JP2008516613A - Pcr増幅での再現性の改善およびミスプライミングの低減のための試薬および方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用する核酸増幅反応およびアッセイに関し、それにはリアルタイムアッセイおよびエンドポイントアッセイの両者のホモジニアスアッセイが含まれる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用する核酸増幅(PCR増幅を含むアッセイなど)は周知である。米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号および同第4,965,188号、および、一般には、PCR PROTOCOLS, a guide to Methods and Applications, Innis et al.(編), Academic Press(San Diego, CA (USA) 1990)を参照されたい。未結合検出試薬またはプローブを除去するための洗浄を必要とせず、ゆえに増幅反応容器を開けることなく実施できるホモジニアスPCRアッセイもまた周知である。ホモジニアスPCRアッセイには、増幅反応の終了時点で増幅産物を検出するエンドポイントアッセイ、および反応が進行しているときに一部のまたはすべての熱サイクル中に増幅産物を検出するリアルタイムアッセイの両者が含まれる。米国特許第5,994,056号、同第5,487,972号、同第5,925,517号および同第6,150,097号を参照されたい。
本発明の試薬は、少なくとも一部のPCR増幅においてミスプライミングの1種以上の現象を防止することが可能な添加剤である。「現象を防止する(防ぐ)」とは、反応の終了時点で、本明細書中に記載の技術、すなわち蛍光性DNA色素、ゲル電気泳動、DNAシークエンシングおよび融点解析によって、ミスプライミングの生成物または生成物群が検出されないことを意味する。本発明に基づく試薬は、重合活性および5’−3’エキソヌクレアーゼ活性(5' - to - 3' exonuclease activity)の両方を有するポリメラーゼを利用する場合でさえ、増幅開始前に、1マイクロモル濃度(μM)(すなわち1000nM)未満、好ましくは650ナノモル濃度(nM)以下、より好ましくは300nM以下、最も好ましくは50〜250nMの比較的低い濃度でPCR増幅混合物中に含ませてよい。本発明に基づく試薬は修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドである。本発明に基づく試薬を構築するために利用してよいオリゴヌクレオチドは広範囲のオリゴヌクレオチドである。それらはDNA、RNAまたは混合DNA−RNAであってよい。それらは、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、例えば2’O−メチルリボヌクレオチド、非天然ヌクレオチド間結合、非ヌクレオチドリンカー、PNA、LNAおよび付加化学部分、例えばGlenn Researchによって報告されているキャップヌクレオチド(capped nucleotides)を含有してよい。
図1は、本発明に記載の試薬の阻害活性を試験するために設計したミスプライミングエラーに関する厳密な定性的PCRアッセイから得たサンプルのゲル電気泳動解析を示す。
図2は、本発明の試薬によってPCRベースのリアルタイムアッセイおよびエンドポイントアッセイが可能になることを示す。
図3は、本発明に記載の試薬を使用し、ミスプライミングエラーの非存在下で70サイクルのLATE−PCR増幅後に生成された一本鎖DNA産物から取得したDNA配列クロマトグラフを示す。
図4は、五重(pentaplex)LATE−PCR増幅に対する化合物9−3DDの効果を示す。
図5は、本発明の試薬がTaqポリメラーゼに結合すると、PCRサイクル処理温度が変性ステップに達するまでそれらはポリメラーゼから遊離しないことの証拠を示す。
図6は、25℃でのDNAポリメラーゼ活性に対する効果に関する、本発明の試薬の直接比較を示す。
図7は、ポリメラーゼ活性の非存在下で、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対する、本発明に基づく試薬の効果を評価するためのアッセイを示す。
図8は、対称的PCRアッセイにおいてミスプライミングを防止する本発明に基づく試薬の能力を示す。
図9は、エキソヌクレアーゼ阻害を定量化するためのアッセイを示す。
図10は、LATE−PCR増幅でのプライマー二量体およびプライマーオリゴマーの形成に対する、本発明の試薬の用量依存的効果を示す。
図11は、2ペアのプライマーを用いる2種の標的配列についての二重LATE−PCR増幅に対する、低濃度の試薬9−22DDの効果を示す。
図12は、2ペアのプライマーを用いた2種の標的配列についての二重LATE−PCR増幅に対する、試薬9−3DDのステム組成を変化させることの効果を示す。
図13は、2ペアのプライマーを用いる2種の標的配列についての二重LATE−PCR増幅に対する、試薬9−3bDDの濃度を変化させることの効果を示す。
図14は、CT値に関して、LATE−PCR増幅の効率に対する試薬9−3DDの濃度上昇の効果を示す。
図15は、蛍光シグナル勾配および最終蛍光に関して、LATE−PCR増幅の効率に対する試薬9−3DDの濃度上昇の効果を示す。
図16は、本発明の化合物の混合物を用いるか用いないで実行された多重反応の産物を示す。
図17は、化合物12−3DDの作用に関する試験の結果を示す。
図18は、化合物12−C3DDの作用に関する試験の結果を示す。
種々の図面中の参照記号などは要素などを示す。
上記のように、本発明者らは、ミスプライミングエラーの3種の異なるタイプおよび原因であると考えられるものを特定した。全3タイプのミスプライミングを評価するために、本発明者らは以下の実施例1に示す厳密なアッセイを開発した。増幅は剪断DNAを用いて開始され、これはミスプライミングを促進する。物理的操作、例えばDNAをピペット内に吸い込むことによって、DNAは剪断されやすい。さらに、「ホットスタート」試薬および方法によってはタイプ1のミスプライミングしか防止できないので、本発明者らは多数の温度サイクル(少なくとも60サイクル)をアッセイに組み入れた。さらに本発明者らは、一部のLATE−PCRアッセイで利用される低温検出ステップを組み入れた。さらにまた、本発明者らは、プライマー二量体の形成およびさらにそれらのオリゴマー形成および増幅を追加のタイプのミスプライミングとして認識している。プライマー二量体形成および増幅は、添加鋳型DNAの存在下および非存在下の両方で生じうるものであり、本発明者らはこれらの現象に関するアッセイをさらに開発した。
PCR増幅反応においてタイプ1、タイプ2およびタイプ3のミスプライミングを評価するために、本発明者らは、剪断ゲノムDNAを利用するLATE−PCR増幅を実施し、融点解析およびゲル電気泳動によってその産物を調べる。使用した具体的な増幅は以下の通りである。
基質:2000ゲノムの剪断ゲノムDNA
1×PCRバッファー
Mg+2:3ミリモル濃度(mM)
dNTP:250マイクロモル濃度(μM)の4種の各dNTP
過剰プライマー:1000ナノモル濃度(nM)の配列5’ CTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3’(配列番号13)
制限的プライマー:50nMの配列5’ CCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3’(配列番号14)
DNAポリメラーゼ:25マイクロリットル(μL)の反応混合物あたり1.25単位。
低温インキュベーション:室温で35分
PCR増幅プロトコル:95℃で15分間の高温浸漬;95℃で10秒間、55℃で30秒間、および70℃で30秒間の10サイクル;次いで95℃で10秒間、50℃で30秒間、および70℃で30秒間の70サイクル。
反復実験サンプル間の反応キネティクスの確率的変動によってハイブリダイゼーションプローブ由来のシグナルのばらつきが生じ、エンドポイント解析が妨害される。LATE−PCRはその問題を著しく軽減する。本発明の試薬を利用するとエンドポイント検出を利用する能力がさらに改善される。図2は、テイ・サックス病に関与するヘキソサミニダーゼA遺伝子のG269対立遺伝子を含むアンプリコンを増幅する際に得られる結果を示す。反応混合物は0.6μMのハイブリダイゼーションプローブおよび1000ゲノムのホモ接合性野生型DNA標的(+/+)またはヘテロ接合性DNA標的(G269/+)を含んでいた。各タイプの反復サンプルを以下のように増幅した:25μLの反応物中、100nMの実施形態9−22DDの存在または非存在下での、1×PCRバッファー、3mMのMgCl2、250μMの各dNTP、配列5’ CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC 3’(配列番号15)を有する25nMの制限的プライマー、配列5’ TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT 3’(配列番号16)を有する1000nMの過剰プライマー、1.25単位のPlatinum(ホットスタート) Taqポリメラーゼ、配列5’ Cy5−GGGACCAGGTAAGAA−リン酸 3’(配列番号17)を有する0.6μMのCy5標識ハイブリダイゼーションプローブ、および1:40,000希釈のSYBR Gold I。PCRサイクルのパラメータは、95℃で3分間;95℃で10秒間、65℃で20秒間、および72℃で20秒間の25サイクル;および、95℃で10秒間、65℃で20秒間、72℃で20秒間、55℃で20秒間、および45℃で20秒間の30サイクルであり、72℃でSYBR Goldに関する蛍光を取得し、55℃および45℃でCy5に関する蛍光を取得した。反応キネティクスの試験管ごとの変動を補正するために、72℃でのSYBR Goldシグナルに対する55℃でのCy5シグナルの比によってハイブリダイゼーションシグナルを標準化した。そのような標準化の影響の1つはすべてのCTの遅延がマスクされることである。
LATE−PCRは、増幅反応が60以上の熱サイクルにわたって実行される場合に、DNAシークエンシングに好適な大量の一本鎖DNAを生産しうる非対称増幅法である。しかし、そのような多数の増幅サイクルはミスプライミングの産物の出現を助長し、それにはタイプ2およびタイプ3のミスプライミングエラーの形成が含まれると考えられる。該ミスプライミングエラーは検出可能な非特異的産物の蓄積として現れ、それは、最終的に、反応において最も多数を占める分子種になる。本発明の試薬は、70以上のサイクルのLATE−PCR増幅を使用する場合に、非特異的産物を生じずに、DNAシークエンシングに好適な大量の一本鎖DNAの合成を可能にする。キャピラリーゲル電気泳動によるジデオキシシークエンシングに好適なサンプルを以下のように調製した。まずLATE−PCR反応混合物を、1×PCRバッファー、3mMのMgCl2、配列5’ GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3’(配列番号18)を有する1000nMの過剰プライマー、配列5’ CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3’(配列番号19)を有する25nMの制限的プライマー、1.25単位のPlatinum Taqポリメラーゼ、600nMの試薬9−3DDおよび250μMの各dNTPを含有する25μLで調製した。化合物9−3DDは、オリゴヌクレオチド9−3の各末端ヌクレオチドに付加されたDabcylクエンチャーを有する。増幅は、95℃で3分間;95℃で10秒間、65℃で20秒間、および72℃で20秒間の10サイクル;および、95℃で10秒間、65℃で20秒間、72℃で20秒間;および45℃で20秒間の60サイクル実行した。二本鎖および一本鎖DNA合成を別々にモニタリングするために、1:40,000希釈のSYBR Greenまたは配列5’ FAM−CGTGCGCTCTGGTAAGGGTTTGCACG−Dabcyl 3’(配列番号20)を有する2.4μMの低Tm分子ビーコンを用いて並行して反応を実施した。各サンプルは6ng(約1000ゲノム)のヒトDNAを含有した。さらに、化合物9−3DDを加えずに対照反応を実施した。
ミスプライミングエラーの抑制は、複数の産物が同時に増幅される多重化反応において特に重要である。複数のプライマーペアおよび増幅産物が存在すると、これらの反応種の2者間および3者以上の間のミスプライミング相互作用の確率が高くなる。増加した数のアンプリコンからなる多重化反応を化合物9−3DDの不存在または存在下で実行した。以下に示すプライマーペアの種々の組み合わせに関して、300nMの試薬9−3DDの非存在下または存在下で、サンプル、1×PCRバッファー、3mMのMgCl2、100μMの各dNTP、1000nMの過剰プライマー、50nMの制限的プライマー、および1.25単位の非ホットスタートPromega Taqポリメラーゼからなる25μL容量のLATE−PCR反応物を調製した。サンプルの増幅は、95℃で3分間;95℃で10秒間,65℃で30秒間,および70℃で30秒間の10サイクル;および、95℃で10秒間,50℃で30秒間,70℃で30秒間の40サイクルの熱サイクルプロファイルを使用して行った。反応の終了時点で、0.5×TBE中の3.5%アガロースゲルでのゲル電気泳動によってサンプルを分析した。試験対象の所望のアンプリコンおよびプライマーペアは以下の通りであった。
TSD1278過剰プライマー:5’ GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3’(配列番号21)
TSD1278制限的プライマー:5’ CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3’(配列番号22)
TSD1421過剰プライマー:5’ CCGGGTCTCTAAGGGAGAACTCCT 3’(配列番号23)
TSD1421制限的プライマー:5’ CCGGCCGACAACACAAACCTGGTCC 3’(配列番号24)。
本反応は反応Aと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した:
CF ex10過剰プライマー:5’ GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3’(配列番号25)
CF ex10制限的プライマー:5’ CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3’(配列番号26)。
本反応は反応Bと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した:
CF ex11過剰プライマー:5’ TCGAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3’(配列番号27)
CF ex11制限的プライマー:5’ TGACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT 3’(配列番号28)。
本反応は反応Cと同じプライマーペアに加えて以下のプライマーペアを含有した:
βグロビン過剰プライマー:5’ TGGGTTTCTGATACGCACTGACTCTCTC 3’(配列番号29)
βグロビン制限的プライマー:5’ GGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACT 3’(配列番号30)。
標的を含む同じ増幅混合物を利用して2種の異なるLATE−PCR増幅プロトコルを比較した。600nMの化合物9−3DDを含む場合および化合物9−3DDを含まない場合の両方で各増幅を実施した。上記のように、化合物9−3DDのステムTm(すなわち無修飾のオリゴヌクレオチド9−3の計算上の融解温度)は56℃である。ホットスタートPlatinum Taq DNAポリメラーゼを使用した。2種の増幅は、主として、使用されるプライマーアニーリング温度が異なり、65℃(ステムTmより高い)または55℃(ステムTmより低い)であった。増幅サイクルのパラメータは以下の通りであった:
プロファイルA:95℃で3分間;95℃で10秒間,65℃で20秒間,72℃で20秒間の10サイクル;95℃で15秒間,55℃で20秒間,72℃で20秒間,50℃で20秒間の60サイクル
プロファイルB:最後の60サイクルが95℃で10秒間,65℃で20秒間,72℃で20秒間,45℃で20秒間であったことを除いて、プロファイルAと同一。
本発明の試薬およびそれらの無修飾のオリゴヌクレオチドアナログの効果を評価するために、一連のプライマー伸長実験を25℃で実行した。各反応混合物には、鋳型、プライマーおよびTaqDNAポリメラーゼを含めた。各場合において2時間、反応を実行した。プライマーをCy5で蛍光標識した。SYBR Green蛍光色素を反応混合物に加えた。伸長反応後に、融解曲線を作成した。その場合、本発明者らが同時に出願した米国仮特許出願、表題「Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid amplification」に開示されるように、色素を刺激し、該色素からのFRET転移による蛍光団の発光を読み取った。結果を図6に挙げる。
本発明者らは、DNA合成の非存在下での5’−3’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を実証するアッセイを開発した。本アッセイでは、一方の鎖の5’末端がFAM蛍光団で標識され、他方の鎖の3’末端がDabcylクエンチャーで標識されている特異的二本鎖DNA分子を基質として使用する。蛍光団はクエンチャーと近接していて、蛍光団が刺激された場合に蛍光は生じない。加熱および冷却による鎖変性およびアニーリングによって、FAM標識鎖の切断および蛍光団の遊離が起こる。何らかのサイクル処理によってTaqポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性に関する基質が生成されると考えられる。したがって、蛍光の増大はTaqポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性の尺度を提供する。
本発明者らは、剪断ゲノムDNAおよび等モル濃度で近似のTmを有する1ペアのプライマーを利用してリアルタイムPCR増幅アッセイを実施した。400nMの試薬9−3DDを加えない場合および加えた場合で反復アッセイを実施した。DNA全体としての蓄積のキネティクスに関して、SYBR Greenでの染色によって、ならびに臭化エチジウム染色を用いるゲル電気泳動によって試薬の効果を評価した。
本実施例は、TaqDNAポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性に対する本発明の試薬の阻害効果を測定するための厳密なアッセイを記載する。本アッセイでは、M. W. Kaiser, N. Lyamicheva, W. Ma, C. Miller, B. Neri, L. Fors, and V. I. Lyamicheva in J. Bio. Chem., 274, pp. 21387-21394(1999)に記載の系と同様のプライマー−鋳型系を使用した。ただし、鋳型の5’末端をCy5で標識し、二本鎖DNAに結合すると蛍光を発するDNA色素であるSYBR Green Iの存在下でアッセイを実行した点で異なる。本アッセイ用の鋳型は、ヌクレオチド配列:5’−ACGAGCGTCTTTC−3’(配列番号36)を有するプライマーにアニーリングするオリゴヌクレオチド配列5’−Cy5−AAAACGCTGTCTCGCTGAAAGCGAGACAGCGAAAGACGCTCGT−3’(配列番号35)からなる。長い方のオリゴヌクレオチドは、異なる長さの2個の一本鎖尾部を有するヘアピン構造を形成する。鋳型の短い5’尾部はCy5蛍光団を含有し、4アデノシン残基からなり;鋳型の長い方の3’尾部は、プライマーオリゴヌクレオチドに対する標的となり、これにより、該プライマーが1塩基対の重複を有して5’の鋳型尾部の直前に位置する。この鋳型−プライマー複合体にSYBR Green Iを加えると、該複合体の二本鎖DNA領域に結合したSYBR Green Iが生じる。480nmレーザーでSYBR Green Iが励起されると、結合したDNA色素からの蛍光エネルギーがCy5によって完全に吸収され、それは蛍光共鳴エネルギー転移によって生じると考えられ、最大SYBR Green発光波長(最大発光波長:521nm)で検出可能な蛍光は存在しない。Taqポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性によって5’尾部が加水分解されると、鋳型−プライマー複合体からCy5部分が除去され、検出可能なSYBR Green I蛍光が回復する。TaqDNAポリメラーゼの存在下でのSYBR Green I蛍光の回復についてのキネティクスは、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性の定量的尺度を提供する。本発明の試薬はTaqポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し、SYBR Green I蛍光の増大を減速させる。
最終容量25μL中の100ゲノムのヒト胎盤DNA(Sigma, St Louis, MO)の存在下または非存在下で、一連のLATE−PCR増幅反応を準備した。この実験では、LATE−PCR増幅反応物は、1×PCRバッファー(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3mMのMgCl2、0.25mMのdNTP、1000nMの過剰プライマー、50nMの制限的プライマー、0.25μMのFAM標識プローブ鎖、0.3μMのDabcyl標識リバース相補鎖、1.25単位のPlatinum TaqDNAポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA)から構成するものとした。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りであった:
過剰プライマー:5’ GTTTCTTTGCTGCCGTGTTC 3’(配列番号37)
制限的プライマー:5’ CCCCAGAGACCCCAGTTGCTAACCAGAC 3’(配列番号38)
FAM標識プローブ鎖:5’ [TET]AGACAGAGTTGAAAGTCAGG[Phos] 3’(配列番号39)
Dabcyl標識リバース相補鎖:5’ ACTTTCAACTCTGTCT[Dabcyl] 3’(配列番号40)。
最終容量25μL中の100ゲノムのヒト胎盤DNA(Sigma, St Louis, MO)の存在下または非存在下で、一連のLATE−PCR増幅反応を準備した。この実験では、LATE−PCR増幅反応物は、1×PCRバッファー(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3mMのMgCl2、0.20mMのdNTPから構成するものとした。サンプルごとに1.25単位のTaqポリメラーゼを使用した。第一の増幅標的配列(産物1)は嚢胞性線維症遺伝子のエキソン11の一部分であり、100nMの制限的プライマー:5’ GACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT 3’(配列番号41)および2,000nMの過剰プライマー:5’ TCCAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3’(配列番号42)を用いて増幅した。第二の増幅標的配列(産物2)は嚢胞性線維症遺伝子のエキソン10の一部分であり、50nMの制限的プライマー:5’ CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3’(配列番号43)および1000nMの過剰プライマー:5’ GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3’(配列番号44)を用いて増幅した。
マウスOct4およびXist遺伝子のエキソン内の配列(それぞれGenBank登録番号NM_013633およびL04961)を同時に増幅するための二重リアルタイムLATE−PCRアッセイを設計した。各反応は最終容量50μL中で実行し、以下の試薬を含有した:20mMのTris−HCl,pH8.4、および50mMのKClによって構成される1×PCRバッファー(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3mMのMgCl2、0.4mMの各dNTP、配列5’ TGGCTGGACACCTGGCTTCAGACT 3’(配列番号45)を有する50nMのOct4制限的プライマー、配列5’ CAACTTGGGGGACTAGGC 3’(配列番号46)を有する2μMのOct4過剰プライマー、配列5’ GGTCGTACAGGAAAAGATGGCGGCTCAA 3’(配列番号47)を有する100nMのXist制限的プライマー、配列5’ TGAAAGAAACCACTAGAGGGCA 3’(配列番号48)を有する2μMのXist過剰プライマー、配列5’ TET−CCG CCT GGG ATG GCA TAC TGT GGA AGG CGG−Dabcyl 3’(配列番号49)を有する1μMの低TmのOct4分子ビーコンおよび2単位の抗体複合体化Platinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA)。さらに化合物9−3DDまたは化合物9−3bDDを、以下に指定される濃度でPCR混合物に加えた。本実施例では、Xistアンプリコンを検出するための分子ビーコンを加えなかった。各アッセイは、PurAmpプロトコル(Hartshorn et al. (2005) BMC Biotechnol 5: 2を参照のこと)にしたがって、2.5μL容量中に細胞溶解および逆転写に必要な試薬をさらに含有した。この二重LATE−PCRでは、前記試薬の最終濃度は以下の通りであった:2.5mMのTris酢酸,pH8.4、3.75mMの酢酸カリウムおよび0.4mMの酢酸マグネシウム(希釈したcDNA合成バッファー, ThermoScriptTM RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, CA)、追加の50μMの各dNTP、0.13mMのイソチオシアン酸グアニジン、6.7μMのβ−メルカプトエタノール、0.7μMのクエン酸ナトリウム,pH7.0、0.7×10−4%(vol/vol)のジメチルスルホキシドおよび0.2×10−4%のサルコシル(sarcosyl)。
ヒトゲノムDNA出発材料の5種の異なる標的配列を個別に増幅するために、および多重反応においてすべての5配列を一緒に増幅するために、LATE−PCR反応混合物を調製した。各標的配列はその独自のペアの制限的および過剰プライマーを必要とした。前記標的配列は、(1)191塩基対のグロビン対立遺伝子、(2)312塩基対のテイ・サックスG269対立遺伝子、(3)452塩基対のテイ・サックス1278および1421対立遺伝子、(4)ミトコンドリア超可変領域1の549塩基対セグメント、および(5)p53遺伝子エキソン7および8を含む611塩基対セグメントであった。25μLの反応混合物は、1×PCRバッファー(Invitrogen)、0.4mMのdNTP、3mMのMg++、0.24×SYBR Greenおよび1.5単位のTaqDNAポリメラーゼ(Invitrogen)を含有した。制限的プライマーに関しては50nMおよび過剰プライマーに関しては1000nMの濃度でプライマーを加えた。すべての5ペアのプライマーを多重反応に加えた。熱サイクル処理は、95℃で10秒間,64℃で20秒間,および72℃で1分間の45サイクルであった。
本発明者らは、本発明の試薬のミスプライミングの低減(特異性改善)およびポリメラーゼ阻害効果を定量的に研究する試験を考案した。該試験は第1の作用様式と第3の作用様式を識別すると考えられる。該試験は、実施例1に記載のアッセイと本質的に同様のPCR増幅アッセイであるが、以下の例外を有する:増幅反応混合物は半数(1000ゲノム)の剪断ゲノムDNAを含有し、熱サイクル処理の最終部分は70サイクルから40サイクルに減少される。種々の量、典型的には25nM、50nM、100nM、300nM、1500nMおよび3000nMの本発明の試薬を加えて増幅を実施する。試験は2種の分析を含む:第一は、特異性に関する、増幅産物の融解曲線の分析であり;第二は、阻害に関する、合成二本鎖産物のリアルタイム蛍光曲線の分析である。
Claims (20)
- 少なくとも1種の増幅DNA産物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅において、25μLの反応混合物あたり1.25単位の熱安定性DNAポリメラーゼを含有するPCR増幅混合物に650nM以下の濃度で添加した場合に、少なくとも1種のミスプライミング現象を防ぐことができる試薬であって、該試薬は伸長不可能なオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドはステムループ構造を有し、前記少なくとも1種の増幅DNA産物に対するハイブリダイゼーションプローブでなく、6ヌクレオチド長より長いステムを有し、該ループの反対側のステムの末端は安定化されており、かつ計算上のステムの融解温度(Tm)が94℃より低い、上記試薬。
- 前記ループが少なくとも3個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の試薬。
- 前記ループが非ヌクレオチド化学リンカーである、請求項1に記載の試薬。
- 前記ステムが、該ステムの3’および5’ヌクレオチドに共有結合した結合性化学部分により末端で安定化されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記結合性化学部分がいずれも蛍光性でない、請求項4に記載の試薬。
- Tm値より低い温度では二本鎖となる前記ステムの一部分が、9〜12塩基対の長さを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記計算上のステムの融解温度が72〜85℃の範囲内である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記計算上のステムの融解温度が50〜71℃の範囲内である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の試薬。
- デオキシヌクレオチドリン酸(dNTP)および熱安定性DNAポリメラーゼを含有する増幅反応混合物から少なくとも1種の増幅DNA産物を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅での少なくとも1種のミスプライミング現象を防ぐ方法であって、該反応混合物に請求項1〜8のいずれか1項に記載の少なくとも1種の試薬を添加することを含む、上記方法。
- 前記試薬がオリゴヌクレオチドループを有し、該試薬の濃度が300nM以下である、請求項9に記載の方法。
- 前記試薬が非ヌクレオチド化学リンカーであるループを有し、かつ該試薬を前記反応混合物に1000nM以下の濃度で添加する、請求項9に記載の方法。
- 前記増幅が、前記Tmより低い温度で行われる低温検出ステップを含む直線後指数的PCR(LATE−PCR)アッセイである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅が対称的PCRアッセイである、請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅に続いてエンドポイント検出を行う、請求項9〜13のいずれか1項に記載の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を行うための試薬キットであって、熱安定性DNAポリメラーゼ、少なくとも1ペアのPCRプライマー、dNTP、および請求項1〜8のいずれか1項に記載の少なくとも1種の試薬を含んでなる、上記キット。
- 核酸単離のための試薬をさらに含んでなる、請求項15に記載のキット。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を行うためのオリゴヌクレオチドセットであって、少なくとも1ペアのPCRプライマーおよび請求項1〜8のいずれか1項に記載の少なくとも1種の試薬を含んでなる、上記セット。
- 前記少なくとも1ペアのPCRプライマーにより規定される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも1種の蛍光標識プローブをさらに含有する、請求項17に記載のセット。
- 前記少なくとも1ペアのプライマーが、直線後指数的PCR(LATE−PCR)増幅を行うのに適した比率で制限的プライマーと過剰プライマーとを含む、請求項17または18に記載のセット。
- 前記増幅産物が一本鎖である、請求項17〜19のいずれか1項に記載のセット。
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