JP6670237B2 - 酵素によるl−核酸の合成 - Google Patents
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Description
上記変異酵素活性提示部分が、アミノ酸配列を含み、上記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、上記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、上記配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置、好ましくは3つのアミノ酸位置で配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
方法。
a)アミノ酸位置71、76、67、もしくは86のうちの少なくとも1つ、または
b)アミノ酸位置155もしくは203および71、または
c)アミノ酸位置155もしくは203および31、または
d)アミノ酸位置155もしくは203および76、または
e)アミノ酸位置155もしくは203および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203および85、または、
i)アミノ酸位置155および203および71、または、
j)アミノ酸位置155および203および86、または、
k)アミノ酸位置155および203および31、または、
l)アミノ酸位置155および203および76、または、
m)アミノ酸位置155および203および67、または、
n)アミノ酸位置155および203および86、または、
o)アミノ酸位置155および203および96、または、
p)アミノ酸位置155および203および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜p)のうちのいずれか1つで、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態1に記載の方法。
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号121、161、201、241、および281のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号122〜160、162〜200、202〜240、242〜280、および282〜338のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号135、174、214、254、294のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含む、
実施形態6に記載の方法。
a)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155および/もしくは203、および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、実施形態9に記載の方法。
上記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、上記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸が、D−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置、好ましくは3つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
上記変異酵素提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
方法。
a)アミノ酸位置71、76、67、もしくは86のうちの少なくとも1つ、または、
b)アミノ酸位置155もしくは203、および71、または、
c)アミノ酸位置155もしくは203、および31、または、
d)アミノ酸位置155もしくは203、および76、または、
e)アミノ酸位置155もしくは203、および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203、および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203、および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203、および85、または、
i)アミノ酸位置155および203、および71、または、
j)アミノ酸位置155および203、および86、または、
k)アミノ酸位置155および203、および31、または、
l)アミノ酸位置155および203、および76、または、
m)アミノ酸位置155および203、および67、または、
n)アミノ酸位置155および203、および86、または、
o)アミノ酸位置155および203、および96、または、
p)アミノ酸位置155および203、および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜p)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態25に記載の方法。
a)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは85
で、配列番号121、161、201、241、および281のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号122〜160、162〜200、202〜240、242〜280、および282〜338のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号135、174、214、254、294のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含む、
実施形態30に記載の方法。
a)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155、および/もしくは203、および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態33に記載の方法。
上記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、上記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置、好ましくは3つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22、および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
タンパク質。
a)アミノ酸位置71、76、67、もしくは86のうちの少なくとも1つ、または、
b)アミノ酸位置155もしくは203および71、または、
c)アミノ酸位置155もしくは203および31、または、
d)アミノ酸位置155もしくは203および76、または、
e)アミノ酸位置155もしくは203および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203および85、または、
i)アミノ酸位置155および203および71、または、
j)アミノ酸位置155および203および86、または、
k)アミノ酸位置155および203および31、または、
l)アミノ酸位置155および203および76、または、
m)アミノ酸位置155および203および67、または、
n)アミノ酸位置155および203および86、または、
o)アミノ酸位置155および203および96、または、
p)アミノ酸位置155および203および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜p)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換され、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態49に記載のタンパク質。
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号121、161、201、241、および281のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号122〜160、162〜200、202〜240、242〜280、および282〜338のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号135、174、214、254、294に係るいずれか1つのアミノ酸配列を含む、
実施形態54に記載のタンパク質。
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態57に記載のタンパク質。
上記野生型のポリメラーゼが、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、好ましくは配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置、好ましくは3つのアミノ酸位置で、野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号15〜22、および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
ポリメラーゼの変異体。
a)アミノ酸位置71、76、67、もしくは86のうちの少なくとも1つ、または、
b)アミノ酸位置155もしくは203および71、または、
c)アミノ酸位置155もしくは203および31、または、
d)アミノ酸位置155もしくは203および76、または、
e)アミノ酸位置155もしくは203および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203および85、または、
i)アミノ酸位置155および203および71、または、
j)アミノ酸位置155および203および86、または、
k)アミノ酸位置155および203および31、または、
l)アミノ酸位置155および203および76、または、
m)アミノ酸位置155および203および67、または、
n)アミノ酸位置155および203および86、または、
o)アミノ酸位置155および203および96、または、
p)アミノ酸位置155および203および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜p)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態66に記載のポリメラーゼの変異体。
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
での配列番号121、161、201、241、および281のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号122〜160、162〜200、202〜240、242〜280、および282〜338のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号135、174、214、254、294のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含む、
実施形態71に記載のポリメラーゼの変異体
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
h)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置76のアミノ酸が、グリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態74に記載のポリメラーゼの変異体。
(a)L−核酸分子の異種性の集合を作製するステップと、
(b)上記標的分子と、ステップ(a)のL−核酸分子の異種性の集合を接触させるステップと、
(c)上記標的分子により結合されていないL−核酸分子を分離するステップと、
(d)上記標的分子により結合されたL−核酸分子を増殖するステップであって、上記増殖ステップがタンパク質を使用しており、上記タンパク質が、実施形態49〜65のいずれか1つに記載のタンパク質である、ステップと
を含む、方法。
(e)上記標的分子により結合されたL−核酸分子をシークエンシングするステップと、
(f)ステップ(e)においてシークエンシングしたL−核酸分子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列の核酸分子を合成するステップと
をさらに含む、実施形態81に記載の方法。
(da)上記標的分子と上記増幅した核酸分子を接触させるステップ
が導入されており、
ステップ(b)および任意にステップ(c)および/または(d)が、ステップ(e)の前に実行されており、ステップ(da)、(b)、(c)、および任意に(d)が、1回または数回実行されている、実施形態81〜83のいずれか1項に記載の方法。
(a)上記タンパク質の2つ以上のフラグメントが化学的に合成されており、上記フラグメントが全体で、上記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくは上記フラグメントが、固相ペプチド合成により合成されており、
(b)ステップ(a)のフラグメントが、セグメントの縮合、天然の化学的なライゲーション、酵素的なライゲーション、またはその組み合わせにより互いに結合しており、
上記タンパク質が、実施形態49〜65のいずれか1項に記載のタンパク質である、
方法。
a)ポリメラーゼがN−末端で短縮される場合、アミノ酸位置は、ポリメラーゼのC−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
b)ポリメラーゼがC−末端で短縮される場合、アミノ酸位置は、ポリメラーゼのN−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
b)ポリメラーゼがN−末端およびC−末端で短縮される場合、アミノ酸位置は、そのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置によって決定されるようになる。
断片縮合は、ペプチドのアミノ酸のその鎖が化学基で完全に保護されているペプチドを使用し、そのペプチドは溶液中でカップリングされる。
実施例で使用される場合の略語
ACN アセトニトリル(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
DCM ジクロロメタン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
DIPEA N,N−ジイソプロピルアミン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
EDT(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
Fmoc 9−フルオレニル−メトキシカルボニル−
HATU (2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)(CreoSalus,米国ケンタッキー州ルイビル)
HFIP 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロホスフェート(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
HPLC 高速液体クロマトグラフィー(高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれることもある。)
MeIm メチルイミダゾール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
MeOHメタノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
MSNT 1−(メシチレン−2−スルホニル)−3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール(Merck KGaA,ドイツダルムシュタット)
NMP N−メチル−ピロリドン(Iris Biotech GmbH,ドイツマルクトレドヴィッツ)
PyBOP (ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(Merck KGAA,ドイツダルムシュタット)
SDS ドデシル硫酸ナトリウム(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
TBTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(Merck KGaA,ドイツダルムシュタット)
tBu (tert.−ブチル−)
TFA トリフルオロ酢酸(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
TFE 1,1,1−トリフルオロエタノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
THF(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
TIS(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
TLC 薄層クロマトグラフィー
Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)
UPLC 超高速液体クロマトグラフィー
アフリカブタ熱ウイルス(略称ASFV)からのポリメラーゼXは、1997年にOliverosらにより記載され、特徴が調べられた。ポリメラーゼXの野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む、僅か525塩基対のオープンリーディングフレーム(略称ORF)を有する(Oliverosら、1997)。コードされるタンパク質の長さは僅か174アミノ酸である。この例は、どのようにポリメラーゼXならびにそれらの変異体がE.コリ(E.coli)で発現され、His6−Tagを用いて精製されたかを説明する。
ASFVのコドン使用はE.コリ(E.coli)と異なるので、ポリメラーゼXに対するE.コリ(E.coli)−コドン最適化合成遺伝子をGeneArt AG(ドイツレーゲンスブルク)から購入した。本合成遺伝子配列は、pCR4−Blunt−TOPOベクター(元の会社:Invitrogen,ドイツカールスルーエ)中で提供された。開始コドンおよび2つの終止コドンを含むコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列:ATGCTGACCCTGATTCAGGGCAAAAAAATCGTGAACCATCTGCGTAGCCGTCTGGCCTTTGAATATAACGGCCAGCTGATTAAAATTCTGAGCAAAAACATTGTGGCGGTGGGCAGCCTGCGTCGTGAAGAAAAAATGCTGAACGATGTGGATCTGCTGATTATTGTGCCGGAAAAAAAACTGCTGAAACATGTGCTGCCGAACATTCGTATTAAAGGCCTGAGCTTTAGCGTGAAAGTGTGCGGCGAACGTAAATGCGTGCTGTTTATCGAATGGGAAAAAAAAACCTACCAGCTGGACCTGTTTACCGCGCTGGCCGAAGAAAAACCGTATGCGATCTTTCATTTTACCGGTCCGGTGAGCTATCTGATTCGTATTCGTGCGGCGCTGAAAAAAAAAAACTACAAACTGAACCAGTATGGCCTGTTTAAAAACCAGACCCTGGTGCCGCTGAAAATTACCACCGAAAAAGAACTGATTAAAGAACTGGGCTTTACCTATCGCATTCCGAAAAAACGCCTGTAATAAを有した。
発現コンストラクトpMJ14を用いてE.コリ(E.coli)で全−L−ポリメラーゼXを発現させた。pMJ130、pMJ356、pMJ357またはpMJ412から全−L−ポリメラーゼXの変異体を発現させた。発現のために、コンピーテントE.コリ(E.coli)株の「BL−21(DE3)pLysS’」(Novagen/VWR、ドイツドレスデン)において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。600nmでの光学密度がおよそ0.6に到達するまで、2YT培地中で培養物を37℃で増殖させた。次いで、0.4mMの最終濃度まで、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(略称IPTG)を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。30℃で発現を4時間行った。遠心によって細胞を回収し、−80℃で保存するか、またはすぐに処理した。
「溶解および結合(lyse and bind)緩衝液」(50mM Na−リン酸、pH7.5、500mM NaCl、40mMイミダゾール)中、新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,
ドイツシュヴェービッシュ・グミュント)細胞破壊装置を用いて溶解させた。「Ni−NTA Superflow」材料(Qiagen、ドイツヒルデン)を用いて4℃で精製を行った。溶出緩衝液(50mM Na−リン酸、pH7.5、500mM NaCl、200mMイミダゾール)を用いて、段階溶出を行った。SDS−PAGE(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて「Q Sepharose fast flow」材料(GE healthcare,ドイツフライブルク)を用いて「AKTA purifier」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。MALDI質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、再緩衝化した。25mM Na−リン酸、pH7.5、250mM NaCl、50%グリセロールからなる緩衝液中で精製タンパク質を−20℃で保存した。ウシ血清アルブミン(略称BSA)標準物質を用いてBCA−タンパク質アッセイ(Pierce/Perbio Science,ドイツボン)によってタンパク質濃度を評価した。
オリゴヌクレオチドにより形成される様々なタイプの基質複合体を用いて、全−L−ポリメラーゼXおよび全−L−ポリメラーゼXの変異体(実施例1参照)に対する活性アッセイを行ったが、この基質およびオリゴヌクレオチドはD−DNA−ヌクレオチドからなる。
Sekizakiら(Sekizakiら、1996)と同様に、tert−ブチルオキシカルボニル−保護4−グアニジノフェノールを合成した。これに従い、40mmolのN,N’−Bis−(tert−ブチルオキシカルボニル)−S−メチルイソチオウレア(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)および60mmolの4−アミノフェノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)を500mL丸底フラスコ中、250mL THF中で溶解させた。この後、溶液にアルゴンを10分間吹き付け、CaCl2チューブで密封しながら120時間撹拌し続けた。
1mmolのZ−D−Leu−OH(Bachem,スイスブーベンドルフ)、0.9eq.TBTUおよび0.9eq.HO−Gp(Boc)2を10mL DMF中で溶解させた。2eq.DIPEAの添加後、溶液を2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、DCMを用いて粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。Z−D−Leu−OGp(Boc)2の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
Barlosら(Barlosら、1989)により記載のように、0.10mmolのTentaGel−R−Tritylレジン(Rapp Polymere,ドイツテュービンゲン)をFmoc−D−Ser(tBu)−OH(Bachem,スイスブーベンドルフ)とともに載せた。したがって、0.10mmolレジンを0.6mmolの塩化チオニルとともに、30分間、2回温置し、その後DCMで洗浄した。この後、6mL DCM中で、0.6mmolのFmoc−D−Ser(tBu)−OH、2.4mmol DIPEとともに90分間レジンを温置した。その後、DCM中の10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールとともにABI433(Applied Biosystems,米国フォスターシティ)を用いて、自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)を用いてFmoc−脱保護化を7分間、3回行った。
6mL NMP中で45分間にわたり、5eq.アミノ酸、eq.4.9eq.HATUおよび10eq.DIPEAを用いて、Fmoc−D−Ala−OHを0.10mmolのTentaGel−R−NH2レジン(Rapp Polymere,ドイツテュービンゲン)に充填した。その後に、レジンをTHFで洗浄した。80℃で2時間、THF中の4eq.Lawesson試薬と温置することによって、Fmoc−D−Ala−Ψ[CS−NH]−R−TentaGelへの変換を達成した。この後、レジンをNMPで洗浄した。その後、既に記載のとおり(実施例1.3参照)、そのように調製したレジンを自動化ペプチド合成において使用した。この後、Sharmaら(Sharmaら、2011)に従い、DMF中ヨウ化メチルと一晩温置することによって、対応するチオエステルを生成させた。レジンのろ過後、ペプチドチオエステルを含有する溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。TFA中2.5%EDT、2.5%水、2.5%TISを用いて2時間にわたり、側鎖保護基の切断を行った。TFAの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させた。ACN/水勾配を用いて、C18カラム(Phenomenex,ドイツアシャッフェンブルク)上でペプチドチオエステルの逆相HPLC精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
DCM中6eq.アミノ酸、6eq.MSNTおよび4.5eq MeImを用いて、0.10mmolのTentaGel−R−PHBレジン(Rapp Polymere,ドイツテュービンゲン)にFmoc−D−Leu−OHを充填した。FASTmocプロトコールとともにABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンを用いて7分間にわたりFmoc−脱保護化を3回行った。42アミノ酸後、ダブルカップリング段階を行った。TFA中2.5%EDT、2.5%水、2.5%TISを用いて2時間にわたり、N末端Fmoc−保護化ペプチドの切断を達成した。TFAの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。C18カラム上でACN/水勾配を用いて、粗製N末端保護化ペプチドの逆相HPLC精製を行った。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。その後、Fmoc−保護化ペプチドを溶解させ、N末端Fmoc−基を切り離すために、DMF中20%ピペリン中で撹拌した。20分後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。その後に、ACN/水勾配とともにC18カラムにより逆相HPLCを用いて、沈殿粗製ペプチドを精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
2%TritonX100(Sigma Aldrich Chemie GmbH,ドイツシュネルドルフ)を含有するリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH8.5、100mM NaCl入り)中で、ペプチド1を0.2mMに、ペプチド2を0.6mMに溶解させた。20μMクロストリパイン(Endoprotease Arg−C,Worthington Biochemical Corporation,米国ニュージャージー州レイクウッド)の添加後、反応混合物を37℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、H2O/ACN/ギ酸 60/40/0.5中で溶解させ、30分内の30%から60%の水中ACNの勾配でRP−18−カラム(Phenomenex,ドイツアシャッフェンブルク)を用いて、逆相HPLCによって精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
6Mグアニジウム塩酸塩中で実施例3による乾燥全−DポリメラーゼX変異体V80Aを溶解させ、3,500分子量カットオフの市販の透析装置(Pierce/PerBio,ドイツボン)中での段階的な透析によって4℃で再折り畳みを行った。最終緩衝液は、50mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.5であった。プレキャストゲル(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)上で標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用いてドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行い、続いてSYPRO−RED染色(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)およびBioRad Fxスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによってタンパク質濃度を推定した。
33マー下鎖(lower strand)DNAオリゴヌクレオチドを2本の17マー上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果、上鎖(upper strand)で1ヌクレオチドギャップを生じさせることによって、基質を作製した。L−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(Gamma−32P−ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的キナーゼ反応によって、32Pにより17マーの上鎖(upper strand)オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDをその5’−末端で放射性標識した。L−オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に、2つのD−立体配置グアノシン塩基を5’末端に付加した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中でアニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)上での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でA、C、GまたはTの何れかを含有した。基質複合体の仕組みについては、図7参照。
33マー下鎖(lower strand)DNAオリゴヌクレオチドを2つの17マーおよび12−マー上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果上鎖(upper strand)において6ヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質を作製した。L−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、17マー上鎖(upper strand)オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MD(L−立体配置)をその5’−末端で32Pにより放射性標識した。L−オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に2つのD−立体配置グアノシン塩基を5’末端に付加した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中で、アニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)上での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。基質複合体の仕組みについては、図9Aを参照。
アフリカブタ熱ウイルス(略称ASFV)からのポリメラーゼXは、ギャップ修復機能がある非常に離散性の高い酵素として文献(Oliveros,1997)に記載されている。実施例2で示されるように、全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体は、ギャップのある基質上でのそれぞれの開始後、非常に僅かなヌクレオチドのみの組み込みを触媒することが示された。ここで、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXおよび変異体を用いてより長いDNAを合成することを可能にする方法を開示し、83マー鎖の完全な重合化を示す。
全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体の活性を試験するために、プライマー−鋳型複合体を使用した。全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GおよびV80Aを試験するためにも同じ複合体を使用した。
活性アッセイにおいて、全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GまたはV80AをD−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせた。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.3ng/μL以下の全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GもしくはV80A、8μMの各D−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有した。Rovalab(ドイツテルトー)からD−dNTPを購入した。Pol−X試料に対して、温置時間は37℃で30分間であった。陰性対照として、基質を全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GもしくはV80Aなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(D−dNTP)なしでも温置した。製造者により供給されたTaq緩衝液中0.083U/μLの最終濃度でTaqポリメラーゼ(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)を用いて陽性対照を遂行した。Taq試料を60℃で30分間温置した。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性ゲル上で分離した。ゲルをBioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
開始後の全−L−ポリメラーゼXが僅か1個のヌクレオチドの組み込みを触媒し、次いでDNA基質上に留まりながら停止するという仮定のもと、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXが鋳型から解離し、鋳型に再会合できるように、加熱パルス(50℃、2分間)を繰り返し行った。この温度サイクリング手順を繰り返して、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXを用いて、83マーの完全な重合化を行うことができた。全−L−ポリメラーゼX試料に対する温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上に記載のように反応および対照を設定した:
5から25サイクルの(20℃で30分間//50℃で2分間)
次いで20℃で30分間の最終段階。
この実施例で開示される方法は、全−D立体配置ポリメラーゼを試験するためにL−立体配置基質を使用する。
活性アッセイにおいて、合成全−DポリメラーゼX変異体V80AをL−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせる。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.3ng/μL以下の全−DポリメラーゼX変異体、8μMの各L−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有する。L−dNTPをRasayan,Inc.(米国カリフォルニア州エンシニータス)から購入した。温置時間は37℃で少なくとも30分間である。陰性対照として、基質をまた、ポリメラーゼなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(L−dNTP)なしでも温置する。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性ゲル上で分離する。ゲルはBioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取る。
実施例5と同様に、全−DポリメラーゼX変異体V80Aによる83マーL−基質の全長全重合化を可能にするために温度サイクリング手順を繰り返す。温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上で記載されるように反応および対照を設定する:
5から25サイクルの(20℃で30分間//50℃で2分間)
次いで20℃で30分間の最終段階。
ポリメラーゼDpo4は元来、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)(略称Sso)(Boudsocq,2001)で発見された。この野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む1,059塩基対のオープンリーディングフレーム(略称ORF)を有する。コードされるタンパク質の長さは、352アミノ酸である。この例は、ポリメラーゼDpo4およびポリメラーゼDpo4の変異体がどのようにE.コリ(E.coli)において発現されて、Strep−Tagを用いて精製されたかを説明する。
Ssoのコドン使用はE.コリ(E.coli)とは異なるので、野生型SsoポリメラーゼDpo4に対するE.コリ(E.coli)−コドン最適化合成遺伝子をGeneArt AG(ドイツレーゲンスブルク)から購入した。合成遺伝子配列は、pENTRY−IBA10ベクター(元の会社:IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)において提供された。開始コドンを含むが終止コドンを含まないコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列を有した:ATGATTGTGCTGTTTGTGGATTTTGATTATTTTTATGCCCAGGTGGAAGAAGTTCTGAATCCGAGCCTGAAAGGTAAACCGGTTGTTGTTTGTGTTTTTAGCGGTCGCTTTGAAGATAGCGGTGCAGTTGCAACCGCCAATTATGAAGCCCGTAAATTTGGTGTTAAAGCCGGTATTCCGATTGTTGAAGCCAAAAAAATTCTGCCGAATGCAGTTTATCTGCCGATGCGCAAAGAAGTTTATCAGCAGGTTAGCAGCCGTATTATGAATCTGCTGCGCGAATATAGCGAAAAAATTGAAATTGCCAGCATTGATGAAGCCTATCTGGATATTAGCGATAAAGTGCGCGATTATCGCGAAGCATATAATCTGGGCCTGGAAATTAAAAATAAAATCCTGGAAAAAGAAAAAATTACCGTGACCGTGGGCATTAGCAAAAATAAAGTGTTTGCCAAAATTGCAGCAGATATGGCAAAACCGAATGGCATTAAAGTGATTGATGATGAAGAAGTGAAACGTCTGATTCGCGAACTGGATATTGCAGATGTTCCGGGTATTGGCAATATTACCGCAGAAAAACTGAAAAAACTGGGCATTAATAAACTGGTTGATACCCTGAGCATTGAATTTGATAAACTGAAAGGCATGATTGGTGAAGCGAAAGCCAAATATCTGATTAGCCTGGCACGTGATGAATATAATGAACCGATTCGTACCCGTGTTCGTAAAAGCATTGGTCGTATTGTGACCATGAAACGCAATAGCCGTAATCTGGAAGAAATTAAACCGTACCTGTTTCGTGCAATTGAAGAAAGCTATTATAAACTGGATAAACGCATTCCGAAAGCCATTCATGTTGTTGCAGTTACCGAAGATCTGGATATTGTTAGCCGTGGTCGTACCTTTCCGCATGGTATTAGCAAAGAAACCGCCTATAGCGAAAGCGTTAAACTGCTGCAGAAAATCCTGGAAGAAGATGAACGTAAAATTCGTCGTATTGGTGTGCGCTTTAGCAAATTTATTGAAGCCATTGGCCTGGATAAATTTTTTGATACC。
発現コンストラクトpMJ343を用いて、E.コリ(E.coli)において全−L−ポリメラーゼDpo4を発現させた。pMJ361、pMJ362、pMJ363、pMJ365、pMJ502、pMJ503、pMJ504、pMJ508、pMJ509、pMJ511、pJA95、pJA96、pJA100、pJA103またはpJA104から、全−L−ポリメラーゼDpo4の突然変異の変異体を発現させた。発現のために、「Transformation and Storage Solution」(Epicentre/Biozym,ドイツヘッシシュ・オルデンドルフ)を用いて、E.コリ(E.coli)株「NEB express」(New England Biolabs,ドイツフランクフルト・アム・マイン)において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として200ng/mLアンヒドロテトラサイクリン(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いて、培地「EnBase Flo」または「EnPresso」(BioSilta,フィンランドオウル)中で30℃にて48時間、発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−80℃で保存するかまたはすぐに処理した。
「緩衝液W」(100mM Tris−HCl、pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA)中で新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,ドイツシュヴェービッシュ・グミュント)細胞破壊装置を用いて溶解させた。5mL StrepTrap HPカラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を備えた「AKTA express」システム上で4℃で精製を行った。2.5mMデスチオビオチン(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を含む緩衝液Wを用いて段階溶出を行った。SDS−PAGE(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて、「Q HP」カラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を備えた「AKTA精製装置」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。LC−MS質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、10,000分子量カットオフ(MWCO)のVivaSpin 15R濃縮装置(VivaSciences/Sartorius Stedim Biotech,ドイツゲッティンゲン)を用いて再緩衝化した。100mM KCl、10mM Tris−HCl pH7.4、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%グリセロールからなる緩衝液中で、精製タンパク質を−20℃で保存した。SDS−PAGE上でウシ血清アルブミン(略称BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)で染色して、ゲル密度測定によって、タンパク質濃度を推定した。
全−LポリメラーゼDpo4の長さは352アミノ酸である。全−LポリメラーゼDpo4を化学的に作製するために、固相ペプチド合成により合成され得るより短い断片から、このような合成全−LポリメラーゼDpo4を組み立てなければならず、このより短い断片は、ネイティブ化学ライゲーションなどのペプチドライゲーション法によってライゲーションしなければならなかった。この例は、合成全−L−ポリメラーゼDpo4を得るためにネイティブ化学ライゲーションによって、Dpo4のライゲーション断片1−154、155−352、155−202および203−352が、E.コリ(E.coli)でどのように発現され、精製され、互いに対してライゲーションされているかを説明する。
実施例7で開示されるように、市販ソースから合成遺伝子コンストラクトとして全−L−ポリメラーゼDpo4に対する遺伝子を得た(GeneArt,ドイツレーゲンスブルク)。そのコドン最適化配列に基づいてこの実施例の全ての断片をクローニングした。全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154、155−352、155−202および203−352に対する次の発現コンストラクトを作製した:
このコンストラクトは、全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154、続いてMxe GyrAインテインを含有し、チオエステルおよびキチン−結合ドメイン(CBD)を生成させるためにこれを使用した。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154を増幅するために鋳型としてのpMJ343およびプライマーMJ_1_90_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGATTGTGCTGTTTGTGGATTTT−3’)およびMJ_1_91_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCATGCAATTTTGGCAAACACTTT−3’)を用いて、PCR生成物1を作製した。Mxe Gyr AインテインおよびCBDを増幅するために鋳型としてのpTWIN1(New England Biolabs,ドイツフランクフルト・アム・マイン)およびプライマーMJ_1_72_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGCATCACGGGAGAT−3’)およびMJ_1_73_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAACGTT−3’)を用いて、PCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_90_DDおよびMJ_1_91_DDは、Purimex(ドイツグレーベンシュタイン)由来であり、一方でプライマーMJ_1_72_DDおよびMJ_1_73_DDは、IBA GmbH(ドイツゲッティンゲン)由来であった。フラッシュゲル系(LONZA,スイスバーゼル)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いてpENTRY−IBA20において一緒にクローニングし、その結果、pMJ366が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いたpASG−IBAwt1(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)におけるpMJ366からのサブクローニングによって、pMJ370が得られた。コンストラクトpMJ370は、(インテイン切断/チオエステル産生後)154アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに、全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154−チオエステルをコードする:MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIA−チオエステル。
このコンストラクトは、「Profinity eXact」タグと、それに続く全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片155−352を含有する。「Profinity eXact」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。「Profinity eXact」タグを増幅するために鋳型としてのpPAL7(Bio−Rad,ドイツミュンヘン)およびプライマーMJ_1_99_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGGGAGGGAAATCAAACGGGGAA−3’)およびMJ_1_100_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCACAAAGCTTTGAAGAGCTTGTC−3’)を用いて、PCR生成物1を作製した。A155C突然変異を含有するdpo4断片155−352を増幅するために鋳型としてのpMJ361およびプライマーMJ_1_96_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGCGATATGGCAAAACCGAATGGCATTAAA−3’)およびMJ_1_97_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTAGGTATCAAAAAATTTATCCAGG−3’)を用いて、PCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_96_DD、MJ_1_97_DD、MJ_1_99_DDおよびMJ_1_100_DDは全て、Purimex(ドイツグレーベンシュタイン)由来であった。フラッシュゲルシステム(LONZA,スイスバーゼル)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いてpENTRY−IBA20と一緒にクローニングし、pMJ382が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いたpASG−IBA5(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)中のpMJ382からのサブクローニングによって、pMJ384が得られた。コンストラクトpMJ384は、(タンパク質分解性切断後)198アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに突然変異A155Cを含有する全−L−ポリメラーゼDpo4の断片155−352をコードする:CDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLVDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT。
このコンストラクトは、「Profinity eXact」タグとそれに続く、突然変異V203Cを含有するdpo4断片203−352を含有する。「Profinity eXact」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。「Profinity eXact」タグを増幅するために鋳型としてのpPAL7(Bio−Rad,ドイツミュンヘン)およびプライマーMJ_1_99_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGGGAGGGAAATCAAACGGGGAA−3’)およびMJ_1_100_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCACAAAGCTTTGAAGAGCTTGTC−3’)を用いてPCR生成物1を作製した。V203C突然変異を含有するdpo4断片203−352を増幅するために鋳型としてのpMJ362およびプライマーMJ_1_98_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGTGATACCCTGAGCATTGAATTT−3’)およびMJ_1_97_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTAGGTATCAAAAAATTTATCCAGG−3’)を用いてPCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_97_DD、MJ_1_98_DD、MJ_1_99_DDおよびMJ_1_100_DDは全てPurimex(ドイツグレーベンシュタイン)由来であった。フラッシュゲルシステム(LONZA,スイスバーゼル)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いてpENTRY−IBA20中で一緒にクローニングし、その結果、pMJ383が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いたpASG−IBA5(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)中のpMJ383からのサブクローニングによって、pMJ385が得られた。コンストラクトpMJ385は、(タンパク質分解性切断後)150アミノ酸長の次のタンパク質配列とともにdpo4断片203−352 V203Cをコードする:CDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT。
このコンストラクトは、dpo4断片155−202とそれに続く、チオエステルを生成させるために使用したMxe GyrAインテインおよびキチン−結合ドメイン(CBD)を含有する。2つのPCR生成物からコンストラクトを組み立てた。dpo4 155−202断片を増幅するために鋳型としてのpMJ343およびプライマーMJ_1_101_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGATGGCAGATATGGCAAAACCGAAT−3’)およびMJ_1_102_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGGCACAGTTTATTAATGCCCAGTTT−3’)を用いてPCR生成物1を構築した。Mxe Gyr AインテインおよびCBDを増幅させるために鋳型としてのpTWIN1(New England Biolabs,ドイツフランクフルト・アム・マイン)およびプライマーMJ_1_72_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGTGCATCACGGGAGAT−3’)およびMJ_1_73_DD(5’−リン酸−AGCGGCTCTTCGCCCTTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAACGTT−3’)を用いてPCR生成物2を作製した。プライマーMJ_1_101_DDおよびMJ_1_102_DDは、Purimex(ドイツグレーベンシュタイン)由来であり、一方、プライマーMJ_1_72_DDおよびMJ_1_73_DDはIBA GmbH(ドイツゲッティンゲン)由来であった。フラッシュゲルシステム(LONZA,スイスバーゼル)上で2つのPCR生成物をゲル精製し、StarGate Mutagenesis ENTRYクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いてpENTRY−IBA20中で一緒にクローニングし、その結果、pMJ386が得られた。StarGate Transferクローニングキット(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いたpASG−IBAwt1(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)中でのpMJ386からのサブクローニングによって、pMJ388が得られた。コンストラクトpMJ388は、dpo4断片155−202とそれに続く(最初のメチオニンのE.コリ(E.coli)介在切断後およびインテイン切断/チオエステル産生後)48アミノ酸長のタンパク質配列をコードする:ADMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKL−チオエステル。
発現のために、「Transformation and Storage Solution」(Epicentre/Biozym,ドイツヘッシシュ・オルデンドルフ)を用いてE.コリ(E.coli)株「NEB EXPRESS」(New England Biolabs,ドイツフランクフルト・アム・マイン)中で適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として200ng/mLアンヒドロテトラサイクリン(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を用いて、一晩、周囲温度で培地「EnBase Flo」または「EnPresso」(BioSilta,フィンランドオウル)中で発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−80℃で保存するかまたはすぐに処理した。
「カラム緩衝液」(20mM HEPES、pH8.5、500mM NaCl)中で新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,ドイツシュヴェービッシュ・グミュント)細胞破壊装置を用いて溶解させた。キチン結合ビーズを含有するカラム(New Englands Biolabs,ドイツフランクフルト・アム・マイン)を備えた「AKTA express」システム(GE healthcare,ドイツフライブルク)」上で4℃で精製を行った。細胞溶解液を適用し、ベースラインまでカラム緩衝液で洗浄した後、インテイン介在性タンパク質切断およびチオエステル形成を誘導するために、カラム緩衝液中の50mM 2−メルカプトエタンスルホネート(略称MESNA)とともにカラムを4℃で20時間温置した。チオエステルを担う切断タンパク質をカラム緩衝液でカラムから洗い流し、濃縮し、5mM Bis−Tris、pH6.5、250mM NaClからなる緩衝液中でBioGel P60媒体材料(BioRad,ドイツミュンヘン)を用いてゲルろ過に供した。SDS−PAGE上でウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。LC−MS質量分析によって、タンパク質の正体およびチオエステルの存在を確認した。
次のとおり、pMJ384からの全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片155−352の精製を行った:「緩衝液W」(100mM Tris−HCl、pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA)中で新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,ドイツシュヴェービッシュ・グミュント)細胞破壊装置を用いて溶解させた。5mL StrepTrap HPカラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を備えた「AKTA express」システム上で4℃で精製を行った。2.5mMデスチオビオチン(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を含む緩衝液Wを用いて段階溶出を行った。HiPrep26/10脱塩カラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を用いた「Profinity eXact溶出緩衝液」(0.1M Na−リン酸、pH7.2、0.1M NaF)中での緩衝液交換に、溶出タンパク質を供し、次いでゆっくりとProfinity eXactカラムに注入した。試料を濃縮し、1mMの最終濃度になるまでTris(2−カルボキシエチル)ホスフィン)(TCEP)を供給し、5mM Bis−Tris、pH6.5、250mM NaClからなる緩衝液で展開されるHiLoad 16/60 Superdex 75調製グレードカラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を用いてゲルろ過に適用した。タンパク質を濃縮し、−80℃で保存した。SDS−PAGE上でウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。LC−MS質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
次のとおりpMJ385からのdpo4断片203−352 V203Cの精製を行った:封入体を調製し、「i−FOLDタンパク質再折り畳み系」マニュアル(Novagen/Merck−Millipore,ドイツダルムシュタット)に記載のとおり変性させた。Sephadex G−25微細物質(GE healthcare,ドイツフライブルク)を用いて、可溶化タンパク質を「緩衝液W」(100mM Tris−HCl、pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA)への緩衝液交換に供し、StrepTrap HPカラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を備えた「AKTA express」システム上で4℃で精製した。2.5mMデスチオビオチン(IBA GmbH,ドイツゲッティンゲン)を含む緩衝液Wで段階溶出を行った。0.1Mの最終濃度まで溶出タンパク質溶液にNaFを供給し、1mMの最終濃度になるようにTris(2−カルボキシエチル)ホスフィン)(TCEP)を供給し、次いでProfinity eXactカラム中にゆっくりと注入した。脱イオン化水でフロースルーを1:3希釈し、HClを用いてpHを7.2に調整した。「緩衝液A」(50mM Na−リン酸、pH7.2、1mM 2−メルカプトエタノール)中で平衡化したHiTrap SP HPカラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を用いて陽イオン交換−クロマトグラフィーによって試料をさらに精製した。17%、25%および100%の「緩衝液B」(50mM Na−リン酸、pH7.2、1M NaCl、1mM 2−メルカプトエタノール)を用いて段階溶出を行った。分画をプールし、濃縮し、脱イオン化水中で展開させるHiLoad 16/60 Superdex 75調製グレードカラム(GE healthcare,ドイツフライブルク)を用いてゲルろ過に適用した。液体窒素中でタンパク質を瞬間凍結し、凍結乾燥させた。SDS−PAGE上でのウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を用い、SYPRO Red(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。LC−MS質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
2%Triton X100、1%チオフェノールおよび5mM TRIS(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含有するTRIS−緩衝液(pH8.6)中で全−L−ポリメラーゼDpo4変異体A155Cの断片1−154−チオエステルおよび155−352を50μMで溶解させた。反応混合物を室温により72時間振盪した。その後、ライゲーションの成功をSDS−PAGE(図11A)およびLC−ESI−質量分析(RP18−カラム、20分間の0.1%TFA 5−95%での水中0.1%TFAによるACN勾配、図11B)により分析した。41kDa前後でレーンにおいて明確なバンドが見出され、このことから、全長ポリメラーゼが示された。理論分子量(Mtheor=40223Da)は、ESI−MSにより示される場合の、実測分子量(Mobs=40265Da)と一致する。
2%SDS、1%チオフェノールおよび5mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含有するTRIS−緩衝液(pH8.6)中で、全−L−ポリメラーゼDpo4の断片155−202−チオエステルおよび203−352 V203Cを0.2Mで溶解させた。室温によって反応混合物を72時間振盪した。SDS−PAGE(図20A)およびLC−ESI−質量分析(RP18−カラム、20分間の0.1%TFA 5−95%での水中0.1%TFAによるACN勾配、図20B)によって、ライゲーションの成功の分析を行った。レーン7で21.5kDa前後で明確なバンドが見出され、これによりライゲーション生成物が示された。理論分子量(Mtheor=22749Da)は、ESI−MSによって示される場合の、実測分子量(Mobs=22769Da)と一致する。
ポリメラーゼDpo4は、初めにSulfolobus Solfataricus(略語 Sso)で発見された(Boudsocq, 2001)。野生型の遺伝子は、開始コドンおよび終始コドンを含む1,059の塩基対のオープンリーディングフレーム(略語:ORF)を有する。コードされたタンパク質は、352個の長さのアミノ酸を有する。この実施例は、どのようにポリメラーゼDpo4の切断型がE.Coliで発現されたか、およびStrep−Tagを使用して精製されたかを説明する。
Ssoのコドンの利用は、E.Coliと異なるため、野生型SsoポリメラーゼDpo4用のE.Coli−コドン最適化合成遺伝子は、GeneArt AG(ドイツレーゲンスブルク)から購入した。また、C末端から3、6、または9個のアミノ酸を切断した切断型を、GeneArtによりカスタムメイドした。合成遺伝子の配列は、N末端にStrep−Tagを追加するpASK−IBA5plusベクター(originator company: IBA GmbH, ドイツゲッティンゲン)で提供されている。C末端で3つのアミノ酸が欠失したdpo4のトランケーション形態は、この一連のプラスミドから発現した最も長い変異体であり、クローン3.C11(変異体Δ3)と命名されており、368個のアミノ酸である以下のアミノ酸を有した(N〜C末端が示された配列):
MASWSHPQFEKGAETAVPNSIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIAADMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLVDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKF。
Dpo4の切断型Δ3、Δ6、Δ12、またはΔ15を、pASK−IB5plusに基づく発現構築物を使用してE.coliにおいて発現した。発現のために、適切な発現構築物を、“形質転換および保存用溶液(Transformation and Storage Solution)”(Epicentre/Biozym, ドイツヘッシシュ・オルデンドルフ)を使用してE.coliの株「NEB express」(New England Biolabs, ドイツフランクフルト・アム・マイン)で形質転換し、抗菌性のアンピシリンを用いて維持した。インデューサーとして200ng/mlのアンヒドロテトラサイクリン(IBA GmbH、ドイツゲッティンゲン)を使用して、30℃で48時間、培地“EnBase Flo”または“EnPresso”(BioSilta, フィンランドオウル)中で発現を行った。細胞を、延伸により収集して、−80℃で保存するか、またはすぐに処理した。
新鮮または凍結したE.coliを、“Buffer W”(100 mM Tris−HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1mM EDTA)中、氷上で再懸濁し、“French Press”(G. Heinemann, ドイツシュヴェービッシュ・グミュント)細胞破砕機を使用して溶解した。5mlのStrepTrap HPのカラム(GE healthcare, ドイツフライブルク)を備え付けた“AKTA Express”システムで精製を4℃で行った。段階溶出を、2.5mMのデスチオビオチン(IBA GmbH, ドイツゲッティンゲン)を含むバッファーWを用いて行った。画分を集め、HiPrep_26/10カラム(GE healthcare, ドイツフライブルク)を使用して、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.2)でバッファー交換した。次にタンパク質の試料を、5mlの陽イオン交換カラムHiTrap_SP_HP(GE healthcare、ドイツフライブルク)に添加し、最大1MのNaClを含む50mMのリン酸ナトリウム(pH7.2)の勾配で溶出した。溶出したピークの画分を回収し、集め、20mM Tris−HCl(pH7.4)、200mM KCl、0.2mM EDTAでバッファー交換した。すべての重要な画分を、SDS−PAGEを使用して分析した(Invitrogen, ドイツカールスルーエ)。タンパク質の同一性を、LC−MS質量分析により確認した。最終的な試料を、10,000の分子量のカットオフ(MWCO)で、VivaSpin 15Rの濃縮装置を使用して濃縮し(VivaSciences/Sartorius Stedim Biotech, ドイツゲッティンゲン)、1容量のグリセロールおよびDTTを追加することにより、保存バッファーは、10mM Tris−HCl(pH7.4)、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%のグリセロールからなるものであった。精製したタンパク質を−20℃で保存した。タンパク質の濃度を、SDS−PAGEにとって標準的なウシ血清アルブミン(略語BSA)を使用し、SYPRO Red(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)で染色したゲルデンシトメトリーにより評価した。
この実施例は、全−L−ポリメラーゼDpo4および実施例7による全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体に対する、および実施例8による合成全−L−ポリメラーゼDpo4に対する、および実施例9によるDpo4の切断型に対するPCR活性試験を記載する。
PCR反応のための鋳型は、83マー1本鎖D−DNAオリゴヌクレオチド(MJ_1_1_DD)であり、これにより第一の温度サイクルにおいて逆の鎖が生成する。その後、両鎖を指数関数的増幅のための鋳型とする。D−立体配置で、NOXXONにおいて、鋳型DNAオリゴヌクレオチドおよびDNAプライマーを合成する。
15μLPCR反応は、各0.2mMの4種類のD−dNTP、10nM 83マーssDNA(MJ_1_1_DD)鋳型、1μMのフォワードおよびリバースプライマー、1x ThermoPol緩衝液(Invitrogen、20mMトリス−HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X−100、pH8.8@25℃)および少なくとも0.67ng/μLの全−L−ポリメラーゼDpo4または全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体または合成全−L−ポリメラーゼDpo4を含有した。フォワードプライマーはDE4.40T7であり、リバースプライマーはDE4.40Rであり、102塩基対長のPCR生成物が得られる。Rovalab(ドイツテルトー)からD−dNTPを購入した。全−L−ポリメラーゼDpo4または全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体または合成全−L−ポリメラーゼDpo4を省くことによって陰性対照を遂行した。市販の全−L−dpo4(New England Biolabs,ドイツフランクフルト・アム・マイン)を用いて陽性対照を遂行した。
全−L−ポリメラーゼDpo4、全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体A155C、V203C、C31S、A155C/V203C、S85C、S86C、S96C、A71C/A155C/V203C、S86C/A155C/V203C、C31S/S86C/A155C/V203C、M76G/A155C/V203C、M76A/A155C/V203C、I67C/A155C/V203C、S86G/A155C/V203Cおよび全−L−ポリメラーゼDpo4のS96C/A155C/V203C、およびDpo4のC末端での切断型Δ3、Δ6、Δ9、Δ12、およびΔ15を試験した。試験したポリメラーゼは全て、PCR反応において鋳型鎖を増幅することができた。図12Aは、全−L−ポリメラーゼDpo4の変異体A155C、V203C、C31S、A155C/V203Cを用いて行ったPCR反応の分析を示し、、DNA標準物質ラダーと比較した場合に約100bpの範囲となるバンドを示した。予想されたPCR生成物サイズは102塩基対であった。このバンドはポリメラーゼがない陰性対照では現れない。またこの102bpバンドは、83マー鋳型より高く移動する。図12Bは、組み換え全−L−ポリメラーゼdpo4を用い、断片のライゲーションにより作製された合成全−L−ポリメラーゼdpo4を使用して行ったPCR反応の分析を示す。ゲルは、DNA標準物質ラダーと比較した場合に約100bpの範囲となるバンドを示した。予想されたPCR生成物サイズは102塩基対であった。ポリメラーゼがない陰性対照においてこのバンドは非常に弱い。組み換え全−L−ポリメラーゼdpo4および合成全−L−ポリメラーゼdpo4は、比較可能な活性を示す。図12Cは、組み換え全L−ポリメラーゼdpo4、および変異体71C/A155C/V203C、S86C/A155C/V203CおよびC31S/S86C/A155C/V203Cを用いて実施したPCR反応の分析を示す。このゲルは、DNAの標準ラダーと比較して約100bpの範囲のバンドを示した。予測したPCR産物の大きさは102の塩基対であった。図12Dは、組み換え全L−ポリメラーゼdpo4、および変異体M76G/A155C/V203CおよびM76A/A155C/V203Cで実施したPCR反応の分析を示す。このゲルは、DNA標準ラダーと比較して約100bpの範囲のバンドを示した。予測したPCR産物の大きさは102の塩基対であった。図12Eは、変異体I67C/A155C/V203C、S86G/A155C/V203CおよびS96C/A155C/V203Cで実施したPCR反応の分析を示す。このゲルは、DNA標準ラダーと比較して約100bpの範囲のバンドを示した。予測したPCR産物の大きさは102塩基対であった。図12Fは、Dpo4のC末端での切断型Δ3、Δ6、Δ9、Δ12、およびΔ15で実施したPCR反応の分析を示す。このゲルは、DNA標準ラダーと比較した約100bpの範囲のバンドを示した。予測したPCR産物の大きさは102塩基対であった。
本実施例中では、全−DポリメラーゼDpo変異体A155C/V203Cの合成を記載する。全−DポリメラーゼDpo変異体A155C/V203Cのアミノ酸配列は、Ac−MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIACDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLCDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−OHである。
1mmolのZ−D−Met−OH、0.9eq.TBTUおよび0.9mmol HO−Gp(Boc)2を10mL DMF中で溶解させた。2eq.DIPEAの添加後、溶液を2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、DCMを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。Z−D−Met−OGp(Boc)2の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
6mL NMP中で45分間、5eq.アミノ酸、eq.4.9eq.HATUおよび10eq DIPEAを用いて、Fmoc−脱保護後に、Fmoc−D−Thr(tBu)−OHを0.1mmolのFmoc−Sieber rink アミドNovaSynTGレジンに充填した。
Barlosら(Barlosら、1989)により記載されるように、0.10mmolのTentaGel−R−TritylレジンにFmoc−D−Gly−OHを充填した。したがって、0.6mmolの塩化チオニルとともに0.10mmolレジンを30分間、2回温置し、その後にDCMで洗浄した。この後、6mLDCM中の0.6mmolのFmoc−Gly−OH、2.4mmol DIPEAとともにレジンを90分間温置した。その後、DCM中10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールによりABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンを用いてFmoc−脱保護化を7分間、3回行った。39アミノ酸のカップリング後、ダブルカップリングを行った。
Barlosら(Barlosら、1989)に記載のように、Fmoc−D−Leu−OHを0.10mmolのTentaGel−R−Tritylレジンに充填した。したがって、0.6mmolの塩化チオニルとともに0.10mmolレジンを30分間、2回温置し、その後にDCMで洗浄した。この後、6mL DCM中の0.6mmolのFmoc−D−Leu−OH、2.4mmol DIPEAとともにレジンを90分間温置した。その後、DCM中10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールによりABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて、10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンを用いてFmoc−脱保護化を7分間、3回行った。
6mL NMP中で、45分間、5eq.アミノ酸、eq.4.9eq.HATUおよび10eq.DIPEAを用いて、0.10mmolのTentaGel−R−NH2レジンにFmoc−D−Ala−OHを充填した。その後に、レジンをTHFで洗浄した。2時間にわたり、80℃でTHF中4eq.Lawesson試薬との温置によって、Fmoc−D−Ala−Ψ[CS−NH]−R−TentaGelへの変換を達成した。この後、レジンをNMPで洗浄した。その後に、このように調製したレジンを既に記載のように自動化ペプチド合成において使用した(ABI433、FASTmocプロトコール、NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化し;カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンによって7分間、Fmoc−脱保護化を3回行った。)。44カップリングアミノ酸の後、ダブルカップリング段階を行った。
0.10mmolのTentaGel−R−Tritylレジンに、Barlosら(Barlosら、1989)に記載のようにFmoc−D−Pro−OHを充填した。したがって、0.6mmolの塩化チオニルとともに30分間、2回、0.10mmolレジンを温置し、その後に、DCMで洗浄した。この後、6mL DCM中0.6mmolのFmoc−D−Pro−OH、2.4mmol DIPEAとともに、レジンを90分間温置した。その後、DCM中10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールによってABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンによって、7分間、3回、Fmoc−脱保護化を行った。46アミノ酸のカップリング後、ダブルカップリングを行った。DMF中10%(v/v)無水酢酸および10%(v/v)DIPEAを用いてN−末端のアセチル化を10分間、3回行った。
ペプチド7とのペプチド6のプロテアーゼ−触媒ライゲーションによる、全−D−ペプチド、Ac−MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIA−SMe(8)の合成
4M尿素を含有するリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH8.5、100mM NaCl入り)中で、ペプチド6を0.2mMに溶解させ、ペプチド7を0.6mMに溶解させた。20μMクロストリパイン(エンドプロテアーゼArg−C、Worthington Biochemical Corporation,米国ニュージャージー州レイクウッド)の添加後、反応混合物を37℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、H20/ギ酸 80/20中で溶解させ、30分内で5%から95%の水中ACN勾配でRP−18−カラム(Phenomenex,ドイツアシャッフェンブルク)を用い、逆相HPLCによって精製する。最終ペプチドをSDS−PAGE(図19A)およびESI−質量分析(図19B)により分析した。レーン1で14,4kDaと21.5kDaとの間でバンドが見られ、ライゲーション生成物が示された。ライゲーション生成物の理論分子量(Mtheor=17476Da)は、ESI−MSにより示されるように実測分子量(Mobs=17486Da)と一致する。
2%Triton X100、1%チオフェノールおよび5mMトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含有するトリス−緩衝液(pH8.6)中で、ペプチド5および8の両方を0.2Mに溶解させる。反応混合物を室温により72時間振盪する。その後、逆相HPLCにより混合物を精製し、SDS−PAGE、逆相UPLCおよびESI−質量分析により分析する。ライゲーション生成物の正確な質量が分かる。
D−アミノ酸からなるポリメラーゼDpo4の変異体A71C/A155C/V203Cの合成
実施例の中で、全D−ポリメラーゼDpo変異体A71C/A155C/V203Cの合成を説明する。全―DポリメラーゼDpo変異体A71C/A155C/V203Cのアミノ酸配列は、Ac−MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNCVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIACDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLCDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−NH2である。
H−RTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−NH2(1)
0.1mmolのFmoc−Sieber rinkアミドNovaSynTG樹脂を、5当量のアミノ酸、4.9当量のHATU、および10当量のDIPEAを使用してFmoc−D−Thr(tBu)−OHを用いた、6mlのNMP中で45分間のFmocの脱保護の後で充填した。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Gly−OHで充填した。よって0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間2回インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−Gly−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで90分インキュベートした。その後、この樹脂を、DCM中10% MeOH(v/v)、10% DIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルを用い、ABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%(v/v)のピペリジンで7分間、3回行った。ダブルカップリングのステップを、39のアミノ酸のカップリングの後に行った。
H−CDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−NH2(5)の合成
5マイクロモル濃度の(3)および1当量の(1)を、DCM中25%(v/v)のTFEに溶解した。5当量のPyBOPおよび10当量のDIPEAを添加した後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿し、ろ過した。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al. (Barlos et al., 1989)に記載するようにFmoc−D−Ala−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間、2回インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Ala−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで、90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10% MeOH(v/v)、10% DIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocのプロトコルを用い、ABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc−脱保護を、NMP中20%(v/v)のピペリジンで7分間、3回行った。ダブルカップリングは、44のアミノ酸のカップリングの後に行った。N末端のアセチル化を、DMF中10%(v/v)の無水酢酸および10%(v/v)のDIPEAで、10分間、3回行った。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Asn(Trt)−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルを用いて、30分間、2回、インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、6mlのDCM中0.6mmolのFmoc−D−Asn(Trt)−OH、2.4mmolのDIPEAで90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して、10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルを用い、ABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%(v/v)のピペリジンで、7分間、3回、行った。ダブルカップリングを、40のアミノ酸のカップリングの後に行った。N末端のアセチル化を、DMF中10%(v/v)の無水酢酸および10%(v/v)のDIPEAを用いて10分間、3回行った。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Leu−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間、2回インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Leu−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで、90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルを用い、ABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%(v/v)のピペリジンで、7分間、3回行った。
ペプチド10およびペプチド9を、6Mのグアニジン―HCl、5mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、および2%のチオフェノールを含むリン酸ナトリウムバッファー(100mM、pH8、100mM NaClを含む)に、0.5Mで溶解した。反応混合物を室温で72時間振盪した。その後、チオフェノール―沈殿物を遠心し、上清を、Agilent SEC−3カラム(Agilent Technologies Deutschland GmbH, ドイツブリンゲン)および移動相として50mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH6)中6Mのグアニジンを使用した分子ふるいクロマトグラフィーにより精製した。次にペプチドを含む画分を、HiTrap脱塩カラム5ml(GE Healthcare GmbH, ドイツミュンヘン)で水/1%のギ酸で脱塩した。凍結乾燥した後、画分を、SDS−PAGE(図27A)およびESI−LC質量分析(図27B)により分析した。バンドを、ライゲーション産物を示すマーカーの15kDaのバンド〜20kDaのバンドの間で、レーン3〜6で見出した。ライゲーション産物の理論的な分子量(Mtheor=17641Da)は、ESI−LC−MSにより示されるように観察された分子量(Mobs=17641Da)に対応する。
ペプチド11および8の両方を、50μMで、2%のTriton X100、1%のチオフェノール、および5mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー(pH8、100mMのNaClを含む)に溶解した。反応混合物を室温で72時間振盪した。その後、反応混合物を、SDS−PAGE(図28A+B)およびESI−LC質量分析(図28C)により分析した。バンドを、ライゲーション産物を示す天然のL−Dpo4が多い抽出物において、マーカーの37kDaのバンド〜50kDaのバンドの間のクマシー染色したゲルのレーン3(A)および銀染色したゲルの対応するレーン(B)で見出された。ライゲーション産物の理論的な分子量(Mtheor=40298Da)は、ESI−MS(C)により示されるように観察した分子量(Mobs=40945Da)に対応する。647kDaより高い測定した質量は、Triton X−100付加物により引き起こされ得る。
本実施例の中で、全DポリメラーゼDpoの変異体M76G/A155C/V203Cの合成を説明する。全DポリメラーゼDpoの変異体M76G/A155C/V203Cのアミノ酸配列は、Ac−MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPGRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIACDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLCDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−NH2である。
1mmolのZ−Gly−OH、0.9当量のTBTUおよび0.9mmmolのHO−Gp(Boc)2を、10mlのDMEに溶解した。0.2当量のDIPEAを添加した後、溶液を2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、未処置の産物を、DCM:EE(9:1)を使用してフラッシュクロマトグラフィーで精製した。Z−Gly−OGp(Boc)2の精製した画分を組み合わせ、溶媒を蒸発させた。
0.1mmolのFmoc−Sieber rinkアミドNovaSynTG樹脂を、6mlのNMPにおいて、5当量のアミノ酸、4.9当量のHATU、および10当量のDIPEAを45分間、使用する、Fmoc−D−Thr(tBu)−OHを用いたFmoc脱保護の後充填した。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−Gly−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間、2回、インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、6mlのDCM中0.6mmolのFmoc−Gly−OH、2.4mmolのDIPEAで、90分インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回、ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルでABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%(v/v)のピぺリジンで7分間、3回行った。ダブルカップリングのステップを、39のアミノ酸のカップリングの後行った。
5マイクロモル濃度の(3)および1当量の(1)を、DCM中25%(v/v)のTFEに溶解した。5当量のPyBOPおよび10当量のDIPEAを添加した後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させ、ろ過した。
0.1mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Ala−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで2回、30分間インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Ala−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回、ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルでABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量HATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護は、NMP中20%(v/v)のピペリジンで7分間、3回、行った。ダブルカップリングを、44のアミノ酸をカップリングした後行った。N末端のアセチル化を、DMF中10%(v/v)の無水酢酸および10%(v/v)のDIPEAを用いて、10分間、3回行った。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Pro−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間、2回インキュベートし、その後DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Pro−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで、90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルでABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおyび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%(v/v)のピペリジンで、7分間、3回行った、ダブルカップリングを、45のアミノ酸をカップリングした後行った。N末端のアセチル化を、DMF中10%(v/v)の無水酢酸および10%(v/v)のDIPEAを用いて、10分間3回行った。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Leu−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間、2回インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Leu−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで、90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して、10分間3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルでABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分間であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%(v/v)のピペリジンで7分間、3回行った。
ペプチド5および7の両方を、2%のTriton X100、1%のチオフェノール、および5mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー(100mM、100mMのNaClを含む、pH8)に0.2Mで溶解した。反応混合物を室温により48時間で振盪した。その後、混合物を、30分以内に、水/1%TFA中30%〜80%のACN/メタノール(1:1)の勾配を使用して、RP−8カラム(Vydac 208 TP, Grace GmbH & Co KG, ドイツヴォルムス)での逆相HPLCにより精製した。産物を含む画分を集め、Yarra 3u SEC−2000−カラム(Phenomenex, ドイツアシャッフェンブルク)で分子ふるいクロマトグラフィーによる第2の段階で精製した。N末端のZ保護基の除去のために、ペプチドを、270当量のTFAおよび50当量のチオアニソールに溶解し、室温で6時間振盪した(Yoshiaki Kisoet al, 1980)。TFAを蒸発させた後、ペプチドを沈殿させ、氷冷したジエチルエーテルにより洗浄した。遊離ペプチド8の分析を、SDS−PAGE(図26A)およびESI−LC質量分析(図26B)により行った。バンドが、ライゲーション産物を示すマーカーの20kDaのバンドおよび25kDaのバンドの間で見出された。ライゲーション産物の理論的な分子量(Mtheor=22781Da)は、ESI−LC−MSにより示されるように観察された分子量(Mobs=22796Da)に対応する。
4Mの尿素を含むリン酸ナトリウムバッファー(100mM、pH8、100mMのNaClを含む)に、ペプチド10を0、2Mで溶解し、ペプチド9を0.6mMで溶解した。20μMのクロストリパイン(Endoprotease Arg−C, Worthington Biochemical Corporation, 米国ニュージャージー州レイクウッド)を添加した後、反応混合物を37℃で一晩振盪した。その後、6Mのグアニジン―HClを添加し、混合物を、移動相として50mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH6)中の6Mのグアニジン―HClを用い、AgilentSEC−3カラム(Agilent Technologies Deutschland GmbH, ドイツブリンゲン)を使用して分子ふるいクロマトグラフィーにより精製した。その後、ペプチドを含む画分を、HiTrap脱塩カラム5ml(GE Healthcare GmbH, ドイツミュンヘン)で、水/1%のギ酸で脱塩した。凍結乾燥した後、画分を、SDS−PAGE(図33A)およびESI−LC質量分析(図33B)により分析した。バンドは、リガンド産物を示す15kDa〜20kDaのレーン3および4で見出された。ライゲーション産物の理論的な分子量(Mtheor=17612Da)は、ESI−MSにより示される観察された分子量(Mobs=17641Da)に対応した。
ペプチド11および8の両方を、2%のTriton X100、1%のチオフェノール、および5mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含むTRISバッファー(pH8.6)に0.2Mで溶解した。反応混合物を室温により72時間振盪した。その後、混合物を逆相HPLCにより精製し、SDS−PAGEおよび逆相UPLCおよびESI質量分析により分析した。ライゲーション産物の正確な質量を見出す。
本実施例の中で、全DポリメラーゼDpoの変異体 A71C/A155C/V203Cの合成を説明する。全DポリメラーゼDpoの変異体 A71C/A155C/V203Cのアミノ酸配列は、Ac−MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNCVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIACDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLCDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−NH2である。
0.1mmolのFmoc−Sieber rinkアミドNovaSynTG樹脂を、45分間、6mlのNMP中、5当量のアミノ酸、4.9当量のHATU、および10当量のDIPEAを使用する、Fmoc−D−Thr(tBu)−OHでFmoc脱保護の後に充填した。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Pro−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Pro−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで、90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルを用い、ABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%のピペリジン(v/v)で7分間、3回、行った。ダブルカップリングのステップを、40のアミノ酸をカップリングした後行った。N末端のシステイン誘導体は、Boc−D−Cys(Trt)−OHであった。
5マイクロモル濃度の(3)および1当量の(1)を、DCM中25%のTFE(v/v)に溶解した。5当量のPyBOPおよび10当量のDIPEAを添加した後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させ、ろ過した。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Zheng et al.(Zheng et al., 2013)に記載されるようにヒドラジドで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間、2回インキュベートし、その後、DCM、およびDCM中50%のDMF(v/v)で洗浄した。この後、樹脂を、DMF中5%のNH2NH2(v/v)で30分間、2回インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。第1のアミノ酸のカップリングを、NMPに溶解した1mmolのFmoc−D−Ala−OH、0.9mmolのHATU、2mmolのDIPEAで1時間樹脂をインキュベートすることにより達成した。自動化合成を、FASTmocプロトコルを用い、ABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%のピペリジン(v/v)で7分間、3回行った。ダブルカップリングを、43のアミノ酸のカップリングの後行った。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Asn(Trt)−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで30分間、2回インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Asn(Trt)−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルでABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分間であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%のピペリジン(v/v)で7分間、3回、行った。ダブルカップリングを、40のアミノ酸のカップリングの後行った。N末端のアセチル化を、DMF中10%の無水酢酸(v/v)および10%のDIPEA(v/v)で、10分間、3回行った。
0.10mmolのTentaGel−R−Trityl樹脂を、Barlos et al.(Barlos et al., 1989)に記載されるようにFmoc−D−Leu−OHで充填した。よって、0.10mmolの樹脂を、0.6mmolの塩化チオニルで2回、30分間インキュベートし、その後、DCMで洗浄した。この後、樹脂を、0.6mmolのFmoc−D−Leu−OH、2.4mmolのDIPEAを含む6mlのDCMで90分間インキュベートした。その後、樹脂を、DCM中10%のMeOH(v/v)、10%のDIPEA(v/v)の溶液を使用して10分間、3回ブロッキングし、DCMで洗浄した。自動化合成を、FASTmocプロトコルでABI433を使用して行った。10当量のアミノ酸を、NMP中9当量のHATUおよび20当量のDIPEAを使用して活性化した。カップリング時間は45分であり、Fmoc脱保護を、NMP中20%(v/v)のピペリジンで7分間、3回行った。最終的なカップリングステップの後、Fmoc脱保護を実行した。リポタグを、Garcia−Echeverria (Garcia−Echeverria, C. 1995)にしたがって、一晩、NMP中10当量の4−ニトロフェニル−2−(オクタデシルスルホニル)エチルカルボナート、10当量のHOBt、および10当量のDIPEAで樹脂をインキュベートすることにより導入した。この後、樹脂を、NMPおよびDCMで洗浄した。
ペプチド10およびペプチド9を、200Mのメルカプトフェニル酢酸および50mMのトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー(200mM、6MのグアニジンHCl、pH8)に2mMで溶解した。反応混合物を室温で24時間振盪した。HPLC精製を、30分で、C4カラム(Jupiter 5μm,300Å, Phenomenex, ドイツアシャッフェンブルク)および30〜95%のACN(0.1%のTFA)の勾配を使用して実行した。画分を含む産物を組み合わせ、凍結乾燥した。ライゲーション産物の理論的な分子量(Mtheor=17641Da)は、ESI−LC−MSにより示されるように観察した分子量(Mobs=17641Da)に対応する。
ペプチド11のヒドラジドの官能性の酸化、チオエステルへの変換、および天然の化学的なライゲーションを、Zheng et al.(Zheng et al., 2013)により行った。ペプチド11を、リン酸ナトリウムバッファー(200mM、6MのグアニジンHCl、pH3)に2mMで溶解し、−15℃の氷冷槽に置いた。酸化を、NaNO2を添加することにより行い、50mMの最終濃度を得た。15分後、溶液を、200Mのメルカプトフェニル酢酸および50mMのTCEPを含むリン酸ナトリウムバッファー(200mM、6Mのグアニジン―HCl、pH8)中、ペプチド8の2mMの溶液と混合した。
この実施例は、実施例11、12、13、および14による全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203C、A71C/A155C/V203C、およびM76G/A155C/V203Cに対するPCR活性試験を記載する。ここで、全―DポリメラーゼDpo4変異体A71C/A155C/V203Cは、実施例13または14による合成およびライゲーションで産生できる。
驚くべきことに、合成全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203C、A71C/A155C/V203C、およびM76G/A155C/V203Cは、余分な再折り畳みを行うことなく活性であり、したがって、さらなる再折り畳み手順なく使用される。プレキャストゲル(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)上でのドデシル硫酸ナトリウム(略称SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(略称PAGE)により、標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用い、その後SYPRO−RED染色(Invitrogen,ドイツカールスルーエ)およびBioRad Fxスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによって、タンパク質濃度を推定する。
PCR反応に対する鋳型は、83マー1本鎖L−DNAオリゴヌクレオチド(MJ_1_105_LD)であり、そこから、第一の温度サイクルにおいて逆鎖が生成される。その後、両鎖を指数関数的増幅に対する鋳型とする。NOXXONにおいてL−立体配置で鋳型DNAオリゴヌクレオチドおよびDNAプライマーを合成する。
15μLPCR反応は、各0.2mMの4種類のL−dNTP、10nM 83マーssDNA(MJ_1_105_LD)鋳型、1μMのフォワードおよびリバースプライマー、1x ThermoPol緩衝液(Invitrogen、20mMトリス−HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X−100、pH8.8@25℃)および少なくとも0.67ng/μLの全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203Cを含有する。フォワードプライマーは、MJ_oligo_187_LDであり、102bpのPCR生成物が得られ、これは83マー鋳型とは区別されるものである。リバースプライマーは、MJ_oligo_189_LDである。L−dNTPは、Rasayan,Inc.(米国カリフォルニア州エンシニータス)によるカスタム合成として購入する。
全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203CおよびL−DNA基質およびL−ヌクレオチドを用いたPCR反応によって、DNA標準物質ラダーと比較した場合に約100bpの範囲となるバンドが得られる。このバンドは、ポリメラーゼがない陰性対照では出現しない。また、この102bpバンドは、83マー鋳型より高く移動する。全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203CはL−DNA増幅の出現に依存するので、温度増幅過程での合成全−DポリメラーゼDpo4変異体A155C/V203Cの活性が確認される。
標準的な環外アミン保護基とともに(DamhaおよびOgilvie、1993)2’TBDMS DNAホスホラミダイト化学を用いて、ABI394合成装置(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)による固相合成によって、L−DNA核酸またはD−DNA核酸を作製した。DNA合成のために、D−およびL−立体配置のdA(N−Bz)−、dC(N−Ac)−、dG(N−ibu)−およびdTを適用した。ChemGenes,Wilmington,MAから全ホスホルアミダイトを購入した。合成および脱保護後、ゲル電気泳動によってL−DNA核酸またはD−DNA核酸を精製した。
Claims (26)
- 第1のL−核酸の3’末端に1つまたは複数のL−ヌクレオチドを付加する方法であって、前記方法が、変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で第1のL−核酸と前記1つまたは複数のL−ヌクレオチドを反応させるステップを含み、前記酵素活性が、前記第1のL−核酸の3’末端に1つまたは複数のL―ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、前記配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
(i) 前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の以下のアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置71、76、もしくは67のうちの少なくとも1つ、または、
b)アミノ酸位置155もしくは203および71、または、
c)アミノ酸位置155もしくは203および31、または、
d)アミノ酸位置155もしくは203および76、または、
e)アミノ酸位置155もしくは203および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203および85、または、
i)アミノ酸位置155および203および71、または、
j)アミノ酸位置155および203および86、または、
k)アミノ酸位置155および203および31、または、
l)アミノ酸位置155および203および76、または、
m)アミノ酸位置155および203および67、または、
n)アミノ酸位置155および203および96、または、
o)アミノ酸位置155および203および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、ならびに/または
(ii) 前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号15に係るアミノ酸配列のn個のC末端のアミノ酸を欠いており、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、および15を含む群から選択されるいずれかの整数である、
方法。 - a)〜o)のうちのいずれか1つで、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、請求項1に記載の方法。
- L−ヌクレオチドおよび変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的L−核酸を増幅する方法であって、前記変異酵素活性提示部分が、前記標的L−核酸を増幅することができ、
前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸が、D−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記変異酵素提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
(i) 前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の以下のアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置71、76、もしくは67のうちの少なくとも1つ、または、
b)アミノ酸位置155もしくは203および71、または、
c)アミノ酸位置155もしくは203および31、または、
d)アミノ酸位置155もしくは203および76、または、
e)アミノ酸位置155もしくは203および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203および85、または、
i)アミノ酸位置155および203および71、または、
j)アミノ酸位置155および203および86、または、
k)アミノ酸位置155および203および31、または、
l)アミノ酸位置155および203および76、または、
m)アミノ酸位置155および203および67、または、
n)アミノ酸位置155および203および96、または、
o)アミノ酸位置155および203および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、ならびに/または
(ii) 前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号15に係るアミノ酸配列のn個のC末端のアミノ酸を欠いており、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、および15を含む群から選択されるいずれかの整数である、
方法。 - a)〜o)のうちのいずれか1つで、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、
請求項3に記載の方法。 - 前記変異酵素活性提示部分が、
(i) 配列番号89〜120のいずれか1つに係るアミノ酸配列、または
(ii) 配列番号121、161、201、241、および281のいずれか1つに係るアミノ酸配列、または
(iii) 配列番号122〜160、162〜200、202〜240、242〜280、および282〜338のいずれか1つに係るアミノ酸配列、
を含む、
請求項1または3に記載の方法。 - 第1のL−核酸の3’末端に1つまたは複数のL−ヌクレオチドを付加する方法であって、前記方法が、変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で第1のL−核酸と前記1つまたは複数のL−ヌクレオチドを反応させるステップを含み、前記酵素活性が、前記第1のL−核酸の3’末端に1つまたは複数のL―ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、前記配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なる、
方法。 - a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項6に記載の方法。
- L−ヌクレオチドおよび変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的L−核酸を増幅する方法であって、前記変異酵素活性提示部分が、前記標的L−核酸を増幅することができ、
前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸が、D−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記変異酵素提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なる、
方法。 - a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項8に記載の方法。
- 前記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項3、8及び9のいずれか一項に記載の方法。
- 変異酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、前記変異酵素活性が、第1のL−核酸の3’末端に1つまたは複数のL−ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22、および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
(i) 前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置71、76もしくは67のうちの少なくとも1つ、または、
b)アミノ酸位置155もしくは203および71、または、
c)アミノ酸位置155もしくは203および31、または、
d)アミノ酸位置155もしくは203および76、または、
e)アミノ酸位置155もしくは203および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203および85、または、
i)アミノ酸位置155および203および71、または、
j)アミノ酸位置155および203および86、または、
k)アミノ酸位置155および203および31、または、
l)アミノ酸位置155および203および76、または、
m)アミノ酸位置155および203および67、または、
n)アミノ酸位置155および203および96、または、
o)アミノ酸位置155および203および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
ならびに/または
(ii) 前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号15に係るアミノ酸配列のn個のC末端のアミノ酸を欠いており、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、および15を含む群から選択されるいずれかの整数である、
タンパク質。 - a)〜o)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換され、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項12に記載のタンパク質。
- 前記変異酵素活性提示部分が、
(i) 配列番号89〜120のいずれか1つに係るアミノ酸配列、または
(ii) 配列番号121、161、201、241、および281のいずれか1つに係るアミノ酸配列、または
(iii) 配列番号122〜160、162〜200、202〜240、242〜280、および282〜338のいずれか1つに係るアミノ酸配列、
を含む、
請求項12又は13に記載のタンパク質。 - 変異酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、前記変異酵素活性が、第1のL−核酸の3’末端に1つまたは複数のL−ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号15〜22、および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なる、
タンパク質。 - a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項15に記載のタンパク質。
- 前記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位である、請求項12〜16のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 野生型のポリメラーゼのポリメラーゼの変異体であり、
前記ポリメラーゼの変異体が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記野生型のポリメラーゼが、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号15〜22、および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、以下の、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置71、76もしくは67のうちの少なくとも1つ、または、
b)アミノ酸位置155もしくは203および71、または、
c)アミノ酸位置155もしくは203および31、または、
d)アミノ酸位置155もしくは203および76、または、
e)アミノ酸位置155もしくは203および67、または、
f)アミノ酸位置155もしくは203および86、または、
g)アミノ酸位置155もしくは203および96、または、
h)アミノ酸位置155もしくは203および85、または、
i)アミノ酸位置155および203および71、または、
j)アミノ酸位置155および203および86、または、
k)アミノ酸位置155および203および31、または、
l)アミノ酸位置155および203および76、または、
m)アミノ酸位置155および203および67、または、
n)アミノ酸位置155および203および96、または、
o)アミノ酸位置155および203および85
で、配列番号15に係るアミノ酸配列からなる野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、
ならびに/または
(ii)前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号15に係るアミノ酸配列のn個のC末端のアミノ酸を欠いており、nが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、および15を含む群から選択されるいずれかの整数である、
ポリメラーゼの変異体。 - a)〜o)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項18に記載のポリメラーゼの変異体。
- 前記ポリメラーゼの変異体が、
(i) 配列番号89〜120のいずれか1つに係るアミノ酸配列、または
(ii) 配列番号121、161、201、241、および281のいずれか1つに係るアミノ酸配列、または
(iii) 配列番号122〜160、162〜200、202〜240、242〜280、および282〜338のいずれか1つに係るアミノ酸配列、
を含む、
請求項18又は19に記載のポリメラーゼ変異体。 - 野生型のポリメラーゼのポリメラーゼの変異体であり、
前記ポリメラーゼの変異体が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記野生型のポリメラーゼが、配列番号15に係るアミノ酸配列からなり、配列番号15に係るアミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、かつ/または、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号15に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号15〜22、および51のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記ポリメラーゼの変異体が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記ポリメラーゼの変異体が、少なくとも1つのアミノ酸位置で、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号15に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号339〜343のいずれか1つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置:
a)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは71、または、
b)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは86、または、
c)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは31、または、
d)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは76、または、
e)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは67、または、
f)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは96、または、
g)アミノ酸位置155および/もしくは203および/もしくは85
で、配列番号339〜343のいずれか1つのアミノ酸配列と異なる、
ポリメラーゼ変異体。 - a)〜h)のいずれか1つにおいて、位置155、203、71、67、85、および96のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置31のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置76のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置86のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項21に記載のポリメラーゼ変異体。
- L−核酸の3’末端に1つまたは複数のL−ヌクレオチドを付加する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、請求項12〜17のいずれか1項に記載のタンパク質である、使用。
- L−ヌクレオチドの存在下で標的L−核酸を増幅する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、請求項12〜17のいずれか1項に記載のタンパク質である、使用。
- L−核酸分子に結合する標的分子の同定のための方法であって、以下の、
(a)L−核酸分子の異種性の集合を作製するステップと、
(b)前記標的分子と、ステップ(a)のL−核酸分子の異種性の集合を接触させるステップと、
(c)前記標的分子により結合されていないL−核酸分子を分離するステップと、
(d)前記標的分子により結合されたL−核酸分子を増殖するステップであって、前記増殖ステップがタンパク質を使用しており、前記タンパク質が、請求項12〜17のいずれか1つに記載のタンパク質である、ステップと
を含む、方法。 - タンパク質を生成する方法であって、前記タンパク質がアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD―アミノ酸であり、
(a)前記タンパク質の2つ以上のフラグメントが化学的に合成されており、これにより前記フラグメントが全体で、前記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、前記フラグメントが、固相ペプチド合成により合成されており、
(b)ステップ(a)のフラグメントが、セグメントの縮合、天然の化学的なライゲーション、酵素的なライゲーション、またはその組み合わせにより互いに結合しており、
前記タンパク質が、請求項12〜17のいずれか1項に記載のタンパク質である、
方法。
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