光学信号，从而得到不同的核苷酸底物的掺入顺序。其中，电学信号的非限制性实例包括电流信号，具体的检测方式例如检测离子电流、隧道电流等。光学信号的非限制性实例包括荧光信号，具体的检测方式例如通过荧光共振能量转移检测等。
根据本申请的一些实施方式，核苷酸底物为核苷酸、核苷酸类似物中的至少一种。
核苷酸类似物作为底物在聚合酶催化作用下合成与DNA模板链互补的产物链时，修饰的标签通过聚合酶从核苷酸类似物中释放。释放出的标签通过跨孔电压等方式的介导，平移通过纳米孔，从而改变跨孔电流。通过检测其电流变化，可以推导出DNA链的碱基序列。
根据本申请的一些实施方式，核苷酸类似物的分子量在1500～15000。当核苷酸类似物的分子量达到1500～15000时，标签的长度足够长，使过孔速率大大放缓，对纳米孔跨孔电流信号的检测分辨率明显提高。但同时，对于聚合酶对核苷酸类似物底物的利用效率也提出了更高的要求。另外，不同的核苷酸类似物携带有不同的标签，而不同标签的长度和结构的不同使其过孔时的阻滞电流和阻滞时间也不相同，从而能够区别不同的底物类型。优选的，核苷酸类似物的分子量为2000～15000、3000～15000、5000～15000。
根据本申请的一些实施方式，核苷酸类似物为多磷酸核苷酸。
根据本申请的一些实施方式，核苷酸类似物的磷酸基团在四个以上。
根据本申请的一些实施方式，核苷酸类似物的磷酸基团在六个以上。磷酸基团越多，对于聚合酶的要求也越高，当核苷酸类似物的磷酸基团在六个以上时，本申请实施例中所提供的聚合酶突变体仍然对其有较好的利用率。
本申请的第七方面，提供组合物，该组合物包括上述的聚合酶突变体。该组合物具体可以是纳米孔和聚合酶突变体的组合物，纳米孔和聚合酶突变体通过共价连接或其它本领域熟知的方式结合到一起。在另外一些情况下，该组合物还可以是核苷酸底物和聚合酶突变体的组合物。在进行纳米孔测序或其它测序过程中，加入包含聚合酶突变体和核苷酸底物的混合液进行反应。
本申请的第八方面，提供测序系统，该测序系统包括上述的聚合酶突变体。该测序系统能够以修饰后的核苷酸类似物作为底物参与待测序DNA模板的互补链的合成，有效进行延伸反应，从而完成测序。
根据本申请的一些实施方式，该测序系统为纳米孔测序系统，该纳米孔测序系统在纳米孔上复合有上述的聚合酶突变体。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的一个实施例的pGH-18B的PCR产物的电泳结果，左侧为marker，右侧为pGH-18B的条带。
图2是本申请的一个实施例的pET28a-Phi29EL、pGH-14B和pGH-18B的质粒双酶切产物的电泳结果，(A)为pET28a-Phi29EL，(B)为pGH-14B，(C)为pGH-18B；左侧为marker，右侧为对应质粒的条带。
图3是本申请的一个实施例的表达载体pET28a-Phi29EL-14B和pET28a-Phi29EL-18B的质粒双酶切产物的电泳结果，(A)为pET28a-Phi29EL-14B，(B)为pET28a-Phi29EL-18B；左侧为marker，右侧为对应表达载体的条带。
图4是本申请的一个实施例的聚合酶突变体的12％SDS-PAGE电泳结果，(A)为Phi29EL-14B聚合酶，(B)为Phi29EL-18B聚合酶。
图5是本申请的一个实施例中部分核苷酸类似物的结构式示意图。
图6是本申请的一个实施例的发卡模板示意图。
图7是本申请的一个实施例中发卡延伸反应实验结果的电泳图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
下述实施例中使用的材料说明如下：
Phi29-EL：将野生型Phi29聚合酶引入坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V的HhH基序的E～L基序得到的嵌合体聚合酶(具体参考中国专利CN110747191A)。
pET28a-Phi29EL：在pET28a质粒载体上插入Phi29-EL的基因片段得到的重组载体(具体参考中国专利CN110747191A)。
定点突变试剂盒
Figure BDA0002991211220000081
Site-Directed Mutagenesis Kit：购自NEB公司，货号E0552。
大肠杆菌表达菌株BL21：购自Transgene公司。
普通DNA产物纯化试剂盒：购自天根公司，货号DP204-02。
KpnI限制性内切酶：购自NEB公司，货号R0142S。
BstBI限制性内切酶：购自NEB公司，货号R0519S。
连接溶液Solution I：购自Takara公司，货号6022Q。
质粒提取试剂盒
Figure BDA0002991211220000082
Plasmid DNA Purification Kit：购自威邦生命科学(香港)有限公司，货号NP11001.50/200。
实施例1
本实施例提供聚合酶突变体，该聚合酶突变体的制备过程如下：
1实验步骤
1.1聚合酶突变体Phi29EL-14B基因片段合成
以Phi29-EL的核苷酸序列为基础，通过全基因合成获得包含6个突变位点(T368F、T372L、E375S、K478Y、A484E、K512Y)的基因片段(记为pGH-14B，长度858bp)，pGH-14B片段的5′和3′端分别包含BstBI和KpnI酶切位点，并连接到pGH载体上。
1.2点突变生成pGH-18B基因片段
以pGH-14B为模板，设计引物，利用定点突变试剂盒
Figure BDA0002991211220000083
Site-DirectedMutagenesis Kit进行S375K定点突变，得到相对于Phi29-EL包含6个突变位点(T368F、T372L、E375K、K478Y、A484E、K512Y)的基因片段(记为pGH-18B)。准备PCR反应体系，如表1所示：
表1.点突变反应体系
Figure BDA0002991211220000084
突变正向引物的序列为：AAAGGAGCGATCAAGCAAC(SEQ ID No.7)；
突变反向引物的序列为：TGATGTCAACTTGATGTAAAAC(SEQ ID No.8)。
PCR扩增的条件为98℃变性30s，循环周期为98℃，10s，55℃，22s，72℃，2min，30个循环；72℃，2min。
取PCR产物，进行Kinase-Ligase-DpnI(KLD)处理去除模板、连接片段。反应体系如表2所示：
表2.PCR产物处理体系
Figure BDA0002991211220000091
将反应体系混匀，室温孵育5min。转化大肠杆菌表达菌株BL21，将测序验证正确的载体pGH-18B，用于下一步实验。
1.3载体酶切
选取pET28a-Phi29EL、pGH-14B和pGH-18B的质粒进行双酶切。准备酶切反应体系，进行分步酶切。第一步酶切如下：
表3.Kpn I酶切反应体系
Figure BDA0002991211220000092
酶切反应条件为37℃，16h。选取酶切产物，准备第二步酶切体系，如表4：
表4.BstBI酶切反应体系
Figure BDA0002991211220000093
酶切反应条件为：65℃，4h。
酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带选取凝胶用普通DNA产物纯化试剂盒进行回收。
1.4片段连接
连接Phi29EL片段、pGH-14B片段和pGH-18B，用1.3中pGH-14B(或pGH-18B)质粒酶切回收产物片段替换野生型Phi29EL片段中对应片段，得到Phi29EL-14B(或Phi29EL-18B)。准备连接反应体系，如表5：
表5.Phi29EL-14B(或Phi29EL-18B)连接反应体系
Figure BDA0002991211220000101
连接溶液为Solution I。连接反应条件为：16℃，30min。
取连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取阳性克隆。选用质粒提取试剂盒
Figure BDA0002991211220000102
Plasmid DNA Purification Kit提取质粒，进行测序，获得序列正确的突变型Phi29DNA聚合酶质粒pET28a-Phi29EL-14B(或pET28a-Phi29EL-18B)。
1.5蛋白表达纯化
取质粒pGEX6P-1-Phi29、pET28a-Phi29EL、pET28a-Phi29EL-14B和pET28a-Phi29EL-18B，转化大肠杆菌表达菌株BL21，表达野生型Phi29 DNA聚合酶、Phi29-EL DNA聚合酶、Phi29EL-14B DNA聚合酶和Phi29EL-18B DNA聚合酶。蛋白诱导表达选择低温诱导，诱导条件为16℃，16h。
蛋白纯化步骤包括：
①收集菌体，超声破碎细胞。功率50～100W，超声5～15s，间隔10～30s。共持续20～40min。
②离心去除细胞碎片，取上清。分别采用采用Glutathione Sepharose 4B和NiSepharose亲和层析柱纯化步骤裂解粗产物。
③用12％SDS-PAGE检测蛋白纯度和浓度。
2.实验结果
2.1pGH-18B点突变结果
图1是pGH-18B的PCR产物的电泳结果，扩增产物约为4kb。从图中可以看出，该次PCR已扩增出目的条带。
2.2酶切结果
图2是质粒双酶切结果。其中，(A)为pET28a-Phi29EL，(B)为pGH-14B，(C)为pGH-18B；(A)、(B)、(C)中左侧为marker，右侧为对应质粒的两个重复的条带。结合图2，pET28a-Phi29EL、pGH-14B和pGH-18B经质粒双酶切分别回收图中所示的7000bp左右和855bp左右的片段。
2.3pET28a-Phi29EL-14B载体酶切验证
图3是表达载体双酶切结果。其中，(A)为pET28a-Phi29EL-14B，(B)为pET28a-Phi29EL-18B；(A)、(B)中左侧为marker，右侧为对应表达载体的条带。其中，pET28a-Phi29EL-14B用KpnI和BstBI双酶切，pET28a-Phi29EL-18B用EcoRI和NotI双酶切，并对正确的克隆菌株测序验证。
2.4Phi29EL-14B和Phi29EL-18B蛋白检测
图4是聚合酶突变体的12％SDS-PAGE电泳结果，(A)为Phi29EL-14B聚合酶的结果，(B)为Phi29EL-18B聚合酶的结果。其中，M为蛋白分子量Marker；泳道1和泳道2为突变型聚合酶的两个重复。结合图4，上述聚合酶突变体的分子量均为116.6kD。
其中，Phi29EL-14B的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；Phi29EL-18B的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
实施例2
聚合酶突变体底物结合能力检测
天然核苷酸底物由碱基、核糖和三个磷酸组成，每个核苷酸的整合，伴随着DNA链的延伸和焦磷酸的释放。在DNA聚合酶辅助的纳米孔测序技术中，单个DNA聚合酶分子共价结合到α-溶血素七聚物纳米孔上，DNA聚合酶结合模板引物复合物后，以携带标记的核苷酸为底物，进行边合成边测序。纳米孔依次捕获和检测携带标记的核苷酸，从而产生核苷酸特异的电流信号。根据这一原理，本实施例中设计合成了包含六个磷酸基团、聚乙二醇(PEG)侧链和香豆素(Coumarin)的核苷酸类似物，记为Coumarin-PEGm-dN6P(CPm-dN6P)，其中，m表示核苷酸类似物中聚乙二醇单元的重复数量，N表示A、T、C、G中的任一种。
具体如下：Coumarin-PEG12-dA6P(CP12-dA6P)、Coumarin-PEG24-dC6P(CP24-dC6P)、Coumarin-PEG24-dA6P(CP24-dA6P)、Coumarin-PEG24-dT6P(CP24-dT6P)、Coumarin-PEG24-dG6P(CP24-dG6P)、Coumarin-PEG36-dT6P(CP36-dT6P)和Coumarin-PEG44-dG6P(CP44-dG6P)，部分核苷酸类似物的结构式如图5中的(A)～(D)所示。
取等量的Phi29ELDNA聚合酶、Phi29EL-14B DNA聚合酶和Phi29EL-18B DNA聚合酶，以核苷酸类似物为底物，进行发夹延伸实验，检测突变体底物结合能力。发夹模板如图6所示，长度为53nt，延伸产物长度为74nt。延伸反应结束后，模板链含量减少，生成产物链。根据有无产物链以及产物链的含量，即可判断DNA聚合酶对特异性底物的结合能力。
将200nM实施例1中制得的DNA聚合酶、500nM的发夹模板及反应缓冲液混合，得到反应体系，另外以Phi29EL DNA聚合酶作为对照。反应体系包括：dNTP(-KCl)组、dNTP(+KCl)组、CP-dN6P(-KCl)组、CP-dN6P(+KCl)组，具体组成如表6所示：
其中，反应缓冲液由50mM的Tris-HCl、10mM的MgCl2、10mM的(NH4)2SO4、4mM的DTT及200μM dNTPs组成，反应缓冲液在25℃条件下的pH为7.5。将反应体系在温度为30℃的条件下反应10min，得到反应产物。
表6发夹延伸反应体系
Figure BDA0002991211220000121
将反应产物加入6×DNA loading后，上样到20％TBE-Urea聚丙烯酰胺凝胶中；电泳条件为180V，3h。电泳结束后，将PAGE胶浸泡在SYBR Gold染液中，缓慢水平震荡约20min。然后利用Azure Biosystems成像检测模板链和产物链的亮度。通过模板链和产物链的亮度确定实施例1制备的DNA聚合酶的活性。
实验结果如图7所示，从图中可以看出，实施例1制备的DNA聚合酶的具有DNA酶的活性，且Phi29EL-14B和Phi29EL-18B分别能够以CP24-dC6P、CP24-dA6P、CP24-dT6P和CP24-dG6P的混合物为底物，还能够以CP12-dA6P、CP24-dC6P、CP36-dT6P和CP44-dG6P混合物为底物，合成全长的延伸产物。而作为对照的Phi29EL DNA聚合酶以两类核苷酸类似物为底物时，全部或者大部分产物为不完全延伸产物。
比较不同KCl浓度对反应的影响，从图中可以看出，添加0.3M KCl时，三种DNA聚合酶的活性均有一定程度的下降，但仍然能够利用核苷酸类似物合成产物链。其中，Phi29EL-14B和Phi29EL-18B这两种DNA聚合酶能够利用天然底物和修饰底物，合成少量全长产物；而Phi29EL聚合酶仅能生成少量的不完全延伸产物。证实Phi29EL-14B和Phi29EL-18B这两种DNA聚合酶在低盐和高盐浓度下，均能有效利用包含PEG侧链的核苷酸类似物为底物，进行DNA复制和延伸。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳清华大学研究院
安序源生物科技(深圳)有限公司
<120> 聚合酶突变体及其应用
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1028
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
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Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
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Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
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Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Gly
565 570 575
Thr Gly Ser Gly Ala Leu Lys Thr Leu Glu Ser Ile Val Gly Asp Leu
580 585 590
Glu Lys Ala Asp Glu Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Ala Ser Ala Val
595 600 605
Arg Arg Leu Pro Val Glu Glu Leu Arg Glu Leu Gly Phe Ser Asp Asp
610 615 620
Glu Ile Ala Glu Ile Lys Gly Ile Pro Lys Lys Leu Arg Glu Ala Phe
625 630 635 640
Asp Leu Glu Thr Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Arg Tyr Gly Ser Leu Lys
645 650 655
Glu Ile Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Leu Glu Leu Gly Ala
660 665 670
Thr Pro Lys Ala Ala Ala Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Leu
675 680 685
Leu Asn Ile Glu Gly Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Leu Glu
690 695 700
Ala Val Asp Tyr Asp Leu Glu Arg Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Glu
705 710 715 720
Leu Ala Glu Lys Val Glu Gly Leu Gly Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val
725 730 735
Val Tyr Ala Ala Arg Glu Arg Val Glu Ser Arg Arg Lys Ser Gly Arg
740 745 750
Gln Glu Arg Ser Glu Glu Glu Trp Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Val
755 760 765
Gly Glu Gly Arg Ala Arg Arg Leu Ile Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Gly
770 775 780
Glu Val Gly Lys Leu Val Glu Asn Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Glu
785 790 795 800
Val Pro Gly Ile Gly Asp Glu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro Gly Tyr
805 810 815
Lys Thr Leu Arg Asp Ala Gly Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Arg Val
820 825 830
Leu Lys Arg Tyr Gly Ser Val Ser Lys Val Gln Glu Gly Ala Thr Pro
835 840 845
Asp Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Gly Asp Ala Lys Ile Ala Arg Ile
850 855 860
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Val Asn Lys Arg Leu Asp Val Asp Thr Ala
865 870 875 880
Tyr Glu Leu Lys Arg Arg Tyr Gly Ser Val Ser Ala Val Arg Lys Ala
885 890 895
Pro Val Lys Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Ser Asp Arg Lys Ile Ala
900 905 910
Arg Ile Lys Gly Ile Pro Glu Thr Met Leu Gln Val Arg Gly Met Ser
915 920 925
Val Glu Lys Ala Glu Arg Leu Leu Glu Arg Phe Asp Thr Trp Thr Lys
930 935 940
Val Lys Glu Ala Pro Val Ser Glu Leu Val Arg Val Pro Gly Val Gly
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Leu Ser Leu Val Lys Glu Ile Lys Ala Gln Val Asp Pro Ala Trp Lys
965 970 975
Ala Leu Leu Asp Val Lys Gly Val Ser Pro Glu Leu Ala Asp Arg Leu
980 985 990
Val Glu Glu Leu Gly Ser Pro Tyr Arg Val Leu Thr Ala Lys Lys Ser
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Asp Leu Met Arg Val Glu Arg Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg
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1025
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<211> 1028
<212> PRT
<213> 人工序列
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Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
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Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Phe
355 360 365
Tyr Ile Lys Leu Thr Ser Lys Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Tyr Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Glu His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Tyr
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Gly
565 570 575
Thr Gly Ser Gly Ala Leu Lys Thr Leu Glu Ser Ile Val Gly Asp Leu
580 585 590
Glu Lys Ala Asp Glu Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Ala Ser Ala Val
595 600 605
Arg Arg Leu Pro Val Glu Glu Leu Arg Glu Leu Gly Phe Ser Asp Asp
610 615 620
Glu Ile Ala Glu Ile Lys Gly Ile Pro Lys Lys Leu Arg Glu Ala Phe
625 630 635 640
Asp Leu Glu Thr Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Arg Tyr Gly Ser Leu Lys
645 650 655
Glu Ile Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Leu Glu Leu Gly Ala
660 665 670
Thr Pro Lys Ala Ala Ala Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Leu
675 680 685
Leu Asn Ile Glu Gly Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Leu Glu
690 695 700
Ala Val Asp Tyr Asp Leu Glu Arg Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Glu
705 710 715 720
Leu Ala Glu Lys Val Glu Gly Leu Gly Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val
725 730 735
Val Tyr Ala Ala Arg Glu Arg Val Glu Ser Arg Arg Lys Ser Gly Arg
740 745 750
Gln Glu Arg Ser Glu Glu Glu Trp Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Val
755 760 765
Gly Glu Gly Arg Ala Arg Arg Leu Ile Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Gly
770 775 780
Glu Val Gly Lys Leu Val Glu Asn Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Glu
785 790 795 800
Val Pro Gly Ile Gly Asp Glu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro Gly Tyr
805 810 815
Lys Thr Leu Arg Asp Ala Gly Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Arg Val
820 825 830
Leu Lys Arg Tyr Gly Ser Val Ser Lys Val Gln Glu Gly Ala Thr Pro
835 840 845
Asp Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Gly Asp Ala Lys Ile Ala Arg Ile
850 855 860
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Val Asn Lys Arg Leu Asp Val Asp Thr Ala
865 870 875 880
Tyr Glu Leu Lys Arg Arg Tyr Gly Ser Val Ser Ala Val Arg Lys Ala
885 890 895
Pro Val Lys Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Ser Asp Arg Lys Ile Ala
900 905 910
Arg Ile Lys Gly Ile Pro Glu Thr Met Leu Gln Val Arg Gly Met Ser
915 920 925
Val Glu Lys Ala Glu Arg Leu Leu Glu Arg Phe Asp Thr Trp Thr Lys
930 935 940
Val Lys Glu Ala Pro Val Ser Glu Leu Val Arg Val Pro Gly Val Gly
945 950 955 960
Leu Ser Leu Val Lys Glu Ile Lys Ala Gln Val Asp Pro Ala Trp Lys
965 970 975
Ala Leu Leu Asp Val Lys Gly Val Ser Pro Glu Leu Ala Asp Arg Leu
980 985 990
Val Glu Glu Leu Gly Ser Pro Tyr Arg Val Leu Thr Ala Lys Lys Ser
995 1000 1005
Asp Leu Met Arg Val Glu Arg Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg
1010 1015 1020
Ile Arg Ala Ala Gly
1025
<210> 4
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Leu Lys Thr Leu Glu Ser Ile Val Gly Asp Leu Glu Lys Ala Asp Glu
1 5 10 15
Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Ala Ser Ala Val Arg Arg Leu Pro Val
20 25 30
Glu Glu Leu Arg Glu Leu Gly Phe Ser Asp Asp Glu Ile Ala Glu Ile
35 40 45
Lys Gly Ile Pro Lys Lys Leu Arg Glu Ala Phe Asp Leu Glu Thr Ala
50 55 60
Ala Glu Leu Tyr Glu Arg Tyr Gly Ser Leu Lys Glu Ile Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Leu Glu Leu Gly Ala Thr Pro Lys Ala Ala
85 90 95
Ala Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Leu Leu Asn Ile Glu Gly
100 105 110
Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Leu Glu Ala Val Asp Tyr Asp
115 120 125
Leu Glu Arg Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Glu Leu Ala Glu Lys Val
130 135 140
Glu Gly Leu Gly Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val Val Tyr Ala Ala Arg
145 150 155 160
Glu Arg Val Glu Ser Arg Arg Lys Ser Gly Arg Gln Glu Arg Ser Glu
165 170 175
Glu Glu Trp Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Val Gly Glu Gly Arg Ala
180 185 190
Arg Arg Leu Ile Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Gly Glu Val Gly Lys Leu
195 200 205
Val Glu Asn Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Glu Val Pro Gly Ile Gly
210 215 220
Asp Glu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro Gly Tyr Lys Thr Leu Arg Asp
225 230 235 240
Ala Gly Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Arg Tyr Gly
245 250 255
Ser Val Ser Lys Val Gln Glu Gly Ala Thr Pro Asp Glu Leu Arg Glu
260 265 270
Leu Gly Leu Gly Asp Ala Lys Ile Ala Arg Ile Leu Gly Leu Arg Ser
275 280 285
Leu Val Asn Lys Arg Leu Asp Val Asp Thr Ala Tyr Glu Leu Lys Arg
290 295 300
Arg Tyr Gly Ser Val Ser Ala Val Arg Lys Ala Pro Val Lys Glu Leu
305 310 315 320
Arg Glu Leu Gly Leu Ser Asp Arg Lys Ile Ala Arg Ile Lys Gly Ile
325 330 335
Pro Glu Thr Met Leu Gln Val Arg Gly Met Ser Val Glu Lys Ala Glu
340 345 350
Arg Leu Leu Glu Arg Phe Asp Thr Trp Thr Lys Val Lys Glu Ala Pro
355 360 365
Val Ser Glu Leu Val Arg Val Pro Gly Val Gly Leu Ser Leu Val Lys
370 375 380
Glu Ile Lys Ala Gln Val Asp Pro Ala Trp Lys Ala Leu Leu Asp Val
385 390 395 400
Lys Gly Val Ser Pro Glu Leu Ala Asp Arg Leu Val Glu Glu Leu Gly
405 410 415
Ser Pro Tyr Arg Val Leu Thr Ala Lys Lys Ser Asp Leu Met Arg Val
420 425 430
Glu Arg Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Arg Ala Ala Gly
435 440 445
<210> 5
<211> 3093
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgccgagaa agatgtatag ttgtgacttt gagacaacta ctaaagtgga agactgtagg 60
gtatgggcgt atggttatat gaatatagaa gatcacagtg agtacaaaat aggtaatagc 120
ctggatgagt ttatggcgtg ggtgttgaag gtacaagctg atctatattt ccataacctc 180
aaatttgacg gagcttttat cattaactgg ttggaacgta atggttttaa gtggtcggct 240
gacggattgc caaacacata taatacgatc atatctcgca tgggacaatg gtacatgatt 300
gatatatgtt taggctacaa agggaaacgt aagatacata cagtgatata tgacagctta 360
aagaaactac cgtttcctgt taagaagata gctaaagact ttaaactaac tgttcttaaa 420
ggtgatattg attaccacaa agaaagacca gtcggctata agataacacc cgaagaatac 480
gcctatatta aaaacgatat tcagattatt gcggaagctc tgttaattca gtttaagcaa 540
ggtttagacc ggatgacagc aggcagtgac agtctaaaag gtttcaagga tattataacc 600
actaagaaat tcaaaaaggt gtttcctaca ttgagtcttg gactcgataa ggaagtgaga 660
tacgcctata gaggtggttt tacatggtta aatgataggt tcaaagaaaa agaaatcgga 720
gaaggcatgg tcttcgatgt taatagtcta tatcctgcac agatgtatag ccgtctcctt 780
ccatatggtg aacctatagt attcgagggt aaatacgttt gggacgaaga ttacccacta 840
cacatacagc atatcagatg tgagttcgaa ttgaaagagg gctatatacc cactatacag 900
ataaaaagaa gtaggtttta taaaggtaat gagtacctaa aaagtagcgg cggggagata 960
gccgacctct ggttgtcaaa tgtagaccta gaattaatga aagaacacta cgatttatat 1020
aacgttgaat atatcagcgg cttaaaattt aaagcaacta caggtttgtt taaagatttt 1080
atagataaat ggttttacat caagttgaca tcaagcggag cgatcaagca actagcaaaa 1140
ctgatgttaa acagtctata cggtaaattc gctagtaacc ctgatgttac agggaaagtc 1200
ccttatttaa aagagaatgg ggcgctaggt ttcagacttg gagaagagga aacaaaagac 1260
cctgtttata cacctatggg cgttttcatc actgcatggg ctagatacac gacaattaca 1320
gcggcacagg cttgttatga tcggataata tactgtgata ctgacagcat acatttaacg 1380
ggtacagaga tacctgatgt aataaaagat atagttgacc cttacaaatt gggatactgg 1440
gaacatgaaa gtacattcaa aagagctaaa tatctgagac agaagaccta tatacaagac 1500
atctatatga aagaagtaga tggttattta gtagaaggta gtccagatga ttacactgat 1560
ataaaattta gtgttaaatg tgcgggaatg actgacaaga ttaagaaaga ggttacgttt 1620
gagaatttca aagtcggatt cagtcggaaa atgaagccta agcctgtgca agtgccgggc 1680
ggggtggttc tggttgatga cacattcaca atcaaaggta ccggctctgg cgccctgaag 1740
accctggaga gcatagtagg ggatctggag aaggccgacg agctgaagcg gaagtacgga 1800
tccgcgtccg cggttcgacg tctgcccgta gaggagctac gcgaactcgg gttctccgac 1860
gatgagatcg ccgagatcaa ggggatacct aagaagctcc gggaggcctt cgaccttgag 1920
accgccgcgg aactctacga gcggtacggt tcgctgaaag agatcggtcg ccgactctct 1980
tacgacgatc tactcgagct cggtgcgact ccgaaggccg cggccgagat caaggggccg 2040
gagttcaagt tcctcctgaa catcgaaggg gtcggaccga aactcgctga gcggatactc 2100
gaggccgtgg attatgacct cgagcgactg gcttccctga atcccgagga acttgcggag 2160
aaggtggaag gactgggcga agagctcgcg gagcgcgtcg tgtacgctgc tagggagcgc 2220
gtagaaagtc gcaggaagtc cggccgccag gagcggtcgg aggaagaatg gaaggagtgg 2280
ctcgagcgta aggtcggcga ggggagggct cgccggttga ttgagtattt cggctccgcg 2340
ggtgaagtag gaaagctggt cgagaacgcc gaggtgtcga agctactgga ggtcccgggt 2400
ataggcgacg aggccgtcgc taggctcgta ccgggctaca agaccctacg agacgccggt 2460
ctcacgccgg ccgaagcgga gcgcgtgctg aaacggtacg gctcggtctc caaagtgcag 2520
gaaggagcca ctccggacga gttacgcgag ctcggcctcg gcgacgccaa gatcgcgagg 2580
atcctgggcc tgcgcagcct ggtgaacaag aggctggacg tggacaccgc gtacgagctc 2640
aagcgtagat acggttccgt ctccgccgtc cggaaggccc cggtgaaaga actgcgcgag 2700
ctcggcctct ccgatcggaa gatcgcacgt atcaagggca tcccggagac gatgcttcag 2760
gtccgaggga tgagcgtgga gaaagcggag cggctgctgg agcgtttcga tacctggacc 2820
aaggtgaagg aagctcccgt ctcggagctg gtgagagtcc cgggtgtcgg attgagtttg 2880
gtgaaggaga tcaaggctca ggtggatccg gcctggaagg cacttctgga tgtcaaaggg 2940
gtcagtccgg agctggccga ccggctcgtc gaggagctcg gcagcccgta tcgggtgctg 3000
acggccaaga aatccgacct gatgagagtc gagagagtcg gaccgaagct cgccgagcga 3060
atccgggccg cgggctaagc ggccgcatcg tga 3093
<210> 6
<211> 3093
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgccgagaa agatgtatag ttgtgacttt gagacaacta ctaaagtgga agactgtagg 60
gtatgggcgt atggttatat gaatatagaa gatcacagtg agtacaaaat aggtaatagc 120
ctggatgagt ttatggcgtg ggtgttgaag gtacaagctg atctatattt ccataacctc 180
aaatttgacg gagcttttat cattaactgg ttggaacgta atggttttaa gtggtcggct 240
gacggattgc caaacacata taatacgatc atatctcgca tgggacaatg gtacatgatt 300
gatatatgtt taggctacaa agggaaacgt aagatacata cagtgatata tgacagctta 360
aagaaactac cgtttcctgt taagaagata gctaaagact ttaaactaac tgttcttaaa 420
ggtgatattg attaccacaa agaaagacca gtcggctata agataacacc cgaagaatac 480
gcctatatta aaaacgatat tcagattatt gcggaagctc tgttaattca gtttaagcaa 540
ggtttagacc ggatgacagc aggcagtgac agtctaaaag gtttcaagga tattataacc 600
actaagaaat tcaaaaaggt gtttcctaca ttgagtcttg gactcgataa ggaagtgaga 660
tacgcctata gaggtggttt tacatggtta aatgataggt tcaaagaaaa agaaatcgga 720
gaaggcatgg tcttcgatgt taatagtcta tatcctgcac agatgtatag ccgtctcctt 780
ccatatggtg aacctatagt attcgagggt aaatacgttt gggacgaaga ttacccacta 840
cacatacagc atatcagatg tgagttcgaa ttgaaagagg gctatatacc cactatacag 900
ataaaaagaa gtaggtttta taaaggtaat gagtacctaa aaagtagcgg cggggagata 960
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aacgttgaat atatcagcgg cttaaaattt aaagcaacta caggtttgtt taaagatttt 1080
atagataaat ggttttacat caagttgaca tcaaaaggag cgatcaagca actagcaaaa 1140
ctgatgttaa acagtctata cggtaaattc gctagtaacc ctgatgttac agggaaagtc 1200
ccttatttaa aagagaatgg ggcgctaggt ttcagacttg gagaagagga aacaaaagac 1260
cctgtttata cacctatggg cgttttcatc actgcatggg ctagatacac gacaattaca 1320
gcggcacagg cttgttatga tcggataata tactgtgata ctgacagcat acatttaacg 1380
ggtacagaga tacctgatgt aataaaagat atagttgacc cttacaaatt gggatactgg 1440
gaacatgaaa gtacattcaa aagagctaaa tatctgagac agaagaccta tatacaagac 1500
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aagcgtagat acggttccgt ctccgccgtc cggaaggccc cggtgaaaga actgcgcgag 2700
ctcggcctct ccgatcggaa gatcgcacgt atcaagggca tcccggagac gatgcttcag 2760
gtccgaggga tgagcgtgga gaaagcggag cggctgctgg agcgtttcga tacctggacc 2820
aaggtgaagg aagctcccgt ctcggagctg gtgagagtcc cgggtgtcgg attgagtttg 2880
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<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaaggagcga tcaagcaac 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgatgtcaac ttgatgtaaa ac 22

Claims (9)

1.聚合酶突变体，其特征在于，所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2~3中任一种所示。
2.分离的多核苷酸，其特征在于，为：
（a）编码权利要求1所述的聚合酶突变体的核苷酸序列；或
（b）与（a）所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID No.5~6中任一种所示。
4.重组载体，其特征在于，包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。
5.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求4所述重组载体，或包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。
6.权利要求1所述的聚合酶突变体在核酸的扩增或测序中的应用。
7.DNA模板的测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提供DNA模板、引物、核苷酸底物及权利要求1所述的聚合酶突变体；
（2）在所述聚合酶突变体催化下，引导所述核苷酸底物掺入所述DNA模板，确定所述核苷酸底物的掺入顺序。
8.组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的聚合酶突变体。
9.测序系统，其特征在于，所述测序系统包括权利要求1所述的聚合酶突变体。
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In vitro evolution of phi29 DNA polymerase using isothermal compartmentalized self replication technique;Tadas Povilaitis et al.;《Protein Engineering, Design & Selection》;20161128;第29卷(第12期);第617-628页 *
深海噬菌体NrS-1 DNA聚合酶结构和功能研究;郭豪杰;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 基础科学辑》;20210115(第1期);摘要，第1-92页 *

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