JP2002537825A

JP2002537825A - Ｄｎａポリメラーゼに対する核酸リガンド阻害剤

Info

Publication number: JP2002537825A
Application number: JP2000602817A
Authority: JP
Inventors: ジャヤセナ，スメダ; ゴールド，ラリー
Original assignee: ギリード・サイエンシズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2002-11-12
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: AU3604700A; HK1044803A1; AU781567B2; PT1171632E; US6183967B1; DK1171632T3; JP2011103890A; HK1044803B; ATE478157T1; EP2241635A1; EP1171632A4; JP4738599B2; EP1171632A1; CA2362526A1; WO2000052207A1; EP1171632B1; ES2349213T3; WO2000052207A9; DE60044845D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンドを開示する。具体的には、本発明は、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合する能力を有するＤＮＡリガンド、並びにこうしたリガンドを得る方法を開示する。リガンドは、あらかじめ決定されたいかなる温度でも、ポリメラーゼを阻害することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本明細書に記載されるのは、ＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼに対する高親和性核酸リガンドを同定し、そして調製する方法である。好
ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカスから単
離された熱安定性ポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼ；サーマス・サーモフ
ィラスから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈポリメラーゼ；
または別のサーマス種から単離されたＴＺ０５ポリメラーゼである。しかし、本
発明の方法は、いかなる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの同定および調製に拡張し
てもよい。これらの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのいくつかはまた、ＲＮＡをコ
ピーＤＮＡに逆転写する能力も有する。逆転写能を持つＤＮＡポリメラーゼの例
には、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼが含まれる。こうした核酸リガンドを
同定するのに、本明細書において利用される方法はＳＥＬＥＸと称され、これは
、指数的濃縮によるリガンドの計画的進化（ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕ
ｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌｅｎｒｉｃ
ｈｍｅｎｔ）の頭字語である。本明細書にやはり記載されるのは、本発明の核酸
リガンドを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行う改善法である。本明細書に特に開
示されるのは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、およびＴＺ０５ポリ
メラーゼに対する高親和性核酸リガンドである。本発明は、Ｔａｑポリメラーゼ
、Ｔｔｈポリメラーゼ、およびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、それによりあら
かじめ決定された温度範囲でポリメラーゼ活性を阻害する、高親和性ＤＮＡリガ
ンドを含む。本発明にさらに含まれるのは、核酸スイッチである。本発明のＤＮ
Ａポリメラーゼに対する核酸リガンドの温度依存性結合は、その望ましい特性が
、いかなる数でもよい反応条件、例えばｐＨおよび塩濃度に基づき、スイッチオ
ンまたはオフすることが可能であるリガンドの例である。

【０００２】発明の背景ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、近年開発された技術であり、科学の多く
の領域に重大な影響を有してきた。ＰＣＲは、指数的方式で標的ＤＮＡ配列を特
異的に増幅する、迅速でそして単純な方法である（Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２３０：１３５０；ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ（１９
８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５）。簡潔には、該方
法は、標的配列に隣接するＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプライマ
ーセットを合成することからなる。その後、プライマーを、標的ＤＮＡ、熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼおよびすべての４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）の溶液と混合する。その後、ＤＮ
Ａの相補鎖を分離するのに十分な温度（およそ９５℃）に溶液を加熱し、そして
その後、プライマーが隣接配列に結合するのを可能にするのに十分な温度に冷却
する。その後、反応混合物を再び（およそ７２℃に）加熱し、ＤＮＡ合成が進行
するのを可能にする。短期間の後、反応混合物の温度を再び、新規に形成された
二本鎖ＤＮＡを分離するのに十分な温度に上昇させ、こうしてＰＣＲの第一の周
期を完了する。その後、反応混合物を冷却し、そして周期を反復する。このよう
に、ＰＣＲはＤＮＡ融解、アニーリングおよび合成の反復周期からなる。２０の
複製周期により、標的ＤＮＡ配列の百万倍までの増幅を達成することが可能であ
る。単一のＤＮＡ分子をＰＣＲにより増幅する能力は、環境および食物微生物学
（Ｗｅｒｎａｒｓら（１９９１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
５７：１９１４−１９１９；ＨｉｌｌおよびＫｅａｓｌｅｒ（１９９１）Ｉ
ｎｔ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６７−７５）、臨床微
生物学（Ｗａｇｅｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３３：５８
−６３；Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏら（１９９１）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＰｒｏｂ
ｅｓ５：２２９−２４０；Ｌａｕｒｅら（１９８８）Ｌａｎｃｅｔ２：５
３８）、腫瘍学（ＫｕｍａｒおよびＢａｒｂａｃｉｄ（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ３：６４７−６５１；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌｓ１：５６−６１；Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉら（１９８８）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４８６９）、遺伝的疾患
予後（Ｈａｎｄｙｓｉｄｅら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４４：７６８−７７
０）、血液バンキング（Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９０）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ３０：５１−５７）および法医学（ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら（
１９８８）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３３２：５４３）に適用を有する。

【０００３】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの入手可能性
は、ＰＣＲを単純化しそしてまた改善してきている。元来、ＰＣＲで使用するの
に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼなどの熱感受性ポリメラーゼ
のみが利用可能であった。しかし、熱感受性ポリメラーゼは二本鎖ＤＮＡを融解
するのに必要な温度で破壊され、そして各ＰＣＲ周期後に、さらなるポリメラー
ゼを添加しなければならない。好熱性細菌、サーマス・アクアティカスから単離
されたＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、９５℃まで安定であり、そしてＰＣＲで
使用すると、各熱周期後、温度感受性ポリメラーゼを繰り返し添加する必要性が
除かれた。さらに、Ｔａｑポリメラーゼはより高い温度で用いることが可能であ
るため、ＰＣＲの特異性および感受性が改善された。特異性が改善された理由は
、より高い温度で、望ましいもの以外の部位に対するプライマーの結合（ミスプ
ライミングと称される）が有意に減少するためである。

【０００４】その発見以来、ポリメラーゼ連鎖反応は、多様な適用のため修飾されてきてお
り、例えば、伝統的なｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの検出限界を単一
コピーレベルにまで押し上げたｉｎｓｉｔｕＰＣＲ（Ｈａａｓｅら（１９９
０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：４９７１
−４９７５）、およびＰＣＲにより増幅される前に、逆転写酵素（ＲＴ）により
ＲＮＡ配列をコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、ＲＮＡをＰＣＲの基質とする
、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９１）Ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＮＡ，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ．ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎ
ｎｉｓら監修，中，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，カリフォルニ
ア州サンディエゴ，２１−２７）がある。しかし、中温性ウイルス逆転写酵素
は、ＲＮＡ分子の安定な二次構造を「読みぬく（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）」
ことが不可能であるため、全長ｃＤＮＡ分子を合成することがしばしば不可能で
ある。この限界は、最近、サーマス・サーモフィラスから単離されたポリメラー
ゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）の使用により克服された。Ｔｔｈポリメラーゼは、逆
転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼの両方として機能することが可能な熱安定性
ポリメラーゼである（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ（１９９１）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ３０：７６６１−７６６６）。Ｔｔｈポリメラーゼを用い、上
昇した温度で逆転写を行うと、テンプレートＲＮＡの二次構造が除かれ、全長ｃ
ＤＮＡ合成が可能になる。

【０００５】ＰＣＲ技術にはかなりの進歩があったが、副反応、例えばバックグラウンドＤ
ＮＡのミスプライミングによる、非標的オリゴヌクレオチド増幅および／または
プライマーオリゴマー化は、やはり重大な問題を呈する。これは、バックグラウ
ンドＤＮＡを含むが、標的ＤＮＡが単一コピーで存在する可能性がある環境で、
ＰＣＲを行う、診断適用に特に当てはまる（Ｃｈｏｕら（１９９２）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２０：１７１７−１７２３）。非特異的増幅産物の
生成は、非特異的にアニーリングしたプライマーを伸長する、周囲温度でのポリ
メラーゼ活性に起因すると考えられてきている（Ｃｈｏｕら（１９９２）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２０：１７１７−１７２３；Ｌｉら（１９９
０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：４５８０
）。したがって、周囲温度でのポリメラーゼ活性の阻害は、非特異的産物の生成
を調節するのに重要である。

【０００６】これらの副反応を最小限にする、２つの方法が報告されてきている。「手動ホ
ットスタート（ｍａｎｕａｌｈｏｔｓｔａｒｔ）」ＰＣＲと称される、第一
の方法では、混合物温度が、非特異的プライマーアニーリングを防ぐのに十分に
高くなるまで、反応混合物にポリメラーゼ活性に必須の構成要素（例えば二価イ
オンおよび／またはポリメラーゼ自体）を添加しない（Ｃｈｏｕら（１９９２）
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２０：１７１７−１７２３；Ｄ’Ａｑ
ｕｉｌａら（１９９１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１９：３７４９
）。したがって、最後の試薬、通常はポリメラーゼを添加する前に、試薬すべて
を７２℃に加熱する。ワックス仲介「ホットスタート」ＰＣＲでは、ポリメラー
ゼ活性に必須の構成要素を、第一の周期での加熱に際し融解するワックス層によ
り、低温では残りの反応混合物から物理的に分離する（Ｃｈｏｕら（１９９２）
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１７１７；Ｈｏｒｔｏｎら（
１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１６：４２）。「ホットスタート」Ｐ
ＣＲは特定の欠点を有する；熱反復を開始する前に、試験管を再度開く必要があ
り、これは交差混入を増加させ、そしてピペッティングの反復は、多くの試料を
扱うのを冗長にする。すべての他の反応構成要素と共に直接反応混合物中に入れ
ることが可能であり、そして周囲温度でポリメラーゼを阻害する試薬は、「ホッ
トスタート」ＰＣＲに関連する限界を克服するのに有用であろう。本方法は特異
性を増加させ、それにより副産物を減少させるが、該方法は、多くの試料を扱う
のに不便であり、反応混合物はより容易に汚染され、そして該方法を誤りがちに
する。

【０００７】「ｉｎｓｉｔｕホットスタート」と称される、第二の方法では、低温でポリ
メラーゼに結合しそして阻害するが高温ではしない試薬（例えば、Ｔａｑポリメ
ラーゼの中和抗体（ＴａｑＳｔａｒｔ）またはオリゴヌクレオチドアプタマー）
を完全反応混合物に添加する（Ｂｉｒｃｈら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８１：４４５；ＤａｎｇおよびＪａｙａｓｅｎａ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２６４：２６８；Ｋｅｌｌｏｇｇら（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ１６：１１３４−１１３７）。本抗体は、周囲温度でポリメラーゼ
活性を阻害するが、反応が熱反復されると熱変性により不活性化され、ポリメラ
ーゼを活性にする。副産物を減少させる本アプローチの欠点は、抗Ｔａｑ抗体を
使用まで−２０℃で保管しなければならないことである。これは検出キットを調
節された環境下でパッケージングし、そして輸送しなければならず、費用が加算
されることを意味する。さらに、１回のＰＣＲに、売主が特定する緩衝液で希釈
された、かなりの量の抗体（〜１μｇの抗体／５ＵのＴａｑポリメラーゼ）を
必要とする。

【０００８】熱安定性ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを阻害することが可能な高親和性核
酸リガンドの開発は、「ホットスタート」法の必要性を除き、そして第二の方法
に関連する限界を克服するであろう。非常に特異的で、そして高親和性を有する
核酸阻害剤を開発することが可能である。核酸は周囲温度でタンパク質より安定
であるため、抗体を用いることに関連する輸送およびパッケージングの問題を克
服することが可能である。さらに、核酸は、抗体同様、より高い温度でポリメラ
ーゼに対する親和性を失い、望ましいときにポリメラーゼが活性化されることを
可能にすると確認することが可能である。ＰＣＲにおいて、核酸に基づく阻害剤
が、それ自体、（反応に用いられる特異的プライマーに加え）プライマーとして
機能することにより仲介されるミスプライミングの可能性は、その３’末端をキ
ャップ化することにより、除去することが可能である。

【０００９】いくつかのＤＮＡポリメラーゼのＸ線結晶構造により、これらが類似の三次元
構造にフォールディングしていることが示されてきている（概説には、Ｊｏｙｃ
ｅおよびＳｔｅｉｚ（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：７７７を参照されたい）。重合に責任があるＣ末端ドメインは、解剖学的に
右手と類似の「手のひら（ｐａｌｍ）」、「手指（ｆｉｎｇｅｒ）」および「親
指（ｔｈｕｍｂ）」の３つのサブドメインに組織される。Ｔｔｈポリメラーゼお
よびＴａｑポリメラーゼは、アミノ酸配列レベルで９３％類似であり、そして８
８％同一である（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ニューヨーク）中）。どちらも３’→５’
エキソヌクレアーゼ活性を持たないが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含
む（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ，ニューヨーク）中；ＴｉｎｄａｌｌおよびＫｕｎｋｅ
ｌ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７：６００８）。したがって、核
酸リガンド阻害剤は、これらの酵素両方と共に、他の熱安定性ポリメラーゼに類
似の振る舞いをすると期待される。これにより、いくつかの熱安定性酵素に単一
の阻害剤を用いることが可能になるであろう。

【００１０】ＲＮＡ配列は、ＰＣＲにより増幅される前に、逆転写によりｃＤＮＡに変換さ
れる。最初は、これは、２つの異なる酵素：逆転写酵素および熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼを用いた２つの工程で達成された。最近の研究により、特定の熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを逆転写する能力を有し、ＲＮＡ単位複製物を
増幅するのに単一の酵素の使用が可能になることが示されてきている（Ｍｙｅｒ
ｓおよびＧｅｌｆａｎｄ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：７６６
１−７６６６）。ＲＮＡは二価イオンの存在下で、高温で不安定であるため、逆
転写はＤＮＡ合成より低い温度（５０−６０℃）で行う。したがって、ポリメラ
ーゼの周囲活性を阻害するのに用いられる試薬が、より低い温度でポリメラーゼ
を再活性化するような試薬を有することが望ましいであろう。この必要性は、Ｒ
ＮＡに基づく増幅において、ｉｎｓｉｔｕホットスタート条件を生成する、不
活性化のために高温（７０−９０℃）を要求する、抗体の使用を排除する。

【００１１】ＳＥＬＥＸ^TM 標的分子に対し非常に特異的な結合を持つ、核酸分子のｉｎｖｉｔｒｏ進化
のための方法が開発されてきている。本方法は、指数的濃縮によるリガンドの計
画的進化、ＳＥＬＥＸ^TMと称され、現在放棄されている、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａ
ｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０７／５３６，４２８号
、１９９１年６月１０日に提出された“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎ
ｄｓ”と題される米国特許出願第０７／７１４，１３１号、現米国特許第５，４
７５，０９６号、および１９９２年８月１７日に提出された“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ
”と題される米国特許出願第０７／９３１，４７３号、現米国特許第５，２７０
，１６３号（１９９１年１２月２６日に刊行されたＷＯ９１／１９８１３も参
照されたい）に記載され、これらの各々は、特に本明細書に援用される。これら
の出願の各々は、本明細書において、集合的にＳＥＬＥＸ特許出願と称され、い
かなる望ましい標的分子に対しても核酸リガンドを作成するための根本的に新規
な方法を記載する。

【００１２】ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、並びに同じ一般
的選択計画を用いた、結合、分配および増幅の段階的反復を伴い、実質的にいか
なる望ましい規準の結合親和性および選択性も達成する。ＳＥＬＥＸ法は、好ま
しくはランダム配列セグメントを含む核酸混合物から出発し、結合に好ましい条
件下で標的と混合物を接触させ、標的分子に特異的に結合している核酸から非結
合核酸を分配し、核酸−標的複合体を解離させ、核酸−標的複合体から解離した
核酸を増幅し、核酸のリガンド濃縮混合物を生じ、その後、結合、分配、解離お
よび増幅を、望ましいだけ再反復し、標的分子に対する非常に特異的な高親和性
核酸リガンドを生じる工程を含む。

【００１３】いくつかの特定の目的を達成するように、基本的なＳＥＬＥＸ法が修飾されて
きている。例えば、１９９２年１０月１４日に提出され、現在放棄されている、
“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＳｅｌｅｃｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｄｉｓ
ｏｎｔｈｅＢａｓｉｓｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒｅ”と題される米国特許出
願第０７／９６０，０９３号（１９９４年２月２２日に提出された“Ｍｅｔｈｏ
ｄｆｏｒＳｅｌｅｃｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｄｉｓｏｎｔｈｅ
ＢａｓｉｓｏｆＳｔｒｕｃｔｕｒｅ”と題される米国特許出願第０８／１
９８，６７０号、現米国特許第５，７０７，７９６号を参照されたい）は、特定
の構造特性を持つ核酸分子、例えば折れ曲がりＤＮＡを選択するための、ゲル電
気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ法の使用を記載する。１９９３年９月１７日に
提出され、現在放棄されている、“ＰｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／１２
３，９３５号（１９９６年３月８日に提出された“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖ
ｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎ
ｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＰｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓａｎｄＳｏｌｕｔｉｏｎＳＥＬＥＸ”と題され
る米国特許出願第０８／６１２，８９５号、現米国特許第５，７３６，１７７号
）は、標的分子に結合しおよび／または光架橋しおよび／または該分子を光不活
性化することが可能な光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥ
Ｘに基づく方法を記載する。１９９５年５月１８日に提出された“Ｈｉｇｈ−Ａ
ｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓＴｈａｔＤｉ
ｓｃｒｉｍｉｎａｔｅＢｅｔｗｅｅｎＴｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅａｎｄ
Ｃａｆｆｅｉｎｅ”と題される、米国特許出願第０８／４４３，９５７号、現米
国特許第５，５８０，７３７号を支持し、放棄された、１９９３年１０月７日に
提出された“Ｈｉｇｈ−ＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇ
ａｎｄｓＴｈａｔＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅＢｅｔｗｅｅｎＴｈｅｏｐ
ｈｙｌｌｉｎｅａｎｄＣａｆｆｅｉｎｅ”と題される、米国特許出願第０８
／１３４，０２８号は、非常に近縁の分子の間を区別することが可能な非常に特
異的な核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥ
ＬＥＸ）と称される方法を記載する。１９９５年６月５日に提出された“Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏ
ｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＳｏｌｕｔｉｏｎＳＥＬＥＸ”と
題される、米国特許出願第０８／４６１，０６９号、現米国特許第５，５６７，
５８８号を支持し、放棄された、１９９３年１０月２５日に提出された“Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏ
ｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＳｏｌｕｔｉｏｎＳＥＬＥＸ”と
題される、米国特許出願第０８／１４３，５６４号は、標的分子に高い親和性を
有するオリゴヌクレオチドおよび低い親和性を有するものの間の非常に効率的な
分配を達成する、ＳＥＬＥＸに基づく方法を記載する。１９９２年１０月２１日
に提出された、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓｔｏＨＩＶ−
ＲＴａｎｄＨＩＶ−１Ｒｅｖ”と題される、米国特許出願第０７／９６４
，６２４号、現米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸが行われた後に
、改善された核酸リガンドを得るための方法を記載する。１９９５年３月８日に
提出された、“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎ
ｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−
ＳＥＬＥＸ”と題される、米国特許出願第０８／４００，４４０号、現米国特許
第５，７０５，３３７号は、標的にリガンドを共有結合する方法を記載する。

【００１４】ＳＥＬＥＸ法は、リガンドに改善された特性、例えば改善されたｉｎｖｉｖ
ｏ安定性または改善された搬送特性を与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性核
酸リガンドの同定を含む。こうした修飾の例には、リボースおよび／またはリン
酸および／または塩基位での化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含む、
ＳＥＬＥＸ法で同定された核酸リガンドは、１９９５年４月２７日に提出された
、“ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ
ＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題さ
れる、米国特許出願第０８／４３０，７０９号、現米国特許第５，６６０，９８
５号を支持し、放棄された、１９９３年９月８日に提出された“ＨｉｇｈＡｆ
ｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓＣｏｎｔａｉｎｉ
ｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題される、米国特許出願
第０８／１１７，９９１号に記載され、該出願は、ピリミジンの５−および２’
−位で化学的に修飾されているヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを
記載する。上記の米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−Ｎ
Ｈ₂）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’
−ＯＭｅ）で修飾されている１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、非常に
特異的な核酸リガンドを記載する。１９９４年６月２２日に提出された、現在放
棄されている、“ＮｏｖｅｌＭｅｔｈｏｄｏｆＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｏｆＫｎｏｗｎａｎｄＮｏｖｅｌＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓｂｙＩｎ
ｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＮｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃＤｉｓｐｌａｃｅｍｅ
ｎｔ”と題される米国特許出願第０８／２６４，０２９号は、多様な２’−修飾
ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。

【００１５】１９９４年８月２日に提出された“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏ
ｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅ
ｎｔ：ＣｈｉｍｅｒｉｃＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２８
４，０６３号、現米国特許第５，６３７，４５９号および１９９４年４月２８日
に提出された“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎ
ｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｂｌｅｎｄｅ
ｄＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２３４，９９７号、現米国特
許第５，６８３，８６７号にそれぞれ記載されるように、ＳＥＬＥＸ法は、選択
されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリ
ゴヌクレオチド官能単位と組み合わせることを含む。これらの出願により、オリ
ゴヌクレオチドの広範囲の形状および他の特性のアレイ、並びに効率的な増幅お
よび複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。基
本的ＳＥＬＥＸ法の修飾を記載する上述の特許出願の各々は、特に、完全に本明
細書に援用される。

【００１６】発明の簡単な概要本発明は、ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定しそして産生する
方法を含む。特に含まれるのは、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼを
含む、ポリメラーゼ連鎖反応に有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸
リガンドを同定する方法、並びにこうして同定されそして産生された核酸リガン
ドである。より詳細には、それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラー
ゼに特異的に結合することが可能であり、それにより、それらがＤＮＡ合成を触
媒する能力を阻害するＤＮＡ配列が提供される。本発明の方法を用い、使用者に
より定義される条件下で、ｉｎｖｉｔｒｏで核酸リガンドを選択し、そしてし
たがって、あらかじめ選択された温度／またはそれに近い温度で、ポリメラーゼ
に結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するリガンドを選択する機会が提供され
る。周囲温度で、ＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメ
ラーゼを阻害するＤＮＡ配列、並びに５５℃近傍で、ＴａｑおよびＴｔｈポリメ
ラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するＤＮＡ配列が提供される。本
発明の方法は、あらかじめ決定されたいかなる温度までの、いかなる熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定しそして産生すること、およびこ
うして同定されそして産生されたリガンドにも拡張することが可能である。

【００１７】本発明にさらに含まれるのは、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに
対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列を同定する方法であって、（ａ）核
酸候補混合物を調製し、（ｂ）あらかじめ決定された温度で、Ｔａｑ、Ｔｔｈお
よびＴＺ０５ポリメラーゼに対する親和性に基づき、前記候補混合物のメンバー
間で分配し、そして（ｃ）選択された分子を増幅し、それぞれ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ
およびＴＺ０５ポリメラーゼに対する結合に関し比較的高い親和性の核酸配列が
濃縮された核酸混合物を得る、工程を含む、前記方法である。

【００１８】本発明にさらに含まれるのは、周囲温度で熱安定性ポリメラーゼを阻害するが
、上昇した温度で該ポリメラーゼから解離する核酸リガンドを含む工程を含む、
ポリメラーゼ連鎖反応を実行する改善法である。こうした核酸リガンドは、本発
明の方法にしたがって同定される。

【００１９】より具体的には、本発明は、上述の方法にしたがって同定された、Ｔａｑポリ
メラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するｓｓＤＮＡ
リガンドを含み、表２−３、１０および１１（配列番号７−７４および７６−７
７）並びに表４−６および図３３（配列番号７８−１１５）を含む。やはり含ま
れるのは、いかなるものでもよい既定のリガンドに実質的に相同であり、Ｔａｑ
ポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、そし
て該ポリメラーゼの活性を阻害する、実質的に同一の能力を有する、Ｔａｑポリ
メラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するＤＮＡリガ
ンドである。本発明にさらに含まれるのは、本明細書に提示されるリガンドと実
質的に同一の構造型を有し、そしてＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼお
よびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼの活性を阻害する、
実質的に同一の能力を有する、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼおよび
ＴＺ０５ポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドである。

【００２０】本発明はまた、本明細書に同定されるＤＮＡリガンドに基づく修飾ヌクレオチ
ド配列および該配列の混合物も含む。本発明の核酸リガンドは、反応混合物の温度に応じ、ポリメラーゼ連鎖反応を
「オン」または「オフ」にする「スイッチ」として機能することが可能である。
したがって、本発明はまた、スイッチとして機能する核酸リガンド配列を同定し
そして調製する方法であって、（ａ）核酸候補混合物を調製し、（ｂ）Ｔａｑ、
ＴｔｈまたはＴＺ０５ポリメラーゼに対する親和性に基づき、前記候補混合物の
メンバー間で分配し、そして（ｃ）標的分子を用い、選択された分子を増幅し、
増幅温度以下の温度でのみ、それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラ
ーゼに対する結合に関し比較的高い親和性の核酸配列が濃縮された核酸混合物を
得る、工程を含む、前記方法も含む。

【００２１】本発明は、したがって、核酸スイッチを同定する方法を含む。核酸スイッチは
、ＳＥＬＥＸ法により同定される核酸であり、ここで該核酸の望ましい特性は、
いくつかの環境パラメーターの操作に応じ、「スイッチ」オンまたはオフするこ
とが可能である。核酸スイッチは、ＳＥＬＥＸ分配工程を操作し、反応媒体パラ
メーター中の改変に基づき、反対の結果――しばしば標的に対する結合――を生
じる核酸を選択することにより、同定することが可能である。この場合の例は、
温度に基づき、オンおよびオフされる核酸スイッチを示すが、本発明の方法を拡
張し、限定されるわけではないが、ｐＨ、特定のイオン、すなわちＭｇ⁺⁺の濃度
を含む、温度以外の条件に基づくスイッチとして機能する核酸リガンドを同定し
そして調製してもよい。

【００２２】発明の詳細な説明本出願は、ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドの単離を記載する。具体
的には、本出願は、ポリメラーゼ連鎖反応に有用な熱安定性ポリメラーゼに対す
る核酸リガンドの単離を記載する。好ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼ
はＴａｑ、ＴｔｈまたはＴＺ０５ポリメラーゼより選択されるが、本発明の方法
は、いかなる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対する高親和性核酸リガンドの同定
および調製に拡張してもよい。核酸リガンドは、ＳＥＬＥＸとして知られる方法
を通じ、同定される。ＳＥＬＥＸは、現在放棄されている、“Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉ
ａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０７／５３６，４２８
号、１９９１年６月１０日に提出された“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａ
ｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／７１４，１３１号、現米国特許第５，
４７５，０９６号、および１９９２年８月１７日に提出された“Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄ
ｓ”と題される米国特許出願第０７／９３１，４７３号、現米国特許第５，２７
０，１６３号（１９９１年１２月２６日に刊行されたＷＯ９１／１９８１３も
参照されたい）に記載される。これらの出願は各々、特に本明細書に援用され、
集合的にＳＥＬＥＸ特許出願と称される。

【００２３】最も基本的な形で、ＳＥＬＥＸ法は、以下の一連の工程により定義することが
可能である：１）異なる配列の核酸候補混合物を調製する。候補混合物は、一般的に、固定配
列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一部位に同一配列を含む）お
よびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は：ａ）以下に記載される増幅工
程を補助するよう、ｂ）標的に結合する既知の配列を模倣するよう、またはｃ）
候補混合物中の既定の構造配置の核酸の濃度を亢進するよう、選択される。ラン
ダム配列は、完全にランダム（すなわちいかなる位でも塩基が４つのうち１つで
あることを見出すことが可能）でも、または部分的にのみランダム（例えば、塩
基を見出す可能性が、いかなる部位でも０および１００パーセントの間のいずれ
でもよいレベルで選択することが可能）でもよい。２）候補混合物を、標的および候補混合物のメンバーの間の結合に好ましい条件
下で、選択された標的と接触させる。これらの状況下では、標的および候補混合
物核酸の間の相互作用は、標的および標的に対し最も強い親和性を有する核酸の
間の核酸−標的対を形成するとみなすことが可能である。３）標的に対し最も高い親和性を持つ核酸を、標的に対しより少ない親和性の核
酸から分配する。最も高い親和性の核酸に相当する配列は、候補混合物中に非常
に少数のみ（そしておそらくわずか１つの核酸分子が）存在するため、一般的に
、候補混合物中の核酸のかなりの量（およそ５−５０％）が分配中に保持される
ように、分配規準を設定することが望ましい。４）その後、分配中、標的に対し相対的に高い親和性を有すると選択された核酸
を増幅し、標的に対し相対的に高い親和性を有する核酸が濃縮された、新規候補
混合物を生成する。５）上記の分配および増幅工程を反復することにより、新たに形成される候補混
合物は、より少ない特有配列を含み、そして標的に対する核酸親和性の平均的度
合いは、一般的に増加するであろう。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は、標的分子に
対し最も高い親和性を有する、元来の候補混合物由来の核酸に相当する、１つま
たは少数のユニークな核酸を含む、候補混合物を生じるであろう。

【００２４】ＳＥＬＥＸ特許出願は、本方法を非常に詳細に記載し、そして詳述する。含ま
れるのは、本方法に用いることが可能な標的；候補混合物中の核酸を分配する方
法；および分配された核酸を増幅し、濃縮候補混合物を生成する方法である。Ｓ
ＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核酸結合タンパク質であるまたはない、
タンパク質標的を含む、いくつかの標的種に対して得られるリガンドも記載する
。

【００２５】ＳＥＬＥＸ法は、標的分子の高親和性リガンドを提供する。これは核酸研究の
分野で前例のないまれにみる達成に相当する。本発明は、ＳＥＬＥＸ法をＤＮＡ
ポリメラーゼ、特にＴａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポ
リメラーゼの核酸阻害剤という特定の標的に適用する。以下の実施例項では、Ｔ
ａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸阻害剤を単離しそして同
定するのに用いた実験パラメーターが記載される。

【００２６】１９９２年１０月２１日に提出された、同時係属であり、そして本発明の譲受
人に譲渡された米国特許出願第０７／９６４，６２４号、現米国特許第５，４９
６，９３８号（’９３８特許）では、ＳＥＬＥＸを行った後、改善された核酸リ
ガンドを得る方法が記載される。“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ
ｔｏＨＩＶ−ＲＴａｎｄＨＩＶ−１Ｒｅｖ”と題される’９３８特許
は、特に本明細書に援用される。

【００２７】本明細書において、本発明を記載するのに用いられる特定の用語は、以下のよ
うに定義される：本明細書において、「核酸リガンド」は、標的に対し望ましい作用を有する、
非天然発生核酸である。望ましい作用には、限定されるわけではないが、標的の
結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を修飾する／改変する方
式での標的との反応、自殺阻害剤におけるような、標的への共有結合、標的およ
び別の分子の間の反応の促進が含まれる。好ましい態様において、作用は、標的
分子への特異的結合親和性を有し、こうした標的分子は、主にワトソン／クリッ
ク塩基対形成または三重らせん結合に依存する機構を通じ、核酸リガンドに結合
するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここで核酸リガンドは、標
的分子に結合される既知の生理学的機能を有する核酸ではない。既定の標的のリ
ガンドである核酸リガンドには、核酸候補混合物より：ａ）候補混合物を標的と
接触させ、ここで候補混合物に比較し、標的に増加した親和性を有する核酸を残
りの候補混合物から分配することが可能である；ｂ）増加した親和性の核酸を残
りの候補混合物から分配し；そしてｃ）増加した親和性の核酸を増幅し、リガン
ド濃縮核酸混合物を生じる、ことを含む方法により、同定される核酸が含まれる
。

【００２８】「候補混合物」は、そこから望ましいリガンドを選択しようとする、異なる配
列の核酸の混合物である。候補混合物の供給源は、天然発生核酸またはその断片
、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸または前述の技術の組み合
わせにより作成された核酸由来であってもよい。好ましい態様において、各核酸
は、増幅過程を促進する、ランダム領域を囲む固定配列を有する。

【００２９】「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、およびそのいかなる化学
修飾物をも意味する。修飾には、限定されるわけではないが、核酸リガンド塩基
または全体としての核酸リガンドに、さらなる電荷、極性、水素結合、静電相互
作用、および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込む他の化学基を提供
するものが含まれる。こうした修飾には、限定されるわけではないが、２’−位
糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−
チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格修飾
、メチル化、異常塩基対の組み合わせ、例えばイソ塩基、イソシチジンおよびイ
ソグアニジン、並びにそれらに匹敵するものが含まれる。修飾はまた、キャップ
化などの３’および５’修飾も含んでもよい。

【００３０】「ＳＥＬＥＸ」方法論は、望ましい方式で標的と相互作用する、例えばタンパ
ク質に結合する、核酸リガンドの選択と、選択された核酸の増幅との組み合わせ
を伴う。選択／増幅工程の反復周期により、非常に多数の核酸を含むプールから
、標的と最も強く相互作用する１つまたは少数の核酸の選択が可能になる。選択
／増幅法の周期は、選択された目的が達成されるまで続ける。本発明において、
ＳＥＬＥＸ方法論を使用し、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対す
る核酸リガンドを得る。

【００３１】ＳＥＬＥＸ方法論は、ＳＥＬＥＸ特許出願に記載される。「標的」は、リガンドが望ましい、目的のいかなる化合物または分子も意味す
る。標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン
、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻
害剤、薬剤、染色剤、栄養物、増殖因子などであってもよく、制限はない。本出
願では、標的はＤＮＡポリメラーゼである。好ましい態様において、ＤＮＡポリ
メラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラ
ーゼである。

【００３２】本明細書において、「不安定リガンド」は、環境パラメーターの調整に基づき
、標的に対する親和性が非常に減少する、ＳＥＬＥＸ法で同定された核酸リガン
ドである。好ましい態様において、環境パラメーターは温度であり、標的に対す
るリガンドの親和性は、上昇した温度で減少する。

【００３３】本明細書において、「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（逆転写
酵素）をテンプレートして用い、ＤＮＡ鎖に対するデオキシリボヌクレオチド単
位の添加により、ＤＮＡ合成を触媒するいかなる酵素も指す。熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼは、４０℃以上の温度で成長する微生物から単離される。

【００３４】「スイッチ」は、いくつかの特定の反応条件に応じ、反応を「オン」または「
オフ」にするよう機能する、いかなる化合物も指す。本発明において、核酸リガ
ンドは、反応温度に応じ、ＰＣＲを「オン」または「オフ」にするよう機能する
。スイッチは、ｐＨ、イオン強度、あるいは特定のイオンの存在または非存在を
含む他の反応条件に基づき、作動してもよい。核酸スイッチは、分配技術の適切
な選択により、ＳＥＬＥＸ法を介し、同定される。望ましいスイッチ特性を有す
る核酸を選択するため、分配パラメーターを決定する。

【００３５】本発明において、３０ランダム位（３０Ｎ）を含む縮重ライブラリーからＴａ
ｑおよびＴｔｈポリメラーゼに特異的な高親和性を持つ核酸リガンドを同定する
ため、ＳＥＬＥＸ実験を行った（実施例１）。本目的のため、ＲＮＡまたはＤＮ
Ａリガンドを同定することが可能であるが、以下の実施例は、ＤＮＡリガンドの
同定を記載する。本ＳＥＬＥＸ実験は、低温（室温）で、ポリメラーゼに結合し
、そして該ポリメラーゼを阻害するが、高温（＞４０℃）でしないオリゴヌクレ
オチドを同定するよう設計した。これは、上昇した温度でＰＣＲにおいて、親和
性選択分子を増幅する標的ポリメラーゼを用いて達成した。こうした条件下では
、高温でＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを阻害するＤＮＡ配列は、選択中、増
幅し、そして増加するとは期待されなかった。本発明は、実施例１に記載される
方法により同定された、表２に示されるＴｔｈポリメラーゼに対する特異的ｓｓ
ＤＮＡリガンド（配列番号７−３５）および表３に示されるＴａｑポリメラーゼ
に対するリガンド（配列番号３６−６６、７６、７７）並びに、表１０および１
１に示される核酸リガンド（配列番号６７−７４）を含む。本発明はさらに、Ｔ
ａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの機能を阻害するＴａｑおよびＴｔｈポリメラー
ゼに対するＤＮＡリガンドを含む。

【００３６】本発明において、３０ランダム位（３０Ｎ）を含む縮重ライブラリーからＴａ
ｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに特異的な高親和性を持つ核酸リガンドを同定す
るため、高温ＳＥＬＥＸ実験もまた行った（実施例１）。本ＳＥＬＥＸ実験は、
およそ５５℃で、ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するオリ
ゴヌクレオチドを同定するよう設計した。本発明は、実施例１に記載される方法
により同定された、表４および５に示されるＴａｑポリメラーゼに対する特異的
ｓｓＤＮＡリガンド（配列番号７８−８８）並びに表６（配列番号８９−１０６
）および図３（配列番号１０７−１１５）に示されるＴＺ０５ポリメラーゼに対
するリガンドを含む。本発明はさらに、ＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼの機
能を阻害するＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドを含む
。

【００３７】本発明に含まれるリガンドの範囲は、低温および高温親和性選択両方を用いた
ＳＥＬＥＸ法にしたがって同定される、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラ
ーゼの修飾および非修飾核酸リガンドすべてに拡張される。より具体的には、本
発明は、表２−６、１０および１１並びに図３３に示されるリガンドに実質的に
相同な核酸配列を含む。実質的に相同により、一次配列相同性の度合いが７０％
を上回る、最も好ましくは８０％を上回ることを意味する。表２−６、１０およ
び１１並びに図３３に示されるＴａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５のリガンドの配列
相同性の再吟味により、ほとんどまたはまったく一次相同性を持たない配列が、
それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合する、実質的に同
じ能力を有する可能性があることが示される。Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポ
リメラーゼに結合する、実質的に同じ能力は、親和性が、本明細書に記載される
リガンドの親和性と、数桁の範囲にあることを意味する。既定の配列――本明細
書に特に記載されるものと実質的に相同なもの――が、それぞれ、Ｔａｑ、Ｔｔ
ｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合する、実質的に同じ能力を有するかどうか
決定するのは、十分に、一般の当業者の技術の範囲内である。

【００３８】本発明はまた、上述のようなリガンドであって、前記リガンドが、限定される
わけではないが、ストッフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）断片、Ｔｂｒポリメラーゼ（
サーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）より単離）
、Ｔｆｌポリメラーゼ（サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ）
より単離）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（モロニーネズミ白血病ウイルスより単
離）を含む、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの機能を阻害するものも含む。

【００３９】本発明はまた、上述のようなリガンドであって、リガンドのｉｎｖｉｖｏま
たはｉｎｖｉｔｒｏ安定性を増加させ、あるいは、リガンドの結合もしくは他
の望ましい特性またはリガンドの搬送を亢進しまたは仲介するために、特定の化
学的修飾が行われるものも含む。こうした修飾の例には、既定の核酸配列の糖お
よび／またはリン酸および／または塩基位での化学的置換が含まれる。例えば、
本明細書に特に援用される、米国特許出願第０８／４３０，７０９号、現米国特
許第５，６６０，９８５号を支持し、放棄された、１９９３年９月８日に提出さ
れ、“ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄ
ＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題さ
れる、米国特許出願第０８／１１７，９９１号を参照されたい。他の修飾が一般
の当業者に知られる。こうした修飾は、ＳＥＬＥＸ後に行ってもよい（先に同定
された非修飾リガンドの修飾）し、またはＳＥＬＥＸ法への取り込みにより、行
ってもよい。

【００４０】本明細書に記載される、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する
核酸リガンドは、ポリメラーゼ連鎖反応の試薬として有用である。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う改善法を含み、ここで増幅しようとす
る核酸配列を含む試料を、１）増幅しようとする配列に隣接する配列と相補的な
プライマー、２）熱安定性ポリメラーゼ、および３）周囲温度でポリメラーゼを
阻害することが可能な核酸リガンドと混合する。核酸リガンド阻害剤は、固体支
持体上に固定してもよい。その後、混合物の熱反復により、ＰＣＲの通常の工程
――融解、アニーリングおよび合成――にしたがう。核酸リガンドの存在は、反
復前または反復中のより低い温度でのいかなる合成も妨げることにより、混合物
がバックグラウンドＤＮＡを増幅することを妨げる。本発明はまた、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、および周囲温度で前記ポリメラーゼを阻害するが、それにも
かかわらずＰＣＲ法の上昇温度周期中の合成が起こることを可能にする核酸リガ
ンドを含む、ＰＣＲキットも含む。本発明はまた、当業者に理解されるように、
熱安定性ポリメラーゼに、周囲温度で前記ポリメラーゼを阻害するが、それにも
かかわらずＰＣＲ法の上昇温度周期中の合成が起こることを可能にする核酸リガ
ンドを添加する工程を含む、改善ＰＣＲ法も含む。

【００４１】Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンド実施例１は、室温でのＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方、並びに上昇温度
でのＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンドの選択に用いる実
験法を記載する。室温で、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行った選択１０周期から
得たｓｓＤＮＡ配列を表２に示す。Ｔｔｈポリメラーゼ選択由来の２９の個々の
クローンを配列決定した（表２には、可変３０ヌクレオチド領域のみを示す）。
一次配列相同性に基づき、リガンドをファミリーに分類した。

【００４２】室温で、Ｔａｑポリメラーゼを用いて行った選択１２周期から得たｓｓＤＮＡ
配列を表３に示す。Ｔａｑポリメラーゼ選択由来の解析した４２の配列のうち、
３３がユニークであった。大文字は、３０ヌクレオチドランダム領域を示し、こ
れに５’−ｔｔｃｔｃｇｇｔｔｇｇｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｃ−および−ｔｃ
ｔｔｇｔｇｔａｔｇａｔｔｃｇｃｔｔｔｔｃｃｃ−３’固定配列領域が隣接し、
全長配列を形成する。いくつかの配列中の小文字は、５’固定配列を示す。同一
配列を含むクローンの数は、括弧内に示した。配列類似性に基づき、配列を３つ
のファミリーに分類した。ファミリーＩおよびＩＩの保存配列モチーフを囲む。
両ファミリーは、異なるコンセンサス配列を含み：ファミリーＩでは５’−Ａ_/G Ａ_/GＴＧＴＧ_/AＣＡＧＴＡＴ_/GＣ−３’、ファミリーＩＩでは、５’−Ａ_/GＣＧ
ＴＴＴＴＧ−３’であった。ファミリーＩでは、コンセンサス配列の５’および
３’領域は、互いに塩基対形成する能力を示した（表３下線）。さらに、これら
の領域に観察される、共変動（ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、ステムループ構造
の存在の可能性を示唆する。リガンドの大部分で、潜在的な塩基対形成領域は、
コンセンサス領域を越え伸長する。対照的に、ファミリーＩＩリガンドは、明ら
かな二次構造モチーフを持たない。

【００４３】ファミリーＩのクローン３０（ＴＱ３０（配列番号５０））およびファミリー
ＩＩのクローン２１（ＴＱ２１（配列番号５９））に関する、室温でのニトロセ
ルロースフィルター結合により得られた代表的結合曲線を、図３に示す。両方の
場合で、リガンドは２つのポリメラーゼに緊密な結合を示し、Ｋ_d値は低いピコ
モル範囲である：ＴＱ３０のＫ_d値は、それぞれ、Ｔａｑポリメラーゼに関し、
４０±１ｐＭ、そしてＴｔｈポリメラーゼに関し、２８±４ｐＭであり、一
方、ＴＱ２１では、それぞれＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼに関
し、３６±４ｐＭおよび１０±２ｐＭである。２つのファミリーのさらにい
くつかのリガンドをスクリーニングした。Ｋ_d値は、Ｔａｑポリメラーゼに関し
、０．０４ないし９ｎＭ、そしてＴｔｈポリメラーゼに関し、０．０１ないし
０．３ｎＭの範囲であった。

【００４４】Ｔａｑポリメラーゼとの個々の配列の結合相互作用を、５５℃で、ニトロセル
ロースフィルター結合により、測定した。いくつかの代表的な結合曲線を図４Ａ
−Ｅに示す。図４Ａ−Ｄは、ファミリーＩに属する４つの配列（表４および５を
参照されたい）の結合曲線を示す。クローン６（配列番号７８）、２２（配列番
号８１）および２８（配列番号８７）は、すべて、そのＫ_d値が低いピコモル範
囲であったことにより特徴付けられるように、５５℃で、Ｔａｑポリメラーゼに
対する高親和性結合を示す。しかし、ファミリーの他のもののなかに同定される
コンセンサス配列を含む、クローン１８（配列番号８３）は、高親和性を示さな
い。クローン１８は、ランダム領域が４ヌクレオチド短く、欠失ヌクレオチドが
、ポリメラーゼとの相互作用に重要な役割を果たしているようであることが示唆
される。クローン１９（配列番号８４）は、ファミリーＩＩに属し、そしてファ
ミリーＩ配列に同定されたコンセンサス配列を持たない。にもかかわらず、該ク
ローンは、大部分のファミリーＩ配列と類似の高親和性結合を示し（図４Ｅ）、
ファミリーＩ配列に見出されたもの以外の、高親和性結合の別の配列の解決があ
ることが示される。

【００４５】図４Ａ−Ｅに示される結合解析を、５５℃で、Ｔｒｉｓ緩衝液中で行った。４
０℃および５５℃で、ＴｒｉｓおよびＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液中で、クローン６、
２２および２８の親和性を比較した（表７）。両緩衝液中で、すべての３つのク
ローンの結合親和性は、４０℃で、５５℃での場合より高かった。４０℃で、両
緩衝液中で、非常によく似たＫ_d値が観察されたが、５５℃で、Ｔｒｉｃｉｎｅ
緩衝液中では、いくぶん減少した親和性が見られた。

【００４６】実施例２に記載されるように、５５℃で、ニトロセルロースフィルター結合に
より、ＴＺ０５ポリメラーゼを用いた個々の配列の結合相互作用を測定した。図
５Ａ−Ｄは、４つの異なる配列、クローン１（ＴＺ１（配列番号９４））、１３
（ＴＺ１３（配列番号８９））、３６（ＴＺ３６（配列番号９９））および２（
ＴＺ２（配列番号９６））（表６）の代表的な結合曲線を示す。個々のクローン
のＫ_d値およびＩＴ₅₀値を表８に要約する。ＩＴ₅₀値は、実施例２に記載される
ような、ヘアピン伸長アッセイを用いて得た。大部分のリガンドは、Ｋ_d値が低
いピコモル範囲であることで特徴付けられるように、５５℃でＴＺ０５ポリメラ
ーゼに対する高親和性結合を示す。ランダム領域に２６ヌクレオチド（期待され
るより４ヌクレオチド短い）を持つＴＺ２配列は、５５℃で該ポリメラーゼと効
率的に相互作用せず（図５Ｄおよび表８）、欠失ヌクレオチドが高親和性結合に
必要であることが示唆された。

【００４７】ポリメラーゼ阻害アッセイ実施例２（図７−１０）は、低温親和性選択を用いて同定された、本発明のリ
ガンドが、４０℃未満の温度で、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方の相互作
用を阻害することが可能であることを立証する、いくつかのポリメラーゼ阻害ア
ッセイを記載する。実施例２（図１１−１５）はまた、高温親和性選択を用いて
同定された、本発明のリガンドが、およそ５５℃の温度で、ＴａｑおよびＴＺ０
５ポリメラーゼ両方の相互作用を阻害することが可能であることを立証する、い
くつかのポリメラーゼ阻害アッセイも記載する。実施例２では、設計ヘアピンＤ
ＮＡ（ＤＮＡ−ＨＰ；５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧＣ
ＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＴ−３’（配列番号６
；図６））をテンプレートとして用い、ＤＮＡ濃縮プールと共に、本発明の方法
にしたがって同定された特定のリガンドが、多様な条件下で、ポリメラーゼ活性
を阻害する能力を測定した。本アッセイは、折り返しＤＮＡヘアピン上の１５ヌ
クレオチドのテンプレート指示埋め込み合成を検出する。

【００４８】低温でＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを認識するよう選択されたリガンド図７Ａは、ＤＮＡリガンド濃縮プールを用い、異なるインキュベーション時間
で、異なる温度で行った阻害アッセイの結果を示す。ＴａｑおよびＴｔｈポリメ
ラーゼ両方の活性は、レーン３（室温反応）をレーン６−９（それぞれ５０、６
０および７０℃での反応）と比較することにより、わかるように、一般的に、低
温では低く、そして温度が増加するにつれ、増加する。濃縮プールは、室温で各
ポリメラーゼの活性を阻害する（レーン４）が、５０℃−７０℃ではしない。レ
ーン１０は、参考として放射標識プールの移動度を示し、ポリメラーゼのテンプ
レートとして作用することが可能な、プール中のＤＮＡ分子のありうる伸長を検
出する。レーン６−９に標識プールに近くまたはそれ以上に移動する放射標識バ
ンドがないことにより、ｓｓＤＮＡプールの重合がないことが示される。

【００４９】熱安定性ポリメラーゼの活性は、周囲温度で低いため、アッセイ中のインキュ
ベーション期間を１６時間に増加させた。図７Ｂおよび７Ｃは、選択プールおよ
びランダムプールの存在下での２つのポリメラーゼとテンプレートの１６時間イ
ンキュベーションの結果を示す。さらに、選択プールに仲介される阻害を、抗Ｔ
ａｑ抗体（Ｔａｑｓｔａｒｔ）のものと比較した。図７Ｂのデータは、Ｔａｑポ
リメラーゼを用いて得、そして図７Ｃのデータは、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて
得た。研究した３つの温度、室温、３０℃および３７℃に渡り、ランダムプール
は、２つのポリメラーゼの阻害を示さず（レーン１−３を４−６と比較されたい
）、濃縮プールにより引き起こされる阻害は、配列特異的であることが示唆され
た。Ｔａｑポリメラーゼに関し選択されたプールは、室温（レーン７）でのみ、
１６時間インキュベーションに渡り、ポリメラーゼ活性を完全に阻害したが、３
０℃およびそれ以上（レーン８および９）では阻害しなかった。Ｔｔｈポリメラ
ーゼに関して選択されたプールは、Ｔａｑポリメラーゼに結合を示したが、Ｔａ
ｑポリメラーゼを阻害することはできなかった（レーン１０−１２）。期待され
るように、Ｔａｑｓｔａｒｔ抗体は、調べた３つの温度すべてでポリメラーゼ活
性を阻害した（レーン１２−１５）。しかし、Ｔｔｈポリメラーゼに関し選択さ
れたｓｓＤＮＡプールは、１６時間インキュベーションに渡り、酵素活性を阻害
しなかった（レーン１−３を４−６と比較されたい）。対照的に、同一プールは
、短期間のインキュベーションに渡り、酵素活性を阻害することが可能であった
。Ｔａｑポリメラーゼに関し選択されたプールは、室温での１６時間インキュベ
ーションに渡り、Ｔｔｈ活性を部分的に（＞５０％）阻害することが可能であっ
た（レーン１０）。Ｔａｑｓｔａｒｔ抗体は、Ｔｔｈの活性にはいかなる影響も
持たなかった（レーン１３−１５）。

【００５０】Ｔａｑｓｔａｒｔ抗体の使用は、ＰＣＲ反応中１回に限定される。高温で変性
されると、天然型に再生することはできない。しかし、単純な二次構造を持つ核
酸リガンドは、熱周期を経た後、天然型に再生する可能性を有する。Ｔａｑポリ
メラーゼに関し選択されたＤＮＡプールの阻害能が、加熱後、回復するかどうか
調べるため、実験を行った（図７Ｄおよび７Ｅ）。図７Ｄは、熱反復にさらされ
ていない選択ＤＮＡプールによる、２０℃−４０℃のＴａｑ活性の阻害を示す。
４５分間のインキュベーションに渡り、プールは、２０℃および２５℃で、Ｔａ
ｑ活性を完全に阻害する。この比較的短いインキュベーション期間内では、プー
ルは、３０℃で＞７０％の阻害を示した。テンプレートＤＮＡの非存在下で、Ｔ
ａｑポリメラーゼを用いた２つのＰＣＲ周期にさらされたＤＮＡプールで、非常
に類似の阻害プロフィールを見ることが可能である。この結果は、ｓｓＤＮＡに
仲介される阻害は、可逆的に温度感受性であり、そしてＰＣＲの後であっても回
復することが可能であることを立証する。

【００５１】図８は、配列、ＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）（
表３）が、ＴａｑおよびＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに対し阻害性である温度範
囲を示す。本図に示されるヘアピン伸長アッセイは、２５０ｎＭの各リガンド
を用い、１時間、示される温度で行った（レーン１−１０）。予期されるように
、ｓｓＤＮＡリガンドは、＞４０℃の温度でどちらのＤＮＡポリメラーゼも阻害
しなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。リガンドＴＱ３０に関し、１時間アッセイ中
に産物の５０％が生成される温度（ＩＴ₅₀値）は、ＴａｑポリメラーゼおよびＴ
ｔｈポリメラーゼで、それぞれ４１℃および２９℃である。リガンドＴＱ２１に
関するそれぞれの値は３７℃および２９℃である（図８Ｃおよび８Ｄ）。これら
のポリメラーゼに対する２つのリガンドの結合親和性は、これらが高温で減少し
た阻害活性を持つのと一致して、より高い温度で減少する（データ未提示）。ヘ
アピン伸長アッセイでは、投入ヘアピンテンプレートのおよそ２％は、おそらく
正しくないフォールディングのため、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されなかっ
た。

【００５２】図９は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）によるＴａｑポリメラーゼの阻害
は熱的に可逆的であり、そしてＰＣＲ後でさえ回復することが可能であることを
例示する。本図に示されるヘアピン伸長アッセイは、リガンドＴＱ３０の非存在
下（レーン１−５）および存在下（５０ｎＭ）（レーン６−１０）で、５Ｕ
のＴａｑポリメラーゼを用い、１００μｌ反応体積中で、１０分間、示される温
度で行った。図９Ａでは、リガンドＴＱ３０は、熱反復にさらされていない。図
９Ｂでは、ＴＱ３０は、Ｔａｑポリメラーゼと共に、２５周期の熱反復（９０℃
３０秒；５０℃１分；７２℃３０秒）にさらされ、そして放射標識ヘアピンテン
プレート（２５０ｎＭ）を添加する前に、室温に冷却した。図９でわかるよう
に、どちらの場合でも、リガンドＴＱ３０は４０℃未満の温度でポリメラーゼを
阻害した。さらに、熱反復を経た試料は、熱反復にさらされなかった試料と同一
のまたはそれより有効な阻害を示した。

【００５３】図１０は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの阻害に対するリガンド濃度の影
響を立証する。ＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）に関
し、ヘアピンアッセイで産物の５０％を産生するのに必要な阻害剤の濃度（ＩＣ ₅₀ 値）は、１６時間インキュベーション期間に渡る室温（およそ２２℃）でのＴ
ａｑポリメラーゼの阻害に関し、それぞれ、６．５ｎＭおよび１０ｎＭであ
った（図１０Ａ）。アッセイに用いたＴａｑポリメラーゼの濃度は、１２．５
ｎＭであるため、ＴＱ３０（配列番号５０）による酵素阻害は、化学量論的結合
の結果である可能性がある。１時間に渡り３０℃でアッセイした場合、ＩＣ₅₀値
は、およそ３倍増加した（ＴＱ３０では２２ｎＭ、そしてＴＱ２１では６７
ｎＭ；データ未提示）。Ｔｔｈポリメラーゼの阻害に関するＴＱ３０およびＴＱ
２１のＩＣ₅₀値は、室温で、それぞれ、６０および３６ｎＭであった（図１０
Ｂ）。総合すると、これらのオリゴヌクレオチドは、Ｔｔｈポリメラーゼに対す
るより、選択に用いた酵素、Ｔａｑポリメラーゼに対し、より有効な阻害剤であ
る。

【００５４】テンプレート伸長の観察された阻害が、ポリメラーゼに対する選択リガンドの
優先的な結合およびそれに続く基質としての利用のためであるという可能性を除
外するため、５’末端放射標識ＴＱ２１およびＴＱ３０リガンドを、２つのＤＮ
Ａポリメラーゼと１６時間インキュベーションした（実施例２、データ未提示）
。リガンドＴＱ３０は、どちらの酵素とのインキュベーションに際しても、伸長
産物を示さず、ポリメラーゼ活性の基質でないことが示された。しかし、ＴＱ２
１は、より高い分子量のバンドを生じ、どちらのポリメラーゼとのインキュベー
ションに際しても、配列伸長が示された。ＴＱ２１の観察された部分的伸長は、
標準的条件を用い、エチレングリコールリンカーで、３’末端をキャップ化する
ことにより、３’ＯＨ基の利用可能性をブロッキングすることにより、有効に除
去された。３’キャップ化オリゴヌクレオチド構築物は、未キャップ化分子と同
等の有効な阻害剤である（データ未提示）。これらの結果は、ｓｓＤＮＡリガン
ドがポリメラーゼ活性の劣った基質であり、そして２種類のリガンドは、ＤＮＡ
ポリメラーゼ上に異なって配置される可能性があることを示す：ＴＱ２１は、３
’末端が伸長される（劣ってではあるが）ことが可能であるようにポリメラーゼ
に結合し、一方ＴＱ３０は、結合に際し、伸長不可能である。

【００５５】高温でＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼを認識するよう選択されたリガンド図１１は、高温での親和性選択後に得られた４つのリガンド：クローン６（配
列番号７８）、１５（配列番号８６）、１０（配列番号８５）および１８（配列
番号８３）の存在下で、温度範囲に渡り、Ｔａｑポリメラーゼに触媒される、末
端標識ヘアピン基質の伸長を示す。４つのリガンドのすべてが、Ｔａｑポリメラ
ーゼを同じ度合いで阻害するのではなかった。Ｔａｑポリメラーゼに高親和性結
合を示さなかったクローン１８は、４０℃でさえも、有意な酵素阻害を示さなか
った。これらのリガンドによるポリメラーゼ阻害の強度は、その親和性の順にし
たがう；クローン６＞１５＞１０＞＞＞＞１８。図１２ＡおよびＢは、温度の関
数として、これらのリガンドの存在下で形成された産物のパーセントを示す。こ
れらのリガンドのＩＴ₅₀値は、４０℃−５６℃の間であったが、リガンド１８は
＜４０℃の値を示した。この結果は、減少した親和性と一致する。高親和性結合
にしたがい、ファミリーＩＩ配列、クローン１９（配列番号８４）もまた、高い
ＩＴ₅₀値を示した。表９は、クローン６（ＴＱＨ６）および２８（ＴＱＨ２８）
のＫ_d値を要約する。表９中のデータは、明らかに、高温での親和性選択後に得
られたリガンドは、期待される特性、すなわち高温での結合および阻害を持つこ
とを立証する。この結果は、望ましい特性を持つリガンドを得るのに、適切な選
択条件を定義する重要性をさらに裏付ける。

【００５６】図１３Ａ−Ｆは、温度範囲にわたる高温での親和性選択後に得られた多様なリ
ガンドの存在下で、ＴＺ０５ポリメラーゼに触媒される末端標識基質の伸長を示
す。ＴＺ０５ポリメラーゼとリガンドの観察された高親和性相互作用は、これら
が酵素のポリメラーゼ活性を阻害する能力を反映する。高親和性でポリメラーゼ
に結合しなかったクローン２（ＴＺ２（配列番号９６））を除き、他のリガンド
は、４０−５９℃の間のＩＴ₅₀値を示した（表８を参照されたい）。より短いラ
ンダム領域を持つＴＺ２（期待されるより４ヌクレオチド短い）は、３５℃でさ
え、ポリメラーゼを有効に阻害しなかった。ファミリーＩに属するリガンドＴＺ
１３（配列番号８９）およびＴＺ２６（配列番号９３）は、２つの極端なＩＴ₅₀ 値（５８．５℃対４１℃）を示した。配列レベルでは、これらの２つの配列は非
常に類似であるが、特により高い温度では、その阻害強度はかなり異なる。ＴＺ
１３およびＴＺ２６の間には、高い度合いの配列類似性があるが、２つの配列の
重大でない相違が、ポリメラーゼ阻害能の相違の原因となっている可能性がある
。

【００５７】図１４は、Ｔａｑポリメラーゼの阻害に関し、高温親和性選択を用いて得られ
た３つのリガンドの濃度の影響を示す。３つのリガンドのＩＣ₅₀値は、およそ２
０ｎＭである。

【００５８】図１５は、Ｔｒｉｓ緩衝液（図１５Ａ）およびＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液（図１５
Ｂ）中のリガンド６（配列番号７８）、２２（配列番号８１）および２８（配列
番号８７）に関し、温度の関数としてのＩＣ₅₀値の変化を例示する。Ｔｒｉｓ緩
衝液中では、３つのリガンドすべてのＩＣ₅₀値は、４０℃ないし５０℃の温度範
囲内では、非常に弾力的である（図１５Ａ）。しかし、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中
では、ＩＣ₅₀値は、４５°を超える温度で感受性である（図１５Ｂ）。これらの
アッセイでは、Ｔａｑポリメラーゼの濃度は２．５ｎＭであり、そしてＩＣ₅₀ 値は、３０℃ないし４５°で２０−４０ｎＭのままである。したがって、この
温度範囲内では、完全に酵素を阻害するのに、酵素濃度に対し、およそ２０倍過
剰のリガンド濃度で十分である。

【００５９】親和性捕捉実験ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼと核酸リガンドの相互作用の熱可逆性により
、１つの増幅後、続く増幅に再使用するためにポリメラーゼを捕捉する、こうし
たリガンドで生成された親和性マトリックスの使用の可能性が生じる。親和性捕
捉の可能性を調べるため、実施例１に記載されるように、リガンドＴＱ３０（配
列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）を含むアフィニティービーズを調
製した。ヘパリンを含むＰＣＲ緩衝液中で、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを
用い、ヘアピンテンプレートを伸長した後、実施例２に記載されるように、反応
物を、アフィニティービーズまたはコントロールビーズと混合し、ビーズを完全
に洗浄し、そしてポリメラーゼ以外、すべての試薬を含む反応混合物の新鮮なア
リコットに曝露した。７０℃でさらに５分間インキュベーションし、新たに添加
されたテンプレート上の伸長を可能にした後、変性条件下で、８％ポリアクリル
アミドゲル上で、反応混合物を解析した。コントロールビーズを含んだ反応混合
物では、増幅の第二の周期中、テンプレートの伸長はない。対照的に、アフィニ
ティービーズを含んだ反応混合物では、増幅の第一および第二の周期両方で、伸
長産物に相違はなく、両リガンド、ＴＱ３０およびＴＱ２１を含むアフィニティ
ービーズがＰＣＲの最初の周期後、２つのポリメラーゼの捕捉に成功したことが
示された。

【００６０】ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対する核酸リガンドの影響ポリヌクレオチド合成を触媒する能力に加え、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５
ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も持つ（Ｊｏｙｃｅおよび
Ｓｔｅｉｔｚ（１９８７）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１２：
２８８；Ｌｏｎｇｌｅｙら（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ
．１８：７３１７）。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の好ましい基質は、
置換ｓｓＤＮＡ（またはフォーク様構造）であり、切断は二重鎖／ｓｓＤＮＡ結
合部の近傍で起こる。ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対す
るオリゴヌクレオチド阻害剤の影響を研究するため、ヘアピン中に置換ｓｓＤＮ
Ａを含むＤＮＡ基質（Ｅｘｏ−Ｓｕｂ）を設計した（実施例３、図１６）。５’
および３’末端両方でＥｘｏ−Ｓｕｂ基質を放射標識し、エキソヌクレアーゼ活
性により生じる２つのＤＮＡ断片の検出を可能にする。

【００６１】ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対するリガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）の影響エキソヌクレアーゼ活性から生じる２つの標識ＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオ
チド阻害剤の存在下および非存在下両方で見られた（データ未提示）が、オリゴ
ヌクレオチド阻害剤の存在下で生成される切断産物の量は、阻害剤の非存在下で
生じるものより、いくぶん少なく、オリゴヌクレオチド阻害剤が、酵素のエキソ
ヌクレアーゼ活性に対し、いくらか阻害効果を発揮することが示された。これら
のオリゴヌクレオチドは、２５０ｎＭで、２つの酵素のポリメラーゼ活性を完
全に阻害したため、エキソヌクレアーゼ活性に対する影響は、不十分であるとみ
なされる。

【００６２】ＴＺ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対するリガンドＴＺ１３（配列番号８９）、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＴＺ１３（５１ヌクレオチド）およびＴＺ３６（配列番号９９）の影響図１７は、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する３つのリガンド：全長ＴＺ１３、一
部切除ＴＺ１３（５１ヌクレオチド）（以下を参照されたい）および全長ＴＺ３
６を用いて行ったアッセイの結果を示す。レーンＣは、リガンドの非存在下でＴ
Ｚ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ切断により生じる切断産物（７８ヌク
レオチドおよび２４ヌクレオチド）を示す。レーン１−４、５−８および９−１
２は、それぞれ、増加する濃度のＴＺ１３、ＴＺ１３−ＴｒｎｃおよびＴＺ３６
リガンドの存在下でのＥｘｏ−Ｓｕｂ切断を示す。酵素のエキソヌクレアーゼ活
性による基質の切断は、３つのリガンドすべてで阻害された。エキソヌクレアー
ゼ活性の阻害は、２μＭのリガンド濃度でさえ、１００％ではなかった。２５０
ｎＭのリガンド濃度で、ポリメラーゼ活性が完全に阻害されたことは注目に値
する。したがって、ポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の完全な阻
害に必要なリガンド濃度に基づき、これらのリガンドは、ポリメラーゼ活性に関
してそうであるようには、エキソヌクレアーゼ活性の阻害剤として有効でない。

【００６３】リガンドに対するＴａｑポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼの影響理想的には、核酸リガンドは、酵素のポリメラーゼ活性の阻害剤としてのみ機
能し、それによりＰＣＲにおける、望ましくない非特異的増幅を調節するのに適
した試薬となるであろう。しかし、そのフォールディングした構造の性質に応じ
、リガンドはそれ自体、ポリメラーゼ活性または５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性どちらか、あるいは両方の基質となる可能性がある。リガンドに対するＴａ
ｑポリメラーゼの影響を研究するため、５’末端標識リガンド６（ＴＱＨ６（配
列番号７８））、２２（ＴＱＨ２２（配列番号８１））および２８（ＴＱＨ２８
（配列番号８７））を、ｄＮＴＰの存在下および非存在下でＴａｑポリメラーゼ
とインキュベーションし、そして変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、反応産物を解析した。図１８は、これらのリガンドの各々に対するＴａ
ｑポリメラーゼの影響を例示する。各リガンドに関し、レーン１および４は、イ
ンキュベーションが緩衝液中でのみ行われたコントロールである。レーン２およ
び５は、Ｔａｑポリメラーゼとのインキュベーション後の結果を示し、そしてレ
ーン３および６は、Ｔａｑポリメラーゼおよび４つのｄＮＴＰすべてとのインキ
ュベーション後の結果を示す。図１８に見られるように、Ｔａｑポリメラーゼと
インキュベーションした際、レーン２、３、５および６では、３つのリガンドす
べてが、速く動く小さいＤＮＡ断片の出現により示されるように、エキソヌクレ
アーゼ活性の基質として作用した。実際観察されるのは、Ｈｏｌｌａｎｄら（１
９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８８：７２７
６−７２８０に記載されている、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレ
アーゼ活性の構造特異的エンドヌクレアーゼ活性である。エキソヌクレアーゼ活
性の基質であるのに加え、各リガンドはまた、ｄＮＴＰの存在下でインキュベー
ションした際、ポリメラーゼにより伸長された（レーン３）。これは、リガンド
６で明らかに顕著であり、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰとのインキュベーション
に際し、遅く動くバンドが生成された。レーン４−６で見られるように、ポリメ
ラーゼ伸長は、各リガンドの３’ＯＨ基の利用可能性をブロッキングすることに
より、完全に停止した。本研究では、リガンドの化学合成中、３’末端をリン酸
基でキャップ化した。リン酸基に加え、他の分子実体、例えば、エチレングリコ
ールリンカーおよび３’−３’ｄＴ結合もまた、リガンドの３’末端を有効にキ
ャップ化するのに用いることが可能である。リガンドの３’末端のキャップ化は
、リガンドがＰＣＲにおいて非特異的プライマーとして作用する、潜在的な問題
を除去する。リガンドの３’末端のキャップ化は、リガンドの機能に影響を与え
なかった（ＤａｎｇおよびＪａｙａｓｅｎａ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２６４：２６８）。

【００６４】リガンドに対するＴＺ０５ポリメラーゼの影響を研究するため、ＴＺ０５に対
する５’末端標識リガンドを、ｄＮＴＰの存在下でＴＺ０５ポリメラーゼとイン
キュベーションした。大部分のリガンドは、ｄＮＴＰおよびＴＺ０５ポリメラー
ゼとインキュベーションした際、伸長産物を示し、リガンドがポリメラーゼ活性
の基質として利用されることが示された。さらに、試験したすべてのリガンド配
列は、ＴＺ０５ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、２つ
の断片に切断された（データ未提示）。切断の正確な部位はマッピングされなか
ったが、５’固定領域のどこかであるようであった。上に論じられるように、リ
ガンドに対するポリメラーゼ伸長は、リガンドの３’ヒドロキシル基をブロッキ
ングすることにより、有効に調節することが可能である。しかし、ポリメラーゼ
のエキソヌクレアーゼ活性によるリガンドの切断は、ｉｎｓｉｔｕで、新規３
’末端を生成し、２つの結果を導く可能性があるであろう。第一に、切断は、リ
ガンドの機能を潜在的に不活性化する可能性があり、そして第二に、新規未キャ
ップ化３’末端がＰＣＲにおいて非特異的プライマーとして作用する可能性があ
る。これらの観察は、以下に記載される一部切除リガンドの同定を導いた。

【００６５】ＴＱ２１（配列番号５９）およびＴＱ３０（配列番号５０）による多様なＤＮＡポリメラーゼの阻害いくつかの他の商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼ並びに阻害剤としてリ
ガンドＴＱ２１（配列番号５９）およびＴＱ３０（配列番号５０）を用いた阻害
アッセイが、実施例４に記載される。４つの熱安定性酵素（サーマス・ブロキア
ヌス由来のＴｂｒポリメラーゼ、サーマス・フラバス由来のＴｆｌポリメラーゼ
、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ）由来の
Ｔｍａポリメラーゼ、およびサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃ
ｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＴｌｉポリメラーゼ）；３つの中温性酵素
（大腸菌ＤＮＡＰ１のクレノウ断片（ＫＦ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよび
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ）；並びに４つの逆転写酵素（ＲＴ）（ＨＩＶ−Ｉ
ＲＴ、ＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）ＲＴおよびＭ−ＭＬＶ（モロニーネズ
ミ白血病ウイルス）ＲＴおよびＲＮアーゼＨ活性を欠くその突然変異体（Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ））を調べた。

【００６６】調べた６つの熱安定性ポリメラーゼ（ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを含む
）のうち、サーマス種由来の４つのポリメラーゼ（Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｔｂｒおよ
びＴｌｆ）は、選択されたオリゴヌクレオチドの両方で阻害され、これらの酵素
が高い度合いの類似性を共有することが示唆された。上述のように、Ｔｔｈポリ
メラーゼおよびＴａｑポリメラーゼは、アミノ酸配列レベルで、９３％類似であ
り、そして８８％同一であると報告されている（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ニューヨー
ク）中）。Ｔｆｌポリメラーゼは、アミノ酸レベルで、９３％類似であり、そし
て８６％同一であると報告されている（Ｄ．Ｇｅｌｆａｎｄ、個人的通信）。
一方、サーモトガ・マリティマ由来のＴｍａポリメラーゼおよびサーモコッカス
・リトラリス由来のＴｌｉポリメラーゼは、どちらのリガンドによっても阻害さ
れなかった。Ｔｌｉポリメラーゼは、真正細菌酵素と、ほとんど配列相同性を共
有しない（ＩｔｏおよびＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：４０４５）。Ｔｍａポリメラーゼは、アミノ酸レ
ベルで、Ｔａｑポリメラーゼに、６１％類似であり、そして４４％同一であると
報告されている（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ニューヨーク）中）が、オリゴヌクレオチ
ドリガンドは、Ｔｍａポリメラーゼを阻害しない。

【００６７】試験した４つの逆転写酵素のうち、ＨＩＶ−ＩおよびＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症
ウイルス）由来のＲＴは阻害されなかった。一方、Ｍ−ＭＬＶ（モロニーネズミ
白血病ウイルス）およびＲＮアーゼＨ活性を欠くその突然変異体（ＳｕｐｅｒＳ
ｃｒｉｐｔＩＩ）は、２つのオリゴヌクレオチドリガンドにより、阻害された。

【００６８】中温性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌ＤＮＡＰ１のクレノウ断片（ＫＦ）
、Ｔ４ＤＮＡＰおよびＴ７ＤＮＡＰは、Ｔａｑポリメラーゼのポリメラーゼ
ドメインおよびＫＦの類似性にもかかわらず、０．５μＭ濃度で、どちらのリガ
ンドにも阻害されなかった（Ｋｉｍら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ
）３７６：６１２；Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６４：６４２７）。したがって、オリゴヌクレオチド阻害剤は、一般的に
かなり特異的であるようである。これらの結果は、他の逆転写酵素に関するｉｎ
ｖｉｔｒｏ選択により同定される核酸リガンドの振る舞いに似ている（Ｔｕｅ
ｒｋおよびＭａｃＤｏｕｇａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６９８８；ＣｈｅｎおよびＧｏｌｄ（１
９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：８７４６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら
（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：９５９９）。

【００６９】ＴＱＨ６（配列番号７８）およびＴＱＨ２２（配列番号８１）による多様なＤＮＡポリメラーゼの阻害ＴＱＨ６およびＴＱＨ２２の全長および一部切除型両方を研究し、Ｔａｑポリ
メラーゼのストッフェル断片、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＴＺ０５ポリメラーゼを阻
害する能力を測定した。両リガンドは、４８℃のＩＴ₅₀値で、ストッフェル断片
を阻害した（図１９ＡおよびＢ）。どちらの場合でも、全長および一部切除リガ
ンドは、同一のＩＴ₅₀値を示した。この結果は、一部切除リガンドが、全長分子
より低いＩＴ₅₀値を示した、これらの２つのリガンドによるＴａｑポリメラーゼ
の阻害とはまったく異なる。

【００７０】Ｔｔｈポリメラーゼに対する２つのリガンドの全長および一部切除型の阻害特
性は、Ｔａｑポリメラーゼに対するものと非常に類似である。どちらの場合でも
、一部切除リガンドは、より低いＩＴ₅₀値（６℃または１０℃）を示した（図２
０ＡおよびＢ）。

【００７１】Ｍｇ²⁺またはＭｎ²⁺イオンどちらかの存在下で、２つのリガンドによるＴＺ０
５ポリメラーゼの阻害を調べた。どちらかの金属イオンの存在下で、非常に類似
の結果が観察された。図２１ＡおよびＢは、Ｍｇ²⁺イオンの存在下でのＴＺ０５
ポリメラーゼの阻害を示す。

【００７２】ＴＺ１（配列番号９４）、ＴＺ８（配列番号１００）、ＴＺ１３（配列番号８９）およびＴＺ５４（配列番号１０３）による、多様なＤＮＡポリメラーゼの阻害ＴＺ０５ポリメラーゼの親和性選択から得たいくつかのリガンドを用い、これ
らのリガンドによる、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼおよびストッフ
ェル断片の阻害を調べた。異なるファミリー由来の試験したいくつかの全長リガ
ンドのうち、４つの連続するチミンを含むコンセンサスを持つリガンド、すなわ
ちファミリーＩＩＩに分類される配列（ＴＺ８（配列番号１００）およびＴＺ５
４（配列番号１０３））は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを両方、有効に阻
害した（データ未提示）。この結果は、Ｔａｑポリメラーゼに対する親和性選択
により同定されたファミリーＩＩリガンド（表４）もまた、Ｔｔｈポリメラーゼ
と共にサーマス・ブロキアヌスおよびサーマス・フラバス由来のポリメラーゼを
阻害したという事実に基づくと、それほど驚くべきことではない。４つのチミン
を含むコンセンサスモチーフを含むリガンド、ＴＺ５４により観察されるが、７
つの隣接するグアニンを含むリガンド、ＴＺ１３（配列番号８９）により観察さ
れない阻害は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに対する結合親和性を反映する
（図２２ＡおよびＢ）。図２２に示されるように、ＴＺ１３は、どちらのポリメ
ラーゼにも高い親和性では結合しないが、ＴＺ５４は結合する。一方、７つの隣
接するグアニンを含む、ＴＺ１およびＴＺ１３は、３０℃以上で、これらの２つ
のポリメラーゼの有効な阻害を示さない（図２３ＡおよびＢ）。リガンドＴＺ３
６（配列番号９９）は、７つの隣接するグアノシンまたは隣接する４つのチミン
のいずれも持たず、そしてＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方を阻害する点で
ユニークである。したがって、７つの隣接するグアノシンを含むリガンドは、親
和性選択に用いられたポリメラーゼである、ＴＺ０５ポリメラーゼに特異的であ
る可能性がある。

【００７３】試験した３つのリガンド（ＴＺ１、ＴＺ１３およびＴＺ３６）のいずれも、ス
トッフェル断片を阻害しなかった（図２３Ｃ）。この結果は、Ｔａｑポリメラー
ゼを有効に阻害するＴＺ３６に関しては、驚くべきことである。これは、Ｔａｑ
ポリメラーゼ上のＴＺ３６の結合部位が、ストッフェル断片では欠失しているか
または再構成されていることを示唆する。

【００７４】低コピー数標的の増幅実施例５は、標準的ＰＣＲ技術、「ホットスタート」ＰＣＲ、および「ホット
スタート」条件の非存在下で、ＰＣＲにより低コピー数標的の検出を促進する、
本発明の方法により同定されるリガンドを用いたＰＣＲを比較する、いくつかの
ＰＣＲ増幅を記載する。Ｒｅｓｐｅｓｓら（１９９４）により、ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，９４：１１０に記載されるよ
うに、ＨＩＶ−２ＬＴＲ（末端反復配列）由来の２０３塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ
断片を検出するよう設計されたプライマー−テンプレート系を利用した。

【００７５】図２４は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９
）を用いた結果を例示する。ＰＣＲ増幅は、０、１０および５０コピーのＨＩＶ
−２ＬＴＲ標的を用いて行った。通常ＰＣＲ条件下で、正しい標的バンドの同
定は、いくつかの非特異的バンドの存在により、危うくされた（図２４Ａ、レー
ン１−３）。「ホットスタート」条件下で行った増幅は、非特異的バンドを除去
した（図２４Ａ、レーン４−６）。ＴＱ２１およびＴＱ３０と同一の５’および
３’固定配列を含む、非特異的７８ヌクレオチドｓｓＤＮＡ配列の存在下で行っ
た増幅の結果は、「ホットスタート」条件を用いないＰＣＲにより得られたもの
と同様であった。しかし、標準的条件下（「ホットスタート」なし）で行い、Ｔ
Ｑ２１（図２４Ｂ、レーン４−６）またはＴＱ３０（図２４Ｂ、レーン７−９）
いずれかを添加したものは、標的特異的バンドの収率に影響を与えず、非特異的
バンドを除去した。特に重要なのは、標的コピー数が低い場合、シグナル検出が
非常に効果的であったという観察であった（図２４Ｂ、レーン２をレーン５およ
び８と比較されたい）。オリゴヌクレオチド阻害剤の効果は、低コピー数のＨＩ
Ｖ−２ＬＴＲを検出する際、Ｔａｑポリメラーゼの代わりにＴｔｈポリメラー
ゼを用いた場合、同様であった（データ未提示）。ＰＣＲにおいてオリゴヌクレ
オチド阻害剤を用いて得られた標的特異的バンドの収率の亢進は、反応の感受性
を増加させ、およそ３コピーしか存在しない標的の検出を促進した（図２４Ｃ）
。

【００７６】図２４に記載される実験に用いたオリゴヌクレオチド阻害剤は、３’末端がキ
ャップ化されておらず、非特異的に増幅を開始することを可能にし、そしてさら
にＰＣＲの結果を複雑にする可能性がある。しかし、偶発性の（ａｄｖｅｎｔｉ
ｔｉｏｕｓ）バンドは検出されず、本系では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’
キャップ化は、非特異的バンドの生成を除去するのに必要でないことが示唆され
た。

【００７７】図２５は、３’キャップ化一部切除リガンド：ＴＱＨ６、ＴＱＨ２２およびＴ
ＱＨ２８を用いた結果を例示する。増幅は、１μｇのヒト胎盤ＤＮＡと混合した
１０コピーのＨＩＶ−２ＬＴＲ標的を含みまたは含まず行った。図２５に示さ
れるすべての増幅は、ホットスタート条件の非存在下で行った。レーン１−４は
、リガンドを含まないコントロール条件の結果を示す。これらの反応において、
非特異的増幅のため、多数のＤＮＡバンドが生成された。これらの非特異的増幅
産物は、テンプレートＤＮＡを含む反応および含まない反応に存在する。リガン
ドを反応混合物に添加した場合、結果は明らかに異なる（レーン５−１０）。す
べての３つのリガンドの場合で、標的を含まない反応では、増幅産物は１つも存
在しなかった（レーン５、７および９）。標的を含むＰＣＲ反応では、反応混合
物にリガンドＴＱＨ６を添加した場合（レーン６）、特異的単位増幅物（ａｍｐ
ｌｉｃｏｎ）のみが増幅され、そしてリガンドＴＱＨ２２およびＴＱＨ２８を添
加した場合、おそらく標的へのプライマーの非特異的アニーリングのため、さら
なる低分子量バンドが存在した（レーン８および１０）。これらの結果は、これ
らの一部切除リガンドが、ｉｎｓｉｔｕホットスタート条件を生成することに
より、非特異的増幅を調節するのに有効であることを示す。

【００７８】ＴＺ０５ポリメラーゼに対するリガンドが、低コピー数標的配列を増幅するＰ
ＣＲの結果を改善する能力を試験するため、ヒトゲノムＤＮＡからＫ−ｒａｓ遺
伝子を増幅するよう設計されたＰＣＲ系を用いた（Ｎｉｌｓｓｏｎら（１９９７
）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：７４４−７５１）。ＴＺ１（ＴＺ１−Ｔ
ｒ（配列番号１０７））、ＴＺ１３（ＴＺ１３−Ｔｒ（配列番号１０８））およ
びＴＺ３６（配列番号１０９）の５１ヌクレオチド一部切除リガンド（図３３）
を試験した。これらのリガンドの３’ＯＨ基を３’−３’ｄＴ残基でキャップ化
し、リガンドのポリメラーゼ伸長を妨げた。さらに、これらのリガンドは、ＴＺ
０５ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ切断を遮断するため、５’末端に８
つのホスホロチオエート結合を含んだ。増幅反応において、テンプレートヒトゲ
ノムＤＮＡの添加前に、ポリメラーゼおよびプライマーを含む、完全反応緩衝液
中にリガンドが存在した。ＰＣＲ後、３％アガロースゲル上で、増幅産物を解析
した。濃度範囲にわたる、一部切除ＴＺ１リガンドの存在下で行ったＰＣＲの結
果を図２６に示す。リガンドの非存在下または低濃度のリガンドの存在下では、
Ｋ−ｒａｓ遺伝子は増幅されなかった（レーン２−６）。リガンド濃度が増加す
るにつれ、バックグラウンドの減少を伴い、特異的単位増幅物の生成が見られる
（レーン７−８）。リガンド濃度のさらなる増加に際し、ＰＣＲは完全に阻害さ
れた（レーン９）。結果は、２０−４０ｎＭの間である、リガンドの最適濃度
が、望ましい増幅に必要であることを示す。他の２つのリガンドを用いた結果は
、図２６に示される結果に非常に似ていた。

【００７９】ＴＺ１およびＴＺ１３の３０ヌクレオチド一部切除体を用い、同様の結果が得
られた（図２７ＡおよびＢ）。これらの一部切除体は、５’末端にホスホロチオ
エート結合を持たないが、３’末端でキャップ化された。３０ヌクレオチド一部
切除体では、望ましい結果を達成するために必要な濃度は、５１ヌクレオチド一
部切除体で必要とされたもののおよそ２倍であった。３０ヌクレオチド一部切除
体よりさらに高い濃度（６６０ｎＭ）のＴＺ１３の２６ヌクレオチド一部切除
体で同様の結果が観察された。標的特異的単位複製物を産生するのに必要とされ
る一部切除リガンドの有効濃度は、リガンドの長さが減少するにつれ、減少する
。この結果は、そのＩＴ₅₀値と相関し、ＩＴ₅₀値もまた、リガンドの長さの減少
と共に減少する。

【００８０】図２６および２７に見られる増幅は、ＴＺ０５ポリメラーゼを用いて行った。
ＴＺ０５ポリメラーゼを認識するよう選択されたいくつかのリガンドはまた、Ｔ
ｔｈポリメラーゼも阻害した。Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行う、同一のＰＣＲ
系で、リガンドＴＺ３６（５１ヌクレオチド一部切除体）を試験した。図２８に
示されるように、該リガンドはまた、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて特異的単位増
幅物を生成するのにも、非常に有効である。

【００８１】阻害活性を持つ一部切除リガンドの同定典型的には、全長配列中のすべてのヌクレオチドが、その機能に必要であるの
ではない。したがって、全配列の機能を保持する一部切除ＤＮＡ配列の同定が望
ましい。さらに、上に論じられるように、全長配列は、ポリメラーゼに関連する
構造特異的エンドヌクレアーゼ活性による、部位特異的切断を経る。これは、伸
長可能３’末端の生成または切断の際のリガンド機能のありうる不活性化のどち
らか、あるいは両方による、ＰＣＲ適用における潜在的な問題を引き起こす。結
果として、エキソヌクレアーゼ活性の基質でないリガンドが望ましい。切断部位
は、配列の５’末端近傍であるため、一部切除はこの部位を除去することが可能
である。一部切除はまた、リガンドを製造するのに経済的であるため、望ましい
。

【００８２】ＴＱ３０およびＴＱ２１の一部切除リガンドの同定一部切除実験のため、ファミリーＩ由来のリガンドＴＱ３０（配列番号５０）
およびファミリーＩＩ由来のＴＱ２１（配列番号５９）（表１０を参照されたい
）を選択した。実施例２に記載されるように、両リガンドの全長配列から生成し
た末端標識入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）断片に対する親和性選択後、配列決定ゲル解
析を行ったが、同定可能な境界は得られなかった。しがたって、２つのリガンド
を欠失解析に供した。ヘアピン伸長アッセイにおいて、ポリメラーゼを阻害する
能力に関し、連続欠失型を試験し、機能する一部切除体を同定した。

【００８３】リガンドＴＱ３０（配列番号５０）の一部切除体予測されるステム−ループ構造を持つ保存配列モチーフを含むＴＱ３０の可変
３０ヌクレオチド領域（Ｔｒｎｃ．Ａ−３０（配列番号７４）；表１１）は、全
長配列と同じ度合いで、２５℃でＴａｑポリメラーゼを阻害する（データ未提示
）。しかし、より高い温度では、阻害効率は、全長配列より低い。例えば３０℃
では、Ｔｒｎｃ．Ａ−３０（２５０ｎＭ）によるＴａｑポリメラーゼの阻害は
およそ８２％であり、一方、全長配列は、この温度および濃度で、酵素を完全に
阻害した。Ｔｒｎｃ．Ａ−３０の熱感受性の増加は、Ａ−Ｔ塩基対で中断された
らせん、低温で融解する傾向があるらせんの存在による可能性がある。

【００８４】したがって、高Ｇ−Ｃ塩基対を持つ非中断ステムを含む、Ｔｒｎｃ．Ａ−３０
の３つのステム−ループ変異体を設計した。これらの変異体では、ファミリーＩ
に同定される保存配列モチーフは改変されなかった（表１１）が、ステムは多様
な長さを有した。２５０ｎＭ阻害剤濃度で、Ｔｒｎｃ．１−３０（配列番号６
７）およびＴｒｎｃ．２−３０（配列番号６８）は、Ｔａｑポリメラーゼ活性を
およそ９５％阻害し、一方、Ｔｒｎｃ．３−３０（配列番号６９）は、ポリメラ
ーゼ活性の約６０％しか阻害しなかった（以下を参照されたい）。これらの変異
体のうち最短ステム（７塩基対）を含むＴｒｎｃ．３−３０は、Ｔａｑポリメラ
ーゼの劣った阻害剤であり、生産的な相互作用には、ステム内でさらに接触する
ことが必要であることが示された。Ｔｒｎｃ．３−３０で観察された阻害の減少
が、ポリメラーゼに対する結合親和性の減少のためであるか決定するため、Ｔａ
ｑポリメラーゼに対する結合に関し、３つの変異体すべての親和性を計算した。
Ｋ_d値は、２−３ｎＭの間であり、３つの変異体はすべて、同様の結合親和性
を有することが示された。したがって、Ｔｒｎｃ．３−３０により引き起こされ
た阻害の欠失は、結合の欠失のためではなく、おそらく、活性部位をブロッキン
グすることができないためであった。Ｔａｑポリメラーゼに対する結合に関する
３つの変異体の親和性は、全長分子より約７５倍低く（全長配列のＫ_dは、４０
ｐＭである）、そしてＴｒｎｃ．Ａ−３０より約３−５倍低い。３つの構築物
のＩＣ₅₀値は、ステムの長さの減少と共に減少した：Ｔｒｎｃ．１−３０、Ｔｒ
ｎｃ．２−３０およびＴｒｎｃ．３−３０で、それぞれ２５、５０および１８６
ｎＭであった（図２９）。この結果は、より長いステムを持つリガンドがより
有効な阻害剤であるという見解と一致する。全長配列のＩＣ₅₀値は２２ｎＭで
ある。３０℃で１時間、ヘアピン伸長アッセイを行った。Ｔｔｈポリメラーゼが
全長リガンドに完全に阻害されるという事実にもかかわらず、Ｔｒｎｃ．１−３
０もＴｒｎｃ．２−３０もどちらもＴｔｈポリメラーゼを阻害しなかった。

【００８５】ストッフェル断片（６１ｋＤ）は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠
くＴａｑポリメラーゼの一部切除型であり、そしてＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ（６７ｋＤ）と類似である。ストッフェル断片のポリメラーゼ活性
は、全長と共にＴＱ３０の３つの一部切除型で完全に阻害された。３つの一部切
除体のＩＣ₅₀値は、Ｔｒｎｃ．１−３０＝２．７ｎＭ、Ｔｒｎｃ．２−３０＝
５．９ｎＭおよびＴｒｎｃ．３−３０＝１０．３ｎＭである（図３０）。総
合すると、ＴＱ３０の３つの一部切除型は、Ｔａｑポリメラーゼよりストッフェ
ル断片を阻害するのにより有効である（図２９を図３０と比較されたい）。スト
ッフェル断片の阻害に関するこれらの一部切除体のＩＣ₅₀値は、Ｔａｑポリメラ
ーゼに関するものより一桁優れていた。Ｔｒｎｃ．２−３０によるストッフェル
断片の阻害に関するＩＴ₅₀値は、３８℃であった（データ未提示）。驚くべきこ
とに、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを両方阻害するＴＱ２１配列は、ストッ
フェル断片を阻害しない。これは、ストッフェル断片上のＴＱ２１結合部位が、
部分的にまたは完全に欠失しているか、あるいはタンパク質の一部切除に際し、
再構成されているかを示唆する。

【００８６】リガンドＴＱ２１（配列番号５９）の一部切除体ＴＱ３０のようなファミリーＩリガンドと異なり、ファミリーＩＩリガンド、
ＴＱ２１の３０ヌクレオチド可変領域は、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼをど
ちらも阻害せず（データ未提示）、固定領域由来のさらなるヌクレオチドが阻害
に必要であることが示される。全長ＴＱ２１配列の欠失解析により、Ｔａｑおよ
びＴｔｈポリメラーゼを両方阻害する能力を保持する、５１量体配列（Ｔｒｎｃ
．２１（配列番号７０）（表１０））が同定された。３０ヌクレオチドランダム
領域の全てに加え、Ｔｒｎｃ．２１配列は、５’および３’固定領域由来の、そ
れぞれ、９および１２ヌクレオチドを含んだ（表１０）。Ｔａｑポリメラーゼに
減少した親和性を示した、ＴＱ３０一部切除体と対照的に、Ｔｒｎｃ．２１は、
増加した親和性を示し；Ｔａｑポリメラーゼへの結合に関するＴｒｎｃ．２１の
Ｋ_dは、９ｐＭであり（図３１Ａ）、全長配列より約4倍高い親和性である。Ｔ
ａｑポリメラーゼの阻害に関するＴｒｎｃ．２１のＩＣ₅₀値は、２１ｎＭであ
り（図３１Ｂ）、全長配列の値より、約３倍低い。ＴａｑポリメラーゼおよびＴ
ｔｈポリメラーゼに関する計算ＩＴ₅₀値は、それぞれ、３４℃および３５．６℃
である（図３１Ｃ）。２５０ｍＭＴｒｎｃ．２１を用い、３５および５０℃
の温度の間で、1時間、ヘアピン伸長アッセイを行った。このように、親和性お
よびＩＣ₅₀およびＩＴ₅₀の値に基づくと、ＴＱ２１の一部切除型は、全長配列よ
り優れた阻害剤である。全長配列同様、Ｔｒｎｃ．２１は、ストッフェル断片の
活性を阻害しなかった。

【００８７】リガンド６（ＴＱＨ６（配列番号７８））、２２（ＴＱＨ２２（配列番号８１））および２８（ＴＱＨ２８（配列番号８７））の一部切除体全長配列の体系的欠失解析により、機能する一部切除体を同定した。一部切除
体は、可変領域に結合する、それぞれ５’および３’固定領域由来の９および１
２ヌクレオチドを含み、結果として５０または５１ヌクレオチド配列であった。
したがって、各一部切除体では、可変領域に、５’−ＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−およ
び−ＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡ−３’が隣接する。一部切除リガンドは、Ｔａｑ
ポリメラーゼとインキュベーションした際、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
により切断されず（図３２）、一部切除に際し、切断部位が除去されたか、また
はリガンドがエキソヌクレアーゼ活性に認識されない構造に作りかえられたかい
ずれかが示唆される。

【００８８】一部切除リガンド、ＴＱＨ６−ＴｒおよびＴＱＨ２８−ＴｒのＴａｑポリメラ
ーゼに対する親和性を、ＴｒｉｓおよびＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液中で測定した。５
５℃で、２つの緩衝液における全長および一部切除リガンドのＫ_d値は、表９に
示される。リガンド６（ＴＱＨ６）の親和性は、一部切除に際し、どちらの緩衝
液でも３−４倍減少し、そしてリガンド２８（ＴＱＨ２８）の親和性は、Ｔｒｉ
ｓ緩衝液中で３−４倍減少した。総合すると、一部切除に際し、親和性は中程度
に減少し、これは欠失ヌクレオチドが、おそらく、非特異的相互作用を通じ、全
長配列における結合エネルギーのある程度のレベルに寄与することを示す。

【００８９】表１２に示されるように、一部切除リガンドＴＱＨ６−Ｔｒ、ＴＱＨ２２−Ｔ
ｒおよびＴＱＨ２８−ＴｒのＩＴ₅₀値は、一部切除に際し、５−９℃減少した。
一部切除および全長リガンドに関し、４５℃で、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中で測定
したＴＣ₅₀値を比較すると、一部切除に際し、ＴＣ₅₀値（投入ヘアピン基質の５
０％が、既定の温度で完全伸長産物に変換される濃度）が２−３倍増加したこと
が明らかになる（表１２）。

【００９０】総合すると、本解析の結果は、一部切除リガンドが、Ｔａｑポリメラーゼの５
’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されないことを示す。さらに、これ
らはＴａｑポリメラーゼに高親和性結合を示し、そしてより高い温度でポリメラ
ーゼ活性を阻害する。一部切除リガンドのこれらの特性は、非特異的増幅を調節
するため、ＰＣＲ適用に望ましい。

【００９１】ＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンドの一部切除体全長配列の体系的欠失解析により、ＴＺ０５ポリメラーゼのポリメラーゼ活性
を阻害する一部切除リガンドを同定した。これらのリガンドは、２つの固定領域
の大部分を欠き、そして５１ヌクレオチド長である（図３３）。一部切除体は、
ポリメラーゼ活性の有効な阻害のため、５’および３’固定領域由来の、それぞ
れ、９および１２ヌクレオチドを必要とする。

【００９２】表１３は、ＴＺ１、ＴＺ１３およびＴＺ３６に対する一部切除リガンドのＫ_d
値を、各全長リガンドのものに比較する。これらのリガンドの親和性が、５１ヌ
クレオチドまでの一部切除に際し、劇的に変化しなかったことがわかる。５５℃
で、ＴＺ０５緩衝液中で、表１３に示される結合反応を行った。この結果は、２
つの固定領域中の欠失ヌクレオチドがポリメラーゼに対するリガンド結合に必須
でないことを示す。５１ヌクレオチド一部切除体に加え、全長リガンドの可変領
域のみを含む３０ヌクレオチド一部切除体もまた、ポリメラーゼを阻害する能力
に関し、試験した（図３３）。

【００９３】リガンドＴＺ１、ＴＺ１３およびＴＺ３６の５１および３０ヌクレオチド一部
切除体のＩＴ₅₀値を表１４に示す。ＩＴ₅₀値を計算するため、実施例２に記載さ
れるように、ヘアピン伸長アッセイを行った。表１４でわかるように、３つの５
１ヌクレオチド一部切除体はすべて、４０℃以上でポリメラーゼ活性を阻害した
。ＴＺ１３およびＴＺ３６のＩＴ₅₀値は、一部切除に際し、７．５℃および４℃
減少し、一方、ＴＺ１のＩＴ₅₀値は、一部切除に際し、変化しなかった。総合す
ると、５１ヌクレオチドのＩＴ₅₀値および親和性は、これらをＰＣＲ適用に関す
る魅力的な候補とする。

【００９４】リガンドＴＺ１３の場合、３０ヌクレオチドまでのさらなる一部切除は、親和
性をおよそ５倍減少させた（Ｋ_d＝１４５ｐＭ）。本一部切除体の親和性は、
低いＩＴ₅₀値（４２℃）と一致する。ＴＺ１３の３０ヌクレオチド一部切除体の
３’末端からさらに４ヌクレオチド欠失させると、ＩＴ₅₀値は１７℃減少した（
図３４ＡおよびＢ）。興味深いことに、ＴＺ１およびＴＺ１３の３０ヌクレオチ
ド一部切除体は、４０℃以上のＩＴ₅₀値を示し、一方、ＴＺ３６の３０ヌクレオ
チド一部切除体は示さなかった。したがって、ＩＴ₅₀値が＞４０℃であるＴＺ１
およびＴＺ１３の３０ヌクレオチド一部切除体もまた、ＰＣＲ適用に有用である
可能性がある。

【００９５】これらのリガンドの５１ヌクレオチド一部切除体は、親和性（Ｋ_d）およびポ
リメラーゼ阻害（ＩＴ₅₀）に関し、望ましい値を保持する。図３５に示されるよ
うに、５１ヌクレオチド一部切除体は、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性
により切断された。しかし、３０ヌクレオチド一部切除体とＴＺ０５ポリメラー
ゼのインキュベーションの結果、切断は起こらず、５１ヌクレオチド一部切除体
上の切断部位は、５’固定領域の９ヌクレオチドの範囲にある可能性があること
が示唆された。３０ヌクレオチド一部切除体は、酵素により切断されなかったが
、そのＫ_d値（１４５ｐＭ）およびＩＴ₅₀値（４２℃）は、５０℃に近い温度
でのポリメラーゼ活性化が望ましい、特定のＰＣＲ適用には魅力的でない可能性
がある。５１ヌクレオチド一部切除体の切断を遮断する試みの中で、ホスホロチ
オエート結合が導入された。５’末端の最初の８ヌクレオチドにホスホロチオエ
ート結合を含む一部切除体（図３３）は、エキソヌクレアーゼ切断に耐性である
ことが見出された。ホスホロチオエート結合を持つ一部切除体のＩＴ₅₀値は、ホ
スホロチオエートを欠くものに匹敵し、これらの一部切除体への８つのホスホロ
チオエート結合の導入は、ＴＺ０５ポリメラーゼを阻害する能力に影響を与えな
いことが示唆された。

【００９６】一部切除体の二量体型リガンドの多量体化は、有効な局所濃度を増加させ、標的とのより長い在留時
間（アビディティー）を生じる。Ｔａｑポリメラーゼに関する中程度の親和性に
基づき、ホモ二量体の合成のため、Ｔｒｎｃ．２−３０を選択した（表１０）。
Ｔｒｎｃ．２−３０（配列番号６８）のホモ二量体（Ｄ．３０−Ｄ．３０）（配
列番号７１）は、標準法を用い、固相化学合成において、支持体として対称的二
量体ＣＰＧを用い、テールからテールへの方向（３’末端で結合）に合成した。

【００９７】Ｔａｐポリメラーゼに対する結合に関するＤ．３０−Ｄ．３０二量体の親和性
は４０ｐＭ（図３６Ａ）であり、単量体型より約７５倍高かった。ホモ二量体
のＩＣ₅₀値は１４ｎＭであり、単量体型より約３．５倍低かった（図３６Ｂ）
。したがって、一部切除ＴＱ３０の二量体化は、Ｔａｑポリメラーゼのより有効
な阻害剤を産生した。

【００９８】２つの単量体一部切除体、Ｔｒｎｃ．２−３０およびＴｒｎｃ−２１（表１０
）が、３つのチミンを含むリンカーにより連結された、２つのヘテロ二量体配列
もまた、調製した。Ｄ．２１−Ｄ．３０（配列番号７２）において、Ｔｒｎｃ−
２１配列を分子の５’末端に置く。全長ＴＱ３０と異なり、一部切除型は、Ｔｔ
ｈポリメラーゼを阻害しなかった。一方、Ｔｒｎｃ−２は、ＴａｑおよびＴｔｈ
ポリメラーゼ両方を阻害したが、ストッフェル断片を阻害しなかった。単量体単
位が独立に機能することが可能であると仮定すると、単一の配列につなぎとめら
れた後、２つの一部切除リガンドの組合せは、３つのポリメラーゼすべてを阻害
することが可能な単一の配列を提供するであろう。最低の阻害剤濃度（６２．５
ｎＭ）で、Ｔａｑポリメラーゼに対する２つのヘテロ二量体の阻害効果は、２
つの単量体より高い。Ｔｔｈポリメラーゼに対するヘテロ二量体の効果は、Ｔｒ
ｎｃ−２１単量体のものと同等である。ストッフェル断片は、２つのヘテロ二量
体の存在下で、ヘアピンテンプレートを完全に伸長することは不可能であった。
対照的に、単量体Ｔｒｎｃ．２−３０配列の存在下で、部分的伸長産物は、より
少なかった。ヘアピンテンプレートが完全には伸長しないことにより、ヘテロ二
量体が、ストッフェル断片の活性を抑制することが示唆される。

【００９９】ヘテロ二量体Ｄ．２１−Ｄ．３０は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの阻害
に関し、およそ３０ｎＭのＩＣ₅₀値を有する（図３７Ａ）。ＴａｑおよびＴｔ
ｈポリメラーゼの阻害に関するＩＣ₅₀値は、それぞれ、４１および３４．５℃で
ある（図３７Ｂ）。Ｄ．２１−Ｄ．３０は、１５．５ｎＭのＩＣ₅₀値および３
８℃のＩＴ₅₀値で、ストッフェル断片を阻害する（データ未提示）。Ｔａｑポリ
メラーゼに対する結合に関する、リガンドＤ．２１−Ｄ．３０ヘテロ二量体のＫ _d は、Ｔｒｎｃ−２１のもの（１０ｐＭ）と同様であり、該タンパク質が、高
親和性結合で配列モチーフに優先的に結合することを示唆する。

【０１００】二量体中の２つの単量体単位の配置は、３つのポリメラーゼのいずれに対する
阻害にも、全体的な影響を持たないようである。２つの異なる単量体単位は、二
量体に組み合わされた際、不都合な影響を示さなかった。期待されるように、ヘ
テロ二量体は、かなり有効に３つのポリメラーゼすべてを阻害する能力を示し、
概して、ヘテロ二量体における単量体単位の機能は、互いに排他的であることを
示す。

【０１０１】核酸リガンドＴＺ１３（配列番号８９）の３０ヌクレオチド一部切除体は、３
つの異なる型の二量体として合成した（図３８）。ＴＺ１３−タンデム（配列番
号１１６）は、３０ヌクレオチド一部切除体の２つの単位を、３つのチミン単位
により結合した、タンデム様式に置くことにより、得た。ＴＺ１３−対称的二量
体−１（配列番号１１７）は、グリセロール部分により、２つのリガンドの３’
末端を結合することにより、合成した。第三の二量体、ＴＺ１３−対称的二量体
−２（配列番号１１８）では、３’末端で、グリセロール部分を通じて２つの単
量体単位を結合したが、３’末端およびグリセロール部分の間に、６つのエチレ
ングリコール単位からなるリンカーを置いた。図３９Ａおよび表１５に示される
ように、３つの二量体はすべて、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する結合に関し、Ｋ _d 値が１４５ｐＭであった単量体リガンドより、高い親和性を示す（Ｋ_d値は１
８−８０ｐＭの間）。ポリメラーゼと二量体の相互作用には、アビディティー
が役割を果たし、そしてそれにより親和性を増加させると期待される。同一単量
体の３つの二量体構築物は、異なる親和性を示す。リンカーを含まない対称的二
量体−１は、３つの二量体で最高の親和性を示し、一方、エチレングリコールリ
ンカーを含む対称的二量体−２は、最低の親和性を有する。３つの二量体の観察
される親和性は、ＩＴ₅₀値により測定されるような、その阻害強度とよく相関す
る（図３９Ｂおよび表１５）。

【０１０２】以下の実施例は、本発明を説明し、そして例示するため提供され、そして本発
明を限定することを意図しない。

【０１０３】

【実施例】実施例１．実験法Ａ．材料および方法１００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０
．１ｍＭＥＤＴＡ、５０％グリセロール（ｖ／ｖ）および０．２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０からなる緩衝液中に懸濁された組換えＴａｑポリメラーゼ（ｒＴａｑ
；Ｍｒ９４ｋＤａ）；５０ｍＭＢｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）
、９０ｍＭＫＣｌおよび５０％グリセロール（ｖ／ｖ）からなる緩衝液に懸
濁された組換えＴｔｈポリメラーゼ（ｒＴｔｈ；Ｍｒ９４ｋＤａ）；および
サーマス種Ｚ０５（ＴＺ０５ｐｏｌ）はＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＳ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州アラメダ）より購入した。Ｔａｑ
、ＴｔｈおよびＵｌＴｍａＤＮＡポリメラーゼは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
から得た。Ｕｌｔｍａポリメラーゼは、Ｔｍａポリメラーゼの欠失型であり、野
生型５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。ＴｌｉおよびＴｆｌＤＮＡポ
リメラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａより購入した。Ｔｂｒポリメラーゼ（サーマラー
ゼ（Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ）Ｔｂｒ）は、ＡｍｒｅｓｃｏＩｎｃ．より得た。
対称的分岐３’−３’結合ＣＰＧおよびＣ−６チオール修飾剤ホスホロアミダイ
トは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）より得た。ＵＬＴＲＡ
ＬＩＮＫ^TMヨードアセチルビーズは、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ（イリ
ノイ州ロックフォード）より購入した。ＤＮＡの放射標識に用いた酵素は、Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（インディアナ州インディアナポリス）よ
り得た。すべての他の試薬および化学薬品は、解析等級であり、そして標準的な
商業的供給源より購入した。

【０１０４】オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドは、標準的固相シアノエチル
ホスホロアミダイト化学反応により合成し、そして均一な大きさにする、変性ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動または逆相高圧液体クロマトグラフィーにより、
精製した。対称的ホモ二量体は、対称的分岐３’−３’結合ＣＰＧを用いて合成
した。ＤＮＡ濃度は、３３μｇ／ｍｌ＝１Ａ₂₆₀単位に基づいた。

【０１０５】アフィニティービーズの調製５’末端にチオール基を含む、リガンドＴＱ２
１（配列番号５９）またはＴＱ３０（配列番号５０）（表３）いずれか２５ナノ
モルを、製造者の指示にしたがい、ＡｇＮＯ₃およびジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）で脱保護した。過剰なＤＴＴは、等体積の酢酸エチルを用いた、４回の連続
抽出により、除去した。その後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３
）および５ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液で２回洗浄しておいた５００μｌの
ＵＬＴＲＡＬＩＮＫ^TMヨードアセチルビーズと、脱保護リガンドを混合した。反
応混合物を、回転プラットホーム上で、室温で２時間、インキュベーションした
。ヨードアセチルビーズの未反応部位は、同緩衝液中の０．５Ｍシステイン
溶液５０μｌと混合物を１５分間反応させることにより、キャップ化した。コン
トロールビーズは、０．５Ｍシステイン５００μｌとヨードアセチルビーズ
５００μｌを反応させることにより、調製した。反応後、７５μＭヘパリン、
１２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌおよび１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）からなるＰＣＲ緩衝液５００μｌで、ビーズを５回洗
浄した。

【０１０６】Ｂ．ＳＥＬＥＸＳＥＬＥＸ法は、本明細書に完全に援用される、米国特許第５，２７０，１６
３号に、詳細に記載されている。表１に示されるテンプレートおよびプライマー
を用い、室温および上昇した温度で、ＳＥＬＥＸ実験を行った。

【０１０７】室温Ｔａｑポリメラーゼに対する選択は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ８．３：２２℃）、５０ｍＭＫＣｌおよび２．５ｍＭＭｇＣｌ₂
からなる緩衝液（Ｔａｑ結合緩衝液）中で、室温で行った。Ｔｔｈポリメラーゼ
に対する選択は、５０ｍＭＢｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．３：２５℃）
、９０ｍＭＫＣｌおよび３．５ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）₂からなる緩衝液（
Ｔｔｈ結合緩衝液）中で行った。

【０１０８】各ＳＥＬＥＸ実験は、固定構造の５’および３’領域が隣接する、３０ヌクレ
オチドランダム領域からなる、合成のゲル精製ランダム配列プール一本鎖ＤＮＡ
（ｓｓＤＮＡ）（表１）５ｎｍｏｌで開始した。典型的な選択周期では、適切
な結合緩衝液に懸濁したｓｓＤＮＡを９０℃で３分間加熱し、氷上で冷却し、そ
してその後、室温にした。室温に平衡化すると、競合剤としての２ｎｍｏｌの
ｔＲＮＡおよび０．０１％ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）の存在下で、適切な標
的ポリメラーゼとＤＮＡを、１５分間インキュベーションした。あらかじめ湿ら
せたニトロセルロースフィルター（０．４５μＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じ
、吸引下で、ニトロセルロースろ過することにより、未結合ＤＮＡからポリメラ
ーゼ−ＤＮＡ複合体を分離した。フィルターを直ちに、結合緩衝液２０ｍｌ、
結合緩衝液中の０．５Ｍ尿素、および水中の０．５Ｍ尿素で洗浄した。
フィルターに保持されたＤＮＡを溶出し、そしてキャリアーｔＲＮＡ（５μｇ）
の存在下で、エタノール沈殿により、単離した。

【０１０９】単離ＤＮＡを、プライマーセットＩ（表１）を用いたＰＣＲにより、増幅した
。プライマー鎖の１つは、５’末端に３つの連続するビオチンを含んだ。生じた
二重鎖ＤＮＡの非ビオチン化鎖を、変性条件下でゲル電気泳動により単離し（Ｐ
ａｇｒａｔｉｓ（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２４：３６
４５−３６４６）、そして次の選択周期に用いた。続く周期で、標的ポリメラー
ゼとのインキュベーション前に、ＤＮＡプールをニトロセルロースフィルターに
通過させ（逆選択）、ニトロセルロースフィルターに結合するＤＮＡ配列を除去
した。標的ポリメラーゼのピコモル数は、ＳＥＬＥＸの経過中、次第に減少させ
、高親和性結合の配列に関する選択圧を増加させた。各選択中のＤＮＡ量は、タ
ンパク質量の少なくとも５倍に維持され、高親和性結合ＤＮＡ配列に関する競合
を確実にした。

【０１１０】ＳＥＬＥＸの進行は、濃縮プールのニトロセルロースフィルター結合解析によ
りモニターした。最高の親和性の結合を示した濃縮プールは、プライマーセット
ＩＩを用いてＰＣＲ増幅し、生じた二重鎖ＤＮＡの末端にＢａｍＨＩおよびＥｃ
ｏＲＩ制限部位を取り込んだ。このＤＮＡをゲル精製し、そしてＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩで消化し、そして標準的技術を用い、同一酵素であらかじめ消化さ
れたプラスミドｐＵＣ１８ベクターにクローニングした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，中，第３部，ｐＣ．１．ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コ
ールドスプリングハーバー）。クローンを単離し、そして標準的ジデオキシ配列
決定技術により、配列決定した（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、オハイオ
州クリーブランドのＳｅｑｕｅｎａｓｅキット）。

【０１１１】高温ＳＥＬＥＸ５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５
０ｍＭＫＯＡｃ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂および
１０％グリセロールからなる結合緩衝液（Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液）中で、５５℃
で、Ｔａｑポリメラーゼに対する高温での親和性選択を行った。本選択の出発ラ
イブラリーは、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ
ＫＣｌおよび２．５ｍＭＭｇＣｌ₂からなる結合緩衝液中で、室温で行った
親和性選択由来の１２回目の周期のｓｓＤＮＡであった（表３（Ｄａｎｇおよび
Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２６８）
）。大文字は、５’−ＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−
および−ＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’固定配列が
隣接する、３０ヌクレオチド（ｎｔ）ランダム領域を示す。ファミリーＩ配列の
下線領域は、塩基対形成に関し相補的である。後者のライブラリーは、配列５’
−ＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−［Ｎ］₃₀−ＴＣＴＴＧ
ＴＧＴＡＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１；表１）を用い、
合成ランダム配列ｓｓＤＮＡライブラリーから濃縮した。

【０１１２】Ｔｒｉｃｉｎｅ結合緩衝液に懸濁した１２回目の周期のｓｓＤＮＡライブラリ
ー５ｎｍｏｌを用い、高温親和性選択を開始した。本懸濁物を９５℃で３分間
加熱し、氷上で５分間冷却し、そして５５℃にした。２ｎｍｏｌのｔＲＮＡ（
競合剤として使用）、０．０１％（ｗ／ｖ；最終濃度）のｈＳＡ（ヒト血清アル
ブミン）およびＴａｑポリメラーゼ（１２５ｎＭ）をＤＮＡ懸濁物に添加し、
そして５５℃で１５分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセ
ルロースフィルター（０．４５μＭ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じ、吸引下で、
迅速にろ過することにより、ポリメラーゼ結合ＤＮＡを回収した。フィルターを
直ちに、２０ｍｌ体積の結合緩衝液、続いて同体積の結合緩衝液中の０．５
Ｍ尿素で洗浄した。どちらの洗浄緩衝液も、使用前に、あらかじめ６０℃に温
めた。フィルターに保持されたＤＮＡを溶出し、そしてキャリアーとして用いる
５μｇのｔＲＮＡの存在下で、エタノール沈殿により、単離した。単離ＤＮＡは
、上述のようにプライマーセットＩ（表１）を用いたＰＣＲにより増幅した。

【０１１３】Ｔａｑｐｏｌに対する高親和性結合ＤＮＡ配列の濃縮を確実にするため、選
択経過中、選択圧を次第に増加させた。これは、Ｔａｑポリメラーゼおよび各周
期で用いられるＤＮＡ両方の量を次第に減少させると共に、フィルター保持ＤＮ
Ａのストリンジェントな洗浄により、達成した。濃縮ライブラリーの親和性は、
ニトロセルロースフィルター結合によりモニターした（以下に記載される）。８
周期の選択後、有意な親和性の改善は見られなかった。８回目の周期のライブラ
リーを、上述のようにプライマーセットＩＩ（表１）を用いてＰＣＲ増幅した。
ジデオキシ配列決定技術（ＵＳＢのＳｅｑｕｅｎａｓｅキット）により、形質転
換体のＤＮＡ挿入物を配列決定することにより、濃縮ライブラリーの複雑さを解
析した。

【０１１４】５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、１２５ｍＭＫＯＡｃ、２．５ｍ
ＭＭｎ（ＯＡｃ）₂および８％グリセロールからなる結合緩衝液（ＴＺ０５
ｐｏｌ緩衝液）中で、５５℃で、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する親和性選択を行
った。結合緩衝液は、１ＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、３
ＭＫＯＡｃ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）₂および８０％グ
リセロールのストック溶液を混合することにより、調製した。同一条件下で、異
なるｓｓＤＮＡライブラリーから出発し、２つの親和性選択を行った。１つの選
択は、５ｎｍｏｌの合成ランダム配列ｓｓＤＮＡライブラリー；５’−ＴＴＣ
ＴＣＧＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−［Ｎ］₃₀−ＴＣＴＴＧＴＧＴＡ
ＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１；表１）で開始した。他の
選択の出発ライブラリーは、室温で、Ｔａｑポリメラーゼに対して行った親和性
選択由来の１２回目の周期のｓｓＤＮＡライブラリーであった（表３）。

【０１１５】結合緩衝液に懸濁したｓｓＤＮＡライブラリーを９５℃で３分間加熱し、氷上
で５分間冷却し、そしてその後、５５℃にした。２ｎｍｏｌのｔＲＮＡ（競合
剤として使用）、０．０１％（ｗ／ｖ；最終濃度）のｈＳＡ（ヒト血清アルブミ
ン）およびＴＺ０５ポリメラーゼ（１２５ｎＭ）をＤＮＡ懸濁物に添加し、そ
して５５℃で１５分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセル
ロースフィルター（０．４５μＭ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じ、吸引下で、迅
速にろ過することにより、ポリメラーゼ結合ＤＮＡを回収した。フィルターを直
ちに、２０ｍｌの結合緩衝液、および結合緩衝液中の０．５Ｍ尿素で洗浄
した。どちらの洗浄緩衝液も、使用前に、あらかじめ６０℃に温めた。フィルタ
ーに保持されたＤＮＡを溶出し、そしてキャリアーとして用いた５μｇのｔＲＮ
Ａの存在下で、エタノール沈殿により、単離した。

【０１１６】単離ＤＮＡは、上述のようにプライマーセットＩ（表１）を用いたＰＣＲによ
り増幅した。完全ランダムライブラリーで開始した選択には、標準的ＰＣＲ増幅
を用い、一方、Ｔａｑｐｏｌに対するあらかじめ選択されたライブラリーで開
始した選択には、突然変異性ＰＣＲ条件を用いた。突然変異性ＰＣＲは、生じた
ＰＣＲ産物のヌクレオチド多様性を増加させるよう意図され、以下のように行っ
た。回収ＤＮＡは、まず、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、１．１ｍＭＭｎＣｌ₂、７ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭ
ｄＣＴＰ、１ｍＭｄＴＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭＡ
ＴＰおよび１ＵのＴａｑポリメラーゼを含む１００μｌ体積中で、９４℃５０
秒、４５℃４５秒および７２℃４５秒を５周期の反復パラメーターで、ＰＣＲに
より増幅した。上述のＰＣＲから１３μｌを、上述のものと同じ条件下で、５周
期行う、新規の１００μｌＰＣＲのテンプレートとして用いた。後者の工程を
さらに３回繰り返した。４回目の突然変異性ＰＣＲ由来の１３μｌを、５００μ
ｌＰＣＲのテンプレートとして用い、次の選択に用いるｓｓＤＮＡプールを生
成した。変性ポリアクリルアミドゲル上で分離された、生じた二重鎖ＰＣＲ産物
の非ビオチン化鎖を単離し、そして次の周期の選択に用いた。

【０１１７】ＴＺ０５ｐｏｌに対する高親和性結合ＤＮＡ配列の濃縮を確実にするため、
選択経過中、選択圧を次第に増加させた。これは、ＴＺ０５ポリメラーゼおよび
各周期で用いられるＤＮＡ両方の量を次第に減少させると共に、フィルターのス
トリンジェントな洗浄により、達成した。親和性濃縮は、濃縮ライブラリーの平
衡解離定数を測定することにより、モニターした。

【０１１８】その後、濃縮ライブラリーを、上述のようにプライマーセットＩＩ（表１）を
用いてＰＣＲ増幅した。ジデオキシ配列決定技術（ＵＳＢのＳｅｑｕｅｎａｓｅ
キット）により、形質転換体のＤＮＡ挿入物を配列決定することにより、濃縮ラ
イブラリーの複雑さを解析した。

【０１１９】Ｃ．ニトロセルロースフィルター結合アッセイ室温オリゴヌクレオチドライブラリーおよび個々のリガンドの親和性を評価
するため、ニトロセルロースフィルター結合技術を用いた。簡潔には、５’末端
で標識したゲル精製³²ＰｓｓＤＮＡプールを結合緩衝液に懸濁し、８０℃に加
熱し、氷上で冷却し、そしてその後、室温にした。その後、ＤＮＡ（５−１０
ｐＭ）を、０．１μｇのｔＲＮＡおよび０．０１％ｈＳＡを含む、適切な結合
緩衝液５０μｌ中で、多様な量の標的ポリメラーゼと、室温で１５分間インキュ
ベーションした。ＤＮＡ濃度は１００ｐＭより低く維持し、過剰なタンパク質
濃度の存在下で平衡を確実にした。１５分後、結合反応混合物を、あらかじめ湿
らせたニトロセルロース／セルロースアセテート混合マトリックスフィルター（
０．４５μｍ孔サイズ、ＭｉｌｌｏｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチ
ューセッツ州ベッドフォード）に通過させ、そしてフィルターを直ちに５ｍｌ
の結合緩衝液で洗浄した。フィルターに結合したＤＮＡの量は、液体シンチレー
ション計測により、フィルターの放射能を測定することにより、定量化した。タ
ンパク質の非存在下でフィルターに結合したＤＮＡの量を、バックグラウンド訂
正に用いた。各フィルターに保持された投入ＤＮＡのパーセントを、対応するポ
リメラーゼ濃度の対数に対しプロットした（図１および２）。非線形最小二乗法
を用い、それぞれ、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドの
解離定数（Ｋ_d）を得た（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ３４：９５９９；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１２２７−１１２
３１）。

【０１２０】非選択ランダム配列プールは、およそ７０ｎＭの概算Ｋ_dで、Ｔｔｈポリメ
ラーゼに結合し（図１Ｂ（黒丸））、一方、Ｔａｑポリメラーゼに対する本プー
ルの結合のＫ_dはおよそ５０−１００ｎＭである（図１Ａ（白丸））。１２周
期の選択後、Ｔａｑポリメラーゼに対する結合のＫ_dは、３．５ｎＭであった
（図１Ａ（白丸））。選択周期をさらに多くしても、親和性のさらなる改善は生
じなかった。このように、Ｔａｑポリメラーゼに対する濃縮プールの結果的な親
和性は、非選択ランダムプールに比較し、有意に改善された。Ｔｔｈポリメラー
ゼで、同様の結果が得られ、１０回目の周期からのプールは、５ｎＭのＫ_dを
示した（図１Ｂ（白丸））。

【０１２１】Ｔａｑポリメラーゼに関して選択されたｓｓＤＮＡプールは、０．２ｎＭの
Ｋ_dで、Ｔｔｈポリメラーゼに非常に緊密な結合を示した（図２Ａ（白丸））。
２つのポリメラーゼの間のアミノ酸配列同一性はおよそ８７％である（Ａｓａｋ
ｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７６：２６５
−２６９）ため、この結果は驚くべきことではない。Ｔｔｈポリメラーゼに関し
選択されたプールは異なる方式でＴａｑポリメラーゼに結合し、結合は５０％レ
ベル付近で飽和し（図２Ｂ（白丸））、プール中の約半分の配列は、Ｔａｑポリ
メラーゼと相互作用しないことが示唆された。５０％飽和に基づき、概算Ｋ_dは
０．３ｎＭである。

【０１２２】Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行った１０周期の選択から得たｓｓＤＮＡ配列を
、表２に示す。Ｔｔｈポリメラーゼ選択由来の２９の個々のクローンを配列決定
した（可変３０ｎｔ領域のみを表２に示す）。配列類似性に基づき、配列を２つ
のファミリーに分類した。Ｔａｑポリメラーゼを用いて行った１２周期の選択か
ら得たｓｓＤＮＡ配列を、表３に示す。３３のユニーク配列を単離した。いくつ
かの配列中の小文字は、５’固定配列を示し、そして大文字は、３０ヌクレオチ
ドランダム領域を示す。配列類似性に基づき、配列を３つのファミリーに分類し
た。

【０１２３】高温ＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するアプタマーの結合親和性を
、ニトロセルロースフィルター結合技術により、５５℃で測定した。簡潔には、
末端標識アプタマーを、それぞれ、多様な濃度のＴａｑまたはＴＺ０５ポリメラ
ーゼと、５０μｌの結合緩衝液中で、５５℃で１５分間、インキュベーションし
た。アプタマー−ポリメラーゼ混合物を、あらかじめ５５℃に温めた結合緩衝液
を用い、あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μｍ）に通
過させた。５５℃に加熱した同緩衝液５ｍｌを用い、フィルターを直ちに洗浄
した。各ポリメラーゼには２つの緩衝液を用いた：５０ｍＭＫＣｌ、２．５
ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２２℃でｐＨ８．３）
、２ｎｇ／μｌのｔＲＮＡおよび０．０１％ｈＳＡからなるＴｒｉｓ緩衝液
；並びに、５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ
ＫＯＡｃ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、１０％グリセ
ロール、２ｎｇ／μｌのｔＲＮＡおよび０．０１％ｈＳＡからなるＴａｑ緩
衝液または５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、１２５ｍＭＫＯＡｃ、２
．５ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、８％グリセロール、２ｎｇ／μｌのｔＲＮＡ
および０．０１％ｈＳＡからなるＴＺ０５緩衝液。平衡解離定数（Ｋ_d値）は
、非線形最小二乗法を用いることにより、計算した。

【０１２４】５５℃で、Ｔａｑポリメラーゼを用いて行った選択８周期後のｓｓＤＮＡ配列
およびその発生頻度を表４に示す。個々の配列は表５に示す。各配列に関し、３
０ｎｔランダム領域のみを示す。全長アプタマー中、ランダム領域は、表１に示
される固定配列（配列番号１）に隣接する。表４でわかるように、出発ライブラ
リーの複雑さは有意に減少し；そして驚くべきことに、わずか６配列しか見られ
なかった。表４のデータは、６３の読み取り可能な個々の配列の解析から得た。
配列類似性に基づき、アプタマーを２つのファミリーに分類した。ファミリーＩ
アプタマーは、出発ライブラリーのファミリーＩＩ配列に緊密に関連し（表３お
よび４を比較されたい）；これらの２つのファミリーは、各表の囲み内に示され
る類似のコンセンサス配列モチーフを持つ。出発ライブラリーに存在するファミ
リーＩ配列のすべて（表３）は、高温での選択後、完全に消失し、これらのＴａ
ｑポリメラーゼとの相互作用は、非常に温度感受性であったことを示した。最終
ライブラリーでファミリーＩＩと分類された単一配列は、解析した配列のおよそ
１０％に相当する。本配列は、ファミリーＩ配列とまったく異なり、そしてコン
センサスモチーフを欠く。出発および最終ライブラリーの配列複雑性の比較によ
り、出発ライブラリー中の特定の配列は、新規選択条件に耐えず、そして順応し
てヌクレオチドが変化した他の配列が新規条件に耐えたことが示される。

【０１２５】ＴＺ０５ポリメラーゼを用いて行った２つの選択の経過中、ＴＺ０５ポリメラ
ーゼに結合し、そしてまた該ポリメラーゼを阻害する能力に関し、濃縮ライブラ
リーを試験した。ランダム配列ライブラリーで開始した選択は、選択１４周期後
、親和性およびＴＺ０５ポリメラーゼ阻害能の有意な改善を示した。本選択に比
較し、突然変異性ＰＣＲを通じて得た選択の濃縮ライブラリーは、わずか４周期
の選択後、ＴＺ０５ポリメラーゼ阻害能において、さらにより大きい改善を示し
た。４周期の選択後、５５℃で、突然変異性条件下でのＰＣＲを行って得たｓｓ
ＤＮＡ配列を表５に示す。表に示される３０ｎｔランダム領域は、表１に示され
る固定配列（配列番号１）に隣接する。括弧内の数字は、その配列が同定された
回数を示す。配列類似性に基づき、配列を３つのファミリーに分類した。精査す
ると、これらの配列が２つの広いカテゴリーに分類されることが明らかになる；
グアニンがリッチな配列（ファミリーＩ−ＩＩ）およびグアニンが少ない配列（
ファミリーＩＩＩ）である。グアニンリッチ配列中のグアニンの分布は、分子内
Ｇ−四分子構造にフォールディングすることが可能であるようなものである。興
味深いことに、これらのグアニンリッチ配列は、表３に複雑性を示す出発ライブ
ラリーには存在しない（存在量が少ないため、クローニングにより検出されなか
った可能性が最も高い）。ファミリーＩＩＩ中の配列は、グアニンリッチではな
いが、ランダム配列の３’末端付近にＣＧＴＴＴＴＧコンセンサスモチーフを持
つ。出発ライブラリー中、ファミリーＩＩ配列に同様のコンセンサスモチーフが
同定され（表３）、これらの２つのファミリーが関連しており、そして他方から
一方が派生したことが示唆される。出発ライブラリーに存在するファミリーＩ配
列は、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する高温選択に際し、消失した。同一ライブラ
リーを、Ｔａｑポリメラーゼに対する高温親和性選択に供すると、同様の結果が
観察され、出発ライブラリーに見られるファミリーＩアプタマーと２つのポリメ
ラーゼの相互作用が温度感受性であり、そして高温での選択に耐えなかったこと
を示唆する。それらの間でまたは表５に示されるものに配列相同性を持たない１
３の他の配列もまた同定され、そしてオーファン配列と分類された（データ未提
示）。

【０１２６】実施例２．ポリメラーゼ阻害活性ポリメラーゼ阻害アッセイは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび³²Ｐ−γ
−ＡＴＰを用い、５’末端で末端標識し、そして変性条件下でゲル電気泳動によ
り精製したテンプレートＤＮＡ（ＤＮＡ−ＨＰ；５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴ
ＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧ
ＣＧＴ−３’（配列番号６；図６））を用いて行った（図６）。それぞれの実験
法において、０．２５ｐｍｏｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ）または０．１
２５ｐｍｏｌのＴｔｈポリメラーゼ（２．５Ｕ）いずれかを、標準的ＰＣＲ
緩衝液（２０μｌ）中の５ｐｍｏｌ（２５０μＭ）の濃縮プール、ランダムプ
ールまたは特異的ＤＮＡリガンドと混合した。５ｐｍｏｌ（２５０ｎＭ）の
標識テンプレートＤＮＡ−ＨＰを添加し、そして異なる温度で既定の時間、混合
物をインキュベーションした。最終濃度１２５ｍＭにＥＤＴＡを添加する（５
μｌの０．５ＭＥＤＴＡ）ことにより、反応を停止した。変性条件下でポリ
アクリルアミドゲル上でＤＮＡを分離した。オートラジオグラフィーによりゲル
を視覚化し、そしてホスホイメージャーにより結合ＤＮＡパーセントを定量化し
た。特定の反応に関する一般的な方法の変動は、明細に示される。

【０１２７】オリゴヌクレオチド阻害剤が反応混合物に添加される順序は、テンプレートが
最後に添加される限り、問題でない。オリゴヌクレオチドは、機能するのに、Ｐ
ＣＲの必須の構成要素であるＭｇ⁺⁺イオンを必要とし、そして多くの緩衝液系に
耐えるようである。

【０１２８】図７は、ＤＮＡ濃縮プールを用いたポリメラーゼ活性アッセイの結果を例示す
る。図８−１０は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番
号５９）を用いたポリメラーゼ活性アッセイの結果を例示する。

【０１２９】ＩＣ₅₀値の測定ＩＣ₅₀値（アッセイにおいて、産物の５０％を生じるのに必要な阻害剤濃度）
は、ヘアピン伸長アッセイを用いて得た。典型的な阻害アッセイにおいて、２０
μｌ反応は、ＴｒｉｓまたはＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液（ＴａｑおよびＴｔｈｐｏ
ｌ）あるいはＴＺ０５緩衝液（ＴＺ０５ｐｏｌ）中に、０．２５（０．０４）
ｐｍｏｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ）（１Ｕ）、０．１２５ｐｍｏｌの
Ｔｔｈポリメラーゼ（２．５Ｕ）、または０．０５ｐｍｏｌのＴＺ０５ポリ
メラーゼ（１Ｕ）いずれか、オリゴヌクレオチド阻害剤（多様な濃度）、０．
２ＭｄＮＴＰを含んだ。その後、ゲル精製５’末端標識ヘアピンＤＮＡ基質
（ＤＮＡ−ＨＰ；５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡ
ＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＴ−３’（配列番号６；図
６））を、最終濃度２５０ｎＭまで添加し、そして図レジェンドに示されるよ
うに、既定の時間、望ましい温度で、反応をインキュベーションした（ＴＺ０５
ｐｏｌでは３０分間）。反応は、５μｌの０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）の後、ホルムアミドゲル装填緩衝液を添加することにより、停止した。変性
条件下で、１０％ポリアクリルアミドゲル上で、伸長産物を分離し、そしてホス
ホイメージャーにより定量化した。阻害剤の存在下で形成された産物の量を、阻
害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物パーセントを得た。

【０１３０】ＩＴ₅₀値の測定ヘアピン伸長反応は、阻害剤濃度が２５０ｎＭであり、そしてＴＺ０５ポリ
メラーゼ反応が３７℃で行われたことを除き、上述のものと同じであった。各温
度でのインキュベーション時間は、ＴａｑおよびＴｔｈｐｏｌで１時間、そし
てＴＺ０５ｐｏｌで３０分間であった。産物量はホスホイメージャーにより定
量化し、そして同一温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し
、産物パーセントを得た。

【０１３１】リガンドＴＱ３０およびリガンドＴＱ２１基質活性の測定各実験法において、５’末端標識リガンドＴＱ３０（配列番号５０）、ＴＱ２
１（配列番号５９）またはＴＱ２１（エチレングリコールリンカーを用い３’キ
ャップ化されたもの）（およそ３ｐｍｏｌ）を、５ＵのＴａｑポリメラーゼ
または２．５ＵのＴｔｈポリメラーゼいずれかの存在下または非存在下で、２
０μｌの結合緩衝液中、１ｍＭの各ｄＮＴＰと、室温で１６時間、インキュベ
ーションした。ＴＱ２１の３’末端のキャップ化は、当業に知られる標準的条件
を用い、エチレングリコールリンカー（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈの３’−ス
ペーサーＣ３支持体）を用いて達成した。

【０１３２】親和性捕捉アッセイ親和性捕捉反応は：７５μＭヘパリン、１２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１
ｍＭ各ｄＮＴＰ、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３）、５ＵのＴａｑポリメラーゼまたは２．５ＵのＴｔｈポリメラー
ゼおよび２５０ｎＭ５’末端標識ヘアピンアッセイテンプレート（ＤＮＡ−
ＨＰ）を含む、１００μｌ反応体積中で、７０℃で５分間行った。５分後、反応
混合物を３倍希釈し、そして４℃に冷却した。第１周期合成後、１５μｌのビー
ズ（上述のように調製された、アフィニティービーズまたはコントロールビーズ
いずれか）を４℃で反応混合物に添加し、そして１０分間、穏やかに混合した。
標識テンプレートを含む上清を遠心分離後回収し、そしてゲル解析のため取り置
いた。その後、７５μＭヘパリン、１２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ
ＫＣｌおよび１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）からなる緩衝液
１００μｌでビーズを５回洗浄した。第２周期合成後、洗浄ビーズを、ポリメラ
ーゼ以外全ての試薬を含む反応混合物の新鮮なアリコットと混合した。７０℃で
５分間インキュベーションした後、反応混合物を回収し、そしてゲル電気泳動に
より解析した。

【０１３３】実施例３．エキソヌクレアーゼ阻害アッセイエキソヌクレアーゼ阻害アッセイは、（［γ³²Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用い）５’末端で、そして（［α³²Ｐ］−ｄｄＡＴＰおよ
びデオキシターミナルトランスフェラーゼを用い）３’末端で、放射標識された
、設計テンプレート、５’−ＴＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣ
ＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡ
ＡＣＴＧＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡ
ＣＣ−３’ （Ｅｘｏ−ｓｕｂ）（配列番号７５）を用いて行った。Ｔａｑおよ
びＴｔｈｐｏｌのための代表的な実験法において、それぞれ、５ＵのＴａｑ
ポリメラーゼまたは２．５ＵのＴｔｈポリメラーゼを、標準的ＰＣＲ緩衝液（
２０μｌ）中で、２５０ｎＭのリガンドＴＱ３０またはリガンドＴＱ２１と混
合し、その後、二重標識Ｅｘｏ−Ｓｕｂ（２５０ｎＭ、最後に添加）を添加し
た。室温で１６時間インキュベーションした後、最終濃度０．１ｍＭまでＥＤ
ＴＡを添加することにより、反応を停止した。変性条件下で、８％ポリアクリル
アミドゲル上で、切断産物を分離した。

【０１３４】ＴＺ０５のための代表的な実験法において、１ＵのＴＺ０５ポリメラーゼを
、ＴＺ０５緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、５０ｍＭＫＯＡ
ｃ、２．５ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）₂、８％グリセロール；２０μｌ）中で、リ
ガンドと混合し、その後、二重標識Ｅｘｏ−Ｓｕｂ（２５０ｎＭ、最後に添加
）を添加した。４５℃で２０分間インキュベーションした後、最終濃度０．１
ｍＭまでＥＤＴＡを添加することにより、反応を停止した。変性条件下で８％ポ
リアクリルアミドゲル上で、切断産物を分離した。

【０１３５】実施例４．ポリメラーゼ阻害アッセイＴＱ２１（配列番号５９）およびＴＱ３０（配列番号５０）による阻害を、（
Ａ）好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）中温性ＤＮＡＰ（コントロールとしてＴ
ａｑポリメラーゼ）、および（Ｃ）逆転写酵素（ＲＴ）に対し、試験した。すべ
ての反応は、２５０または５００ｎＭのリガンドＴＱ２１またはＴＱ３０いず
れかを用い、１ｍＭ各ｄＮＴＰの存在下で、ＨＰヘアピンテンプレート（実
施例２）を含む２０μｌ体積中で行った。各ポリメラーゼに関する特定の反応条
件は、以下の通りであった：

【０１３６】熱安定性ポリメラーゼ：Ｔｍａポリメラーゼ：ＵｌＴｍａポリメラーゼ（６
Ｕ）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭＫＣｌ、
２．５ｍＭＭｇＣｌ₂および０，００２％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）；
Ｔｂｒポリメラーゼ（２Ｕ）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．
８、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂および０．０１％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００；Ｔｌｉポリメラーゼ（３Ｕ）およびＴｆｌポリメラー
ゼ（５Ｕ）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭＫ
Ｃｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００。

【０１３７】中温性ポリメラーゼ：Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ）（緩衝液の内部コント
ロール）を含むすべてのインキュベーションは、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ７．５、４０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂および７．５ｍ
ＭＤＴＴからなる緩衝液中で行った（クレノウ断片（５Ｕ）；Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ（４Ｕ）；Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（７Ｕ））。

【０１３８】逆転写酵素：すべてのインキュベーションは、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．３、６０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂および
１０ｍＭＤＴＴからなる緩衝液中で行った（ＨＩＶ−１ＲＴ（０．５６
ｐｍｏｌ）；ＡＭＶＲＴ（１Ｕ）；Ｍ−ＭＬＶＲＴ（１０Ｕ）；
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳｓｒｉｐｔＩＩ）（１０Ｕ））。

【０１３９】実施例５．低コピー数標的の検出「ホットスタート」条件なしで、Ｒｅｓｐｅｓｓら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡ
ｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ９４：１１０に記載されるよ
うに、ＨＩＶ−２ＬＴＲから２０３ｂｐの標的特異的産物を増幅する系を用
い、ＰＣＲ増幅を行った。すべてのＰＣＲ増幅は、１００μｌ反応体積中で、１
．３μｇのヒト胎盤ＤＮＡ、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プ
ライマー、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．５ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、１０％グリセロール、０．２ｐｍｏｌ（５Ｕ）のＴａｑポリメラ
ーゼおよびテンプレート（図１０Ａ−１０Ｃに示されるような、およそのコピー
数）の存在下で行った。熱反復は、５０℃２分の後、９４℃３０秒；６０℃３０
秒；７２℃３０秒およびその後、１℃増加の自己伸長（ａｕｔｏｅｘｔｅｎｄｅ
ｄ）６０℃アニーリングを５周期、ＴＣ９６００熱反復装置（ＰＥＡｐｐｌｉ
ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。これに、９０℃３０秒；６５℃３０秒
；７２℃３０秒での３５周期増幅が続いた。

【０１４０】あるいは、ＨＩＶ−２の末端反復配列（ＬＴＲ）を検出するよう設計したＰＣ
Ｒ増幅を、「ホットスタート」条件なしで、１μｇのヒト胎盤ＤＮＡの存在下で
行った（Ｒｅｓｐｅｓｓら（１９９４）ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＣｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈ
ｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ９４：１１０）。ＰＣＲは、１００μｌ体積中に、１５
ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４８ｍＭＫＯＡｃ（ｐ
Ｈ７．５）、３．５ｍＭＭｇ（ＯＡｃ）₂、１０％グリセロール、０．４
ｍＭｄＮＴＰおよび０．２ｐｍｏｌ（５Ｕ）のＴａｑポリメラーゼを含
んだ。リガンドは５０ｎＭ濃度で用い、そしてテンプレートを添加する前に反
応混合物中に存在した。テンプレートは、５０μｌ体積中に１μｇのヒト胎盤Ｄ
ＮＡと混合したゼロまたはおよそ１０コピーのＨＩＶ−２テンプレートＤＮＡを
含んだ。熱反復は、５０℃２分、９４℃３０秒、６０℃３０秒（１℃／周期の自
己伸長で）、７２℃３０秒の後、９０℃３０秒、６５℃３０秒および７２℃３０
秒での３５周期をＴＣ９６００熱反復装置（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）で行った。最後に、反応を７２℃で１０分間インキュベーションし
た。ＰＣＲ由来の２０μｌを、非変性条件下で、８％ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動し、解析した。ゲルは、エチジウムブロミド染色により視覚化した。

【０１４１】ＴＺ０５ｐｏｌに対し選択されたアプタマーの成果は、「ホットスタート」
条件なしに、ヒトゲノムＤＮＡからヒトＫ−ｒａｓ遺伝子を増幅するよう設計さ
れたＰＣＲ系で評価した（Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９７）。ＰＣＲ増幅は、プラ
イマー、５’−ＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ−３’および
５’−ＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡ−３’を用いて行った
。すべてのＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ系９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ）上で、３０μｌ反応体積で行った。ＰＣＲは、１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１
μＭ各プライマー、２００μＭ各ｄＮＴＰ、または５０ｍＭＴｒｉｃｉｎ
ｅ−ＫＯＨ、１２５ｍＭＫＯＡｃ、２．５ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）₂、８％
グリセロール、１μＭ各プライマーおよび２００μＭ各ｄＮＴＰいずれかを
含んだ。アプタマーは、ヒト胎盤ＤＮＡ２５ｎｇをテンプレートとして添加す
る前に、緩衝液および２．５ＵのＴＺ０５ポリメラーゼを含む反応に存在した
。９４℃２分間の変性後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７５℃４５秒で、３４
周期の増幅を行った。これに、７２℃５分間の単回インキュベーションが続いた
。ＴＢＥ緩衝液中の３％アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧ；ＦＭＣＢｉ
ｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）上で、ＰＣＲの５μｌを泳動することにより、増幅産物を
解析した。ゲルは、エチジウムブロミドで染色した後、ＵＶ光下で視覚化した。

【０１４２】「ホットスタート」ＰＣＲは、製造者の指示にしたがい、「ＡｍｐｌｉＷａｘ
」ビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いることにより、行った。全ての他
のＰＣＲ増幅は、「ホットスタート」条件なしで行った。

【０１４３】「ＮｅＸｓｔａｒｔ」ＰＣＲは、阻害剤として（５０ｎＭ最終濃度の）リガ
ンドＴＱ３０およびＴＱ２１を用いて行った。１つの増幅は、比較目的のため、
非特異的オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ最終濃度）の存在下で行った。

【０１４４】

【表１】

【０１４５】

【表２】

【０１４６】

【表３】

【０１４７】

【表４】

【０１４８】

【表５】

【０１４９】

【表６】

【０１５０】

【表７】

【０１５１】

【表８】

【０１５２】

【表９】

【０１５３】

【表１０】

【０１５４】

【表１１】

【０１５５】

【０１５６】

【表１２】

【０１５７】

【表１３】

【０１５８】

【表１４】

【０１５９】

【表１５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、１２周期のＳＥＬＥＸ後のＤＮＡ濃縮プール（白丸）
およびＤＮＡ非選択ランダムプール（黒丸）の、Ｔａｑポリメラーゼに対する結
合親和性を示す。図１Ｂは、１０周期のＳＥＬＥＸ後のＤＮＡ濃縮プール（白丸
）およびＤＮＡ非選択ランダムプール（黒丸）の、Ｔｔｈポリメラーゼに対する
結合親和性を示す。

【図２】図２Ａは、Ｔａｑポリメラーゼに関する濃縮ＤＮＡプール（白丸
）およびＴｔｈポリメラーゼに関する濃縮ＤＮＡプール（黒丸）の、Ｔｔｈポリ
メラーゼに対する交差結合解析を示す。図２Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼに関する
濃縮ＤＮＡプール（白丸）およびＴｔｈポリメラーゼに関する濃縮ＤＮＡプール
（黒丸）の、Ｔａｑポリメラーゼに対する交差結合解析を示す。

【図３】図３Ａは、リガンド３０（ＴＱ３０（配列番号５０））（黒丸）
およびリガンド２１（ＴＱ２１（配列番号５９））（白丸）の、Ｔａｑポリメラ
ーゼに対する結合曲線を示す。図３Ｂは、リガンド３０（黒丸）およびリガンド
２１（白丸）の、Ｔｔｈポリメラーゼに対する結合曲線を示す。

【図４】図４Ａ−Ｅは、５５℃で測定したＴａｑポリメラーゼに対するい
くつかの全長リガンドの結合曲線を示す。図４Ａ−Ｄは、ファミリーＩに属する
リガンドの相互作用を示し、一方図４Ｅは、ファミリーＩＩの代表的なリガンド
の結合を示す。

【図５】図５Ａ−Ｄは、ＴＺ０５ポリメラーゼに対するいくつかの全長リ
ガンドの結合相互作用を示す。

【図６】図６は、ポリメラーゼ活性をアッセイするのに用いた、ヘアピン
ＤＮＡ基質およびその産物を例示する。

【図７】図７Ａは、異なる温度で、異なるインキュベーション時間を用い
て行った、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに関するポリメラーゼ活性アッセイ
を例示する。図６に示される末端標識ＤＮＡ基質を、変性条件下で、１５％ポリ
アクリルアミドゲル上で分離する。パネル１のデータは、Ｔａｑポリメラーゼお
よびＴａｑポリメラーゼに関し選択された濃縮プールを用いて得、一方、パネル
２に示されるデータは、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼに関し選
択された濃縮プールを用いて得た。未処理の５’末端標識ＤＮＡヘアピンテンプ
レート（レーン１）；ポリメラーゼを欠く反応混合物中の標識テンプレート（レ
ーン２）；濃縮プールの非存在下（レーン３）および存在下（レーン４）での、
室温で２５分間の、完全反応混合物のインキュベーション。レーン５、６、およ
び７は、それぞれ、３７℃、５０℃および６０℃で５分間の、濃縮プールの存在
下での完全反応混合物のインキュベーションを示す。レーン８および９は、濃縮
プールの存在下（レーン８）および非存在下（レーン９）での、７０℃で５分間
の、完全反応混合物のインキュベーションを示す。レーン１０は、末端標識プー
ルＤＮＡのゲル移動度を示す。ゲルの右側の図式は、出発時の末端標識された短
いＤＮＡおよびポリメラーゼ伸長産物の位置を示す。図７Ｂおよび７Ｃは、異なる温度で行った、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ
に関する第二のアッセイを例示する。ＤＮＡは、変性条件下で、１５％ポリアク
リルアミドゲル上で分離する。図７Ｂのデータは、Ｔａｑポリメラーゼを用いて
得、そして図７Ｃのデータは、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて得た。レーン１−３
は、それぞれ、室温、３０℃および３７℃で５分間のインキュベーションに際し
、いかなる阻害剤も非存在下で得た産物を示す。レーン４−６は、非選択ランダ
ム配列プールを用いて得たデータを示し；レーン７−９は、Ｔａｑポリメラーゼ
に関する濃縮プールを用いて得たデータを示し；レーン１０−１２は、Ｔｔｈポ
リメラーゼに関する濃縮プールを用いて得たデータを示し；レーン１３−１５は
、示される３つの温度での５分間のインキュベーションでの、Ｔａｑｓｔａｒｔ
抗体で得たデータを示す。右側の図式は、出発時の末端標識された短いＤＮＡお
よびポリメラーゼ伸長産物を示す。図７Ｄおよび７Ｅは、濃縮プールによるＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの可
逆的阻害を例示する。図７Ｄは、熱周期にさらされていない、濃縮プールの存在
下でのＴａｑポリメラーゼの活性を示し、一方、図７Ｅは、反応に添加される前
に熱周期にさらされた、濃縮プールの存在下でのＴａｑポリメラーゼの活性を示
す。レーン１−５は、それぞれ、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃および４０℃
での５分間のインキュベーションに渡り、形成された産物の量を示す。レーン６
−１０は、それぞれ、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃および４０℃での５分間
のインキュベーションに渡る、濃縮プールの存在下での、Ｔａｑポリメラーゼ活
性を示す。右側の図式は、出発時の末端標識された短いＤＮＡおよびポリメラー
ゼ伸長産物を示す。

【図８】図８は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配
列番号５９）による、Ｔａｑポリメラーゼ（図８Ａ）およびＴｔｈポリメラーゼ
（図８Ｂ）の阻害に対する温度の影響を示す（レーン１−１０）。ＤＮＡは、変
性条件下で、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。レーン１１−１５は
、阻害剤の非存在下での産物の形成を示す。オートラジオグラムの右側は、ポリ
メラーゼ伸長前および後の５’標識テンプレートを図式的に示す。図８Ｃおよび
８Ｄは、それぞれ、Ｔａｑポリメラーゼ（図８Ｃ）およびＴｔｈポリメラーゼ（
図８Ｄ）を用い、リガンドＴＱ２１（白丸）およびリガンドＴＱ３０（黒丸）の
存在下で形成された産物のパーセントを示す。産物量は、ホスホイメージャーに
より定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し
規準化し、産物のパーセントを得た（図８ＣおよびＤ（横座標））。

【図９】図９ＡおよびＢは、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）によるＴ
ａｑポリメラーゼの可逆的阻害を例示する。ＤＮＡは、変性条件下で、１０％ポ
リアクリルアミド上で分離する。レーン１−５は、２０℃−４０℃の間でのイン
キュベーションに際し、いかなる阻害剤も非存在下で得た産物を示す。レーン６
−１０は、熱反復されていないリガンドＴＱ３０（図９Ａ）および２５周期の熱
反復にさらされたリガンドＴＱ３０（図９Ｂ）の存在下で、２０℃−４０℃の間
でのインキュベーションに際し、形成された産物を示す。

【図１０】図１０ＡおよびＢは、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）（黒
丸）およびＴＱ２１（配列番号５９）（白丸）による、Ｔａｑポリメラーゼ（図
１０Ａ）およびＴｔｈポリメラーゼ（図１０Ｂ）の阻害に対するリガンド濃度の
影響を示す。テンプレート伸長アッセイにおける、多様な濃度の阻害剤の存在下
で形成された産物の量は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして阻害剤の
非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た（横座標）
。

【図１１】図１１は、リガンド６（配列番号７８）、１５（配列番号８６
）、１０（配列番号８５）および１８（配列番号８３）によるＴａｑポリメラー
ゼの阻害に対する温度の影響を示す。伸長産物は、変性条件下で、１０％ポリア
クリルアミドゲル上で泳動した後、オートラジオグラフィーにより、解析した。

【図１２】図１２ＡおよびＢは、Ｔａｑポリメラーゼを用い、リガンド６
（黒丸）、リガンド１０（黒三角）、およびリガンド１５（黒四角）（図１２Ａ
）並びにリガンド１８（黒丸）、リガンド１９（黒三角）、およびリガンド２０
（黒四角）（図１２Ｂ）の存在下で形成された産物のパーセントを示す。産物量
は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在
下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。

【図１３】図１３Ａ−Ｆは、リガンドＴＺ１（配列番号９４）、ＴＺ２（
配列番号９６）、ＴＺ３（配列番号１０６）、ＴＺ８（配列番号１００）、ＴＺ
９（配列番号１０１）およびＴＺ１３（配列番号８９）によるＴＺ０５ポリメラ
ーゼの阻害に対する温度の影響を示す。伸長産物は、変性条件下でのゲル電気泳
動後、オートラジオグラフィーにより、解析した。

【図１４】図１４は、高温での親和性選択後に得られた多様なリガンドを
用い、Ｔａｑポリメラーゼの阻害に対するリガンド濃度の影響を示す（リガンド
６（配列番号７８）（黒丸）、リガンド２２（配列番号８１）（黒三角）および
リガンド２８（配列番号８７）（黒四角））。ヘアピン伸長アッセイは、実施例
２に記載されるように行った。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャー
により定量化し、そして阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産
物のパーセントを得た。

【図１５】図１５ＡおよびＢは、Ｔｒｉｓ緩衝液（図１５Ａ）およびＴｒ
ｉｃｉｎｅ緩衝液（図１５Ｂ）中のリガンド６（配列番号７８）（黒丸）、リガ
ンド２２（配列番号８１）（黒三角）およびリガンド２８（配列番号８７）（黒
四角）のＩＣ₅₀値に対する温度の影響を示す。

【図１６】図１６は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの５’→３’エキ
ソヌクレアーゼ活性により触媒される、置換鎖と予測される２つのステム−ルー
プを持つ、９７ヌクレオチドＤＮＡ配列（Ｅｘｏ−Ｓｕｂ）（５’−ＴＴＣＧＡ
ＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴ
ＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣ
ＡＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣ−３’（配列番号７５））の切断を
図式的に例示する。フォールディングした配列の極性は、小さい矢印により示さ
れる。ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により仲介される切断は、
置換鎖およびらせんの結合部近傍で起こり、２０ヌクレオチドおよび７７ヌクレ
オチドの２つのＤＮＡ断片を生じると期待される。分子の両端の黒丸は、放射標
識を示す。

【図１７】図１７は、ＴＺ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に
対する、リガンドＴＺ１３（配列番号８９）、ＴＺ１３一部切除体（５１ヌクレ
オチド）およびＴＺ３６（配列番号９９）の影響の解析を示す。レーンＵは、両
端での未処理Ｅｘｏ−Ｓｕｂ標識の移動度を示す。レーンＣは、リガンドの非存
在下でのＴＺ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ切断から生じる切断産物（
７８ヌクレオチドおよび２４ヌクレオチド）を示す。レーン１−４、５−８、お
よび９−１２は、それぞれ、増加する濃度のＴＺ１３、ＴＺ１３−Ｔｒｎｃおよ
びＴＺ３６リガンドの存在下でのＥｘｏ−Ｓｕｂ切断を示す。アプタマー濃度は
、２５０ｎＭから２０００ｎＭの範囲であった。レーンＣから１２までのす
べての反応は、同一条件下で行った。

【図１８】図１８は、５’標識リガンド６（配列番号７８）、２２（配列
番号８１）および２８（配列番号８７）に対するＴａｑポリメラーゼの影響を例
示する。各リガンドに関し、レーン１および４は、インキュベーションが緩衝液
のみで行われたコントロールである。レーン２および５は、Ｔａｑポリメラーゼ
とのインキュベーション後の結果を示し、そしてレーン３および６は、Ｔａｑポ
リメラーゼおよび４つのｄＮＴＰすべてとのインキュベーション後の結果を示す
。下部の矢印は、エキソヌクレアーゼ切断から生じる切断産物を示し、一方、上
部の矢印は、リガンドの伸長産物を示す。

【図１９】図１９ＡおよびＢは、ＴＱＨ６（配列番号７８）（図１９Ａ）
およびＴＱＨ２２（配列番号８１）（図１９Ｂ）の全長（黒丸）および一部切除
（黒四角）リガンドによるストッフェル断片の阻害を示す。ヘアピン基質の伸長
産物は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非
存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。産物の５０
％が形成された温度は、リガンドのＩＴ₅₀値である。

【図２０】図２０ＡおよびＢは、ＴＱＨ６（図２０Ａ）およびＴＱＨ２２
（図２０Ｂ）の全長（黒丸）および一部切除（黒四角）リガンドによるＴｔｈポ
リメラーゼの阻害を示す。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーによ
り定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規
準化し、産物のパーセントを得た。産物の５０％が形成された温度は、リガンド
のＩＴ₅₀値である。

【図２１】図２１ＡおよびＢは、ＴＱＨ６（図２１Ａ）およびＴＱＨ２２
（図２１Ｂ）の全長（黒丸）および一部切除（黒四角）リガンドによるＴＺ０５
ポリメラーゼの阻害を示す。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーに
より定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し
規準化し、産物のパーセントを得た。産物の５０％が形成された温度は、リガン
ドのＩＴ₅₀値である。

【図２２】図２２ＡおよびＢは、Ｔａｑポリメラーゼ（図２２Ａ）および
Ｔｔｈポリメラーゼ（図２２Ｂ）に対する、ＴＺ１３（配列番号８９）（黒四角
）およびＴＺ５４一部切除体（５１ヌクレオチド）（黒丸）の結合解析を示す。

【図２３】図２３Ａ−Ｃは、ＴＺ０５ポリメラーゼに高温で結合するよう
選択された、リガンドＴＺ１（配列番号９４）（黒丸）、ＴＺ１３（配列番号８
９）（黒四角）およびＴＺ３６（配列番号９９）（黒三角）による、多様な熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼの阻害の解析を示す。図２３Ａは、Ｔｔｈポリメラーゼ
の活性に対するリガンドの影響を示し；図２３Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼの活性
に対するリガンドの影響を示し；図２３Ｃは、ストッフェル断片の活性に対する
リガンドの影響を示す。

【図２４】図２４Ａ−Ｃは、標準的ＰＣＲ増幅、「ホットスタート」ＰＣ
Ｒ、並びにオリゴヌクレオチド阻害剤ＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１
（配列番号５９）の存在下でのＰＣＲ増幅（「ＮｅＸスタートＰＣＲ」）を用い
た、低コピー数標的の検出を例示する。図２４Ａは、〜１０および５０コピーで
標的を検出する際の、標準的条件（レーン１−３）下で行った増幅と、「ホット
スタート」ＰＣＲ（レーン４−６）の比較を例示する。図２４Ｂは、〜１０およ
び５０コピーで標的を検出する際の、非特異的（ＮＳ）オリゴヌクレオチド（レ
ーン１−３）の存在下で行ったＰＣＲ増幅と、ＴＱ２１（レーン４−６）および
ＴＱ３０（レーン７−９）のものの比較を例示する。図２４Ｃは、オリゴヌクレ
オチド阻害剤ＴＱ２１およびＴＱ３０の存在下での、（示されるような）非常に
低い数の標的コピーの検出を例示する。（Ｂ）および（Ｃ）とも、オリゴヌクレ
オチド阻害剤は、５０ｎＭの濃度で用いた。Ｍは分子量標準を示す。各パネル
の矢印は、ゲルにおける標的特異的２０３ｂｐＤＮＡの位置を示す。

【図２５】図２５は、リガンドの一部切除オリゴヌクレオチド阻害剤、Ｔ
ＱＨ６（配列番号７８）、ＴＱＨ２２（配列番号８１）およびＴＱＨ２８（配列
番号８７）の存在下でのＰＣＲ増幅（「ＮｅＸスタートＰＣＲ」）を用いた、低
コピー数標的の検出を例示する。すべてのＰＣＲ増幅は、非手動「ホットスター
ト」を用い、１μｇのヒト胎盤ＤＮＡの存在下で行った。レーン１−４は、リガ
ンドの非存在下で行ったＰＣＲ増幅の結果を示す。奇数のレーンに示される反応
は、ＨＩＶ−２テンプレートＤＮＡを含まず、一方、偶数で示されるものは、１
０コピーのＨＩＶ−２ゲノムＤＮＡを含んだ。矢印は特異的単位複製物を示す。

【図２６】図２６は、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子から１０４ｂｐの単位増幅
物を増幅するＰＣＲ系を用いた、低コピー数標的の検出を例示する。ＴＺ０５
ＤＮＡポリメラーゼを含むすべての増幅反応は、手動ホットスタート条件なしで
行った。レーン１では、テンプレートＤＮＡを添加せず；レーン２では、アプタ
マーを添加せず；レーン３−９では、増加する濃度の５１ヌクレオチド一部切除
ＴＺ１リガンドを用い、完全なＰＣＲを行った。リガンド濃度は、１．３ｎＭ
の濃度から開始し、１つの反応から次には二倍とした。レーンＭはＤＮＡサイズ
標準を示す。

【図２７】図２７ＡおよびＢは、ＴＺ１（図２７Ａ）およびＴＺ１３（図
２７Ｂ）の３０ヌクレオチド一部切除体の存在下で、ＴＺ０５ポリメラーゼによ
るヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の増幅を示す。ＴＺ０５ＤＮＡポリメラーゼを含むす
べての増幅反応は、手動ホットスタート条件なしで行った。レーン１では、テン
プレートＤＮＡを添加しなかった。レーン２では、リガンドを添加しなかった。
レーン３−９では、増加する濃度の各リガンドを用い、完全なＰＣＲを行った。
リガンド濃度は、１．３ｎＭの濃度から開始し、各連続反応で二倍とした。

【図２８】図２８は、ＴＺ３６の５１ヌクレオチド一部切除体の存在下で
、ＴｔｈポリメラーゼによるヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の増幅を示す。すべての増幅
反応は、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含み、そして手動ホットスタート条件な
しで行った。レーン１では、テンプレートＤＮＡを添加しなかった。レーン２で
は、リガンドを添加しなかった。レーン３−９では、増加する濃度のリガンドを
用い、完全なＰＣＲを行った。リガンド濃度は、１．３ｎＭの濃度から開始し
、各連続反応で二倍とした。

【図２９】図２９は、Ｔａｑポリメラーゼの活性に対する、Ｔｒｕｎｃ．
１−３０（配列番号７５）（黒丸）、Ｔｒｎｃ．２−３０（配列番号７６）（黒
四角）およびＴｒｎｃ．３−３０（配列番号７７）（黒三角）の濃度の影響を示
す。多様な濃度の阻害剤の存在下で形成された産物の量は、ホスホイメージャー
により定量化し、そして阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産
物のパーセントを得た（横座標）。

【図３０】図３０は、ストッフェル断片の活性に対する、一部切除リガン
ドＴｒｕｎｃ．１−３０（黒丸）、Ｔｒｎｃ．２−３０（黒四角）およびＴｒｎ
ｃ．３−３０（黒三角）の阻害剤濃度の影響を示す。多様な濃度の阻害剤の存在
下で形成された産物の量は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして阻害剤
の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た（横座標
）。

【図３１】図３１Ａ−Ｃは、一部切除リガンドＴｒｎｃ．２１（配列番号
７０）の親和性および阻害特性を例示する。図３１Ａは、Ｔａｑポリメラーゼに
対するリガンドＴｒｎｃ．２１の結合曲線を示す。図３１Ｂは、Ｔａｑポリメラ
ーゼ（黒丸）およびＴｔｈポリメラーゼ（白丸）の活性に対するＴｒｎｃ．２１
濃度の影響を例示する。ＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼのＩＣ₅₀ 値は、それぞれ、２１および３６．５ｎＭである。図３１Ｃは、Ｔｒｎｃ．２
１によるＴａｑポリメラーゼ（黒丸）およびＴｔｈポリメラーゼ（白丸）の阻害
に対する温度の影響を示す。既定の温度で、阻害剤の存在下で形成された産物の
量を、同一温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物の
パーセントを得た。ＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼの計算ＩＴ₅₀ 値は、それぞれ、３４℃および３５．６℃である。

【図３２】図３２は、リガンド６（配列番号７８）、２２（配列番号８１
）および２８（配列番号８７）の一部切除型に対するＴａｑポリメラーゼの影響
を例示する。本実験では５’末端標識リガンドを用いた。各リガンドに関し、レ
ーン１および４は、インキュベーションが緩衝液のみで行われたコントロールで
ある。レーン２および５は、Ｔａｑポリメラーゼとのインキュベーション後の結
果を示し、そしてレーン３および６は、Ｔａｑポリメラーゼおよび４つのｄＮＴ
Ｐすべてとのインキュベーション後の結果を示す。矢印は、リガンドの伸長産物
を示す。

【図３３】図３３は、ＴＺ０５ポリメラーゼに対するリガンドの一部切除
体の配列を示す。下線のヌクレオチド塩基は、５’および３’固定領域由来であ
る。アステリスクは、ホスホロチオエート結合を示す。

【図３４】図３４ＡおよびＢは、リガンドＴＺ１３（配列番号８９）の異
なる一部切除体によるＴＺ０５ポリメラーゼの阻害に対する温度の影響を例示す
る。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同
一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセ
ントを得た。産物の５０％が形成された温度は、アプタマーのＩＴ₅₀値である。

【図３５】図３５は、ＴＺ１およびＴＺ１３の５’末端標識一部切除リガ
ンドに対するＴＺ０５ポリメラーゼの影響を例示する。レーン１−３およびレー
ン４−６は、各リガンドの５１ヌクレオチドおよび３０ヌクレオチド一部切除体
で得た結果を示す。レーン１および４の反応は、ｄＮＴＰを含まず、一方、レー
ン２、３、５および６ではｄＮＴＰを含んだ。矢印は、エキソヌクレアーゼ切断
から生じる切断産物を示す。

【図３６】図３６は、ホモ二量体（Ｄ．３０−Ｄ．３０）（配列番号７１
）の親和性および阻害特性を示す。図３６Ａは、Ｔａｑポリメラーゼに対するホ
モ二量体（Ｄ．３０−Ｄ．３０）の結合曲線を示す（Ｋ_d＝４７．５±５ｐＭ
）。図３６Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼ活性に対する二量体（黒丸）および単量体
（白丸）リガンド濃度の影響を例示する。Ｔｒｎｃ．２−３０（単量体）のＩＣ ₅₀ 値は４８ｎＭであり、一方、Ｄ．３０−Ｄ．３０（二量体）は１４ｎＭで
ある。

【図３７】図３７ＡおよびＢは、ヘテロ二量体Ｄ．２１−Ｄ．３０（配列
番号７２）の阻害特性を示す。図３７Ａは、Ｔａｑポリメラーゼ（黒丸）および
Ｔｔｈポリメラーゼ（白丸）活性に対するＤ２１−Ｄ３０濃度の影響を例示する
。これら２つのポリメラーゼの阻害に関するＩＣ₅₀値はおよそ３０ｎＭである
。図３７Ｂは、ヘテロ二量体Ｄ．２１−Ｄ．３０によるＴａｑポリメラーゼ（黒
丸）およびＴｔｈポリメラーゼ（白丸）の阻害に対する温度の影響を例示する。
Ｔａｑポリメラーゼに対するＩＴ₅₀値は、４１℃であり、一方、Ｔｔｈポリメラ
ーゼに対する値は、３４．５℃である。

【図３８】図３８は、ＴＺ１３（配列番号８９）核酸リガンドの３つの二
量体の配列およびリンカー構造を示す。

【図３９】図３９ＡおよびＢは、ＴＺ１３（配列番号８９）単量体および
図３８に示される３つの二量体の結合および阻害解析を示す。図３９Ａは、ＴＺ
０５ポリメラーゼに対する３つの二量体および単量体のニトロセルロースフィル
ター結合解析を示し、そして図３９Ｂは、反応温度の関数としての３つの二量体
および単量体によるＴＺ０５ポリメラーゼ活性の阻害解析を示す。

【図４０】図４０ＡおよびＢは、Ｔａｑポリメラーゼに対するＴｒｎｃ．
２１の結合親和性に対する、ｄＮＴＰおよびヘアピンテンプレートＤＮＡの影響
を例示する。図４０Ａは、１ｍＭｄＮＴＰの存在下でのＴｒｎｃ．２１のニ
トロセルロースフィルター結合解析を示す。黒丸は、ヘアピンＤＮＡテンプレー
トの非存在下での結合を示し、一方、白丸は、２５０ｎＭのヘアピンＤＮＡテ
ンプレートの存在下での結合を示す。これらの条件下での計算Ｋ_d値は、およそ
２．５ｎＭである。図４０Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼに対するＴｒｎｃ．２１
の結合に対するｄＮＴＰ濃度の影響を例示する。本実験では、１ｎＭＴａｑ
ポリメラーゼに対する放射標識Ｔｒｎｃ．２１の結合を、多様な濃度のｄＮＴＰ
の存在下でモニターした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA11 HA12 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定する方法であっ
て：ａ）核酸候補混合物を調製し；ｂ）あらかじめ決定された温度で、前記ポリメラーゼと核酸候補混合物を接触さ
せ、ここで、その温度で、候補混合物に比較し、ポリメラーゼに増加した親和性
を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；ｃ）増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｄ）増加した親和性を有する核酸を増幅し、ポリメラーゼに対する結合に関し、
相対的により高い親和性および特異性を持つ核酸配列が濃縮された核酸混合物を
生じ、それにより、ポリメラーゼの核酸リガンドを同定することが可能であることを含む、前記方法。
【請求項２】請求項１の方法であって、さらに：ｅ）工程ｂ）、ｃ）、およびｄ）を反復することを含む、前記方法。
【請求項３】請求項１の方法であって、前記ポリメラーゼがＤＮＡポリ
メラーゼまたは逆転写酵素より選択される、前記方法。
【請求項４】請求項１の方法であって、前記ポリメラーゼが熱安定性で
ある、前記方法。
【請求項５】請求項３の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、サ
ーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ
（Ｔａｑポリメラーゼ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）またはＴＺ０５ポリ
メラーゼより選択される、前記方法。
【請求項６】請求項１の方法であって、前記核酸候補混合物が一本鎖核
酸で構成される、前記方法。
【請求項７】請求項１の方法であって、前記一本鎖核酸がデオキシリボ
核酸である、前記方法。
【請求項８】ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する方法であって、請求
項１の方法にしたがって同定された高親和性ＤＮＡポリメラーゼ核酸リガンドの
有効量を、ＤＮＡ重合反応に添加することを含む、前記方法。
【請求項９】請求項８の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａ
ｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼまたはＴＺ０５ポリメラーゼより選択され
る、前記方法。
【請求項１０】請求項９の方法であって、前記ポリメラーゼリガンドが
、表４（配列番号７８−８４）、表５（配列番号８５−８８）、表６（配列番号
８９−１０６）、図３３（配列番号１０７−１１５）、または図３８（配列番号
１１６−１１８）のリガンドの１つより選択される、前記方法。
【請求項１１】請求項３の方法にしたがって同定された、精製されそし
て単離された、非天然発生核酸リガンド。
【請求項１２】請求項１１の精製されそして単離された、非天然発生核
酸リガンドであって、前記リガンドが、表４（配列番号７８−８４）、表５（配
列番号８５−８８）、表６（配列番号８９−１０６）、図３３（配列番号１０７
−１１５）、または図３８（配列番号１１６−１１８）に示される配列あるいは
その対応する相補的配列からなる群より選択される、前記核酸リガンド。
【請求項１３】請求項１１の精製されそして単離された、非天然発生核
酸リガンドであって、前記リガンドが、表４（配列番号７８−８４）、表５（配
列番号８５−８８）、表６（配列番号８９−１０６）、図３３（配列番号１０７
−１１５）、または図３８（配列番号１１６−１１８）に示される配列あるいは
その対応する相補的配列からなる群より選択されるリガンドに実質的に相同であ
り、そして該リガンドと実質的に同一のポリメラーゼ結合能を有する、前記核酸
リガンド。
【請求項１４】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法であって：ａ）増幅しようとする核酸配列を含む試料を、増幅しようとする配列に隣接する
配列と相補的なプライマー、熱安定性ポリメラーゼ、および該ポリメラーゼをあ
らかじめ決定された温度で阻害することが可能であり、それにもかかわらず上昇
した温度でポリメラーゼが活性化されることを可能にする核酸リガンドと混合し
；そしてｂ）標的核酸を融解し、標的核酸にプライマーをアニーリングさせ、そして標的
核酸を合成する標準的ＰＣＲ工程を、混合物の熱反復により行うことを含む、前記方法。
【請求項１５】請求項１４の方法であって、前記熱安定性ポリメラーゼ
がＴａｑポリメラーゼまたはＴＺ０５ポリメラーゼより選択される、前記方法。
【請求項１６】請求項１４の方法であって、前記核酸リガンドが、表４
（配列番号７８−８４）、表５（配列番号８５−８８）、表６（配列番号８９−
１０６）、図３３（配列番号１０７−１１５）、または図３８（配列番号１１６
−１１８）に示される配列、あるいはその対応する相補的配列からなる群より選
択される、前記方法。
【請求項１７】請求項１４の方法であって、前記リガンドが、表４（配
列番号７８−８４）、表５（配列番号８５−８８）、表６（配列番号８９−１０
６）、図３３（配列番号１０７−１１５）、または図３８（配列番号１１６−１
１８）に示される配列、あるいはその対応する相補的配列からなる群より選択さ
れるリガンドに実質的に相同であり、そして該リガンドと実質的に同一の熱安定
性ポリメラーゼ結合能を有する、前記方法。
【請求項１８】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する方法であ
って、請求項１の方法にしたがって同定された、前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害
する核酸リガンドを、前記リガンドが重合を阻害する温度またはそれ以下の温度
で維持されている、ＤＮＡ重合反応に添加することを含む、前記方法。
【請求項１９】請求項１８の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが
ＴａｑポリメラーゼまたはＴＺ０５ポリメラーゼより選択される、前記方法。
【請求項２０】請求項１８の方法であって、前記ポリメラーゼリガンド
が、表４（配列番号７８−８４）、表５（配列番号８５−８８）、表６（配列番
号８９−１０６）、図３３（配列番号１０７−１１５）、または図３８（配列番
号１１６−１１８）のリガンド、あるいはその対応する相補的配列の１つより選
択されるＤＮＡである、前記方法。
【請求項２１】核酸スイッチを同定する方法であって：ａ）核酸候補混合物を調製し；ｂ）標的化合物と核酸候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物に比較し、標
的に増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能で
ある；ｃ）増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物状態から分配し、それによ
り増加した親和性を有する核酸を、環境パラメーターの変動に際し、標的への親
和性を欠くことに基づき、さらに分配し；そしてｄ）増加した親和性を有する核酸を増幅し、ポリメラーゼに対する結合に関し、
相対的により高い親和性および特異性を持つ核酸配列が濃縮された核酸混合物を
生じ、それにより、ポリメラーゼの核酸リガンドを同定することが可能であることを含む、前記方法。