KR102285583B1

KR102285583B1 - L-dna와 결합하는 자연계 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102285583B1
Application number: KR1020200003290A
Authority: KR
Inventors: 안대로; 정학숙; 안진수; 최재우
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2021-08-05
Also published as: KR20210090010A

Abstract

본 발명은 L-DNA와 결합 성질을 보이는 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질, 상기 단백질을 포함하는 약물 전달체, 및 상기 약물 전달체 및 항암제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates) 제조에 적용하여 표적 선택적으로 약물을 전달할 수 있다. 또한, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 항체와 약물의 컨쥬게이션(conjugation)에 적용하게 되면, 특정 표적으로 약물을 전달하기 위한 항체의 표적 인식 부위를 방해하지 않으면서, 위치 선별적으로 원하는 정량만큼 약물 표지가 가능하다.

Description

L-DNA와 결합하는 자연계 단백질 및 이의 용도{An L-DNA-binding natural protein and uses thereof}

본 발명은 L-DNA와 결합 성질을 보이는 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질, 상기 단백질을 포함하는 약물 전달체, 및 상기 약물 전달체 및 항암제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

L-DNA는 천연(natural) D-DNA의 거울상 이성질체이다. 거울상 이미지 구조로 인해 L-DNA는 D-DNA와 혼성화되지 않는다 (B. E. Young. et.al., Chemistry - A European Journal, 25:7981-7990, 2019). L-DNA는 천연 유전자 시스템에 사용되지 않지만, 이 생물직교성 염기-쌍 시스템은 주로 유전자 검출 시스템의 표적 특이성을 개선하고자 생명공학에 적용되어왔다 (G. Ke. et.al., Journal of the American Chemical Society, 134:18908-18911, 2012; N. C. Hauser et.al., Nucleic acids research, 34:5101-5111, 2006). L-DNA의 키랄성은 폴리머라아제, 리가아제 및 뉴클레아제를 포함하는 자연적으로 발생하는 DNA 변형 효소와 양립할 수 없다. 특히, L-DNA의 뉴클레아제 내성은 생물학적 환경에서 앱타머의 안정성을 확보하고자 사용되어왔다 (K. P. Williams et.al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 94:11285-11290, 1997). 또한, L-DNA 이중체(duplex)가 천연 DNA 이중체와 동일한 열역학적 특성을 유지함에 따라 (W. G. Purschke et.al., Nucleic acids research, 31:3027-3032, 2003), D-DNA 나노구조체를 구축하기 위해 이전에 사용된 서열을 차용함에 의해 다양한 자가-조립된 L-DNA 나노구조체를 쉽게 제조할 수 있었다 (K.-R. Kim et.al., Journal of Controlled Release, 243:121-131, 2016; C. Lin et.al., Nano Letters, 9:433-436, 2009). L-DNA 나노구조체는 향상된 혈청 안정성뿐만 아니라 상대적으로 높은 세포 흡수 효율 및 그들의 천연 대응물(counterpart)에 비해 유사한 생체적합성을 보여주었다 (K.-R. Kim et.al., Chemical Science, 5:1533-1537, 2014). L-DNA 나노구조체의 이러한 특성은 생체내 적용을 위한 약물 전달 플랫폼을 개발하는데 성공적으로 활용되었다 (K.-R. Kim et.al., Biomaterials, 195:1-12, 2019; A. Y. Lee et.al., Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 74:187-192, 2019).

L-DNA 나노구조체를 이용하여 단백질 약물을 전달하고자 할 시에는 L-DNA와 단백질간 결합(conjugation)이 필요한데, 이를 위해서 쉽게 이용할 수 있는 방법은 L-DNA 말단을 화학적 결합이 용이한 카르복실산(carboxylic acid), 아민(amine), 또는 티올(thiol) 작용기로 변형하고, 이를 단백질이 지니는 리신(Lys)의 아민 작용기와 교차결합(cross-linking) 반응을 보내는 것이다. 하지만, 이러한 방법은 단백질 내 여러 Lys 중 특정 Lys에만 선택적으로 L-DNA가 결합이 되도록 하기가 어렵다는 단점이 있다. 만일, 단백질이 지니는 도메인들 중에서 L-DNA와 결합할 수 있는 도메인이 있으면 탑재하고자 하는 단백질 약물에 이러한 L-DNA 결합 도메인을 도입하여 L-DNA를 섞어 주었을 때, 자연스럽게 L-DNA에 단백질 약물이 결합하여 탑재 되도록 할 수 있다. 이외에 최근 siRNA또는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)와 같은 질환 유전자를 표적으로 하는 유전자 약물을 질환 부위에 효과적으로 전달하기 위하여 올리고뉴클레오타이드 유전자 약물에 항체를 결합하여 사용하는 항체-올리고뉴클레오타이드 결합(Antibody-Oligonucleotide Conjugates, AOCs)를 활용하고자 하는 시도가 활발하다. 이때, L-DNA 결합 도메인을 항체에 도입하고 유전자 약물 말단을 L-DNA로 연장하여 서로 결합하게 함으로써 유전자 약물을 항체의 특정 부분에 결합하는 것이 가능할 수 있다. 그러나, 자연계에 알려진 단백질 중 현재까지 L-DNA와 결합할 수 있는 도메인을 내재하고 있는 단백질은 보고된 바 없다. L-DNA와의 결합력을 지닐 수 있는지 여부를 알아보기 위해서는 L-DNA와 자연계 단백질간의 상호작용을 알아볼 수 있는 구조적 정보가 필수적으로 필요한데, 이러한 정보도 자연계 DNA인 D-DNA와 단백질의 상호작용에 대한 정보에 비해 매우 부족한 상황이다.

다양한 천연 DNA 형태의 구조 및 그들의 단백질과의 복합체에 대한 연구의 수와 달리 (T. A. Steitz, Journal of Biological Chemistry, 274:17395-17398, 1999; P. J. Paukstelis et.al., Crystals, 6:97, 2016; N. M. Luscombe et.al., Genome Biology, 1, reviews001.1., 2000), L-DNA의 구조에 대한 연구는 매우 제한적이었다. 천연 DNA의 구조적 식견은 많은 DNA-관련 생물학적 기능을 이해하기 위해 더 유용한 정보를 제공하기 때문에 놀라운 것은 아니다. 그럼에도 불구하고, 많은 기능적 L-DNA 구조가 등장하기 시작하면서, L-DNA 구조와 분자 수준의 단백질과의 그들 복합체의 구조적 설명은 거울상 DNA가 생물학적 시스템에 어떻게 통합될 수 있는지 이해하고, L-DNA에서 작동하는 새로운 효소를 설계하는 방법을 마련하는 데 중요하다. 이전에, L-DNA 이중체의 결정 구조는 라세미 혼합물에서 보고되었다 (P. K. Mandal et.al., Angewandte Chemie International Edition, 53:14424-14427, 2014). 자가-조립된 L-DNA 삼방정계의 홀리데이 접합부(Holliday junction)의 결정도 매우 최근에 얻어졌다 (C. R. Simmons et.al., Journal of the American Chemical Society, 139:11254-11260, 2017). L-DNA/단백질 복합체의 구조 측면에서, L-DNA-단백질 상호작용이 자연적으로 자유롭게 이용 가능하지 않기 때문에 매우 적은 경우가 보고되었다. 거울상 DNA/천연 단백질 복합체의 유일한 공지된 결정 구조는 천연 단백질과 이의 실험적으로 발달된 거울상 DNA 앱타머 (또는 DNA 스피에겔머(spiegelmer)) 간의 상호작용을 기술하였다 (L. Yatime et.al., Nature Communications, 6:6481, 2015). 그러나, 천연 단백질의 고유 L-DNA 결합 특성은 지금까지 탐구되지 않았다.

B. E. Young. et.al., Chemistry - A European Journal, 25:7981-7990, 2019 G. Ke. et.al., Journal of the American Chemical Society, 134:18908-18911, 2012 N. C. Hauser et.al., Nucleic acids research, 34:5101-5111, 2006 K. P. Williams et.al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 94:11285-11290, 1997 W. G. Purschke et.al., Nucleic acids research, 31:3027-3032, 2003 K.-R. Kim et.al., Journal of Controlled Release, 243:121-131, 2016 C. Lin et.al., Nano Letters, 9:433-436, 2009 K.-R. Kim et.al., Chemical Science, 5:1533-1537, 2014 K.-R. Kim et.al., Biomaterials, 195:1-12, 2019 A. Y. Lee et.al., Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 74:187-192, 2019 T. A. Steitz, Journal of Biological Chemistry, 274:17395-17398, 1999 P. J. Paukstelis et.al., Crystals, 6:97, 2016 N. M. Luscombe et.al., Genome Biology, 1, reviews001.1., 2000 P. K. Mandal et.al., Angewandte Chemie International Edition, 53:14424-14427, 2014 C. R. Simmons et.al., Journal of the American Chemical Society, 139:11254-11260, 2017 L. Yatime et.al., Nature Communications, 6:6481, 2015

상기와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 신규한 생체적합성(biocompatible) 약물 전달체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 천연 DNA의 거울상 형태인 L-DNA와 DNA 중합효소 Dpo4 유래의 LF 도메인(little figner domain)이 결합 특성을 보임을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 L-DNA와 결합력을 지니는, 단백질 도메인을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인 및 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는 약물 전달체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약물 전달체 및 항암제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은 L-DNA와 결합력을 지니는, 단백질 도메인을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 도메인은 서열번호 2와 서열 상동성이 30% 이상인, 단백질 도메인을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 도메인은 서열번호 2와 서열 상동성이 80% 이상인, 단백질 도메인을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 DNA 중합효소 유래인, 단리된 L-DNA 결합 도메인을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 Dpo4(DNA polymerase 4)인, 단리된 L-DNA 결합 도메인을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 DNA 중합효소의 LF 도메인(little figner domain)인, 단리된 L-DNA 결합 도메인을 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Arg(Arginine), 321번째 Lys(Lysine) 및 339번째 Lys(Lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않는 것인, 단리된 L-DNA 결합 도메인을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 도메인을 포함하는, 단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 단백질은 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates) 제조에 적용되는 것인, 단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 약물은 항암제, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 리보핵산(siRNA, small interfering RNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 단백질을 포함하는, 약물 전달체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 약물 전달체; 및 항암제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 항암제는 DNA 앱타머 또는 RNA 앱타머인, 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates) 제조에 적용하여 표적 선택적으로 약물을 전달할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 일측면에 따른 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 항체와 약물의 컨쥬게이션(conjugation)에 적용하게 되면, 특정 표적으로 약물을 전달하기 위한 항체의 표적 인식 부위를 방해하지 않으면서, 위치 선별적으로 원하는 정량만큼 약물 표지가 가능하므로, 항체-약물 복합체 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1은 천연 DNA 중합효소가 핵심 도메인, 예컨대 썸(thumb), 팜(palm) 및 핑거(finger)에 의해 형성된 포켓을 사용하여 D-DNA에 결합하고 (상단), DNA 중합효소가 L-DNA에 결합할 수 있는지의 여부에 대해서는 알려져 있지 않음 (하단)에 관하여 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 D-DNA(상단) 및 L-DNA(하단)에 결합하는 중합효소를 스크리닝한 6% Native PAGE 결과를 나타낸 도이다. P 및 T는 각각 프라이머 및 주형을 나타낸다.
도 3은 Dpo4(DNA polymerase 4)의 L-DNA 결합 특성을 나타낸 도이다. 구체적으로, (a) FP 분석에 의해 추정된 Dpo4의 DNA 결합 친화력을 나타낸 도이다. 형광 표지된 DNA의 농도는 100 nM이었다. (b) Dpo4 결합에 대한 D-DNA 및 L-DNA간의 경쟁을 나타낸 도이다. D-DNA를 100 nM의 형광 표지된 L-DNA와 미리 인큐베이션한 Dpo4 (1 μM) 용액으로 적정하였다. (c) 형광 표지된 D-프라이머 및 L-프라이머 (100 nM)에 대해 프라이머 연장 반응을 분석한 20% 변성 PAGE 수행 결과를 나타낸 도이다. P 및 P+1은 각각 프라이머 및 단일 뉴클레오티드-연장된 프라이머를 나타낸다. (d) FP 분석을 사용하여, 상이한 GC-함량 (100 nM)을 갖는 다양한 DNA 이중체에 대한 Dpo4 결합의 K_d 값을 측정하여 나타낸 도이다. GC-0, GC-33, GC-67 및 GC-100은 각각 DNA 이중체에서 0%, 33%, 67% 및 100% GC 함량을 나타낸다.
도 4는 D-DNA 및 L-DNA와 복합체를 이루는 Dpo4의 결정 구조를 나타낸 도이다. 구체적으로, (a) Dpo4/D-DNA 바이너리 복합체(binary complex)의 전체 구조를 나타낸 도이다. (b) Dpo4/L-DNA 바이너리 복합체의 전체 구조를 나타낸 도이다. (c) apo-Dpo4 (분홍색), D-DNA (청록색) 및 L-DNA (연한 청색)와 복합화된 Dpo4를 중첩하여 나타낸 도이다. Dpo4/D-DNA 복합체, Dpo4/L-DNA 복합체, 및 apo-Dpo4의 아미노산 부분의 구조적 정렬을 나타내었다. 리틀 핑거 및 다른 핵심 도메인, 촉매 핵심 도메인 (왼쪽 하단), 및 리틀 핑거 도메인 (오른쪽 하단) 간의 가요성 링커 주변의 아미노산 잔기를 확대하여 볼 수 있는 전체 Dpo4 구조 (상단)를 나타내었다. Dpo4/D-DNA 이중체 및 Dpo4/L-DNA 이중체의 C-알파 원자는 PyMol (PDB: 2RDI)프로그램으로 apo-Dpo4 구조의 C-알파 원자와 정렬되었다. (d) Dpo4/L-DNA 복합체에서 이량체화된 리틀 핑거 도메인의 구조 및 이의 90°회전뷰를 나타낸 도이다. (e) 등온적정열량계를 사용하여 추정된 결합 화학량론 곡선을 나타낸 도이다.
도 5는 L-DNA와의 상호작용을 위한 Dpo4에 있어서 리틀 핑거(little finger, LF)의 중요한 역할에 대해 시사하는 도이다. (a) Dpo4, 리틀 핑거가 절단된 Dpo4 (Dpo4-ΔLF), 리틀 핑거가 돌연변이된 Dpo4 (Dpo4-mutLF) 및 리틀 핑거 도메인 (LF)과 L-DNA와의 결합 친화력을 형광 편광 분석을 사용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다. (b) L-DNA 이중체의 부홈과의 상호작용을 담당하는 사슬 A 및 주홈과의 상호작용을 담당하는 사슬 B의 리틀 핑거로부터의 아미노산 잔기를 나타낸 도이다. (c) Dpo4-L-DNA 상호작용의 개략도를 나타낸 도이다.
도 6은 (a) 다양한 고세균(archaea) 종으로부터의 Dpo4의 다양한 농도 조건에 대한 L-DNA의 결합 정도를 추정하고자 실시한 6% Native PAGE 결과 및 (b) 시그마플롯 소프트웨어 (SigmaPlot software; Systat, USA)를 사용하여 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 방정식에 대한 밴드(band) 강도 및 비선형 회귀의 정량화에 의해 결정된 K_d 값을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 적용하여 제조한 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates)의 약물 전달 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 서열번호 2로 표시되는 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4를 기준으로 서열번호 11로 표시되는 술폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius: Sa) Dpo4를 정렬하여 상동성(55.6%)을 확인한 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 서열번호 2로 표시되는 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4를 기준으로 서열번호 12로 표시되는 피크로필러스 토리두스(Picrophilus torridus: Pt) Dpo4를 정렬하여 상동성(48.2%)을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 서열번호 2로 표시되는 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4를 기준으로 서열번호 13으로 표시되는 메탈로스페에라 세둘라(Metallosphaera sedula: Ms) Dpo4를 정렬하여 상동성(56.8%)을 확인한 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 서열번호 2로 표시되는 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4를 기준으로 서열번호 14로 표시되는 니트로소스파이라 비에넨시스(Nitrososphaera viennensis: Nv) Dpo4를 정렬하여 상동성(35.7%)을 확인한 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 서열번호 2로 표시되는 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4를 기준으로 서열번호 15로 표시되는 아시디플라즈마 에오리쿰(Acidiplasma aeolicum: Aa) Dpo4를 정렬하여 상동성(44.5%)을 확인한 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 서열번호 2로 표시되는 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4를 기준으로 고세균 도메인에 있는 5개의 다른 종들 (술폴로부스 아시도칼다리우스[Sulfolobus acidocaldarius: Sa(서열번호 11)], 피크로필러스 토리두스[Picrophilus torridus: Pt(서열번호 12)], 메탈로스페에라 세둘라[Metallosphaera sedula: Ms(서열번호 13)], 니트로소스파이라 비에넨시스[Nitrososphaera viennensis: Nv(서열번호 14)], 아시디플라즈마 에오리쿰[Acidiplasma aeolicum: Aa(서열번호 15)])로부터의 Dpo4를 EMBOSS Needle 프로그램을 이용하여, 정렬하여 나타낸 도이다.

달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates) 제조에 적용하여 표적 선택적으로 약물을 전달할 수 있는, L-DNA와 결합 성질을 보이는 도메인을 포함하는 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질, 상기 단백질을 포함하는 약물 전달체, 및 상기 약물 전달체 및 항암제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "L-DNA"는 천연(natural) D-DNA의 거울상 이성질체로, 거울상 이미지 구조로 인해 L-DNA는 D-DNA와 혼성화되지 않는 특징이 있다. L-DNA의 키랄성은 중합효소(polymerase), 리가아제(ligase) 및 뉴클레아제(nuclease)를 포함하는 자연적으로 발생하는 DNA 변형 효소와 양립할 수 없음이 알려져 있다. 특히, L-DNA의 뉴클레아제 내성은 생물학적 환경에서 앱타머의 안정성을 확보하고자 사용되어왔다. 또한, L-DNA 이중체(duplex)가 천연 DNA 이중체와 동일한 열역학적 특성을 유지함에 따라, D-DNA 나노구조체를 구축하기 위해 이전에 사용된 서열을 차용함에 의해 다양한 자가-조립된 L-DNA 나노구조체를 쉽게 제조할 수 있음이 보고된 바 있다. L-DNA 나노구조체는 향상된 혈청 안정성뿐만 아니라 상대적으로 높은 세포 흡수 효율 및 그들의 천연 대응물(counterpart)에 비해 유사한 생체적합성을 보여주고, L-DNA 나노구조체의 이러한 특성은 생체내 적용을 위한 약물 전달 플랫폼을 개발하는데 활용될 수 있음이 보고되었다.

본 발명에서 용어 "단백질 도메인"은 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 L-DNA에 결합하는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 '폴리펩타이드(polypeptide)'는 10개 이상의 아미노산이 펩타이드(peptide) 결합으로 형성된 아미노산 중합체로서, L-DNA와 결합할 수 있는 한 임의의 특정 폴리펩타이드로 제한되지 않는다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 대응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 도메인은 이에 제한되지는 않으나 서열번호 2와 서열 상동성이 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, L-DNA와 결합력을 지니는 단백질 도메인일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 술포로부스 솔파타리커스 (Sulfolobus solfataricus, Ss) 유래의 Dpo4의 L-DNA 결합 능력을 조사하고자, 형광 편광 (fluorescence polarization, FP) 분석을 사용하여 해리 상수 (K_d) 값을 측정한 결과, K_d 값이 L-DNA 결합에 대해 756 nM임을 나타내었다 (도 3의 a).

또한, 겔-시프트 결합 분석법(gel-shift binding assay)을 사용하여 상기 고세균 술포로부스 솔파타리커스 이외의 고세균 도메인에 있는 5개의 다른 종들 (술폴로부스 아시도칼다리우스[Sulfolobus acidocaldarius: Sa], 피크로필러스 토리두스[Picrophilus torridus: Pt], 메탈로스페에라 세둘라[Metallosphaera sedula: Ms], 니트로소스파이라 비에넨시스[Nitrososphaera viennensis: Nv], 아시디플라즈마 에오리쿰[Acidiplasma aeolicum: Aa])로부터 Dpo4를 조사하였을 시, 이들은 모두 L-DNA에 결합할 수 있음을 확인하였다 (도 6). L-DNA 결합에 대한 이들의 K_d 값은 200 내지 5088 nM으로 결정되었다. 이는 고세균 도메인의 Dpo4 중합효소가 일반적으로 L-DNA 결합 특성을 가질 수 있지만, 친화력은 유기체에 따라 달라질 수 있음을 알 수 있었다.

한편, 상기 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4(서열번호 2)를 기준으로 상기 고세균(archaea) 도메인에 있는 5개의 다른 종들 (Sa(서열번호 11)], Pt(서열번호 12), Ms(서열번호 13), Nv(서열번호 14), Aa(서열번호 15))로부터의 Dpo4를 EMBOSS Needle 프로그램을 이용하여, 상동성을 확인해 본 결과, Ss Dpo4와 Sa Dpo4의 경우 55.6% (도 8), Ss Dpo4와 Pt Dpo4의 경우 48.2% (도 9), Ss Dpo4와 Ms Dpo4의 경우 56.8% (도 10), Ss Dpo4와 Nv Dpo4의 경우 35.7% (도 11), Ss Dpo4와 Aa Dpo4의 경우 44.5% (도 12)의 상동성을 보임을 확인하였다.

상기 일련의 결과를 통해, 유래 유기체에 따라 L-DNA 친화력에 차이를 보이기는 하나, 술포로부스 솔파타리커스 유래의 Dpo4와 30% 수준의 상동성만을 나타내어도 L-DNA와 결합 특성을 가짐을 알 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 "L-DNA"는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "L-DNA 결합 도메인" 또는 "단리된 L-DNA 결합 도메인"은 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 L-DNA에 결합하는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 '폴리펩타이드(polypeptide)'는 10개 이상의 아미노산이 펩타이드(peptide) 결합으로 형성된 아미노산 중합체로서, 다시 말해 'L-DNA 결합 도메인'은 서열번호 1로 표시되는 121개의 아미노산(121 a.a) 서열로 구성된, 폴리펩타이드임을 의미한다.

상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인은 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 1과 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, L-DNA 결합 도메인일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 DNA 중합효소로부터 유래된 것으로, 상기 DNA 중합효소는 이에 제한되지는 않으나, Dpo4(DNA polymerase 4) 유래일 수 있다.

상기 'Dpo4(DNA polymerase 4; DNA polyerase Ⅳ)'는 호열성(thermophilic)의 고세균(archaea)에 속하는 술포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터 유래한 Y-패밀리(Y-family) DNA 중합효소(polymerase)로서, 손상통과합성 (Translesion synthesis, TLS) DNA 중합효소 중의 하나이다. Dpo4는 손상된 DNA와 직면할 때 손상된 부위에서 DNA 합성을 진행할 수 있다.

상기 Dpo4는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 2로 표시되는 352개의 아미노산(352 a.a) 서열로 구성된 폴리펩타이드일 수 있다.

또한, 상기 Dpo4는 이에 제한되지는 않으나, 술포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 술폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 피크로필러스 토리두스(Picrophilus torridus), 메탈로스페에라 세둘라(Metallosphaera sedula), 니트로소스파이라 비에넨시스(Nitrososphaera viennensis), 아시디플라즈마 에오리쿰(Acidiplasma aeolicum) 등의 고세균으로부터 유래될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 DNA 중합효소의 LF 도메인(little figner domain)일 수 있다. 바람직하게는, Y-패밀리 DNA 중합효소인 Dpo4의 LF 도메인으로, 서열번호 1로 표시되는 121개의 아미노산(121 a.a) 서열로 구성된 폴리펩타이드일 수 있다.

한편, Y-패밀리 중합효소는 UmuC, DinB, Rev1/Rad30A 속으로 구성되어 있고, Dpo4는 DinB 상동체(homolog)를 가진다. DinB 상동성 단백질은 인간 (DINB1), 쥐 (DinB1)로부터, 그리고 박테리아, 고세균까지 널리 존재하는 단백질이다. DinB 상동체들은 LF 도메인을 포함하고 있다. LF 도메인은 4개의 β-시트(β-sheet)와 2개의 α-헬릭스(α-helix)가 βαββαβ로 구성되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Arg(Arginine; R), 321번째 Lys(Lysine; K) 및 339번째 Lys(Lysine; K)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않은 것일 수 있다 (도 13 참조).

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Lys(Lysine; K), 321번째 Glu(Glutamic acid; E) 및 339번째 Asn(Asparagine; N)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않은 것일 수 있다 (도 13 참조).

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Try(Tyrosine; Y), 321번째 Lys(Lysine; K) 및 339번째 Lys(Lysine; K)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않은 것일 수 있다 (도 13 참조).

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Lys(Lysine; K), 321번째 Lys(Lysine; K) 및 339번째 Lys(Lysine; K)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않은 것일 수 있다 (도 13 참조).

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Arg(Arginine; R), 321번째 Glu(Glutamic acid; E) 및 339번째 Asp(Aspartic acid; D)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않은 것일 수 있다 (도 13 참조).

본 발명에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Try(Tyrosine; Y), 321번째 Arg(Arginine; R) 및 339번째 Lys(Lysine; K)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않은 것일 수 있다 (도 13 참조).

본 발명에서 상기 용어 "치환" 또는 "변이"는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 그 서열의 변이체를 생성시키기 위해 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 변경, 결실, 또는 삽입하는 것을 의미한다.

상기 용어 "변이체"는 하나 이상의 변형(modification), 예를 들어, 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 기준 폴리펩타이드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 다른 균등한 공유결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 분자를 의미한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.

용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 폴리펩타이드를 형성하도록 펩타이드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 약 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩타이드는 "펩타이드"로 지칭될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, L-DNA 결합 도메인, 즉 LF 도메인이 결여된 절단된 Dpo4 (Dpo4-ΔLF)가 L-DNA 결합에 대해 시험된 경우, FP 분석에서 상당한 결합 친화력을 나타내지 않음을 확인하였다 (도 5의 a). 특히, LF 도메인에서 3개의 아미노산 잔기가 L-DNA와의 결합에 관여함을 확인하였다 (도 5의 b 및 도 5의 c). 상세하게는, 사슬 A에서 LF의 Arg300 및 Lys339는 L-DNA 이중체의 주홈 근처의 인산염과 상호작용하고 (도 5의 b 및 도 5의 c), 사슬 B에서 LF의 Arg300 및 Lys321는 부홈의 인산염과 상호작용함을 확인하였다 (도 5의 b 및 도 5의 c). 이 아미노산을 알라닌 (Dpo4-mutLF)으로 돌연변이된 경우, L-DNA에 대한 K_d는 야생형에 비해 약 7배 감소한 5520 nM이었으며, 이들 아미노산이 Dpo4에 L-DNA 결합 특성을 부여하는 주요 잔기임을 입증하였다 (도 5의 a).

즉, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, Dpo4의 아미노산 서열의 300Arg, 321Lys, 339Lys 부위의 (돌연)변이 유발 시, L-DNA 및 Dpo4의 LF 도메인 간의 특이적 결합이 상실됨을 알 수 있었다 (도 5 및 도 13).

본 발명에 있어서, 상기 도메인, 구체적으로 L-DNA와 결합력을 지니는 단백질 도메인 또는 단리된 L-DNA 결합 도메인은 전술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 상기 도메인을 포함하는 단백질은 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates) 제조에 적용될 수 있다 (도 7 참조).

상기 단백질은 자연계에 존재하는 단백질로, 특정 단백질로 제한되지 않는다. 단백질은 유전정보에 따라 합성되며, 유전자는 단백질의 아미노산 배열정보를 갖고 있다. 단백질은 20종류의 아미노산으로 구성된 고분자로서, 생체에 있어서 기능분자이며, 온갖 생명현상에 필요한 과정과 화학반응을 담당하고 있다.

단백질, 예컨대 중합효소 단백질, 촉매효소 단백질, 호르몬 단백질과 같은 자연계에 존재하는 단백질은 당업자에 의해 용이하게 합성 또는 자연계에 존재하는 생물로부터 분리, 수득될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질은 단백질에 L-DNA 결합 도메인이 포함되어 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.

상기 'L-DNA 결합 도메인이 단백질에 포함되어 있는'이란, 자연계 단백질의 아미노산 배열정보 내에 L-DNA 결합 도메인, 즉 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 정보가 내포되어 있는 것을 의미한다.

이에 제한되지는 않으나, 자연계 단백질에 포함되는 상기 L-DNA 결합 도메인, 즉 Dpo4(DNA polymerase 4) 유래의 LF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상의 상동성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 용어 "항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates)"는 인체에서 질환을 유발하는 항원을 선택적으로 공격하는 항체와 치료 효과를 지닌 약물이 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질에 의해 컨쥬게이션(conjugation)된 복합체를 의미한다.

상기 'L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질'은 전술한 바와 같으며, 상기 단백질은 항체의 표적 인식 부위를 제외한 부위에 결합될 수 있다. 이에 따라, 항체가 표적 인식 부위, 즉 항원 인식 부위를 방해하지 않으면서, 위치 선별적으로 정량적인 개수만큼(예컨대, 항체 1개당 핵산약물 1개) 약물 표지가 가능함에 따라, 특정 표적 선택적으로 원하는 정량만큼 약물을 전달할 수 있다 (도 7 참조).

용어 "항체"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인(가변 영역) 또는 면역글로불린 가변 도메인(가변 영역) 서열을 포함하는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 항체는 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일쇄 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, 및 도메인 항체) 단편(de Wildt et al, Eur J Immunol., 26(3):629-39, 1996)뿐만 아니라 완전한 항체를 포함한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM(뿐만 아니라 이것의 서브타입)의 구조적 특징을 가질 수 있다. 항체는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있지만, 영장류(인간 및 비-인간 영장류) 및 영장류화가 바람직하다.

본 발명에서 있어서, 상기 약물은 항암제, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 리보핵산(siRNA, small interfering RNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 약물은 본 발명의 항체-약물 복합체 형성을 매개하는 상기 단백질에 포함된 L-DNA 결합 도메인, 즉 LF 도메인(서열번호 1)과 결합하는 L-DNA와 혼성화(hybridization) 될 수 있는 단백질 또는 유전자 약물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는, 약물 전달체를 제공한다.

상기 'L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질'은 전술한 바와 같다.

전술한 바와 같이, 약물은 본 발명의 항체-약물 복합체 형성을 매개하는 상기 단백질에 포함된 L-DNA 결합 도메인, 즉 LF 도메인(서열번호 1)과 결합하는 L-DNA 백본에 상보적으로 결합, 또는 혼성화되어 세포 내로 전달되는 것일 수 있다 (도 7 참조).

본 발명의 약물 전달체를 사용하여 세포 내로 전달할 수 있는 약물, 즉 약학적 활성 성분의 종류는 특정의 것으로 제한되지 아니하며, 예컨대 항암제, 조영제, 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 글로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 핵산, 앱타머, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, siRNA 및 마이크로 RNA 등을 포함한다.

본 발명의 약물 전달체는 약학적 활성 성분으로서 핵산을 세포 내로 전달하기 위하여 사용될 수 있으며, 이 경우 전달물질인 핵산의 서열이 담체 서열과 혼성화될 염려가 없으므로, 그 어떠한 천연의 핵산 기반 전달물질이라도 자유롭게 사용할 수 있다는 장점을 갖는다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는 약물 전달체; 및 항암제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 항암제는 이에 제한되지는 않으나, DNA 앱타머 또는 RNA 앱타머일 수 있다.

본 발명의 암 치료용 약학 조성물은 전술한 L-DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는데, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed, 1995)에 상세히 기재되어 있다.

한편, 본 발명에 따른 암 치료용 약학 조성물은, 정맥 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 구강 투여, 골수 내 투여, 경피 투여 또는 국소 투여 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁 주사제, 정제 또는 캡슐제 등의 다양한 형태로 제형화 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 실험 재료 준비 및 실험 방법

실시예 1-1: 실험 재료 준비

Dpo4를 제외한 모든 DNA 중합효소는 New England Biolabs (USA)에서 구입하였다. D-DNA 올리고뉴클레오티드는 Bioneer (Korea)에서 구입하였다. L-DNA 올리고뉴클레오티드는 표준 포스포아마다이트(phosphoramidite) 화학법을 사용하여 Mermaid-4 DNA/RNA 합성기 (Bioautomation, USA)로 1 μmol 스케일로 합성되었다. L-DNA 포스포아마다이트는 ChemGenes (USA)에서 구입하였다. 플루오레세인 포스포아마다이트는 Glen Research (USA)에서 구입하였다. L-dTTP는 TriLink BioTechnologies (USA)에서 구입하였다. D-dNTP는 Promega (USA)에서 구입하였다.

실시예 1-2: Dpo4의 발현 및 정제

코돈(codon)에 최적화된 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4를 운반하는 pET21b 플라스미드는 연세대학교 합성 생물학 연구실로부터 제공받았다. 재조합 플라스미드를 C41(DE3) 발현 숙주로 형질전환시켰다. 단백질 발현을 1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside)로 18℃에서 21시간 동안 유도하였다. HisTrap 및 HiTrap monoS 컬럼을 사용하여 Biochemistry, 43, 2106-2115 (2004)에 보고된 절차에 따라 Dpo4 (서열번호 2)를 정제하였다. 정제된 단백질을 버퍼 20mM Tris-HCl (pH 7.5), 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT에서 10K 아웃-오프 원심분리 필터를 이용하여 11 ㎎/㎖로 농축시켰다.

실시예 1-3: GMSA (Gel mobility shift assay)

ThermoPol® 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 10 mM(NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 2 mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100 pH 8.8@RT, New England Biolabs, USA) 중의 플루오레세인-표지된 프라이머 (GCT ACG ACT CAC TAT GGA CG, 100 nM) 및 주형 (AAA AAA AAA ACG TCC ATA GTG AGT CGT AGC, 100 nM)을 5분 동안 95℃로 가열하고, 어닐링하여 10분 동안 실온 (25℃)으로 냉각시켜 플루오레세인-표지된 DNA 이중체를 형성하였다. DNA 이중체 용액에 중합효소 (말단 데옥시리보뉴클레오티드 트랜스퍼라아제 (TdT) (100 단위(unit)), Deep Vent (exo-) DNA 중합효소 (28 단위), Dpo4 (10 μM), M-MuLV 역전사 효소 (2800 단위), 클레노우 절편 (3'→5' exo-) (70 단위), Taq DNA 중합효소 (70 단위), 및 Vent (exo-) DNA 중합효소 (28 단위))를 첨가하고, 상기 혼합물을 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이후, 혼합물을 100V에서 0.5×TBE (44.5 mM Tris-HCl, 44.5 mM 붕산, 1 mM EDTA pH 8.0) 내 6% 비-변성 PAGE 실행(run)으로 분석하였다. 밴드는 Chemidoc (Biorad, USA)을 사용하여 시각화되었다.

실시예 1-4: 형광 편광 분석

플루오레세인-표지된 프라이머 (fluorescein-GGG GGA AGG ATT CC) 및 주형 (TCA CGG AAT CCT TCC CCC)으로 구성된 플루오레세인-표지된 DNA 이중체 (100 nM)를 Dpo4 반응 버퍼 (50 mM HEPES, pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5mM DTT, 10% 글리세롤, 0.1mM EDTA)에서 다양한 농도 (0-10 μM)의 Dpo4와 혼합하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. DNA 이중체에 대한 Dpo4의 결합 친화력은 형광 편광 값에 의해 분석되었고, Appliskan (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 측정되었다. K_d 값은 시그마플롯 소프트웨어 (Systat, USA)를 사용하여 한-부위(one-site) 포화 리간드 결합 방정식에 대한 비-선형 회귀에 기초하여 추정되었다. 경쟁 실험을 위해, Dpo4 반응 버퍼 중 플루오레세인-표지된 L-DNA 이중체 (100nM)와 미리-혼합된 Dpo4 (1 μM)의 용액에 D-DNA 이중체를 다양한 농도 (0-4 μM)로 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 형광 편광 값은 Appliskan (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 측정되었다. IC₅₀ 값은 시그마플롯 소프트웨어 (Systat, USA)를 사용하여 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 방정식에 대한 비선형 회귀에 기초하여 추정되었다. 모든 데이터는 삼반복 독립된 실험으로부터 수득하였다.

실시예 1-5: 프라이머 연장

연장 분석 전에, 5'-플루오레세인-표지된 DNA 프라이머 (플루오레세인-GCT ACG AGC ACT ATG GA CG) 및 DNA 주형 (AAA AAA AAA ACG TCC ATA GTG AGT CGT AG C)을 2분 동안 95℃로 가열하여 천천히 4℃로 냉각시킴으로써 어닐링하였다. 프라이머 연장 반응은 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM (NH₄)₂SO-₄, 10 mM KCl, 2 mM MgSO₄, 0.1 % 트리톤 X-100, 1 mM dTTP 및 Dpo4 (1 μM)를 함유하는 버퍼에서 1μM의 프라이머/주형을 이용하여 수행되었다. 반응을 55℃에서 30분 동안 수행하고, 동일한 부피의 95% 포름아마이드 및 10mM EDTA를 첨가한 후 95℃에서 5분 동안 인큐베이션함으로써 종결시켰다. 반응 생성물을 7M 우레아에서 20% 변성 PAGE에서 분해하고 iBright FL1000 (Invitrogen)으로 시각화하였다.

실시예 1-6: 등온 적정 열량 측정(Isothermal titration calorimetry)

Dpo4 및 DNA의 등온 적정 열량 측정은 Nano ITC (TA Instruments, USA) 상에서 측정되었다. Dpo4 및 DNA를 20mM HEPES, 100mM NaCl, 0.5mM EDTA, 0.5mM TCEP, 및 10mM MgSO₄를 함유하는 pH 7.5의 ITC 버퍼에 대해 투석하였다. 최적화된 Dpo4 농도는 25 μM이고 DNA의 농도는 125 μM이었다. 샘플 세포에서 5 μL DNA를 Dpo4 용액으로 자동으로 적정하고, 완전한 평형에 도달하기 위해 각 샷(shot) 사이에 300초 간격으로 총 20 적정을 수행하였다. 개별 실험에서 총 측정 시간은 6,000초 이상이었다. L-DNA 대한 Dpo4의 ITC는 45℃에서 수행되었고, D-DNA에 대한 Dpo4의 ITC는 15℃에서 수행되었다. 데이터는 결합 비율이 독립적인 결합 모델에 적절한 프로그램 Nanoanalyze (TA Instruments, USA)로 분석되었다.

실시예 1-7: 결정화 및 구조 결정

프라이머 (GGG GGA AGG ATT CC) 및 주형 (TCA CGG AAT CCT TCC CCC)으로 형성된 DPO4 및 DNA 이중체를 4℃에서 약 1:1.3 몰비로 인큐베이션하였다. Dpo4/D-DNA 또는 Dpo4/L-DNA 복합체의 결정은 각각 5:5 비례 부피의 단백질/DNA 용액 및 리저버 용액(reservoir solution; 0.1 M BIS-TRIS (pH 7.0), 0.1 M 칼슘 아세테이트, 2% 글리세롤, 및 9% w/v PEG3350) 또는 리저버 용액(reservoir solution; 0.1 M 포름산 나트륨, 0.05 M BICINE (pH 8.5), 10% w/v 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 5,000, 및 1.1% 벤즈아미딘-HCl)을 19℃에서 함유하는 드롭(drop)에서 시팅-드롭 증기 확산법(sitting-drop vapour diffusion method)을 사용하여 성장시켰다. Dpo4/D-DNA 결정의 경우 0.1 M BIS-TRIS (pH 7.0), 20% PEG3350, 100mM CaOAC2, 및 25% 글리세롤에, 그리고 Dpo4/L-DNA 결정의 경우 0.1 M 포름산 나트륨, 0.05 M BICINE (pH 8.5), 10% w/v 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 5,000, 1.1% 벤즈아미딘-HCl 및 25% 글리세롤에 결정을 빠르게 침지시켰으며, 이를 즉시 액체 질소로 급속 냉동시켰다. 데이터는 포항 가속기 광원 빔라인 5C (Pohang, Korea)에서 파장 1.0Å에서 수집되었다. 데이터 세트는 HKL-2000을 사용하여 축소 및 확대되었다 (Method Enzymol, 276:307-326, 1997). Dpo4/D-DNA 및 Dpo4/L-DNA 결정을 P22₁2₁ 및 P12₁1에서 결정화하고, 2.60 및 2.36Å의 해상도로 회절하여 각각 2.60 및 2.36으로 알아내었다. 두 복합체에 대한 상(phase)은 공개된 DPO4 구조 (PDB 2BQ3) (J Biol Chem, 280:29750-29764, 2005)를 사용하여 분자 치환을 통해 결정되었으며, 초기 모델 구축은 PHENIX (Acta Crystallogr D, 66:213-221, 2010) 내에서 Autobuild를 사용하여 수행되었다. COOT (Acta Crystallogr D, 60:2126-2132, 2004) 및 PHENIX를 사용하여 모델 구축 및 개량을 수행하였다. 최종 모델은 MOLPROBITY (Acta Crystallogr D, 66:12-21, 2010)를 통해 검증되었다. 통계는 표 2에 요약하여 나타내었다.

실시예 1-8: 결정 구조의 수탁 번호 획득

결정 구조는 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 DPO4/D-DNA 이중체의 수탁 코드 6L84 및 DPO4/L-DNA 이중체의 수탁코드 6L97로 기탁되었다.

실시예 1-9: 다양한 유기체 유래의 Dpo4의 정렬

상기 실시예 1-2에서 수득한 술포로버스 솔파타리쿠스(S. solfataricus: Ss) Dpo4(서열번호 2)를 기준으로 고세균(archaea) 도메인에 있는 5개의 다른 종들 (술폴로부스 아시도칼다리우스[Sulfolobus acidocaldarius: Sa(서열번호 11)], 피크로필러스 토리두스[Picrophilus torridus: Pt(서열번호 12)], 메탈로스페에라 세둘라[Metallosphaera sedula: Ms(서열번호 13)], 니트로소스파이라 비에넨시스[Nitrososphaera viennensis: Nv(서열번호 14)], 아시디플라즈마 에오리쿰[Acidiplasma aeolicum: Aa(서열번호 15)])로부터의 Dpo4 (표 3 참조)를 EMBOSS Needle(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)을 이용하여, pairwise sequence alignment를 수행하여 상동성을 확인하였다.

그 결과, Ss Dpo4와 Sa Dpo4의 경우 55.6% (도 8), Ss Dpo4와 Pt Dpo4의 경우 48.2% (도 9), Ss Dpo4와 Ms Dpo4의 경우 56.8% (도 10), Ss Dpo4와 Nv Dpo4의 경우 35.7% (도 11), Ss Dpo4와 Aa Dpo4의 경우 44.5% (도 12)의 상동성을 보였다.

실시예 2: DNA 중합효소의 D-DNA 및 L-DNA에 대한 결합 분석

DNA 중합효소는 프라이머의 3'-말단에 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP)를 결합시킴으로써 프라이머 DNA를 연장시키는 단백질 효소이다. 중합효소는 효소 활성을 위한 핵심 도메인, 예컨대 썸(thumb), 팜(palm) 및 핑거(finger)를 사용하여 키랄-선택적 방식으로 D-DNA 이중체에 결합한다 (도 1). DNA 결합에 대한 중합효소의 키랄 선택성은 매우 충실한 것으로 여겨지지만, 사실상 L-DNA 결합 성질을 갖는 임의의 중합효소가 있는지의 여부는 알려져 있지 않다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 중합효소가 L-DNA 이중체와 결합할 수 있는지의 여부를 조사하고자, 일련의 쉽게 이용 가능한 DNA 중합효소를 스크리닝하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 Dpo4, M-MuLV 역전사 효소 (RT) 및 클레노우 절편 (Klenow fragment, KF) (도 2)이 L-DNA 이중체에 결합할 수 있음을 밝혀내었다. 본 발명에서, 가장 작은 중합효소인 Dpo4의 L-DNA 결합 특성이 특히 조사되었다. DNA 결합에 대한 해리 상수를 결정한 후, 본 발명자들은 또한 D-DNA 및 L-DNA와 복합화된 중합효소의 결정 구조를 수득하고, 각각의 키랄성으로 DNA 결합을 담당하는 아미노산 잔기 및 도메인을 특징지었다. 구조는 주요 결합 도메인에서 D-DNA와 비교하여 L-DNA에 대한 Dpo4의 두드러지게 상이한 결합 양상, 복합체의 형태, 및 결합 화학량론을 나타내었다. 이는 천연 DNA 중합효소의 고유 L-DNA 이중체-결합 특성을 보고한 최초 연구이다.

실시예 3: D-DNA 및 L-DNA에 대한 DNA 중합효소 4(Dpo 4)의 결합능 분석

술포로부스 솔파타리커스 (Sulfolobus solfataricus, Ss) 유래의 Dpo4는 이전 연구 (K. A. Fiala & Z. Suo, Biochemistry, 43:2106-2115, 2004)에 따라 박테리아로 발현되고 정제되었다. Dpo4의 DNA 결합 능력을 조사하고자, 형광 편광 (fluorescence polarization, FP) 분석을 사용하여 해리 상수 (K_d) 값을 측정하였으며, 이는 K_d 값이 D-DNA 결합에 대해 187 nM이고 L-DNA 결합에 대해 756 nM임을 나타내었다 (도 3의 a). FP 분석에 의해 추정된 Dpo4/D-DNA 복합체에 대한 K_d 값은 이전에 보고된 값 (36 nM)보다 높았으며, 이는 상이한 분석 조건 및 방법으로 인한 것일 수 있다 (K. A. Fiala et.al., Journal of Biological Chemistry, 282:8188-8198, 2007). L-DNA 결합이 Dpo4에 결합된 D-DNA를 교란시키고 대체할 수 있는지를 확인하고자, 본 발명자들은 또한 FP 방법을 사용하여 DNA-Dpo4 상호작용에 대한 경쟁 분석을 수행하였다 (도 3의 b). 중합효소와 복합화된 형광 표지된 L-DNA의 높은 FP 수준은 비표지된 D-DNA의 첨가시 감소되었으며, 이는 D-DNA가 중합효소에 결합하기 위해 L-DNA (IC₅₀: 670 nM)와 경쟁함을 나타낸다. 이는 Dpo4에 D-DNA 및 L-DNA에 대한 공유 결합 부위가 있음을 시사한다. 중합 활성과 관련하여, Dpo4는 L-DNA 프라이머의 3'-말단에 임의의 뉴클레오티드를 결합시킬 수 없었지만, D-DNA 프라이머의 3'-말단에 D-dTTP 및 L-dTTP를 둘 다 추가할 수 있었다 (도 3의 c). 이는 Dpo4에 있어서 L-DNA의 결합 방식이 D-DNA의 결합 방식과 동일하지 않으며 공유 결합 부위가 있지만 중합효소 활성에 적합하지 않음을 시사한다. 상이한 서열 (표 1)을 갖는 추가의 L-DNA 이중체를 사용하여 Dpo4/L-DNA 복합화를 시험하였을 시, K_d 값은 서열에 따라 다양하지만 Dpo4는 모든 시험된 L-DNA 이중체에 결합할 수 있었다. 이것은 Dpo4의 L-DNA 결합 특성이 DNA 서열에 크게 의존하지 않음을 입증한다 (도 3의 d).

Dpo4 결합에 대해 시험한 D-DNA 및 L-DNA 서열

명칭	서열	서열번호
GC-0-L	5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAA-FAM-3'	3
GC-0-D	3'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-5'	4
GC-33-L	5'-CAATGTCTAAACTGAAAG-FAM-3'	5
GC-33-D	3'-GTTACAGATTTGACTTTC-5'	6
GC-67-L	5'-GGACCGTGACTCCCTGAC-FAM-3'	7
GC-67-D	3'-CCTGGCACTGAGGGACTG-5'	8
GC-100-L	5'-GGGGGGGGGGGGGGGGGG-FAM-3'	9
GC-100-D	3'-CCCCCCCCCCCCCCCCCC-5'	10

* FAM 플루오레세인을 나타낸다.

실시예 4: D-DNA 및 L-DNA와 복합체를 이루는 Dpo4의 결정 구조 분석

Dpo4는 D-DNA 뿐만 아니라 L-DNA에도 친화력이 있음을 밝혀낸 후, 본 발명자들은 단백질-DNA 상호작용의 분자적 측면을 밝히고자 각 DNA 입체 이성질체와 복합된 중합효소의 결정 구조를 조사하였다. 본 발명자들은 공간군(space group) P22₁2₁ 및 P12₁1에 속하고 각각 2.6 및 2.36Å로 회절된 Dpo4/D-DNA 및 Dpo4/L-DNA 복합체의 결정을 수득하였다 (표 2). 두 구조 모두 이전에 보고(H. Zang et.al., Journal of Biological Chemistry, 280:29750-29764, 2005)된 Dpo4 구조 (PDB 2BQ3)를 사용한 분자 치환(molecular replacement)을 통해 알아내었다.

데이터 수집 및 개량 통계

Dpo4
	D-DNA	L-DNA
데이터 수집
공간군	P 2 2₁2₁	P 1 2₁1
단위 셀 (a, b, 및 c;Å) (α, β, 및 γ; °)	52.8, 98.7, 100.8 90.0, 90.0, 90.0	85.9, 55.0, 96.6 90.0, 113.4, 90.0
파장 (Å)	1.0	0.9794
해상도^a (Å)	50-2.60 (2.64-2.60)	50-2.36 (2.44-2.36)
R_merge ^a,b(%)	12.2 (35.9)	12.5 (55.5)
평균 I/σ(I)^a	20.6 (5.4)	28.5 (3.1)
완전성^a(%)	99.8 (99.8)	97.9 (95.3)
가외성(redundancy)^a	11.3 (7.7)	4.6 (3.0)
관찰된 상(reflections) (고유)	188,903 (16,695)	153,932 (33,537)
윌슨 B-인자	35.1	50.5
개량(refinement)
R_work/R_free ^c(%)	18.2/22.6	23.0/26.6
asu(air separation unit) 당단백질 당 단백질 잔기	341	672
asu 당 물 분자	108	115
asu 당 기타 리간드	29	28
CA	3
라마찬드란 도표(Ramachandran plot)
선호/허용치/이상치 (%)	95.6/4.1/0.3	95.3/4.7/0.0
Rms(root mean square) 편차
결합 길이 (Å)	0.0034	0.70
결합 각 (°)	0.475	2.09
평균 B 인자 (Å²)	42.7	66.8
거대분자(macromolecule)	42.8	66.2
리간드	52.8	74.4
용매	40.68	55.9
PDB 코드	6L84	6L97

^a 괄호 안의 수는 외부-해상도 쉘(outer-resolution shell)을 나타낸다.

^b R _merge=[Σ _hkl Σ _i |I-〈I〉|/Σ _hkl Σ _I |I|×100].

^c R _factor/R _free=Σ _hkl ∥F _o|-|F _c∥/Σ _hkl |F _o|, 여기서 F _o 및 F _c는 각각 관찰 및 계산된 구조 인자(structure factor)이다.

Dpo4/D-DNA 복합체의 구조는 공지된 Dpo4/D-DNA 바이너리 복합체(binary complex)의 구조와 유사하였다 (H. Ling et.al., Cell, 2001, 107:91-102). D-DNA 이중체는 마치 오른손이 '로프'를 잡는 것처럼 Dpo4의 4개 도메인 (썸, 팜, 핑거, 및 리틀 핑거)에 내장되어 있는데, 이는 이중-가닥 DNA와 복합된 Y-패밀리 DNA 중합효소의 다른 결정 구조와 일치한다 (도 4의 a) [V. Jha & H. Ling, Sci Rep, 8:15125-15125, 2018; W. Yang, Biochemistry, 53:2793-2803, 2014; Y. Zhao et.al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 109:7269-7274, 2012]. 썸 도메인(thumb domain)은 D-DNA 이중체의 부홈(minor groove)과 상호작용하였다. 중합 활성에 결정적으로 요구되는 2가 이온 (Ca²⁺, 노락색 구체)을 갖는 활성 부위 잔기가 팜 도메인(palm domain)에 위치하였다. 들어오는(incoming) 뉴클레오타이드와 상호작용하는 역할을 갖는 핑거 도메인(finger domain)을 프라이머의 3'-말단에 위치시켜 신장(elongation)을 준비하였다. 리틀 핑거 도메인(little finger domain)은 D-DNA의 중합에 있어서 Dpo4의 진행도(processivity)를 개선시키는 것으로 공지되어 있다 (H. Ling et.al., Cell, 107:91-102, 2001). 중합효소와 D-DNA 이중체의 주홈 (major groove) 사이에 결합 인터페이스를 제공하고, 주형 가닥의 5'-말단을 돌출시키기 위해 핑거 도메인과 좁은 간격을 만들었다 (도 4의 a).

통상적 DNA-중합효소 상호작용을 보여주는 Dpo4/D-DNA 복합체의 구조와는 극명하게 대조적으로, Dpo4/L-DNA 복합체의 구조는 비정규 DNA-중합효소 결합 인터페이스를 나타내었다. L-DNA 이중체는 중합효소의 3가지 주요 도메인 (썸 도메인, 팜 도메인, 및 핑거 도메인)과 유의한 상호작용을 갖지 않았지만, 이량체 (사슬 A 및 사슬 B)를 형성하는 2개의 Dpo4 분자로부터 2개의 리틀 핑거 도메인에 의해 만들어진 '핑키 스웨어(pinky swear)' 구조를 취하고 있었다 (도 4의 b). 도 4의 c에 도시된 바와 같이, 이 극적으로 변형된 중합효소의 전체 구조는 주로 다른 도메인으로부터 멀리 떨어진 리틀 핑거의 위치로 인한 것이었다 (도 4의 c, 상단). apo-Dpo4 (PDB : 2RDI) [J. H. Wong et.al., Journal of Molecular Biology, 379:317-330, 2008] 및 Dpo4/D-DNA 복합체에서 리틀 핑거 도메인을 핑거 도메인에 더 가깝게 만들고자 잔기 237-240 주위에 힌지(hinge)를 만드는, 가요성(flexible) 링커 (잔기 231-243)는 활성 포켓 외부에 위치한 L-DNA와 상호작용하기 위해 이완되었다. 그러나, DNA의 존재 및 키랄성에 관계없이, 각 도메인의 폴딩(folding)은 Dpo4/D-DNA 및 Dpo4/L-DNA 복합체로부터 각 도메인을 정렬함으로써 밝혀진 바와 같이 보존되었다 (근평균제곱 편차 (RMSD): 썸의 경우 0.590, 팜의 경우 0.302, 핑거의 경우 0.480, 및 리틀 핑거의 경우 0.298) (도 4의 c, 하단). L-DNA와의 복합체에서 이량체화된 Dpo4의 리틀 핑거 도메인은 β-배럴형-유사 구조를 형성하여, L-DNA에 대한 결합 인터페이스를 제공한다 (도 4의 d). 따라서, 리틀 핑거 도메인의 위치는 또한 DNA에 대한 중합효소의 결합 화학량론, 예컨대 D-DNA와 1:1 및 L-DNA와 2:1을 결정한다. 본 발명자들이 등온적정열량계(isothermal titration calorimetry, ITC)를 사용하여 Dpo4와 DNA 간의 결합 비율을 측정하였을 시, Dpo4는 1:0.9의 비율로 D-DNA에 결합되는 반면 1:0.5 (또는 2:1)의 비율로 L-DNA에 결합됨을 확인하였다 (도 4의 e). 즉, 결정 구조 상에서 단백질 2 분자와 L-DNA 이중체 1 분자가 결합하는 것으로 확인되었으며, 이는 실제 용액에 내에서도 2:1의 비율로 결합됨을 의미한다.

실시예 5: L-DNA와 Dpo4의 LF(little finger) 도메인 간의 특이적 상호작용 분석

Dpo4/L-DNA 복합체의 구조에 따르면, L-DNA는 이량체화된 Dpo4의 리틀 핑거 도메인과 오로지 상호작용하였으며, 이는 리틀 핑거가 Dpo4에 대해 L-DNA 결합 특성을 갖는 데 중요하다는 것을 나타낸다. 실제로, 리틀 핑거 도메인이 결여된 절단된 Dpo4 (Dpo4-ΔLF)가 L-DNA 결합에 대해 시험된 경우, FP 분석에서 상당한 결합 친화력을 나타내지 않음을 확인하였다 (도 5의 a). 그러나, 리틀 핑거 도메인만으로도 L-DNA 결합 특성을 유지하여, 전장(full length) Dpo4와 유사한 K_d 값 (860 nM의 K_d값)을 나타냈으며 (도 5의 a), 이에 결정 구조에 의해 밝혀진 리틀 핑거-편향된 결합 모드를 일관되게 뒷받침할 수 있다. 특히, Dpo4 이량체의 2개의 핑거 도메인에서 3개의 아미노산 잔기가 L-DNA와의 결합에 관여하였다 (도 5의 b 및 도 5의 c). 결합 인터페이스는 이들 잔기의 양으로 하전된 측쇄와 L-DNA의 음으로 하전된 인산 골격(phosphate backbone) 간의 정전기적 상호작용에 기초할 수 있다. 사슬 A에서 리틀 핑거의 Arg300 및 Lys339는 L-DNA 이중체의 주홈 근처의 인산염과 상호작용하였으며 (도 5의 b 및 도 5의 c), 사슬 B에서 리틀 핑거의 Arg300 및 Lys321는 부홈의 인산염과 상호작용하였다 (도 5의 b 및 도 5의 c). 이 아미노산을 알라닌 (Dpo4-mutLF)으로 돌연변이된 경우, L-DNA에 대한 K_d는 야생형에 비해 약 7배 감소한 5520 nM이었으며, 이들 아미노산이 Dpo4에 L-DNA 결합 특성을 부여하는 주요 잔기임을 입증하였다 (도 5의 a). 종합하면, 이러한 결과를 통해 Dpo4의 리틀 핑거 도메인(LF domain; 서열번호 1)이 L-DNA 인식에서 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

실시예 6: 다양한 유기체 유래의 Dpo4의 L-DNA 결합능 분석

거울상 키랄성을 갖는 DNA 및 단백질은 천연 DNA 및 단백질과 동일하지만 미러링된 방식으로 서로 상호작용할 것으로 예상된다. 이전에, 합성 거울상 HIV-1 프로테아제는 거울상 펩타이드 기질에서만 프로테아제 활성을 갖는 것으로 보고된 바 있다 (R. Milton, S. Milton & S. Kent, Science, 256:1445-1448, 1992). 보다 최근에, 합성 거울상 DNA 중합효소는 화학적으로 합성되고, 거울상 DNA에 중합 활성을 보여 거울상 DNA 레플리콘(replicon)을 생성하였다 (A. Pech et.al., Nucleic Acids Research, 45:3997-4005, 2017; Z. Wang et.al., Nature Chemistry, 8:698, 2016). L-단백질에 대한 D-DNA와 같은 자연적으로 발달된 키랄성 선호도는 DNA-단백질 상호작용에서 엄격하게 유지되지만, 거울상-천연 상호작용 (L-단백질에 대한 L-DNA/RNA) 또는 교차-키랄성 상호작용을 나타내는 DNA 및 RNA는 여전히 SELEX를 사용하여 인위적으로 발달될 수 있다 (A. Vater & S. Klussmann, Drug Discovery Today, 20:147-155, 2015). 교차-키랄성 중합 활성을 갖는 리보자임도 발달되었다(J. T. Sczepanski & G. F. Joyce, Nature, 515:440, 2014). 이러한 연구와 구별되는, 본 발명은 Dpo4의 본질적으로 존재하는 교차-키랄성 L-DNA 결합 가능성을 기술한다. 본 발명자들이 아는 한, 이것은 서열-독립적인 방식으로 거울상 DNA와 천연 단백질의 교차-키랄성 상호작용의 최초 발견이다.

중합효소가 L-DNA를 인식하기 위한 리틀 핑거 도메인의 중요성은 다른 유기체로부터의 리틀 핑거를 갖는 Dpo4 중합효소가 또한 L-DNA 결합 특성을 가질 수 있음을 시사한다. 실제로, 본 발명자들은 겔-시프트 결합 분석법(gel-shift binding assay)을 사용하여 고세균(archaea) 도메인에 있는 5개의 다른 종들 (술폴로부스 아시도칼다리우스[Sulfolobus acidocaldarius: Sa], 피크로필러스 토리두스[Picrophilus torridus: Pt], 메탈로스페에라 세둘라[Metallosphaera sedula: Ms], 니트로소스파이라 비에넨시스[Nitrososphaera viennensis: Nv], 아시디플라즈마 에오리쿰[Acidiplasma aeolicum: Aa])로부터 Dpo4 (표 3 참조)를 조사하였을 시, 이들은 모두 L-DNA에 결합할 수 있음을 확인하였다 (도 6). L-DNA 결합에 대한 이들의 K_d 값은 200 내지 5088 nM으로 결정되었다. 이는 고세균 도메인의 Dpo4 중합효소가 일반적으로 L-DNA 결합 특성을 가질 수 있지만, 친화력은 유기체에 따라 달라질 수 있음을 나타낸다.

5종의 고세균 종의 Dpo4 중합효소 아미노산 서열

고세균 종	서열	서열번호
술폴로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius: Sa)	MIVIFVDFDYFFAQVEEVLNPQYKGKPLVVCVYSGRTKTSGAVATANYEARKLGVKAGMPIIKAMEIAPNAVYLPMRKPVYEAFSNRIMNLLNKYADKIEIASIDEAYLDVTNKVQGNFELGVELARKIKQEILEKEKITVTVGVTPNKILAKIIADKSKPNGLGVIRPTEVQDFLNELDIDEIPGIGSVLARRLNELGIHKLRDILSKNYNELEKITGKAKALYLLKLAENKYSEPVENKSKIPHGRYLTLPYNTRDVKVILPYLKKAINEAYNKVNGIPMRITVVAIMEDLDILSKGKKFKHGISIDNAYKVAEDLLRELLIRDKRRNIRRIGVKLDNIIINKTNLSDFFDI	11
피크로필러스 토리두스 (Picrophilus torridus: Pt)	MIMLIDFDYFFAQVEEINDPSLKGKPVVVSVYSGRNERSGAVATSNYEARALGIKSGMPLYRALEIGKNRAVFLPIRKDFYQKYSDKIMDIISEYSEKMEIASIDEAYIDIDGNDCKIGIANEIKNRILNETGIKVSIGIGINKVIAKMAAEMAKPNGIKCISADETGEFLNNIKINDIPGIGKVLSKNLNEIGIEYLRDIKNFDVNKIKSILGESKTNYLYELYENKYFSPVEPRVKKNFGRYLTLPENTRDIDKIVPYLKKSIDAAYEKAPGIPQEISVVAIMEDLDIVSRSYTGNAIKRDDSINIALNLLNKIISEDNRNIRRIGVRLSKISKNNTLDDFF	12
메탈로스페에라 세둘라 (Metallosphaera sedula: Ms)	MIVLFVDFDYFFAQVEEILNPSLKGKPVVVCVYSGRTKDSGAVATSNYEARKLGIKAGMPIIKAKEIGKDAVFLPMRKEVYQQVSRRVMNIISGYGDKLEIASIDEAYLDITRRVKDFDEAKELARKLKAEVLEKERLRVTVGIGPNKVVAKIIADMNKPDGLGIIYPEEVKDFLYNLDISKVPGVGKITEEILRKVGINRLGDVINKSGELVNLVGKSKANYLLSLANNTYHDPVESREITHRGRYVTLPENTRDLNRILPSLKRSIEEAYSKVDGIPMEIYVVAIMEDLDIVSKGKSFKFGVSQDRALSVAQELLNKILESDKRKLRRVGVRLGKITKSSTLEDFLH	13
니트로소스파이라 비에넨시스 (Nitrososphaera viennensis: Nv)	MLAPPHRVVMHIDFDYFFAQCEEVRRPEIRQRPVLVCVFSGRTEDSGVVSTANYVARKYGVKSGIPIRVAKAKLAGVDDALFLPLDASYYRQVSENAMSAIKEHADVFEHVGIDECFIDVSGRANGRFDAAEALARTVKQRVQERTKLTCSVGVAPNKMLAKIASDYNKPDGLTVVRPENALQFVSALDVDKIPGIGPKTRDRLAELGVKTAGDLASFDLFRLIKEFGKKTATYIHNAAKGIDDEPVMESAEGERRQQIMRIVTLKKDAQSAEEMYADLEEICRDVYESATEKKVAFGSVGIILVLDDLENVTRSRGLKAHASSFELLHSTARSLLDEAMGEKKRSVRRLGVRISDFQDSSGQNTLFDYFTARQGE	14
아시디플라즈마 에오리쿰 (Acidiplasma aeolicum: Aa)	MPQFIIFIDFDYFFAQVEEILNPEIREKPVVVCVYSGRTETSGAVATSNYLARKIGIKSGMPLPQAMKIGKDRAVFLPIRKDIYKEWSDHIMDIISEYSDKIEIASIDEAYIDVTDSCKDFNDAVNTAQKIKDEIYNKTGVRVSVGVSVNKAIAKVLGDMAKPNGIKSVGPSEIQDFLKGLEISKIPGVGKVIGQRLNDAGIKYITDVINADRDQLINIIGTAKYNYLYDIANNTYNKPVTPREKKNFGRYMTLPENTRDVNIIIPYVKKAIDSAYEKAPGLPSELSLVAIMEDISILSRSYTGARIDKNRALEIAIGLLNRIINEDQRNIRRVGVRLGKITKNETLDDFF	15

결론적으로, 본 발명자들은 Dpo4의 L-DNA 이중체 결합 특성을 밝혀내었다. 결정학에 의해 밝혀진 구조에 따르면, Dpo4는 2:1 결합 비율로 L-DNA와 상호작용하기 위한 리틀 핑거-기반 결합 인터페이스를 구축하고자 이량체화되었지만, 1:1 결합 비율을 갖는 모든 도메인에 의해 형성된 활성 포켓 내에 D-DNA 이중체를 내장(embedding) 시켰다. 리틀 핑거 도메인은 리틀 핑거 도메인이 각각 돌연변이되거나 절단된 경우 L-DNA에 대한 친화력이 감소되거나 상실되므로, Dpo4가 L-DNA 결합 특성을 갖는 데 중요하였다. 천연 중합효소의 L-DNA 결합 특성의 분자적 측면을 특징화하는 본 발명자들의 연구는 L-DNA 이중체와 결코 연구된 적이 없는 천연 단백질 간의 교차-키랄성 상호작용의 원리를 이해하는데 기여할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> An L-DNA-binding natural protein and uses thereof <130> DP-2019-0467 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LF domain <400> 1 Tyr Asn Glu Pro Ile Arg Thr Arg Val Arg Lys Ser Ile Gly Arg Ile 1 5 10 15 Val Thr Met Lys Arg Asn Ser Arg Asn Leu Glu Glu Ile Lys Pro Tyr 20 25 30 Leu Phe Arg Ala Ile Glu Glu Ser Tyr Tyr Lys Leu Asp Lys Arg Ile 35 40 45 Pro Lys Ala Ile His Val Val Ala Val Thr Glu Asp Leu Asp Ile Val 50 55 60 Ser Arg Gly Arg Thr Phe Pro His Gly Ile Ser Lys Glu Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ser Glu Ser Val Lys Leu Leu Gln Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Arg 85 90 95 Lys Ile Arg Arg Ile Gly Val Arg Phe Ser Lys Phe Ile Glu Ala Ile 100 105 110 Gly Leu Asp Lys Phe Phe Asp Thr 115 120 <210> 2 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ss Dpo4 <400> 2 Met Ile Val Leu Phe Val Asp Phe Asp Tyr Phe Tyr Ala Gln Val Glu 1 5 10 15 Glu Val Leu Asn Pro Ser Leu Lys Gly Lys Pro Val 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Gln Gly Asn Phe Glu Leu Gly Val Glu Leu Ala Arg Lys 115 120 125 Ile Lys Gln Glu Ile Leu Glu Lys Glu Lys Ile Thr Val Thr Val Gly 130 135 140 Val Thr Pro Asn Lys Ile Leu Ala Lys Ile Ile Ala Asp Lys Ser Lys 145 150 155 160 Pro Asn Gly Leu Gly Val Ile Arg Pro Thr Glu Val Gln Asp Phe Leu 165 170 175 Asn Glu Leu Asp Ile Asp Glu Ile Pro Gly Ile Gly Ser Val Leu Ala 180 185 190 Arg Arg Leu Asn Glu Leu Gly Ile His Lys Leu Arg Asp Ile Leu Ser 195 200 205 Lys Asn Tyr Asn Glu Leu Glu Lys Ile Thr Gly Lys Ala Lys Ala Leu 210 215 220 Tyr Leu Leu Lys Leu Ala Glu Asn Lys Tyr Ser Glu Pro Val Glu Asn 225 230 235 240 Lys Ser Lys Ile Pro His Gly Arg Tyr Leu Thr Leu Pro Tyr Asn Thr 245 250 255 Arg Asp Val Lys Val Ile Leu Pro Tyr Leu Lys Lys Ala Ile Asn Glu 260 265 270 Ala Tyr Asn Lys Val Asn Gly Ile Pro Met Arg Ile Thr Val Val Ala 275 280 285 Ile Met Glu Asp Leu Asp Ile Leu Ser Lys Gly Lys Lys Phe Lys His 290 295 300 Gly Ile Ser Ile Asp Asn Ala Tyr Lys Val Ala Glu Asp Leu Leu Arg 305 310 315 320 Glu Leu Leu Ile Arg Asp Lys Arg Arg Asn Ile Arg Arg Ile Gly Val 325 330 335 Lys Leu Asp Asn Ile Ile Ile Asn Lys Thr Asn Leu Ser Asp Phe Phe 340 345 350 Asp Ile <210> 12 <211> 344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pt Dpo4 <400> 12 Met Ile Met Leu Ile Asp Phe Asp Tyr Phe Phe Ala Gln Val Glu Glu 1 5 10 15 Ile Asn Asp Pro Ser Leu Lys Gly Lys Pro Val Val Val Ser Val Tyr 20 25 30 Ser Gly Arg Asn Glu Arg Ser Gly Ala Val Ala Thr Ser Asn Tyr Glu 35 40 45 Ala Arg Ala Leu Gly Ile Lys Ser Gly Met Pro Leu Tyr Arg Ala Leu 50 55 60 Glu Ile Gly Lys Asn Arg Ala Val Phe Leu Pro Ile Arg Lys Asp Phe 65 70 75 80 Tyr Gln Lys Tyr Ser Asp Lys Ile Met Asp Ile Ile Ser Glu Tyr Ser 85 90 95 Glu Lys Met Glu Ile Ala Ser Ile Asp Glu Ala Tyr Ile Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Asn Asp Cys Lys Ile Gly Ile Ala Asn Glu Ile Lys Asn Arg Ile 115 120 125 Leu Asn Glu Thr Gly Ile Lys Val Ser Ile Gly Ile Gly Ile Asn Lys 130 135 140 Val Ile Ala Lys Met Ala Ala Glu Met Ala Lys Pro Asn Gly Ile Lys 145 150 155 160 Cys Ile Ser Ala Asp Glu Thr Gly Glu Phe Leu Asn Asn Ile Lys Ile 165 170 175 Asn Asp Ile Pro Gly Ile Gly Lys Val Leu Ser Lys Asn Leu Asn Glu 180 185 190 Ile Gly Ile Glu Tyr Leu Arg Asp Ile Lys Asn Phe Asp Val Asn Lys 195 200 205 Ile Lys Ser Ile Leu Gly Glu Ser Lys Thr Asn Tyr Leu Tyr Glu Leu 210 215 220 Tyr Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Pro Val Glu Pro Arg Val Lys Lys Asn 225 230 235 240 Phe Gly Arg Tyr Leu Thr Leu Pro Glu Asn Thr Arg Asp Ile Asp Lys 245 250 255 Ile Val Pro Tyr Leu Lys Lys Ser Ile Asp Ala Ala Tyr Glu Lys Ala 260 265 270 Pro Gly Ile Pro Gln Glu Ile Ser Val Val Ala Ile Met Glu Asp Leu 275 280 285 Asp Ile Val Ser Arg Ser Tyr Thr Gly Asn Ala Ile Lys Arg Asp Asp 290 295 300 Ser Ile Asn Ile Ala Leu Asn Leu Leu Asn Lys Ile Ile Ser Glu Asp 305 310 315 320 Asn Arg Asn Ile Arg Arg Ile Gly Val Arg Leu Ser Lys Ile Ser Lys 325 330 335 Asn Asn Thr Leu Asp Asp Phe Phe 340 <210> 13 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ms Dpo4 <400> 13 Met Ile Val Leu Phe Val Asp Phe Asp Tyr Phe Phe Ala 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220 Leu Ser Leu Ala Asn Asn Thr Tyr His Asp Pro Val Glu Ser Arg Glu 225 230 235 240 Ile Thr His Arg Gly Arg Tyr Val Thr Leu Pro Glu Asn Thr Arg Asp 245 250 255 Leu Asn Arg Ile Leu Pro Ser Leu Lys Arg Ser Ile Glu Glu Ala Tyr 260 265 270 Ser Lys Val Asp Gly Ile Pro Met Glu Ile Tyr Val Val Ala Ile Met 275 280 285 Glu Asp Leu Asp Ile Val Ser Lys Gly Lys Ser Phe Lys Phe Gly Val 290 295 300 Ser Gln Asp Arg Ala Leu Ser Val Ala Gln Glu Leu Leu Asn Lys Ile 305 310 315 320 Leu Glu Ser Asp Lys Arg Lys Leu Arg Arg Val Gly Val Arg Leu Gly 325 330 335 Lys Ile Thr Lys Ser Ser Thr Leu Glu Asp Phe Leu His 340 345 <210> 14 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nv Dpo4 <400> 14 Met Leu Ala Pro Pro His Arg Val Val Met His Ile Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 15 Phe Phe Ala Gln Cys Glu Glu Val Arg Arg Pro Glu Ile Arg Gln Arg 20 25 30 Pro Val Leu Val Cys Val Phe Ser Gly Arg Thr Glu Asp Ser Gly Val 35 40 45 Val Ser Thr Ala Asn Tyr Val Ala Arg Lys Tyr Gly Val Lys Ser Gly 50 55 60 Ile Pro Ile Arg Val Ala Lys Ala Lys Leu Ala Gly Val Asp Asp Ala 65 70 75 80 Leu Phe Leu Pro Leu Asp Ala Ser Tyr Tyr Arg Gln Val Ser Glu Asn 85 90 95 Ala Met Ser Ala Ile Lys Glu His Ala Asp Val Phe Glu His Val Gly 100 105 110 Ile Asp Glu Cys Phe Ile Asp Val Ser Gly Arg Ala Asn Gly Arg Phe 115 120 125 Asp Ala Ala Glu Ala Leu Ala Arg Thr Val Lys Gln Arg Val Gln Glu 130 135 140 Arg Thr Lys Leu Thr Cys Ser Val Gly Val Ala Pro Asn Lys Met Leu 145 150 155 160 Ala Lys Ile Ala Ser Asp Tyr Asn Lys Pro Asp Gly Leu Thr Val Val 165 170 175 Arg Pro Glu Asn Ala Leu Gln Phe Val Ser Ala Leu Asp Val Asp Lys 180 185 190 Ile Pro Gly Ile Gly Pro Lys Thr Arg Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly 195 200 205 Val Lys Thr Ala Gly Asp Leu Ala Ser Phe Asp Leu Phe Arg Leu Ile 210 215 220 Lys Glu Phe Gly Lys Lys Thr Ala Thr Tyr Ile His Asn Ala Ala Lys 225 230 235 240 Gly Ile Asp Asp Glu Pro Val Met Glu Ser Ala Glu Gly Glu Arg Arg 245 250 255 Gln Gln Ile Met Arg Ile Val Thr Leu Lys Lys Asp Ala Gln Ser Ala 260 265 270 Glu Glu Met Tyr Ala Asp Leu Glu Glu Ile Cys Arg Asp Val Tyr Glu 275 280 285 Ser Ala Thr Glu Lys Lys Val Ala Phe Gly Ser Val Gly Ile Ile Leu 290 295 300 Val Leu Asp Asp Leu Glu Asn Val Thr Arg Ser Arg Gly Leu Lys Ala 305 310 315 320 His Ala Ser Ser Phe Glu Leu Leu His Ser Thr Ala Arg Ser Leu Leu 325 330 335 Asp Glu Ala Met Gly Glu Lys Lys Arg Ser Val Arg Arg Leu Gly Val 340 345 350 Arg Ile Ser Asp Phe Gln Asp Ser Ser Gly Gln Asn Thr Leu Phe Asp 355 360 365 Tyr Phe Thr Ala Arg Gln Gly Glu 370 375 <210> 15 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aa Dpo4 <400> 15 Met Pro Gln Phe Ile Ile Phe Ile Asp Phe Asp Tyr Phe Phe Ala Gln 1 5 10 15 Val Glu Glu Ile Leu Asn Pro Glu Ile Arg Glu Lys Pro Val Val Val 20 25 30 Cys Val Tyr Ser Gly Arg Thr Glu Thr Ser Gly Ala Val Ala Thr Ser 35 40 45 Asn Tyr Leu Ala Arg Lys Ile Gly Ile Lys Ser Gly Met Pro Leu Pro 50 55 60 Gln Ala Met Lys Ile Gly Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Pro Ile Arg 65 70 75 80 Lys Asp Ile Tyr Lys Glu Trp Ser Asp His Ile Met Asp Ile Ile Ser 85 90 95 Glu Tyr Ser Asp Lys Ile Glu Ile Ala Ser Ile Asp Glu Ala Tyr Ile 100 105 110 Asp Val Thr Asp Ser Cys Lys Asp Phe Asn Asp Ala Val Asn Thr Ala 115 120 125 Gln Lys Ile Lys Asp Glu Ile Tyr Asn Lys Thr Gly Val Arg Val Ser 130 135 140 Val Gly Val Ser Val Asn Lys Ala Ile Ala Lys Val Leu Gly Asp Met 145 150 155 160 Ala Lys Pro Asn Gly Ile Lys Ser Val Gly Pro Ser Glu Ile Gln Asp 165 170 175 Phe Leu Lys Gly Leu Glu Ile Ser Lys Ile Pro Gly Val Gly Lys Val 180 185 190 Ile Gly Gln Arg Leu Asn Asp Ala Gly Ile Lys Tyr Ile Thr Asp Val 195 200 205 Ile Asn Ala Asp Arg Asp Gln Leu Ile Asn Ile Ile Gly Thr Ala Lys 210 215 220 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Asp Ile Ala Asn Asn Thr Tyr Asn Lys Pro Val 225 230 235 240 Thr Pro Arg Glu Lys Lys Asn Phe Gly Arg Tyr Met Thr Leu Pro Glu 245 250 255 Asn Thr Arg Asp Val Asn Ile Ile Ile Pro Tyr Val Lys Lys Ala Ile 260 265 270 Asp Ser Ala Tyr Glu Lys Ala Pro Gly Leu Pro Ser Glu Leu Ser Leu 275 280 285 Val Ala Ile Met Glu Asp Ile Ser Ile Leu Ser Arg Ser Tyr Thr Gly 290 295 300 Ala Arg Ile Asp Lys Asn Arg Ala Leu Glu Ile Ala Ile Gly Leu Leu 305 310 315 320 Asn Arg Ile Ile Asn Glu Asp Gln Arg Asn Ile Arg Arg Val Gly Val 325 330 335 Arg Leu Gly Lys Ile Thr Lys Asn Glu Thr Leu Asp Asp Phe Phe 340 345 350

Claims

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서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된, 단리된 L-DNA 결합 도메인.
제4항에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 DNA 중합효소 유래인, 단리된 L-DNA 결합 도메인.
제5항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 Dpo4(DNA polymerase 4)인, 단리된 L-DNA 결합 도메인.
제4항에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 DNA 중합효소의 LF 도메인(little figner domain)인, 단리된 L-DNA 결합 도메인.
제4항에 있어서, 상기 단리된 L-DNA 결합 도메인은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 300번째 Arg(Arginine), 321번째 Lys(Lysine) 및 339번째 Lys(Lysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 또는 변이되지 않는 것인, 단리된 L-DNA 결합 도메인.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 도메인을 포함하는, 단백질.
제9항에 있어서, 상기 단백질은 항체-약물 복합체(antibody-drug conjugates) 제조에 적용되는 것인, 단백질.
제10항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 리보핵산(siRNA, small interfering RNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질.
제9항의 단백질을 포함하는, 약물 전달체.
제12항의 약물 전달체; 및 항암제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
제13항에 있어서, 상기 항암제는 DNA 앱타머 또는 RNA 앱타머인, 약학 조성물.