ES2358235T3 - Ligandos de ácido nucleico que se unen a adn polimerasas y las inhiben. - Google Patents
Ligandos de ácido nucleico que se unen a adn polimerasas y las inhiben. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2358235T3 ES2358235T3 ES09000032T ES09000032T ES2358235T3 ES 2358235 T3 ES2358235 T3 ES 2358235T3 ES 09000032 T ES09000032 T ES 09000032T ES 09000032 T ES09000032 T ES 09000032T ES 2358235 T3 ES2358235 T3 ES 2358235T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- polymerase
- seq
- acid ligand
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 335
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 326
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 326
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 283
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 174
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 162
- 108010020713 Tth polymerase Proteins 0.000 claims description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 112
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 74
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 65
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 54
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 54
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 34
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 claims description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 241000589596 Thermus Species 0.000 claims description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 75
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 53
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 45
- 239000000047 product Substances 0.000 description 40
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 26
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 16
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 10
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 4
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- -1 iodoacetyl Chemical group 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 4
- 102100022385 Activity-dependent neuroprotector homeobox protein Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 101000755474 Homo sapiens Activity-dependent neuroprotector homeobox protein Proteins 0.000 description 3
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 3
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940123066 Polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- PSOZMUMWCXLRKX-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-6-pentan-2-ylphenol Chemical compound CCCC(C)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O PSOZMUMWCXLRKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGNOTKMIMZMNRX-XVFCMESISA-N 2-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-4-one Chemical compound NC1=NC(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RGNOTKMIMZMNRX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical class O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical class BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 5-iodouracil Chemical class IC1=CNC(=O)NC1=O KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000557720 Thermus brockianus Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108010018161 UlTma DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000003314 affinity selection Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007850 in situ PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229920001187 thermosetting polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ligando de ácido nucleico para una ADN polimerasa termoestable, en el que el ligando de ácido nucleico se une a dicha polimerasa e inhibe a la misma a temperaturas ambientes, aunque permite que la polimerasa se active a temperaturas elevadas.
Description
[0001] En la presente invención se describen procedimientos para identificar y preparar ligandos de ácido nucleico con alta afinidad por las ADN polimerasas, específicamente para las ADN polimerasas termoestables. En una realización preferida, la ADN polimerasa se selecciona de entre la polimerasa Taq, una polimerasa termoestable aislada de Thermus aquaticus, o la polimerasa Tth, una ADN polimerasa y transcriptasa inversa termoestable aislada 10 de Thermus thermophilus. El procedimiento utilizado en la presente invención para identificar tales ligandos de ácido nucleico se denomina SELEX, un acrónimo (en inglés) de Evolución Sistemática Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial. También se describen en la presente invención un procedimiento mejorado para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa usando los ligandos de ácido nucleico de esta invención. En la presente invención específicamente se describen ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad por la polimerasa Taq y polimerasa 15 Tth. La invención incluye ligandos de ADN de alta afinidad, los cuales se unen a la polimerasa Taq y polimerasa Tth, inhibiendo de ese modo su capacidad para polimerizar la síntesis del ADN a temperaturas ambiente. En esta invención se incluyen además interruptores de ácido nucleico. Los ligandos de ácido nucleico de esta invención, con unión dependiente de la temperatura a las ADN polimerasas, son ejemplo de ligandos cuyas propiedades deseables puede activarse y desactivarse en base a cualquier número de condiciones de reacción. 20
[0002] La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica recientemente desarrollada que ha tenido un impacto significativo en muchas áreas de la ciencia. La PCR es un procedimiento rápido y sencillo para 25 amplificar específicamente una secuencia diana de ADN de forma exponencial. (Saiki et al. (1985) Science 230:1350; Mullis y Faloona (1987) Methods Enzymol. 155:335). De forma resumida, el procedimiento consiste en sintetizar un grupo de cebadores que tienen secuencias nucleotídicas complementarias del ADN que flanquea la secuencia diana. Los cebadores se mezclan a continuación con una solución del ADN diana, una polimerasa de ADN termoestable, y los cuatro desoxinucleótidos (A, T, C y G). La solución se calienta entonces hasta una 30 temperatura suficiente para separar las hebras de ADN complementarias (aproximadamente 95˚C), y se enfría a continuación hasta una temperatura suficiente para permitir que los cebadores se unan a las secuencias flanqueantes. La mezcla de reacción se caliente entonces de nuevo (hasta aproximadamente 72˚C) para permitir el progreso de la síntesis del ADN. Después de un breve período de tiempo, la temperatura de la reacción se incrementa de nuevo hasta una temperatura suficiente para separar el recién formado ADN de doble hebra, 35 completándose de este modo el primer ciclo de la PCR. La mezcla de reacción se enfría entonces y se repite el ciclo. Por tanto, la PCR consiste en ciclos repetitivos de fusión, hibridación y síntesis del ADN. Veinte ciclos de replicación pueden rendir una amplificación de hasta un millón de veces de la secuencia diana de ADN. La capacidad para amplificar una única molécula de ADN mediante la PCR tiene aplicaciones en la microbiología ambiental y alimentaria (Wernars et al. (1991) Appl. Env. Microbiol. 57:1914-1919; Hill y Keasler (1991) Int. J. Food Microbiol. 40 12:67-75), en la microbiología clínica (Wages et al. (1991) J. Med. Virol. 33:58-63; Sacramento et al. (1991) Mol. Cell Probes 5:229-240; Laure et al. (1988) Lancet 2:538), en la oncología (Kumar y Barbacid (1988) Oncogene 3:647-651; McCormick (1989) Cancer Cells 1:56-61; Crescenzi et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4869), en la prognosis de enfermedades genéticas (Handyside et al. (1990) Nature 344:768-770), en los bancos de sangre (Jackson (1990) Transfusion 30:51-57) y en las ciencias forenses (Higuchi et al. (1988) Nature (London) 332:543). 45
[0003] La disponibilidad de ADN polimerasas termoestables, tales como la polimerasa de ADN Taq, ha simplificado y mejorado la PCR. Originalmente, sólo estaban disponibles polimerasas sensibles al calor, tales como la ADN polimerasa de E. coli, para su uso en la PCR. Sin embargo, las polimerasas sensibles al calor se destruyen a las temperaturas necesarias para fundir el ADN de doble hebra, y debe añadirse polimerasa adicional después de 50 cada ciclo de la PCR. La polimerasa de ADN Taq, aislada de la bacteria termofílica Thermus aquaticus, es estable hasta los 95˚C, y su uso en la PCR ha eliminado la necesidad de añadir de forma repetitiva de polimerasas sensibles a la temperatura después de cada ciclo térmico. Adicionalmente, puesto que la polimerasa Taq puede usarse a temperaturas más elevadas, ha mejorado la especificidad y sensibilidad de la PCR. La razón de la especificidad mejorada y que a temperaturas más elevadas, la unión de los promotores a sitios distintos de los deseados 55 (fenómeno denominado "mispriming") está significativamente reducida.
[0004] Desde su descubrimiento, la Reacción en Cadena de la Polimerasa ha sido modificada para varias aplicaciones, tales como la PCR in situ, en la cual el límite de detección de la hibridación in situ tradicional se ha llevado hasta el nivel de la copia única (Haase et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4971-4975), y la PCR con 60 transcriptasa inversa (RT-PCR), en donde una secuencia de ARN se convierte en su copia de ADN (ADNc) mediante la transcriptasa inversa (RT) antes de ser amplificada por la PCR, convirtiendo el ARN en un sustrato para la PCR
(Kawasaki (1991) "Amplification of RNA in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications," editores Innis et al., Academic Press Inc., San Diego, CA, 21-27). Sin embargo, las transcriptasas inversas víricas mesofílicas a menudo son incapaces de sintetizar moléculas de ADNc de longitud completa, porque no pueden "leer a lo largo" de las estructuras secundarias estables de las moléculas de ARN. Esta limitación se ha superado recientemente mediante el uso de una polimerasa aislada de Thermus thermophilus (polimerasa Tth). La polimerasa Tth es una 5 polimerasa termoestable que puede funcionar como transcriptasa inversa y como ADN polimerasa (Myers y Gelfand (1991) Biochemistry 30:7662-7666). La transcripción inversa realizada a una temperatura elevada usando la polimerasa Tth elimina las estructuras secundarias del ARN plantilla, haciendo posible la síntesis de ADNc de longitud completa.
10
[0005] Aunque se ha hecho un progreso significativo en la tecnología de la PCR, la amplificación de oligonucleótidos que no son diana debida a reacciones secundarias, tales como el cebado incorrecto del ADN de fondo y/o la oligomerización del cebador, todavía presenta un problema significativo. Esto es especialmente cierto en las aplicaciones de diagnóstico en las cuales la PCR se lleva a cabo en un medio que contiene ADN de fondo, mientras que el ADN puede estar presente en una única copia (Chou et al. (1992) Nucleic Acid Res. 20:717-1723). 15 Se ha determinado que estas reacciones secundarias a menudo ocurren cuando todos los reactivos se han mezclado a temperatura ambiente antes de iniciarse el ciclado térmico.
[0006] Se han descrito dos procedimientos que minimizan estas reacciones secundarias. En el primer procedimiento, denominado PCR "de arranque en caliente (hot start)" (Chou et al. (1992) Nucleic Acid Res. 20:1717-20 1723; D’Aquila et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:3749), todos los reactivos se calientan a 72˚C antes de añadir el reactivo final, usualmente la polimerasa. En la PCR "de arranque en caliente" mediada por cera, un componente o componentes cruciales para la actividad de la polimerasa se separa físicamente, a baja temperatura, del resto de la mezcla de reacción mediante una capa de cera que se funde a partir del calentamiento en el primer ciclo (Chou et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1717; Horton et al. (1994) BioTechniques 16:42). La PCR "de arranque en caliente" 25 tiene ciertas desventajas; la obligatoriedad de reabrir los tubos antes de iniciar el termociclado incrementa la contaminación entrecruzada y el pipeteado repetido la hace tediosa a la hora de manipular un número elevado de muestras. Un reactivo que pueda colocarse directamente en la mezcla de reacción, junto con el resto de los componentes de reacción, e inhiba la polimerasa a temperatura ambiente será útil para superar las limitaciones asociadas con la PCR "de arranque rápido". Aunque este procedimiento incrementa la especificidad, reduciendo de 30 ese modo los productos secundarios, el procedimiento es inconveniente para tratar un número elevado de muestras, la mezcla de reacción puede contaminarse más fácilmente, y el procedimiento es propenso a errores.
[0007] En el segundo procedimiento, se añade al mezcla de reacción completa un anticuerpo neutralizante contra la polimerasa Taq (denominado como Taqstart). Este anticuerpo inhibe la actividad polimerasa a temperatura 35 ambiente (Kellogg et al. (1994) BioTechniques 16:1134-1137), pero se inactiva mediante desnaturalización por calor una vez la reacción se ha termociclado, haciendo activa la polimerasa. El inconveniente de esta estrategia para reducir los productos secundarios es que el anticuerpo anti-Taq debe almacenarse a -20˚C hasta su uso, lo que significa que los equipos de detección deben empaquetarse y enviarse en condiciones controladas, lo que incrementa su coste. Además, para una única PCR se necesita una cantidad significativa de anticuerpo (∼1 µg de 40 anticuerpo/5 U de polimerasa Taq).
[0008] El desarrollo de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad capaces de inhibir las polimerasas Taq y Tth termoestables evitaría la necesidad del procedimiento "de arranque rápido" y superaría las limitaciones asociadas con el segundo procedimiento. Pueden desarrollarse inhibidores de ácido nucleico que son 45 extremadamente específicos y tienen una afinidad elevada. Puesto que los ácidos nucleicos con más estables que las proteínas a temperatura ambiente, pueden evitarse los problemas de empaquetado y transporte asociados con el uso de anticuerpos. Adicionalmente, pueden identificarse ácidos nucleicos que, al igual que los anticuerpos, pierdan su afinidad por la polimerasa a temperaturas más elevadas, permitiendo la activación de la polimerasa cuando se desee. El potencial del cebado incorrecto en la PCR mediado por los propios inhibidores basados en ácidos 50 nucleicos funcionando como cebadores (además de los cebadores específicos usados en la rea cción) puede eliminarse cubriendo sus extremos 3'.
[0009] Las estructuras mediante rayos-X de cristales de varias ADN polimerasas han indicado que se pliegan en estructuras tridimensionales similares. (Para una revisión, consultar Joyce y Steitz (1994) Annu. Rev. Biochem. 55 63:777). El dominio C-terminal responsable de la polimerización se organiza en tres subdominios que representan la "palma", "dedos", y "pulgar", anatómicamente análogos a la mano derecha. La polimerasa Tth y la polimerasa Taq son un 93% similares y un 88% idénticas a nivel de secuencia de aminoácidos (Abramson (1995) en "PCR Strategies" (Academic Press, Nueva York). Ambas carecen de actividad 3’-5’ exonucleasa, pero contienen actividad 5’-3’ exonucleasa (Abramson (1995) en "PCR Strategies" (Academic Press, Nueva York); Tindall y Kunkel (1988) 60 Biochemistry 27:6008). Por tanto, puede esperarse que los ligandos de ácido nucleico inhibidores se comporten de forma similar a ambos enzimas, así como a otras polimerasas termoestables. Esto haría posible el uso de un único
inhibidor para una cierto número de enzimas termoestables.
[0010] Se ha desarrollado un procedimiento para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con unión 5 altamente específica a moléculas diana. Este procedimiento, Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial, denominado SELEX, se describe en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/536.428, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment," actualmente abandonada, en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/714,131, registrada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands," que actualmente es la patente estadounidense nº 5.475.096, en la solicitud de 10 patente estadounidense con número de serie 07/931.473, registrada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands," que actualmente es la patente estadounidense nº 5.270.163 (consultar también PCT/US91/04078). Cada una de estas solicitudes, conjuntamente denominadas en la presente invención como las Solicitudes de Patente SELEX, describe un procedimiento fundamentalmente novedoso para preparar un ligando de ácido nucleico contra cualquier molécula diana deseada. 15
[0011] El procedimiento SELEX implica la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones paso a paso de la unión, reparto y amplificación, usando el mismo esquema general de selección, para conseguir virtualmente cualquier criterio de afinidad de unión y selectividad deseado. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que preferiblemente comprende un segmento de una secuencia aleatoria, el procedimiento SELEX 20 incluye los pasos de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las molécula diana, disociar los complejos de ácido nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos disociados a partir de los complejos de ácido nucleico-diana para rendir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando, a continuación reiterar los pasos de unión, reparto, disociación y amplificación a través de tantos ciclos como se desee para obtener 25 ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad por la molécula diana.
[0012] Se ha modificado el procedimiento SELEX básico para conseguir un cierto número de objetivos. Por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/960.093, registrada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure," describe el uso de SELEX 30 conjuntamente con la electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como el ADN doblado. La solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/123.935, registrada el 17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands" describe un procedimiento basado en SELEX para seleccionar ligandos de ácido nucleico que contienen grupos fotorreactivos capaces de unirse a, y/o entrecruzarse con, y/o fotoinactivar una molécula diana. La solicitud de patente 35 estadounidense con número de serie 08/134.028, registrada el 7 de octubre de 1993, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine," describe un procedimiento para identificar ligandos de ácido nucleico específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente relacionadas, denominado Counter-SELEX. La solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/143.564, registrada el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Solution SELEX," 40 describe una procedimiento basado en SELEX que consigue un reparto altamente eficiente entre oligonucleótidos que tienen una afinidad elevada y baja por una molécula diana. La solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/964.624, registrada el 21 de octubre de 1992, titulada "Methods of Producing Nucleic Acid Ligands," que actualmente es la patente estadounidense nº 4.496.938, describe procedimientos para obtener ligandos de ácido nucleico mejorados una vez se ha realizado la SELEX. La solicitud de patente estadounidense con número de serie 45 08/400.440, registrada el 8 de marzo de 1995, titulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment: Chemi-SELEX," describe procedimientos para unir covalentemente un ligando a su diana.
[0013] El procedimiento SELEX abarca la identificación de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como una estabilidad in 50 vivo mejorada, o características de suministro mejoradas. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen las sustituciones químicas en posiciones de la ribosa y/o del fosfato y/o de la base. Se describen ligandos de ácido nucleico, que contienen nucleótidos modificados, identificados mediante SELEX, en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/117.991, registrada el 8 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides," la cual describe oligonucleótidos que contienen derivados de 55 nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5- y 2'- de las pirimidinas. La solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/134.028, ver más arriba, describe ligandos de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2’-amino (2’-NH2), 2’-fluoro (2’-F), y/o 2’-O-metilo (2’-OMe). La solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/264.029, registrada el 22 de junio de 1994, titulada "Novel Method of Preparation of 2’ Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement," describe 60 oligonucleótidos que contienen varias pirimidinas modificadas en 2'.
[0014] El procedimiento SELEX abarca la combinación de oligonucleótidos seleccionados con otras unidades funcionales oligonucleotídicas y no oligonucleotídicas, según se describe respectivamente en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/284.063, registrada el 2 de agosto de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX" y en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/234.997, registrada el 28 de abril de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential 5 Enrichment: Blended SELEX". Estas solicitudes permiten la combinación de un amplio elenco de formas y otras propiedades, y las propiedades de replicación y amplificación efectiva, de los oligonucleótidos, con las propiedades deseables de otras moléculas. Cada una de las solicitudes de patente descritas anteriormente que describen modificaciones del procedimiento SELEX básico se incorporan en su totalidad específicamente por referencia en la presente invención. 10
[0015] WO91/19813 A (UNIV COLORADO FOUNDATION) describe los métodos de base SELEX para la producción de aptámeros dirigidos a varias proteínas, incluyendo las ADN polimerasas de T4 y VIH. EP 0592 035 A (EASTMAN KODAK CO) describe la utilización de anticuerpos inhibidoras de polimerasa para reducir el cebado erróneo (“mispriming”) a baja temperatura en reacciones PCR. 15
[0016] La presente invención incluye procedimientos para identificar y producir ligandos de ácido nucleico para polimerasas de ADN. Específicamente se incluyen procedimientos para identificar ligandos de ácido nucleico para 20 ADN polimerasas termoestables útiles en la Reacción en Cadena de la Polimerasa, incluyendo las polimerasas Taq y Tth, y los ligandos de ácido nucleico identificados y producidos de ese modo. Más particularmente, se proporcionan secuencias de ADN que son capaces de unirse respectivamente de forma específica a las polimerasas Taq y Tth, inhibiendo de ese modo su capacidad para catalizar la síntesis de ADN a temperatura ambiente. El procedimiento de esta descripción puede extenderse para identificar y producir ligandos de ácido nucleico para 25 cualquier ADN polimerasa termoestable, y los ligandos identificados y producidos de ese modo.
[0017] En esta descripción se incluye además un procedimiento para identificar ligandos de ácido nucleico y secuencias de ligando de ácido nucleico para las polimerasas Taq y Tth, el cual comprende los pasos de (a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos, (b) repartir los miembros de dicha mezcla candidata en base a 30 la afinidad por las polimerasas Taq o Tth, y (c) amplificar las moléculas seleccionadas para rendir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácido nucleico con una afinidad relativamente elevada por la unión respectivamente a las polimerasas Taq y Tth.
[0018] También se incluye en esta descripción un procedimiento mejorado para llevar a cabo la Reacción en 35 Cadena de la Polimerasa, el cual comprende el paso de incluir un ligando de ácido nucleico que inhibe la polimerasa termoestable a temperatura ambiente, pero que se disocia de la polimerasa a temperaturas elevadas. Ambos ligandos de ácido nucleico se identifican de acuerdo con el procedimiento de esta invención.
[0019] Más específicamente, la presente invención incluye los ligandos de ADNss contra la polimerasa Taq y 40 polimerasa Tth identificados de acuerdo con el procedimiento descrito más arriba, incluyendo aquellos ligandos listados en las TABLAS 2-5 (SEC. Nº ID: 7-73). También se describen los ligandos de ADN para la polimerasa Taq y polimerasa Tth que son sustancialmente homólogos de cualquier de los ligandos proporcionados, y que tienen sustancialmente la misma capacidad para unir e inhibir la actividad de la polimerasa Taq y de la polimerasa Tth. También se incluyen en esta descripción los ligandos de ADN para la polimerasa Taq y polimerasa Tth que tienen 45 sustancialmente la misma forma estructural que los ligandos presentados en la presente invención, y que tienen sustancialmente la misma capacidad para unir e inhibir la actividad de la polimerasa Taq y de la polimerasa Tth.
[0020] La presente invención incluye también secuencias de nucleótidos modificados que se basan en los ligandos de ADN identificados en la presente invención, y en mezclas de los mismos. 50
[0021] Los ligandos de ácido nucleico de la presente invención pueden funcionar como "interruptores" en el sentido en que "encienden" o "apagan" la Reacción en Cadena de la Polimerasa dependiendo de la temperatura de la mezcla de reacción. La presente invención, por tanto, incluye también un procedimiento para identificar y preparar secuencias de ligando de ácido nucleico y secuencias de ligando de ácido nucleico que funcionan como 55 interruptores, el cual comprende los pasos de (a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos, (b) repartir los miembros de dicha mezcla candidata en base a la afinidad por las polimerasas Taq o Tth, y (c) amplificar las moléculas seleccionadas usando la molécula diana para rendir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácido nucleico con una afinidad relativamente elevada por la unión respectivamente a las polimerasas Taq y Tth sólo a temperaturas inferiores a la temperatura de amplificación. 60
[0022] Por tanto, la presente invención incluye procedimientos para la identificación de interruptores de ácido
nucleico. Los interruptores de ácidos nucleicos son ácidos nucleicos identificados mediante el proceso SELEX, en donde la propiedad deseada del ácido nucleico puede "encenderse" o "apagarse" dependiendo de la manipulación de algún parámetro del entorno. Los interruptores de ácido nucleico pueden identificarse mediante la manipulación del paso de reparto de SELEX para seleccionar ácidos nucleicos que proporcionen resultados opuestos, a menudo uniéndose a la diana, en base a una alteración en un parámetro del medio de reacción. Los ejemplos en este caso 5 demuestran interruptores de ácidos nucleicos que se encienden y apagan en base a la temperatura, sin embargo, el procedimiento de esta invención pueden extenderse para identificar y preparar ligandos de ácido nucleico que funcionen como interruptores en base a condiciones distintas de la temperatura, incluyendo pero no limitándose al pH, la concentración de iones específicos, por ejemplo, Mg++.
10
[0023] En particular, la presente invención proporciona un ligando de ácido nucleico para una ADN polimerasa termoestable, donde el ligando de ácido nucleico se une a dicha polimerasa y la inhibe a temperatura ambiente, aunque permite que la polimerasa se active a temperaturas elevadas, tal como se define en las reivindicaciones.
[0024]
La FIGURA 1A muestra las afinidades de unión de grupos de ADN enriquecidos después de 12 rondas de SELEX (○) y del grupo aleatorio de ADN no seleccionado (•) para la polimerasa Taq. La FIGURA 1B 20 muestra las afinidades de unión de grupos de ADN enriquecidos después de 10 rondas de SELEX (○) y del grupo aleatorio de ADN no seleccionado (•) para la polimerasa Tth.
La FIGURA 2A muestra un análisis de unión entrecruzada del grupo de ADN enriquecido para la polimerasa Taq (○), y del grupo de ADN enriquecido para la polimerasa Tth (•), con la polimerasa Tth. La 25 FIGURA 2B muestra un análisis de unión entrecruzada del grupo de ADN enriquecido para la polimerasa Taq (○), y del grupo de ADN enriquecido para la polimerasa Tth (•), con la polimerasa Taq.
La FIGURA 3A ilustra una curva de unión del ligando 30 (•) y el ligando 21 (•) a la polimerasa Taq. La FIGURA 3B ilustra una curva de unión del ligando 30 (•) y el ligando 21 (○) a la polimerasa Tth. 30
La FIGURA 5A ilustra un ensayo de actividad polimerasa para las polimerasas Taq y Tth, llevado a cabo a temperaturas diferentes con diferentes tiempos de incubación. El ADN se resolvió en un gel de 35 poliacrilamida al 15% en condiciones desnaturalizantes. Los datos en el Panel A se obtuvieron con la polimerasa Taq y el grupo enriquecido seleccionado para la polimerasa Taq, mientras que los del Panel B se obtuvieron con la polimerasa Tth y el grupo enriquecido seleccionado para la polimerasa Tth. La plantilla sin tratar, de horquilla de ADN marcada en el extremo 5' (carril 1); la plantilla marcada en una mezcla de reacción que carece de polimerasa (carril 2); la incubación de la mezcla de reacción completa 40 durante 24 minutos a temperatura ambiente en ausencia de (carril 3) y en presencia del grupo enriquecido (carril 4). Los carriles 5, 6, y 7 muestran las incubaciones de las mezclas de reacción completas, en presencia del grupo enriquecido, durante 5 minutos respectivamente a 37˚C, 50˚C y 60˚C. Los carriles 8 y 9 muestran las incubaciones de las mezclas de reacción completas en presencia (carril 8) y ausencia (carril 9) del grupo enriquecido a 70˚C durante 5 minutos. El carril 10 muestra la movilidad en 45 gel del ADN del grupo marcado en el extremo. Los esquemas a la derecha de los geles ilustran las posiciones del ADN corto, marcado en su extremo, inicial y del producto extendido de la polimerasa.
Las FIGURAS 5B y 5C ilustran un segundo ensayo de actividad polimerasa para las polimerasas Taq y Tth, realizado a tres temperaturas diferentes. El ADN se resolvió en un gel de poliacrilamida al 15% en 50 condiciones desnaturalizantes. Los datos en la FIGURA 5B se obtuvieron con la polimerasa Taq, y los datos en la FIGURA 5C se obtuvieron con la polimerasa Tth. Los carriles 1-3 muestran los productos obtenidos en ausencia de cualquier inhibidor a partir de la incubación respectivamente a temperatura ambiente, a 30˚C y 37˚C, durante 5 minutos. Los carriles 4-6 muestran los datos obtenidos con el grupo de secuencia aleatoria no seleccionada; los carriles 7-9 con el grupo enriquecido para la polimerasa Taq; 55 los carriles 10-12 con el grupo enriquecido para la polimerasa Tht; los carriles 13-15 con el anticuerpo Taqstart durante incubaciones de 5 minutos a las tres temperaturas indicadas. Los esquemas a la derecha indican el ADN corto inicial marcado en el extremo y el producto extendido de la polimerasa.
Las FIGURAS 5D y 5E ilustran un tercer ensayo de actividad polimerasa para las polimerasas Taq y Tth, 60 resuelto sobre un gel de poliacrilamida al 15% en condiciones desnaturalizantes. La FIGURA 5D muestra la actividad de la polimerasa Taq en presencia del grupo enriquecido que no ha sido sometido a ciclado
térmico, mientras que la FIGURA 5E muestra la actividad de la polimerasa Taq en presencia de un grupo que se ha ciclado térmicamente. Los carriles 1-5 indican la cantidad de producto formado a lo largo de incubaciones de 5 minutos respectivamente a 20˚C, 25˚C, 30˚C, 35˚C y 40˚C. Los carriles 6-10 muestran la actividad de la polimerasa Taq, en presencia del grupo enriquecido, a lo largo de incubaciones de 5 minutos respectivamente a 20˚C, 25˚C, 30˚C, 35˚C y 40˚C. Los esquemas a la derecha ilustran el ADN 5 corto, marcado en el extremo, de inicio y el producto extendido de la polimerasa.
La FIGURA 6 ilustra el efecto de la temperatura sobre la inhibición de la polimerasa Taq (FIGURA 6A) y la polimerasa Tth (FIGURA 6B) mediante los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) (carriles 1-10). El ADN se resolvió en un gel de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes. 10 Los carriles 11-15 ilustran la formación de producto en ausencia de un inhibidor. El lado derecho del autorradiograma ilustra esquemáticamente la plantilla marcada en 5' antes y después de la extensión con polimerasa. Las FIGURAS 6C y 6D muestran el porcentaje de producto formado en presencia del ligando TQ21 (○) y del ligando TQ30 (•) usando respectivamente la polimerasa Taq (FIGURA 6C) y la polimerasa Tth (FIGURA 6D). La cantidad de producto se cuantificó mediante PhosphorImager y se normalizó 15 respecto el producto formado en ausencia de un inhibidor a la misma temperatura, para obtener el porcentaje de producto (FIGURAS 6C y 6D (abscisas)).
La FIGURA 7 ilustra la inhibición reversible de la polimerasa Taq por parte del ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50). El ADN se resolvió en un gel de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes. Los 20 carriles 1-5 muestran los productos obtenidos en ausencia de cualquier inhibidor a partir de la incubación entre 20˚C-40˚C. Los carriles 6-10 muestran los productos formados a partir de la incubación entre 20˚C-40˚C en presencia del ligando TQ30 que no había sido termociclado (FIGURA 7A) y del ligando TQ30 que había sido sometido a 25 rondas de termociclado.
25
La FIGURA 8 ilustra el efecto de la concentración de ligando sobre la inhibición de la polimerasa Taq (FIGURA 8A) y de la polimerasa Tth (FIGURA 8B) por part de los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) (•) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) (○). La cantidad de producto formada en presencia de diversas concentraciones de inhibidor, en los ensayos de extensión de la plantilla, se cuantificó mediant PhosphorImager y se normalizó respecto la cantidad de producto formado en ausencia de un inhibidor, para obtener el 30 porcentaje de producto (abscisas).
La FIGURA 9 ilustra esquemáticamente el corte de la secuencia de ADN de 97 nucleótidos (Exo-Sub) (5’-TTCGAGCGTG AATCTGAATT CGCGGCTAGC CAGCTTTTGC TG GCTAGCCG CGGTGGGAAA CTGAGGTAGG TGTTTTCACC TACCTCAG TT TCCCACC-3’ (SEC. Nº ID.: 75)), con dos tallos-bucles 35 predichos con una hebra desplazada, catalizada por la actividad 5'-3' exonucleasa de las polimerasas Taq y Tth. La polaridad de la secuencia plegada se indica mediante la flecha pequeña. El corte mediado por la actividad exonucleasa de las polimerasas de ADN se espera que ocurra cerca de la unión de la hebra desplazada y la hélice, y que resulte en dos fragmentos de 20 nucleótidos y 77 nucleótidos. Los círculos rellenos en los dos extremos de la molécula indican marcas radiactivas. 40
La FIGURA 10 ilustra la detección de una diana con un número bajo de copias usando la amplificación mediante la PCR estándar, la PCR "de arranque en caliente", y la amplificación mediante la PCR en presencia de los inhibidores de oligonucleótido TQ30 y TQ21 ("PCR NeXstart"). La FIGURA 10A ilustra una comparación de la amplificación realizada en condiciones estándares (carriles 1-3) con las de la PCR 45 "de arranque en caliente" (carriles 4-6) para detectar la diana en ∼10 y 50 copias. La FIGURA 10B ilustra una comparación de las amplificaciones de PCR realizadas en presencia de oligonucleótido no específico (NS) (carriles 1-3), con las del TQ21 (carriles 4-6) y TQ30 (carriles 7-9) para detectar la diana en ∼10 y 50 copias. La FIGURA 10C ilustra la detección de una diana con un número bajo de copias (según se indica) en presencia de los inhibidores oligonucleotídicos TQ21 y TQ30. En ambas (B) y (C), 50 los inhibidores oligonucleotídicos se usaron a una concentración de 50 nM. M indica los estándares de peso molecular. Las flechas en cada panel muestran la posición en los geles del ADN de 203 p.b. específico de la diana.
La FIGURA 11 ilustra el efecto de la concentración de ligandos truncados, Trunc.1-30 (SEC. Nº ID.: 75) 55 (•), Trnc.2-30 (SEC. Nº ID.: 76) (■) y Trnc.3-30 (SEC. Nº ID.: 77) (○), sobre la actividad de la polimerasa Taq. La cantidad de producto formada en presencia de diversas concentraciones de inhibidor se cuantificó mediante PhosphorImager, y se normalizó respecto la cantidad de producto formado en ausencia de un inhibidor para obtener el porcentaje de producto (abscisas).
60
La FIGURA 12 ilustra el efecto de la concentración de inhibidor de los ligandos truncados, Trunc.1-30 (•), Trnc.2-30 (■) y Trnc. 3-30 (▲), sobre la actividad del fragmento Stoffel. La cantidad de producto formada
en presencia de diversas concentraciones de inhibidor se cuantificó mediante PhosphorImager, y se normalizó respecto la cantidad de producto formado en ausencia de un inhibidor para obtener el porcentaje de producto (abscisas).
La FIGURA 13 ilustra las características de afinidad e inhibición del ligando truncado Trnc.21 (SEC Nº 5 ID.: 70). La FIGURA 13A ilustra una curva de unión del ligando Trnc.21 a la polimerasa Taq. La FIGURA 13B ilustra el efecto de la concentración de Trnc.21 sobre la actividad de la polimerasa Taq (•) y la polimerasa Tth (○). Los valores IC50 para la polimerasa Taq y la polimerasa Tth son respectivamente 21 y 36.5 nM. La FIGURA 13C ilustra el efecto de la temperatura sobre la inhibición de la polimerasa Taq (•) y de la polimerasa Tth (○) por parte del Trnc.21. La cantidad de producto formado en presencia del 10 inhibidor a una temperatura determinada se normalizó respecto a la formada en ausencia de un inhibidor a la misma temperatura para obtener el porcentaje de producto. Los valores de IT50 calculados para la polimerasa Taq y la polimerasa Tth son respectivamente 34˚C y 35,6˚C.
La FIGURA 14 ilustra la afinidad y características de inhibición del homodímero (D.30-D.30) (SEC Nº ID.: 15 71). La FIGURA 14A ilustra una curva de unión para el homodímero (D.30-D.30) a la polimerasa Taq (Kd = 47,5 ± 5 pM). La FIGURA 14B ilustra el efecto de las concentraciones de ligando dimérico (•) y monomérico (○) sobre la actividad de la polimerasa Taq. El valor de IC50 del Trnc.2-30 (monómero) es 48 nM, mientras que el del D.30-D.30 (dímero) es 14 nM.
20
La FIGURA 15 ilustra las características de inhibición del heterodímero D.21-D.30 (SEC Nº ID.: 72). La FIGURA 15A ilustra el efecto de la concentración de D.21-D.30 sobre la actividad de la polimerasa Taq (•) y la polimerasa Tth (○). Los valores de IC50 para la inhibición de estas dos polimerasas son aproximadamente 30 nM. La FIGURA 15B ilustra el efecto de la temperatura sobre la inhibición de la polimerasa Taq (•) y de la polimerasa Tth (○) por parte del heterodímero D.21-D.30. El valor de IT50 para 25 la polimerasa Taq es 41˚C, mientras que para la polimerasa Tth es 34,5˚C.
La FIGURA 16 ilustra el efecto de los dNTS y del ADN plantilla en horquilla sobre la afinidad de unión del Trnc.21 a la polimerasa Taq. FIGURA 16A. Análisis de unión a filtro de nitrocelulosa del Trnc.21 en presencia de dNTP 1 mM. Los círculos rellenos (•) indican la unión en ausencia de plantilla de ADN en 30 horquilla, mientras que los círculos vacíos (○) indican la unión en presencia de plantilla de ADN en horquilla 250 nM. Los valores de Kd calculados en estas condiciones son aproximadamente 2,5 nM. La FIGURA 6B ilustra el efecto de la concentración de dNTO sobre la unión del Trnc.21 a la polimerasa Taq. En este experimento la unión de Trnc.21 marcado radiactivamente a polimerasa Taq 1 nM se monitorizó en presencia de diferentes concentraciones de dNTP. 35
[0025] Esta solicitud describe el aislamiento de ligandos de ácido nucleico a polimerasas de ADN. Específicamente, esta solicitud describe el aislamiento de ligandos de ácido nucleico a polimerasas termoestables 40 útiles en la Reacción en Cadena de la Polimerasa. En una realización preferida, la ADN polimerasa se selecciona de entre la polimerasa Taq o polimerasa Tth, no obstante, el procedimiento de esta invención puede ampliarse a la identificación y purificación de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad para cualquier polimerasa de ADN termoestable. Los ligandos de ácido nucleico se identificaron a través del procedimiento conocido como SELEX. SELEX se describe en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/536.428, titulada "Systematic 45 Evolution of Ligands by Exponential Enrichment," actualmente abandonada, en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/714,131, registrada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands," que actualmente es la patente estadounidense nº 5.475.096, en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/931.473, registrada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands," que actualmente es la patente estadounidense nº 5.270.163 (consultar también PCT/US91/04078). Estas solicitudes se denominan 50 conjuntamente las Solicitudes de Patentes SELEX.
[0026] En su forma más básica, el proceso SELEX puede definirse por la siguiente serie de pasos:
1) Se preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos con secuencias diferentes. La mezcla 55 candidata generalmente incluye regiones de secuencias fijas (es decir, cada uno de los miembros de la mezcla candidata contiene las mismas secuencias en la misma ubicación) y regiones de secuencias aleatorias. Las regiones de secuencia fija se seleccionan: (a) para ayudar en los pasos de amplificación descritos más abajo, (b) para imitar una secuencia que se sabe se une a la diana, o (c) para potenciar la concentración de una determinada disposición estructural de los ácidos nucleicos en la mezcla 60 candidata. Las secuencias aleatorias pueden ser totalmente aleatorias (es decir, la probabilidad de hallar una base en cualquier posición es de una sobre cuatro) o sólo parcialmente aleatoria (por ejemplo, la
probabilidad de hallar una base en cualquier ubicación puede seleccionarse a cualquier nivel entre el 0 y 100 por ciento).
2) La mezcla candidata se pone en contacto con la diana seleccionada en condiciones favorables a la unión entre la diana y los miembros de la mezcla candidata. En estas circunstancias, puede considerarse 5 que la interacción entre la diana y los ácidos nucleicos de la mezcla candidata es formadora de pares ácido nucleico-diana entre la diana y aquellos ácidos nucleicos que tienen la afinidad más intensa por la diana.
3) Los ácidos nucleicos con la afinidad más elevada por la diana se separan de los ácidos nucleicos con 10 una afinidad menor por la diana. Puesto que en la mezcla candidata sólo un número extremadamente pequeño de secuencias (y posiblemente sólo una molécula de ácido nucleico) correspondiente a los ácidos nucleicos con la máxima afinidad, generalmente es deseable establecer el criterio de reparto de tal forma que una cantidad significativa de ácidos nucleicos en la mezcla candidata (aproximadamente el 5-10%) sea retenida durante el reparto. 15
4) Aquellos ácidos nucleicos seleccionados durante el reparto como poseedores de una afinidad relativamente elevada por la diana se amplifican a continuación para crear una nueva mezcla candidata que está enriquecida en ácidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente elevada por la diana.
20
5) Repitiendo los pasos de reparto y amplificación anteriores, la mezcla candidata nuevamente formada contiene menos y menos secuencias únicas, y el grado promedio de afinidad de los ácidos nucleicos por la diana generalmente incrementará. Llevado al extremo, el proceso SELEX rendirá una mezcla candidata que contendrá una o un número pequeño de ácidos nucleicos únicos que representarán los ácidos nucleicos de la mezcla candidata original que tienen las afinidad más elevada por la molécula 25 diana.
[0027] Las Solicitudes de Patente SELEX describen y elaboran este proceso con gran detalle. Se incluyen dianas que pueden usarse en el proceso; procedimientos para repartir ácidos nucleicos en una mezcla candidata; y procedimientos para amplificar ácidos nucleicos seleccionados para generar mezclas candidatas enriquecidas. Las 30 Solicitudes de Patentes SELEX también describen ligandos obtenidos para un cierto número de especies dianas, incluyendo dianas proteicas en donde la proteína es y no es una proteína unidora de ácido nucleico.
[0028] El proceso SELEX proporciona ligandos de elevada afinidad de una molécula diana. Esto representa un logro singular que no tiene precedentes en el campo de la investigación en ácidos nucleicos. La presente invención 35 aplica el procedimiento SELEX a las dianas específicas de los inhibidores de ácido nucleico de las ADN polimerasas, particularmente las polimerasas Taq y Tth. En la sección de ejemplos de más abajo, se describen los parámetros experimentales usados para aislar e identificar los inhibidores de ácido nucleico de las polimerasas Taq y Tth.
40
[0029] En la solicitud de patente estadounidense pendiente de tramitación, y en condiciones normales concedida, con número de serie nº 07/964.624, registrada el 21 de octubre de 1992 (’624), que actualmente es la patente estadounidense nº 5.496.938, se describen procedimientos para obtener ligandos de ácido nucleico mejorados una vez se ha realizado la SELEX.
45
[0030] Ciertos términos usados para describir la invención en la presente memoria se definen como sigue:
"Ligando de ácido nucleico" tal y como se utiliza en la presente invención es un ácido nucleico que ocurre de forma no natural y que tiene una acción deseable sobre una diana. Una acción deseable incluye, pero no se limita a la unión de la diana, cambiar catalíticamente la diana, reaccionar con la diana 50 de una forma que modifica/altera la diana o la actividad funcional de la diana, unirse covalentemente a la diana como en un inhibidor suicida, facilitar la reacción entre la diana y otra molécula. En la realización preferida, la acción tiene afinidad de unión específica por una molécula diana, siendo semejante molécula diana una estructura química tridimensional distinta de un polinucleótido, la cual se une al ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que predominantemente depende del 55 emparejamiento de bases de Watson/Crick o de la unión de la triple hélice, en donde el ligando de ácido nucleico no es un ácido nucleico que tienen la función fisiológica conocida de ser unido por la molécula diana. Los ligandos de ácido nucleico incluyen los ácidos nucleicos que son identificados a partir de una mezcla candidata de ácidos nucleicos, siendo dicho ligando de ácido nucleico un ligando de una diana determinada, mediante el procedimiento que comprende: a) poner en contacto la mezcla candidata con la 60 diana, en donde los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada por la diana respecto a la mezcla de candidatos pueden separarse del resto de la mezcla de candidatos; b) separar los ácidos
nucleicos de afinidad incrementada del resto de la mezcla de candidatos; y c) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada para rendir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando.
"Mezcla de candidatos" es una mezcla de ácidos nucleicos de secuencias diferentes, de la cual se selecciona un ligando deseado. La fuente de una mezcla de candidatos puede ser ácidos nucleicos, o 5 fragmentos de los mismos, que ocurren de forma natural, ácidos nucleicos sintetizados químicamente, ácidos nucleicos sintetizados enzimáticamente, o ácidos nucleicos preparados mediante una combinación de las técnicas precedentes. En una realización preferida, cada ácido nucleico tiene secuencias fijas que rodean una región aleatoria para facilitar el proceso de amplificación.
10
"Ácido nucleico" significa ADN, ARN, de hebra sencilla o de doble hebra, y cualquier modificación química de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a las que proporcionan otros grupos químicos que incorporan una carga, polarizabilidad, puentes de hidrógeno, interacción electrostática, y fluxionalidad adicional a las bases del ligando de ácido nucleico o al ligando de ácido nucleico en su conjunto. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a las modificaciones del 15 azúcar en la posición 2', las modificaciones de la pirimidina en la posición 5, las modificaciones de la purina en la posición 8, las modificaciones en las aminas exocíclicas, la sustitución de la 4-tiouridina, la sustitución del 5-bromo o 5-yodo-uracilo, las modificaciones del esqueleto, las metilaciones, las combinaciones de emparejamiento de bases inusuales, tales como las isobases de isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones incluyen también las modificaciones 3' y 5' tales como el 20 recubrimiento (capping).
La metodología "SELEX" implica la combinación de la selección de ligandos de ácido nucleico, los cuales interacción con una diana de una manera deseable, por ejemplo, uniéndose a una proteína, con la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados. La iteración cíclica de los pasos de 25 selección/amplificación permite la selección de uno o un número pequeño de ácidos nucleicos, los cuales interaccionan con la diana con la máxima intensidad, de entre un grupo que contiene un número muy elevado de ácidos nucleicos. Los ciclos del proceso de selección/amplificación se continúan hasta que se alcanza un objetivo seleccionado. En la presente invención, la metodología SELEX se emplea para obtener ligandos de ácido nucleico para las polimerasas Taq y Tth. 30
[0031] La metodología SELEX se describe en las Solicitudes de Patentes SELEX.
[0032] "Diana" significa cualquier compuesto o molécula de interés para la cual se desea un ligando. Una diana puede ser una proteína, un péptido, un carbohidrato, un polisacárido, una glicoproteína, una hormona, un receptor, 35 un antígeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, una análogo de estado de transición, un cofactor, un inhibidor, un fármaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento, etcétera, sin limitación. En esta solicitud, la diana es una ADN polimerasa. En una realización preferida la ADN polimerasa es la polimerasa Taq y la polimerasa Tth.
40
[0033] Un "ligando lábil" tal y como se utiliza en la presente invención es un ligando de ácido nucleico identificado mediante el proceso SELEX, el cual tiene una afinidad enormemente disminuida por su diana en base a un ajuste de un parámetro del entorno. En la realización preferida, el parámetro del entorno es la temperatura, y la afinidad de un ligando por su diana está disminuida a temperaturas elevadas.
45
[0034] "ADN polimerasa" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier enzima que cataliza la síntesis de ADN mediante la adición de unidades de desoxirribonucleótido a una cadena de ADN, usando ADN o ARN (transcriptasa inversa) como plantilla. Las ADN polimerasas termoestables se aíslan de microorganismos que prosperan a temperaturas superiores a 40˚C.
50
[0035] Un "interruptor" se refiere a cualquier compuesto que funciona para "encender" o "apagar" una reacción dependiendo de alguna condición o condiciones de reacción específicas. En la presente invención, los ligandos de ácido nucleico funcionan para "encender" o "apagar" la PCR dependiendo de la temperatura de la reacción. Un interruptor puede operar en base a otras condiciones de reacción, incluyendo el pH, la fuerza iónica, o la presencia o ausencia de iones específicos. Los interruptores de ácido nucleico se identifican mediante el procedimiento SELEX a 55 través de la selección apropiados de técnicas de reparto. Los parámetros de reparto se determinan con objeto de que se seleccionen ácidos nucleicos que tienen las características interruptoras deseadas.
[0036] En la presente invención, el experimento SELEX se realizó con objeto de identificar ligandos de ácido nucleico con elevada afinidad específica por las polimerasas Taq y Tth a partir de una biblioteca degenerada que 60 contenía 30 posiciones aleatorias (30N) (EJEMPLO 1). Aunque pueden identificarse ligandos de ARN o ADN para este propósito, los ejemplos siguientes describen la identificación de ligandos de ADN. El experimento SELEX se
diseñó para identificar oligonucleótidos que unen e inhiben las polimerasas a baja temperatura (temperatura ambiente), pero no a temperaturas más elevadas (>40˚C). Esto se consiguió usando la polimerasa diana para amplificar las moléculas seleccionadas por afinidad en la PCR a una temperatura elevada. En semejantes condiciones, no se esperaba que las secuencias de ADN que inhiben las polimerasas Taq y Tth a temperatura elevada se amplificaran y propagaran durante la selección. Esta invención incluye los ligandos de ADNss específicos 5 para la polimerasa Tth mostrados en la TABLA 3 (SEC. Nº ID.: 7-35) y la polimerasa Taq mostrados en la TABLA 3 (SEC. Nº ID.: 36-66, 76, 77), y los ligandos de ácido nucleico mostrados en las TABLAS 4 y 5 (SEC. Nº ID.: 67-74), identificador mediante los procedimientos descritos en el EJEMPLO 1. Esta invención incluye además ligandos de ADN para las polimerasas Taq y Tth que inhiben la función de la polimerasas Taq y Tth.
10
[0037] El ámbito de los ligandos cubierto por esta descripción se extiende a todos los ligandos de ácido nucleico de las polimerasas Taq y Tth, modificados y no modificados, identificados de acuerdo con el procedimiento SELEX. Más específicamente, esta descripción incluye las secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente homólogas a los ligandos mostrados en las TABLAS 2-5. Por sustancialmente homólogas se quiere significar un grado de homología de secuencia primaria superior al 70%, más preferiblemente superior al 80%. Una revisión de 15 las homologías de secuencia de los ligandos de Taq y Tth mostrados en las TABLAS 2-5 muestra que las secuencias con poca o ninguna homología primaria pueden tener sustancialmente la misma capacidad para unir respectivamente la polimerasa Taq y Tth. Por estas razones, esta descripción incluye también ligandos de ácido nucleico que tienen sustancialmente la misma capacidad para unir las polimerasas Taq y Tth que los ligandos de ácido nucleico mostrados en las TABLAS 2-5. Sustancialmente la misma capacidad para unir la polimerasa Taq o 20 Tth significa que la afinidad se halla dentro de unos pocos órdenes de magnitud de la afinidad de los ligandos descritos en la presente invención. Entre las capacidades de los especialistas con formación ordinaria en la técnica se halla claramente el establecer si una secuencia determinada --sustancialmente homóloga con las descritas específicamente en la presente invención-- tiene sustancialmente la misma capacidad para unir respectivamente las polimerasas Taq y Tth. 25
[0038] Esta descripción incluye también los ligandos tal y como se han descrito más arriba, en donde dichos ligandos inhiben la función de otras polimerasas de ADN termoestables, incluyendo, pero no limitándose al fragmento Stoffel, la polimerasa Tbr, la polimerasa Tlf, y la transcriptasa inversa de M-MLV.
30
[0039] Esta descripción incluye también los ligandos tal y como se ha descrito más arriba, en donde ciertas modificaciones químicas se realizan con objeto de incrementar la estabilidad in vivo o in vitro del ligando, o para potenciar o mediar la unión u otras características deseables del ligando, o el suministro del ligando. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen las sustituciones químicas en posiciones del azúcar y/o del fosfato y/o de la base de una determinada secuencia de ácido nucleico. Consultar, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con 35 número de serie 08/117.991, registrada el 9 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides." Otras modificaciones son conocidas por alguien con formación ordinaria en la técnica. Tales modificaciones pueden hacerse después de la SELEX (modificación de ligandos sin modificar identificados previamente) o por incorporación en el proceso de SELEX.
40
[0040] Los ligandos de ácido nucleico para las polimerasas Taq y Tth descritos en la presente invención son útiles como reactivos en la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
[0041] La presente descripción incluye un procedimiento mejorado para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa, en donde una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico que ha de amplificarse se mezcla 45 con 1) cebadores que son complementarios de secuencias que flanquean la secuencia a amplificar, 2) una polimerasa termoestable, y 3) un ligando de ácido nucleico que es capaz de inhibir la polimerasa a temperaturas ambiente. El ligando de ácido nucleico inhibidor puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. A continuación se siguen los pasos normales de la PCR ---fundido, hibridación y síntesis--- mediante iteración cíclica térmica de la mezcla. La presencia del ligando de ácido nucleico impide que la mezcla amplifique el ADN de fondo, impidiendo 50 cualquier síntesis a temperaturas inferiores antes o durante la iteración. La presente invención incluye también una equipo de PCR que comprende una ADN polimerasa termoestable y un ligando de ácido nucleico que inhibe dicha polimerasa a temperaturas ambiente, aunque permite que ocurra la síntesis durante los ciclos de temperatura elevada del proceso de la PCR. La presente invención incluye también un procedimiento para mejorar la PCR, tal y como será entendido por los especialistas en la técnica, incluyendo el paso de añadir a la polimerasa termoestable 55 un ligando de ácido nucleico que inhibe dicha polimerasa a temperaturas ambiente, aunque permite que ocurra la síntesis durante los ciclos de temperatura elevada del proceso de la PCR.
60
[0042] El EJEMPLO 1 describe los procedimientos experimentales usados en la selección de ligando de ácido nucleico para ambas, las polimerasas Taq y Tth. En la TABLA 2 se detallan las secuencias de ADNss obtenidas de
10 rondas de selección realizadas con la polimerasa Tth. Se secuenciaron veintinueve clones individuales procedentes de la selección con polimerasa Tth (sólo la región de nucleótidos variable se muestra en la TABLA 2). Los ligandos se agruparon en familias basadas en homología de secuencia primaria.
[0043] Las secuencias de ADNss obtenidas de 12 rondas de selección realizadas con la polimerasa Taq se 5 detallan en la TABLE 3. De las cuarenta y dos secuencias analizadas de la selección con la polimerasa Taq, treinta y tres eran únicas. Las letras mayúsculas indican la región aleatoria de 30 nucleótidos que está flanqueada por las regiones de secuencia fija 5’-TTCTCGGTTG GTCTCTGGCG GAGC- y –TCTTGTGTAT GATTCGCTTT TCCC-3’ para formar las secuencias de longitud completa. Las letras minúsculas en algunas de las secuencias indican la secuencia 5' fija. El número de clones portadores de la misma secuencia se indica entre paréntesis. Las secuencias 10 se agruparon en tres familias en base a la similitud de secuencia. Los motivos de secuencia conservados en las familias I y II están encuadrados. Ambas familias contenían una secuencia consenso diferente; 5’-A/GA/GTGTG/ACAGTAT/GC-3’ para la Familia I, y 5’-A/GCGTTTTG-3’ para la Familia II. En la Familia I, las regiones 5' y 3' de la secuencia consenso mostraron potencial para el emparejamiento de bases entre ellas (subrayadas en la TABLA 3). Adicionalmente, la covariación observada en estas regiones sugiere la existencia de una posible 15 estructura tallo-bucle. En la mayoría de los ligandos las regiones de emparejamiento potencial de bases se extendía más allá de la región consenso. Por contra, los ligandos de la Familia II no tienen un motivo estructura secundario obvio.
[0044] Las curvas de unión representativas del clon 30 (TQ30 (SEC. Nº ID.: 50)) de la Familia I y del clon 21 20 (TQ21 (SEC. Nº ID.: 59)) de la Familia II, se muestran en la FIGURA 3. En ambos casos, los ligandos muestran una unión estrecha a las dos polimerasas, con valores de Kd en el rango picomolar bajo; los valores de Kd del TQ30 son ± 1 pM para la polimerasa Taq y 28 ± 4 pM para la polimerasa Tth, mientras que los del TQ21 son 36 ± 4 pM y 10 ± 2 pM respectivamente para las polimerasa Taq y la polimerasa Tth. Se examinaron varios ligandos mas de las dos familias, Los valores de Kd oscilaron de 0,04 a 9 nM para la polimerasa Taq y de 0,01 a 0,3 nM para la polimerasa 25 Tth.
[0045] El EJEMPLO 2 (FIGURAS 5-9) describe un cierto número de ensayos de inhibición de la polimerasa y 30 demuestra que los ligandos de la invención son capaces de inhibir la interacción de ambos, las polimerasas Taq y Tth, a temperaturas inferiores a 40˚C. En el EJEMPLO 2, el ADN en horquilla diseñado (DNA-HP; 5’-ATGCCTAAGT TTCGAACGCG GCTAGCCAGC TTTTGCTGGC TAGCCGCGT-3’ (SEC. Nº ID.: 6) se usa como una plantilla para medir la capacidad de los grupos de ADN enriquecidos, así como, de los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) procedentes de la selección con polimerasa Taq, para inhibir la actividad polimerasa en una 35 variedad de condiciones. Este ensayo detecta la síntesis de relleno, dirigida por la plantilla, de 15 nucleótidos sobre una horquilla de ADN plegada hacia atrás.
[0046] La FIGURA 5A muestra los resultados de los ensayos de inhibición llevados a cabo a diferentes temperaturas con diferentes tiempos de incubación usando los grupos enriquecidos de ligandos de ADN. La 40 actividad de ambas, las polimerasas Taq y Tth es generalmente bajo a temperaturas bajas, e incrementa a medida que la temperatura se incrementa, como puede observarse comparando el carril 3 (reacción a temperatura ambiente) con los carriles 6-9 (reacción a 50, 60 y 70˚C, respectivamente). Los grupos enriquecidos inhiben la actividad de sus respectivas polimerasas a temperatura ambiente (carril 4), pero no a 50˚C-70˚C. El carril 10 muestra la movilidad del grupo marcado radiactivamente como una referencia para detectar la posible extensión de 45 moléculas de ADN en el grupo que puedan servir como plantilla para las polimerasas. La ausencia de bandas marcadas radiactivamente migrando en la proximidad o por encima del grupo marcado en los carriles 6-9 indica la ausencia de polimerización del grupo de ADNss.
[0047] Puesto que la actividad de las polimerasas termoestables es baja a temperatura ambiente, el período de 50 incubación en el ensayo se incrementó hasta 16 horas. Las FIGURAS 5B y 5C muestran los resultados de la incubación de 16 horas de la plantilla con la dos polimerasas en presencia de grupos seleccionados y del grupo aleatorio. Además, la inhibición mediada por grupos seleccionados se comparó con la del anticuerpo anti-Taq (Taqstart). Los datos en la FIGURA 5B se obtuvieron con la polimerasa Taq, y los datos en la FIGURA 5C se obtuvieron con la polimerasa Tth. En las tres temperaturas estudiadas, temperatura ambiente, 30˚C y 37˚C, el grupo 55 aleatorio no mostró inhibición de las dos polimerasas (comparar los carriles 1-3 con 4-6), sugiriendo que la inhibición causada por el grupo enriquecido es específica de la secuencia. El grupo seleccionado para la polimerasa Taq inhibió completamente la actividad polimerasa a lo largo de una incubación de 16 horas a temperatura ambiente (carril 7), pero no a 30˚C y más (carriles 8 & 9). Aunque el grupo seleccionado para la polimerasa Tth mostró unión a la polimerasa Taq, fue incapaz de inhibir la polimerasa Taq (carriles 10-12). Tal y como se esperaba, el anticuerpo 60 Taqstart inhibió la actividad polimerasa a las tres temperaturas investigadas (carriles 12-15). Sin embargo, el grupo del ADNss seleccionado para la polimerasa Tth no inhibió la actividad enzimática a lo largo de una incubación de 16
horas (comparar los carriles 1-3 con 4-6). Por contra, el mismo grupo fue capaz de inhibir la actividad enzimática a lo largo de períodos breves de incubación. El grupo seleccionado para la polimerasa Taq fue capaz de inhibir parcialmente (> 50%) la actividad Tth a lo largo de una incubación de 16 horas a temperatura ambiente (carril 10). El anticuerpo Taqstart no tuvo efecto alguno sobre la actividad de la Tth (carriles 13-15).
5
[0048] El uso del anticuerpo Taqstart está limitado a una vez en una reacción de la PCR. Una vez se ha desnaturalizado a temperatura elevada no puede renaturalizarse de vuelta a su forma nativa. Sin embargo, los ligandos de ácido nucleico con estructuras secundarias simples tiene el potencial de renaturalizarse de vuelta a su forma nativa después de superar un ciclo térmico. Se llevó a cabo un experimento para investigar si la capacidad inhibidores del grupo de ADN seleccionado para la polimerasa Taq podía restablecerse después del calentamiento 10 (FIGURAS 5D y 5E). La FIGURA 5D muestra la inhibición de la actividad Taq entre 20˚C-40˚C por parte del grupo de ADN seleccionado que no ha sido sometido a termociclado. A lo largo de 45 minutos de incubación, el grupo inhibió completamente la actividad Taq a 20˚C y 25˚C. Durante este período relativamente corto de incubación, el grupo exhibió >70% de inhibición a 30˚C. Puede observarse un perfil de inhibición muy similar con el grupo de ADN que se ha sometido a dos ciclos de la PCR con la polimerasa Taq en ausencia del ADN plantilla. Este resultado demuestra 15 que la inhibición mediada por el ADNss es reversiblemente sensible a la temperatura y que puede restablecerse incluso después de la PCR.
[0049] La FIGURA 6 muestra el rango de temperaturas en las cuales las secuencias TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) (TABLA 3) son inhibidores de las ADN polimerasas Taq y Tth. Los ensayos de extensión de 20 la horquilla representados en esta figura se realizaron a las temperaturas indicadas, durante 1 hora, usando 250 nM del ligando respectivo (carriles 1-10). Tal y como se anticipaba, los ligandos de ADNss no inhibieron ninguna polimerasa a temperaturas >40˚C (FIGURAS 6A y 6B). Las temperaturas a las que se genera el 50% del producto durante el ensayo de una hora (valores IT50) para el ligando TQ30 son respectivamente 41˚C y 29˚C para las polimerasas Taq y Tth. Los valores respectivos para el ligando TQ21 son 37˚C y 29˚C. Las afinidades de unión de 25 los dos ligandos para estas polimerasas disminuyen a temperaturas más elevadas (no se muestran los datos), de acuerdo con su actividad inhibidora disminuida a temperatura elevada. En los ensayos de extensión de la horquilla, aproximadamente el 2% de la plantilla en horquilla inicial no fue extendida por la ADN polimerasa, presumiblemente debido a un plegado incorrecto.
30
[0050] La FIGURA 7 ilustra que la inhibición de la polimerasa Taq por parte del ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) es térmicamente reversible, y que puede restablecerse incluso después de la CR. Los ensayos de extensión de la horquilla representados en esta figura se realizaron a las temperaturas indicadas, durante 10 minutos, en un volumen de reacción de 100 ml, con 5 U de polimerasa Taq, en ausencia (carriles 1-5) y en presencia (carriles 6-10) de ligando TQ30 (50 nM). En la FIGURA 7A, el ligando TQ30 no se ha sometido a termociclado. En la FIGURA 7B, 35 el ligando TQ30 se sometió a 25 rondas de termociclado con polimerasa Taq (30 segundos a 90˚C; 1 minuto a 50˚C, 30 segundos a 72˚C) y se enfrió a temperatura ambiente antes de añadir la plantilla en horquilla marcada radiactivamente (250 nM). Como puede observarse en la FIGURA 7, en ambos casos el ligando TQ30 inhibió la polimerasa a temperaturas inferiores a 40˚C. Adicionalmente, la muestra que experimentó el termociclado mostró una inhibición idéntica o más efectiva que la muestra no sometida a termociclado. 40
[0051] La FIGURA 8 demuestra el efecto de la concentración de ligando sobre la inhibición de las polimerasas Taq y Tth. La concentración de inhibidor necesaria para producir el 50% del producto en el ensayo de horquilla (valores IC50) para el TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) fue respectivamente 6,5 nM y 10 nM para la inhibición de la polimerasa Taq a temperatura ambiente (aproximadamente 22˚C) a lo largo de una incubación de 16 45 horas (FIGURA 8A). Puesto que la concentración de polimerasa Taq usada en el ensayo es 12,5 nM, la inhibición del enzima por parte del TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) es probable que sea el resultado de una unión estequiométrica. Cuando se ensayó a 30˚C a lo largo de 1 hora, los valores de IC50 incrementaron aproximadamente tres veces (22 nM para el TQ30 y 67 nM para el TQ21; no se muestran los datos). Los valores de IC50 del TQ30 y TQ21 para la inhibición de la polimerasa Tth fueron respectivamente 60 y 36 nM, a temperatura ambiente (FIGURA 8B). En 50 conjunto, estos oligonucleótidos son inhibidores más efectivos para la polimerasa Taq, el enzima usado en la selección, que para la polimerasa Tth.
[0052] Para excluir la posibilidad de que la inhibición observada de la extensión de la plantilla se deba a la unión preferente de ligandos seleccionados a la polimerasa, y a su utilización subsiguiente como sustrato, se incubaron los 55 ligandos TQ21 y TQ30 marcados radiactivamente con las dos ADN polimerasas durante 16 horas (EJEMPLO 2, no se muestran los datos). El ligando TQ30 no mostró productos de extensión a partir de su incubación con cualquiera de los enzimas, indicando que no es un sustrato de la actividad polimerasa. Sin embargo, el TQ21 dio lugar a una banda de peso molecular más elevado, indicativa de una extensión de secuencia a partir de su incubación con ambas polimerasas. La extensión parcial observada del ligando TQ21 se eliminó efectivamente bloqueando la 60 disponibilidad del grupo 3'-OH mediante el recubrimiento del extremo 3' con un engarce de etilenglicol usando condiciones estándares. Las construcciones de oligonucleótidos recubiertas en 30 son inhibidores tan efectivos
como las moléculas sin recubrir (no se muestran los datos). Estos resultados indican que los ligandos de ADNss son sustratos pobres para la actividad polimerasa, y que los dos tipos de ligandos probablemente se colocan sobre las ADN polimerasas de forma diferente; el TQ21 se une a las polimerasa de tal forma que su extremo 3' puede ser prolongado (aunque pobremente), mientras que el TQ30 no puede ser extendido después de su unión.
5
[0053] La reversibilidad térmica de la interacción de los ligandos de ácido nucleico con las polimerasas Taq y Tth plantea la posibilidad de usar una matriz de afinidad generada con tales ligandos, para capturar la polimerasa después de una amplificación, para usarla en una amplificación subsiguiente. Para investigar la posibilidad de la 10 captura por afinidad, se prepararon cuentas de afinidad que contenían los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) según se describe en el EJEMPLO 1. Después de la extensión de la plantilla en horquilla con las polimerasas Taq y Tth en un tampón de PCR que contenía heparina, se mezcló la reacción con cuentas de afinidad o cuentas control según se describe en el EJEMPLO 2, las cuentas se lavaron minuciosamente y se expusieron a continuación a una alícuota reciente de mezcla de reacción que contenía todos los reactivos excepto la polimerasa. 15 Después de incubarlas durante 5 minutos adicionales a 70˚C para permitir la extensión sobre la plantilla recién añadida, las mezclas de reacción se analizaron sobre un gel de poliacrilamida al 8% en condiciones desnaturalizantes. En las mezclas de reacción que contenían las cuentas control no hubo extensión de la plantilla en la segunda ronda de amplificación. Por contra, en las mezclas de reacción que contenían cuentas de afinidad no hubo diferencia en los productos de extensión en ambas la primera y segunda ronda de amplificación, indicando que 20 las cuentas de afinidad contenían ambos, el ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y el TQ21, exitosamente capturaban la dos polimerasas después de la primera ronda de la PCR.
25
[0054] Tal y como se ha discutido más arriba, además de su capacidad para catalizar la síntesis de polinucleótidos, tanto la polimerasa Taq como la polimerasa Tth poseen también actividad exonucleasa 5'-3' (Joyce y Steitz (1987) Trends Biochem. Sci. 12:288; Longley et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7317). El sustrato preferido para la actividad exonucleasa 5'-3' es un ADNss desplazado (o una estructura parecida a un tenedor) teniendo lugar el corte cerca de la unión dúplex/ADNss. Para estudiar el efecto de los inhibidores de oligonucleótidos sobre la 30 actividad exonucleasa 5'-3' de las polimerasas, se diseñó un sustrato de ADN (Exo-Sub) que contenía un ADNss desplazado en una horquilla (EJEMPLO 3, FIGURA 9). El marcado radiactivo del sustrato Exo-Sub en ambos extremos 5' y 3' permitió la detección de los dos fragmentos de ADN producidos por la actividad exonucleasa. Los dos fragmentos de ADN etiquetados, que procedían de la actividad exonucleasa, aparecían ambos en presencia y ausencia de los inhibidores de oligonucleótidos (no se muestran los datos), sin embargo, la cantidad de productos de 35 corte generados en presencia de los inhibidores de oligonucleótidos era algo inferior a la producida en ausencia de los inhibidores, indicando que los inhibidores de oligonucleótidos ejercen cierto efecto inhibidor sobre la actividad exonucleasa de los enzimas. Puesto que estos oligonucleótidos inhibían completamente las actividades polimerasa de los dos enzimas a 250 nM, su efecto sobre la actividad exonucleasa se considera marginal.
40
[0055] Los ensayos de inhibición usando otras polimerasas de ADN disponibles comercialmente y los ligandos TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) y TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) como inhibidores, se describen en el EJEMPLO 4. Se examinaron cuatro enzimas termoestables (lo polimerasa Tbr de Thermus brockianus, la polimerasa Tfl de Thermus flavus, la 45 polimerasa Tma de Thermotoga maritima, y la polimerasa Tli de Thermococcus litoralis); tres enzimas mesofílicos (fragmento Klenow de DNAP1 (KF) de E. coli, ADN polimerasa de T4 y ADN polimerasas de T7); y cuatro transcriptasas inversas (RT) (RT del VIH-I, RT del VMA (virus de la mieloblastosis aviaria) y RT del VLM-M (virus de la leucemia múrida de Moloney), y su mutante que carece de actividad ARNasa H (SuperScript II).
50
[0056] De las seis polimerasas termoestables examinadas (incluyendo las polimerasas Taq y Tth), las cuatro polimerasas derivadas de especies de Thermus (Taq, Tth, Tbr y Tlf) fueron inhibidas por los dos oligonucleótidos seleccionados, sugiriendo que estos enzimas comparten un elevado grado de similitud. Tal y como se ha afirmado más arriba, se ha descrito que la polimerasa Tth y la polimerasa Taq son un 93% similares y un 88% idénticas a nivel de secuencia de aminoácidos (Abramson (1995) en "PCR Strategies" (Academic Press, Nueva York). La 55 polimerasa Tfl se ha descrito que es un 93% similar y 86% idéntica a la polimerasa Taq a nivel de aminoácidos (D. Gelfand, comunicación personal). Por otro lado, la polimerasa Tma de Thermotoga maritima y la polimerasa Tli de Thermococcus litoralis no fueron inhibidas por ninguno de los ligandos. La polimerasa Tli comparte poca homología de secuencia con los enzimas de eubacterias (Ito y Braithwaite (1991) Nucleic Acids Res. 19:4045). Se ha descrito que la polimerasa Tma es un 61% similar y un 44% idéntica a la polimerasa Taq a nivel de aminoácidos (Abramson 60 (1995) en "PCR Strategies" (Academic Press, Nueva York), aunque los ligandos de oligonucleótidos no inhiben la polimerasa.
[0057] De las cuatro transcriptasas inversas ensayadas, las RT del VIH-I y VMA (virus de la mielobastosis aviaria) no se inhibieron. Por otra parte, la RT del VLM-M (virus de la leucemia múrida de moloney) y su mutante sin actividad RNasa H (SuperScript II) fueron inhibidas por los dos ligandos de oligonucleótidos.
5
[0058] Las ADN polimerasa mesofílicas, tales como el fragmento Klenow de la ADNP1 de E. coli (KF), la ADNP de T4 y la ADNP de T7 no fueron inhibidas por ningún ligando a una concentración de 0,5 mM, a pesar de la similitud de los dominios polimerasa de la polimerasa Taq y del KF (Kim et al. (1995) Nature (London) 376:612; Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 6427). Por tanto, parece que los inhibidores de oligonucleótidos son generalmente bastante específicos. Estos resultados son similares al comportamiento de los ligandos de ácido 10 nucleico identificados mediante selección in vitro para otras transcriptasas inversas (Tuerk y MacDougal (1994) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 89:6988; Chen y Gold (1994) Biochemistry 31:8746; Schneider et al. (1995) Biochemistry 34:9599).
[0059] El EJEMPLO 5 (FIGURA 10) describe un cierto número de amplificaciones de la PCR comparando las técnicas estándares de la PCR, la PCR "de arranque en caliente", y la PCR usando el TQ30 y TQ21 para facilitar la detección de una diana con un número bajo de copias mediante la PCR en ausencia de condiciones "de arranque en caliente". Se utilizó un sistema de cebador-plantilla diseñado para detectar un fragmento de ADN de 203-pares de 20 bases (p.b.) procedente del LTR (repetición terminal larga) del VIH-2, según describieron Respess et al. (1994) en Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy 94:110. Las amplificaciones mediante la PCR se realizaron con 0, 10 y 50 copias de la diana del LTR del VIH-2. En condiciones de PCR normal, la identificación de la banda de diana correcta estuvo comprometida por la presencia de un cierto número de bandas no específicas (FIGURA 10A, carriles 1-3). La amplificación realizada en condiciones "de arranque en caliente" eliminó las bandas 25 no específicas (FIGURA 10A, carriles 4-6). Los resultados de la amplificación realizada en presencia de una secuencia de ADNss de 78-nucleótidos no específica, que contenía secuencias fijas 5' y 3' idénticas que el TQ21 y TQ30 (FIGURA 10B, carriles 1-3) fueron similares a los obtenidos mediante la PCR sin usar condicione "de arranque en caliente". Sin embargo, la adición tanto del TQ21 (FIGURA 10B, carriles 4-6) como del TQ30 (FIGURA 10B, carriles 7-9) llevada a cabo en condiciones estándares (sin "arranque en caliente") eliminó las bandas no específicas 30 sin afectar al rendimiento de la banda específica de la diana. Fue de particular importancia la observación de que cuando el número de copia de la diana era bajo, la detección de la señal era muy eficiente (FIGURA 10B, comparar el carril con los carriles 5 y 8). El efecto de los inhibidores de oligonucleótidos fue similar cuando se usó la polimerasa Tth en lugar de la polimerasa Taq (no se muestran los datos) para detectar un número bajo de copias del LTR del VIH-2. El rendimiento potenciado de la banda específica de la diana obtenidos con los inhibidores de 35 oligonucleótidos en la PCR incrementa la sensibilidad de la reacción, facilitando la detección de la diana presente con aproximadamente sólo 3 copias (FIGURA 10C).
[0060] Los inhibidores de oligonucleótidos usados en el experimento descrito en la FIGURA 10 no tenían protegidos sus extremos 3', permitiendo potencialmente que iniciaran la amplificación de forma no específica, y 40 complicando aún más el resultado de la PCR. Sin embargo, no se detectaron bandas adventicias, lo que sugiere que en este sistema, el recubrimiento 3' de los inhibidores de oligonucleótidos no era necesario para eliminar la generación de bandas no específicas.
[0061] Típicamente, no todos los nucleótidos en una secuencia de longitud completa son necesarios para su función. Por tanto, es deseable la identificación de secuencias de ADN truncadas que retienen la función de la secuencia completa. Para los experimentos de truncación se escogieron los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) de la Familia I y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) de la Familia II (consultar TABLA 4). Las selecciones por afinidad de fragmentos 50 anillados con extremo etiquetado generados a partir de las secuencias de longitud completa de ambos ligandos, seguidas por el análisis en gel de secuenciación, según se describe en el EJEMPLO 2, no proporcionó límites identificables. Por tanto, los dos ligandos se sometieron a análisis de supresión. Las formas suprimidas secuencialmente se ensayaron en función de su capacidad para inhibir las polimerasas en el ensayo de extensión de la horquilla, para identificar truncaciones funcionales. 55
[0062] La región variable de 30 nucleótidos del TQ30, que contenía el motivo de secuencia conservado con la estructura de tallo-bucle predicha (Trnc.A-30 (SEC. Nº ID.: 74); TABLA 5) inhibe la polimerasa Taq a 25˚C con el 60 mismo alcance que la secuencia de longitud completa (no se muestran los datos). No obstante, a temperaturas más elevadas la eficacia de la inhibición es menor que la de la secuencia de longitud completa. A 30˚C, por ejemplo, la
inhibición de la polimerasa Taq por el Trnc.A-30 (250 nM) es aproximadamente del 82%, mientras que la secuencia de longitud completa inhibió totalmente el enzima a esta temperatura y concentración. La sensibilidad térmica incrementada del Trnc.A-30 puede deberse a la presencia de un hélice interrumpida con pares de bases A-T, una hélice propensa a fundirse a una temperatura baja.
5
[0063] En consecuencia, se diseñaron tres variantes de tallo-bucle del Trnc.A-30, las cuales contenían tallos no interrumpidos con elevada proporción de pares de bases G-C. En estas variantes, el motivo de secuencia conservado identificado en la Familia I estaba inalterado (TABLA 5), pero los tallos tenían varias longitudes. A una concentración de inhibidor de 250 nM, el Trnc.1-30 (SEC. Nº ID.: 67) y el Trnc.2-30 (SEC. Nº ID.: 68) inhibieron aproximadamente el 95% de la actividad de la polimerasa Taq, mientras que el Trnc.3-30 (SEC. Nº ID.: 69) inhibió 10 sólo aproximadamente el 60% de la actividad polimerasa (ver más abajo). El Trnc.3-30 que contenía el tallo más corto (7 pares de bases) de las tres variantes era un inhibidor pobre para la polimerasa Taq, indicando que se requieren contactos adicionales en el tallo para una interacción productiva. Para determinar si la inhibición disminuida observada con el Trnc.3-30 se debe a su afinidad reducida por la unión a la polimerasa, se calcularon las afinidades de las tres variantes por su unión a la polimerasa Taq. Los valores de Kd se hallan en el rango 2-3 nM 15 (TABLA 5), indicando que las tres variantes tenían afinidades similares. Por tanto, la ausencia de inhibición causada por el Trnc.3-30 no se debe a la ausencia de unión, sino presumiblemente a su incapacidad para bloquear el sitio activo. Las afinidades de las tres variantes por la unión a la polimerasa Taq son aproximadamente 75 veces inferiores a las de la molécula de longitud completa (la Kd de la secuencia de longitud completa es 40 pM), y aproximadamente 3-5-veces inferior a la del Trnc.A-30. Los valores de IC50 de las tres construcciones disminuyeron 20 con la disminución en la longitud del tallo; 25, 50 y 186 nM respectivamente para el Trnc.1-30, Trnc.2-30 y Trnc.3-30. Este resultado está de acuerdo con la noción de que los ligandos con tallos más largos son inhibidores más efectivos. El valor de IC50 de la secuencia de longitud completa es 22 nM. Los ensayos de extensión de horquilla se realizaron a 30˚C durante 1 hora.
25
[0064] Aunque el TQ30 de longitud completa inhibe la polimerasa Tth, ni el Trnc.1-30 ni el Trnc.2-30 inhiben la polimerasa Tth, a pesar del hecho de que el enzima es completamente inhibido por el ligando de longitud completa.
[0065] El fragmento Stoffel (61 kD) es una forma truncada de la polimerasa Taq que carece de actividad exonucleasa 5'-3' y es similar a la ADN polimerasa KlenTaq de 67 kD (67 kD). La actividad polimerasa del fragmento 30 Stoffel fue inhibida completamente por el TQ30 de longitud completa, así como por los tres formas truncadas. Los valores IC50 de las tres formas truncados son, Trnc. 1-30 = 2,7 nM, Trnc.2-30 = 5,9 nM y Trnc.3-30 = 10,3 nM (FIGURA 12). En conjunto, las tres formas truncadas del TQ30 son más efectivas inhibiendo el fragmento Stoffel que la polimerasa Taq (comparar la FIGURA 11 con la FIGURA 12). Los valores de IC50 de estas formas truncadas para la inhibición del fragmento Stoffer son un orden de magnitud mejores que los de la polimerasa Taq. El valor de IT50 35 para la inhibición del fragmento Stoffer por parte del Trnc.2-30 fue 38˚C (no se muestran los datos). Sorprendentemente, la secuencia TQ21, que inhibe tanto la polimerasa Taq como la Tth, no inhibe el fragmento Stoffel. Esto sugiere que el sitio de unión del TQ21 sobre el fragmento Stoffel está, bien parcialmente o completamente suprimido, o ha sido reorganizado a partir de la truncación de la proteína.
40
[0066] A diferencia de los ligandos de la Familia I, tales como el TQ30, la región variable de 30-nucleótidos del ligando de la Familia II, TQ21, no inhibe ni la polimerasa Taq ni la Tth (no se muestran los datos), indicando que los nucleótidos adicionales de las regiones fijas son necesarios para la inhibición. El análisis de supresión de la 45 secuencia TQ21 de longitud completa condujo a la identificación de una secuencia de 51-meros (Trnc.21 (SEC. Nº ID.: 70) (TABLA 4)) que retuvo la capacidad de inhibir tanto la polimerasa Taq como la Tth. Además de la región aleatoria de 30-nucleótidos completa, la secuencia del Trnc.21 contenía 9 y 12 nucleótidos a partir respectivamente de las regiones fijas 5' y 3' (TABLA 4). En contraste con las formas truncadas del TQ30, las cuales mostraban una afinidad disminuida por la polimerasa Taq, el Trnc.21 mostró una afinidad incrementada; la Kd del Trnc.21 por la 50 unión a la polimerasa Taq es de 9 pM (FIGURA 13A), una afinidad aproximadamente 4 veces mayor que la de la secuencia de longitud completa. El valor de IC50 del Trnc.21 para la inhibición de la polimerasa Taq es de 21 nM (FIGURA 13B), aproximadamente 3 veces inferior al valor para la secuencia de longitud completa. Los valores de IT50 calculados para la polimerasa Taq y la polimerasa Tth son respectivamente 34˚C y 35,6˚C (FIGURA 13C). Los ensayos de extensión de la horquilla se realizaron entre las temperaturas de 35 y 50˚C durante 1 hora con Trnc.21 55 250 mM. Por tanto, en base a la afinidad y a los valores de IC50 e IT50, la forma truncada del TQ21 es un inhibidor mejora que la secuencia de longitud completa. De forma similar a la secuencia de longitud completa, el Trnc.21 no inhibió la actividad del fragmento Stoffel.
[0067] La multimerización de ligandos incrementa la concentración local efectiva, resultando en un mayor
tiempo de residencia con la diana (avidez). En base a su moderada afinida por la polimerasa Taq, se seleccionó el Trnc.2-30 para la síntesis de un homodímero (TABLA 4). El homodímero (D.30-D.30) (SEC. Nº ID.: 71) (TABLA 4) de Trnc.2-30 se sintetizó en una orientación cola-con-cola (unido en los extremos 3') usando el dímeros simétrico CPG como soporte en una síntesis química en fase sólida usando procedimientos estándares.
5
[0068] La afinidad del dímero D.30-D.30 por la unión a la polimerasa Taq es de 40 pM (FIGURA 14A), aproximadamente 75-veces superior a su forma monomérica. El valor de IC50 del homodímeros es de 14 nM, aproximadamente 3,5 veces inferior al de la forma monomérica (FIGURA 14B). Por tanto, la dimerización del TQ30 truncado produjo una inhibidor más efectivo de la polimerasa Taq.
10
[0069] También se prepararon dos secuencias heterodiméricas en las que dos formas monoméricas truncadas, el Trnc.2-30 y el Trnc-21 (TABLA 4), se unieron mediante un engarce que contenía 3 timinas. En D.21-D.30 (SEC. Nº ID.: 72) la secuencia Trnc-21 se colocó en el extremo 5' de la molécula, mientras que en D.30-D.21 (SEC. Nº ID.: 73) ocupa el extremo 3' de la molécula. A diferencia del TQ30 de longitud completa, sus formas truncadas no inhiben la polimerasa Tth. El Trnc-2, por otra parte, inhibió ambas polimerasas Taq y Tth, pero no el fragmento Stoffel. 15 Asumiendo que las unidades monoméricas son capaces de funcionar independientemente, después de ser atadas en una única secuencia, la combinación de los dos ligandos truncados proporcionará una única secuencia que puede inhibir las tres polimerasas. A la concentración de inhibidor más baja (62,5 nM) el efecto inhibidor de los dos heterodímeros sobre la polimerasa Taq es mayor que el de los dos monómeros. El efecto de los heterodímeros sobre la polimerasa Tth es idéntico al del monómero Trnc-21. El fragmento Stoffer no pudo extender completamente 20 la plantilla en horquilla en presencia de los dos heterodímeros. En contraste, los productos parcialmente extendidos fueron menos abundantes en presencia de la secuencia Trnc.2-30 monomérica. La ausencia de la extensión completa de la plantilla en horquilla sugiere que los heterodímeros no suprimen la actividad del fragmento Stoffel.
[0070] El heterodímero D.21-D.30 tiene un valor de IC50 de aproximadamente 30 nM para la inhibición de las 25 polimerasas Taq y Tth (FIGURA 15A). Los valores de IT50 para la inhibición de las polimerasas Taq y Tth son respectivamente 41˚C y 34,5˚C (FIGURA 15B). El D.21-D.30 inhibe el fragmento Stoffel con un valor de IC50 de 15,5 nM y un valor de IT50 de 38˚C (no se muestran los datos). La Kd del heterodímero D.21-D.30 ligando para la polimerasa Taq es similar al del Trnc-21 (10 pM), lo que sugiere que la proteína preferentemente se une al motivo de secuencia con una elevada afinidad de unión. 30
[0071] La ubicación de las dos unidades monoméricas en el dímero parece no tener un efecto global sobre la inhibición de ninguna de las tres polimerasas. Las dos unidades monoméricas diferentes no muestran un efecto perjudicial cuando se combinan en un dímero. Como se esperaba, los heterodímeros mostraron la capacidad de inhibir las tres polimerasas de forma bastante efectiva, indicando que, en general, las funciones de las unidades 35 monoméricas en los heterodímeros son mutuamente excluyentes.
[0072] Los ejemplos siguientes se proporcionan para explicar e ilustrar la presente invención y no se pretende que sean limitantes de la invención.
40
[0073] La polimerasa Taq recombinante (rTaq; Mr 94 kDa) suspendida en un tampón consistente en KCl 100 45 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 0,1 mM, 50% de glicerol (v/v) y 0,2% de Tween 20, y la polimerasa Tth recombinante (rTth Mr 94 kDa) suspendida en un tampón consistente en Bicine-KOH 50 mM (pH 8,3), KCl 90 mM y 50% de glicerol (v/v) se compraron a Roche Molecular Systems, Inc. (Alameda, CA). Las ADN polimerasas Taq, Tth y UlTma se obtuvieron de Perkin Elmer. La polimerasa Ultma es una forma suprimida de la polimerasa Tma que carece de la actividad exonucleasa 5'-3' del tipo salvaje. Las ADN polimerasas Tli y Tfl se compraron a Promega. La 50 polimerasa Tbr (Thermalase Tbr) se obtuvo de Amresco Inc. Los fosforamiditos CPG de engarce 3'-3' con ramificación simétrica y C-6 Thiolmodifier se obtuvieron de Clontech (Palo Alto, CA). La cuentas de yodoacetilo ULTRALINK™ se compraron a Pierce Chemicals (Rockford, IL). Los enzimas usados en el marcado radiactivo del ADN se obtuvieron de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Todos los otros reactivos y compuestos químicos eran de grado analítico y se compraron a fuentes comerciales estándares. 55
[0074] Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante la química de cianoetil-fosforamidito en fase sólida estándar, y se purificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante para homogeneizarlos en 60 tamaño antes de usarlos. El homodímero simétrico se sintetizó con CPG de engarce 3'-3' de ramificación simétrica. La concentración de ADN se basó en 33 µg/mL = 1 unidad de A260.
[0075] Veinticinco nanomoles del ligando TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) o TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) (TABLA 3) que contenían un grupo tiol en el extremo 5' se desprotegieron con AgNO3 y ditiotreitol (DTT) de acuerdo con las 5 instrucciones del fabricante. El exceso de DTT se eliminó mediante cuatro extracciones secuenciales con volúmenes iguales de acetato de etilo. El ligando desprotegido se mezcló a continuación con 500 µL de cuentas de yodoacetilo ULTRALIN™ que se habían lavado dos veces en un tampón consistente en Tris-HCl 50 mM (pH 8,3) y EDTA 5 mM. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas sobre una plataforma rotatoria. Los sitios sin reaccionar sobre las cuentas de yodoacetilo se recubrieron haciendo reaccionar la mezcla con 50 µl de una 10 solución de cisteína 0,5 M en el mismo tampón durante 15 minutos. Las cuentas de control se prepararon haciendo reaccionar 500 µL de cuentas de yodoacetilo con 500 µl de cisteína 0,5 M. Después de la reacción, las cuentas se lavaron cinco veces con 500 µL de un tampón de PCR consistente en heparina 75 µM, MgCl2 12,5 mM, KCl 50 mM y Tris-HCl 10 mM (pH 8,3).
15
B. SELEX.
[0076] El procedimiento SELEX se ha descrito con detalle en la patente estadounidense nº 5.270.163. Los experimentos SELEX con ambas polimerasas se realizaron usando la plantilla y los cebadores mostrados en la TABLA 1. La selección con la polimerasa Taq se llevó a cabo a temperatura ambiente en un tampón consistente en 20 Tris-HCl 10 mM (pH 8,3; a 22˚C), KCl 50 mM y MgCl2 2,5 mM (tampón unidor para Taq). La selección con la polimerasa Tth se llevó a cabo en un tampón que contenía Bicina-KOH 50 mM (pH 8,3; a 25˚C), KCl 90 mM y Mn(OAc)2 3,5 mM (tampón unidor para Tth).
[0077] Cada experimento SELEX se inició con 5 nnmoles de ADN de hebra simple (ADNss) sintético, purificado 25 en gel, del grupo de secuencia aleatoria, consistente en una región aleatoria de 30 nucleótidos, flanqueada por regiones 5' y 3' de estructura fija (TABLA 1). En una ronda de selección típica, el ADNss suspendido en el tampón de unión apropiado se calentó a 90˚C durante 3 minutos, se enfrió sobre hielo, y a continuación se llevó a temperatura ambiente. Una vez equilibrado a temperatura ambiente, el ADN se incubó durante 15 minutos con la polimerasa diana apropiada, en presencia de 2 nnmoles de ARNt como un competidor y albúmina de suero bovino al 0,01% 30 (hSA). Los complejos de polimerasa-ADN se separaron del ADN no nido mediante filtración en nitrocelulosa a través de un filtro de nitrocelulosa prehumedecido (0,45 µM, Millipore) bajo succión. El filtro se lavó inmediatamente con 20 mL del tampón de unión, 20 mL de urea 0,5 M en el tampón unidor, y urea 0,5 M en agua. El ADN retenido en el filtro se eluyó y aisló mediante precipitación con etanol en presencia de ARNt portador (5 µg).
35
[0078] El ADN aislado se amplificó mediante la PCR con el Equipo Cebador I (TABLA 1). Una de las hebras cebadoras contenía tres biotinas contiguas en el extremo 5'. La hebra no biotinilada del ADN dúplex resultante se aisló mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (Pagratis et al., en preparación) y se usó en la siguiente ronda de selección. En las rondas subsiguientes, antes de incubarlos con la polimerasa diana, los grupos de ADN se pasaron a través de filtros de nitrocelulosa (contraselección) para eliminar secuencias de ADN que se 40 unieran al filtro de nitrocelulosa. El número de picomoles de polimerasa diana se disminuyó gradualmente durante el curso de la SELEX para incrementar la presión selectiva en busca de secuencias con elevada afinidad de unión. La cantidad de ADN en cada selección se mantuvo al menos cinco veces superior a la cantidad de proteína para garantizar la competición en busca de secuencias de ADN con elevada afinidad de unión.
45
[0079] El progreso de la SELEX se monitorizó mediante análisis de unión al filtro de nitrocelulosa de los grupos enriquecidos. Los grupos enriquecidos que mostraban la afinidad de unión más elevada se amplificaron mediante PCR con el Equipo de Cebadores II para incorporar sitios de restricción BamHI y EcoRI en los extremos del ADN dúplex resultante. Este ADN se purificó en gel y se digirió con BamHI y EcoRI, y se clonó en el vector plasmídico pUC18 previamente digerido con los mismos enzimas usando técnicas estándares. (Sambrook et al. (1989), en 50 "Molecular Cloning: A laboratory Manual," 2ª ed., Parte 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los clones se aislaron y secuenciaron mediante la técnica de secuenciación dideoxi estándar (equipo Sequenase de U.S. Biochemical, Cleveland, OH).
C. Ensayo de unión a filtro de nitrocelulosa. 55
[0080] Para aislar las moléculas de ADN que se unen con fuerza respectivamente a la polimerasa Taq y a la polimerasa Tth, se usó el procedimiento de reparto del filtro de nitrocelulosa tal y como se utiliza en la solicitud de patente de la SELEX. De forma resumida, los grupos de 32P-ADNss purificados en gel se suspendieron en el tampón de unión, se calentaron hasta 80˚C, se enfriaron sobre hielo, y a continuación se llevaron a temperatura ambiente. El 60 AND (5-10 pM) se incubó a continuación durante 15 minutos a temperatura ambiente, con distintas cantidades de la polimerasa diana, en 50 µL del tampón de unión apropiado, el cual contenía 0,1 µg de ARNt y un 0,01% de hSA. La
concentración de ADN se mantuvo más baja que 100 pM para garantizar el equilibrio en presencia de concentraciones de proteína en exceso. Transcurridos 15 minutos las mezclas de reacción se pasaron a través de filtros de matriz mixta nitrocelulosa/acetato de celulosa previamente humedecidos (0,45 mm de tamaño de poro, Millipore Corporation, Bedford, MA) y los filtros se lavaron inmediatamente con 5 mL de tampón de unión. La cantidad de ADN unida a los filtros se cuantificó midiendo la radiactividad de los filtros mediante recuento de 5 centelleo en líquido. La cantidad de ADN unido a los filtros en ausencia de proteína se usó para la corrección de fondo. El porcentaje de ADN de entrada retenido sobre cada filtro se representó frente al log de la correspondiente concentración de polimerasa (FIGURAS 1 y 2). Para obtener las constantes de disociación (Kd) de los ligandos de AND respectivamente para las polimerasas Taq y Tth se usó el procedimiento no lineal de los mínimos cuadrados. (Schneider et al. (1995) Biochemistry 34:9599; 40 Jellinek et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 90:11227-10 11231).
[0081] El grupo de secuencia aleatoria no seleccionada se une a la polimerasa Tth con una Kd estimada de aproximadamente 70 nM (FIGURA 1B, (•)), mientras que la Kd de la unión de este grupo a la polimerasa Taq es aproximadamente de 50-100 nM (FIGURA 1A, (○)). Después de 12 rondas de selección, la Kd de unión a la 15 polimerasa Taq fue de 3,5 nM (FIGURA 1A, (○)). Rondas adicionales de selección no resultaron en una mejora adicional de la afinidad. Por tanto, la afinidad resultante del grupo enriquecido por la polimerasa Taq se mejoró significativamente en comparación con el grupo aleatorio no seleccionado. Se obtuvieron resultados similares con la polimerasa Tth, en donde el grupo procedente de la 10ª ronda mostró una Kd de 5 nM (FIGURA 1B, (○)).
20
[0082] El grupo del ADNss seleccionado para la polimerasa Taq mostró una unión muy estrecha a la polimerasa Tth con una Kd de 0,2 nM (FIGURA 2A, (○)). Este resultado no es sorprendente, puesto que la identidad de secuencia de aminoácidos entre las dos polimerasas es aproximadamente del 87% (Asakura et al. (1993) J. Ferment. Bioeng. 76:265-269). El grupo seleccionado para la unión a la polimerasa Tth unió la polimerasa Taq de manera diferente, con la saturación de la unión alrededor del nivel del 50% (FIGURA 2B, (○)), sugiriendo que 25 aproximadamente la mitad de las secuencias en el grupo no están interaccionando con la polimerasa Taq. En base al 50% de saturación, la Kd estimada es de 0,3 nM.
[0083] En la TABLA 2 se detallan las secuencias de ADNss obtenidas de 10 rondas de selección realizadas con la polimerasa Tth. Se secuenciaron veintinueve clones individuales procedentes de la selección con polimerasa Tth 30 (sólo la región variable de 30-nucleótidos se muestra en la TABLA 2). Las secuencias se agruparon en dos familias en base a la similitud de secuencia. Las secuencias de ADNss obtenidas de 12 rondas de selección realizadas con la polimerasa Taq se detallan en la TABLA 3. Se aislaron treinta y tres secuencias únicas. Las letras minúsculas en algunas de las secuencias indican la secuencia 5' fija y las letras mayúsculas ilustran la región aleatoria de 30 nucleótidos. Las secuencias se agruparon en tres familias en base a la similitud de secuencia. 35
[0084] Los ensayos de inhibición de polimerasa se realizaron usando el ADN plantilla (DNA-HP; 5’-ATGCCTAAGT TTCGAACGCG GCTAGCCAGC TTTTGCTGGC TAGCCGCGT-3’ (SEC. Nº ID.: 6)), marcada en el 40 extremo 5' con la quinasa de polinucleótidos del T4 y 32P-γ-ATP, y se purificaron mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (FIGURA 4). En un procedimiento experimental representativo, 0,25 pmoles de polimerasa Taq (5 U) o 0,125 pmoles (2,5 U) de polimerasa Tth se mezclaron con 5 pmoles (250 nM) del grupo enriquecido, del grupo aleatorio, o con un ligando de ADN específico, en el tampón estándar de la PCR (20 µL). Se añadieron cinco pmoles (250 nM) de DNA-HP plantilla marcado, y la mezcla se incubó a diferentes temperaturas 45 durante un determinado período de tiempo. La reacción se detuvo añadiendo EDTA hasta una concentración final de 125 mM (5 µL de EDTA 0,5 M). El ADN se resolvió sobre un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Los geles se visualizaron mediante autorradiografía, y el porcentaje de ADN unido se cuantificó mediante PhosphoImager. Las variaciones en este procedimiento general para reacción específicas se mencionan en memoria. 50
[0085] El orden en el que se añaden los inhibidores de oligonucleótidos a la mezcla de reacción es irrelevante con tal que la plantilla se añada en último lugar. Los oligonucleótidos requieren iones Mg++, un componente esencial de la PCR, para funcionar, y parecen tolerar muchos sistemas de tampón.
55
[0086] La FIGURA 5 ilustra los resultados de los ensayos de actividad polimerasa usando los grupos de ADN enriquecidos. Las FIGURAS 6-9 ilustran los resultados de los ensayos de actividad polimerasa usando los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59).
[0087] Los valores de IC50 (la concentración de inhibidor necesaria para producir el 50% del producto en el
ensayo) se obtuvieron usando el ensayo de extensión de la horquilla. En un ensayo de inhibición típica, una reacción de 20 µL contenía 0,25 pmoles de polimerasa Taq (5 U) ó 0,125 pmoles de polimerasa Tth (2,5 U), el inhibidor de oligonucleótidos (a diferentes concentraciones), Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, y 1 mM de cada dNTP. El sustrato de ADN en horquilla con el extremo 5' marcado (DNA-HP; 5’-ATGCCTAAGT TTCGAACGCG GCT AGCCAGC TTTTGCTGGC TAGCCGCGT-3’) se añadió a continuación hasta una concentración final de 250 5 nM, y la reacción se incubó a 30˚C durante 1 hora. La reacción se detuvo añadiendo 5 µL de EDTA 0,5 M (pH 8.0) seguidos por tampón de carga en gel de formamida. Los productos de la extensión se resolvieron sobre geles de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes. La cantidad de productos de extensión se cuantificó mediante PhosphoImager. Las cantidades de productos formados en presencia de inhibidor se normalizó respecto el producto formado en ausencia de un inhibidor para obtener el porcentaje de producto. 10
[0088] Las reacciones de extensión de la horquilla fueron las mismas que las descritas arriba, excepto que la concentración de inhibidor era 250 nM. El tiempo de incubación a cada temperatura era de 1 hora. La cantidad de 15 producto se cuantificó mediante PhosphorImager, y se normalizó respecto el producto formado en ausencia de un inhibidor a la misma temperatura para obtener el porcentaje de producto.
20
[0089] En un procedimiento experimental representativo, se incubó ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50), TQ21 ó TQ21 (recubierto en 3' con un engarce de etilenglicol) (aproximadamente 3 pmoles) marcado en el extremo 5', en 20 µL del tampón de unión y 1 mM de cada dNTP, en ausencia y presencia de 5 U de polimerasa Taq o 2,5 U de polimerasa Tth, durante 16 horas a temperatura ambiente. El recubrimiento del extremo 30' del TQ21 se realizó con un engarce de etilenglicol ("3’-Spacer C3" de Glen Research) usando condiciones estándares conocidas en el 25 estado de la técnica.
[0090] Las reacciones de captura por afinidad se realizaron a 70˚C durante 5 minutos en un volumen de 30 reacción de 100 mL que contenía: heparina 75 µM, MgCl2 12,5 mM, 1 mM de cada dNTP, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), 5 U de polimerasa Taq ó 2,5 U de polimerasa Tth, y plantilla de ensayo en horquilla con el extremo 5' marcado (DNA-HP) 250 nM. Transcurridos 5 minutos la mezcla de reacción se diluyó tres veces y se enfrió a 4˚C. Después de 1 ronda de síntesis, se añadieron 15 µL de cuentas (bien cuentas de afinidad o cuentas control, preparadas tal y como se describió más arriba) a la mezcla de reacción a 4˚C y se mezclaron con delicadeza durante 35 10 minutos. Los sobrenadantes que contenían la plantilla marcada se retiraron después de la centrifugación y se guardaron para su análisis en gel. Las cuentas se lavaron cinco veces con 100 µL de un tampón consistente en heparina 75 µM, MgCl2 12,5 mM, KCl 50 mM y Tris-HCl 10 mM (pH 8,3). Después de 2 rondas de síntesis, las cuentas lavadas se mezclaron con una alícuota reciente de la mezcla de reacción que contenía la totalidad de los reactivos excepto la polimerasa. Después de incubarla a 70˚C durante 5 minutos, la mezcla de reacción se recuperó 40 y analizó mediante electroforesis en gel.
[0091] Los ensayos de inhibición de exonucleasas se realizaron usando la plantilla diseñada, 5’-TTCGAGCGTG 45 AATCTGAATT CGCGGCTAGC CAGCTTTTGC TGGCTAGCCG CGGTGGGAAA CTGAGGTAGG TGTTTTCACC TACCTCAG TTTCCCACC-3’ (Exo-sub) (SEC. Nº ID.: 75), marcada en el extremo 5' (usando [γ32P]-ATP y la quinasa de polinucleótido de T4) y en el extremo 3' usando ([α32P]-ddATP y desoxiterminal transferasa). En un procedimiento experimental representativo, 5 U de la polimerasa Taq ó 2,5 U de la polimerasa Tth se mezclaron con 250 nM de ligando TQ30 o ligando TQ21 en el tampón de PCR estándar (20 µL), seguidos por la adición del Exo-Sub 50 doblemente marcados (250 nM, añadido en último lugar). Después de incubarlas durante 16 horas a temperatura ambiente, las reacciones se apagaron mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de 0,1 mM. Los productos del corte se resolvieron sobre geles de poliacrilamida al 8% en condiciones desnaturalizantes.
[0092] La inhibición mediante el TQ21 (SEC. Nº ID.: 50) y el TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) se ensayó con (A) polimerasas de ADN termofílicas, (B) ADNP mesofílicas (polimerasa Taq como control), y transcriptasas inversas, y (C) RT. Todas las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 20 µL con la plantilla en horquilla HP (EJEMPLO 2) en presencia de 1 mM de cada dNTP, usando 250 ó 500 nM de ligando TQ21 o TQ30. Las condiciones de 60 reacción específicas para cada polimerasa fueron como sigue:
Polimerasas termostables: polimerasa Tma: polimerasa UlTma (6 U), Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, 10 mM KCl, MgCl2 2,5 mM y 0,002% Tween 20 (v/v); polimerasa Tbr (2 U), Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM y 0,01% de Triton X-100; polimerasa Tli (3 U) y polimerasa Tfl (5 U), Tris-HCl 10 mM; pH 9,0, KCl 50 mM y 0,1% de Triton X-100.
5
Polimerasas mesofílicas: Todas las incubaciones incluyendo la polimerasa Taq (5 U) (un control interno para el tampón) se realizaron en un tampón consitente en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, KCl 40 mM, MgCl2 5 mM, y DTT 7,5 mM (fragmento Klenow (5 U); ADN polimerasa de T4 (4 U); ADN polimerasa de T7 (7 U).
Transcriptasas inversas. Todas las incubaciones se realizaron en un tampón consistente en Tris-HCl 50 10 mM, pH 8,3, NaCl 60 mM, Mg(OAc)2 6 mM, y DTT 10 mM. (RT de VIH-1 (0,56 pmoles); RT de VMA (1 U); RT de VML-M (10 U); Superscript II (Ssript II) (10 U).
15
[0093] Las amplificaciones con PCR se realizaron usando un sistema que amplifica un producto de 203-p.b. específico para la diana, procedente de la LTR 2 del VIH-35, según describieron Respess et al. (1994) en Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy 94:110). Todas las amplificaciones con PCR se llevaron a cabo en presencia de 1,3 µg de ADN placentario humano, 0,4 mM de cada dNTP, 25 pmoles de cada cebador, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 2,5 mM, 10% de glicerol, 5 U de polimerasa Taq y la plantilla (el número 20 aproximado de copias se indica en las FIGURAS 10A-10C) en 100 µL de volumen de reacción. El termociclado se realizó a 50˚C durante 2 minutos, seguido por 94˚C durante 30 segundos; 60˚C durante 30 segundos; 72˚C durante 30 segundos, y a continuación una hibridación autoextendida a 60˚C en incrementos de 1˚C durante 5 ciclos. Esto siguió una amplificación de 35 ciclos a 90˚C durante 30 segundos; 65˚C durante 30 segundos; 72˚C durante 30 segundos. 25
[0094] La PCR "de arranque en caliente" se realizó usando cuentas "AmpliWax" (de Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las otras amplificaciones con PCR se realizaron sin condiciones "de arranque en caliente".
30
[0095] La PCR "NeXstart" se realizó usando los ligandos TQ30 y TQ21 (concentración final 50 nM) como inhibidores. Una amplificación se realizó en presencia de un oligonucleótido no específico (concentración final 50 nM) con propósito de comparación.
[0096] Los siguientes párrafos numerados contienen lso enunciados de las combinaciones amplias de las 35 características técnicas inventivas descritas en la presente invención.
1. Un método de identificación de ligandos de ácido nucleico para una polimerasa, que comprende:
a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos;
b) poner en contacto la mezcla candidata de ácidos nucleicos con dicha polimerasa, donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la polimerasa en relación con la mezcla candidata se pueden 40 separar del resto de la mezcla candidata;
c) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla candidata; y
d) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad y especificidad relativamente superior para la unión a la polimerasa, mediante lo cual se pueden identificar los ligandos de ácido nucleico de la polimerasa. 45
2. El método del párrafo 1, que comprende además:
e) repetir las etapas b), c) y d).
3. El método del párrafo 1, en el que dicha polimerasa es una ADN polimerasa.
4. El método del párrafo 1, en el que dicha polimerasa es una transcriptasa inversa.
5. El método del párrafo 1, en el que dicha polimerasa es termoestable. 50
6. El método del párrafo 3, en el que dicha ADN polimerasa se aísla de Thermus aquaticus (Taq polimerasa).
7. El método de los párrafos 3 ó 4, en el que dicha polimerasa se aísla de Thermus thermophilus (Tth polimerasa).
8. El método del párrafo 1, en el que dicha mezcla candidata de ácidos nucleicos está comprendida de ácidos nucleicos de cadena sencilla.
9. El método del párrafo 1, en el que dichos ácidos nucleicos de cadena sencilla son ácidos desoxirribonucleicos. 55
10. Un método para inhibir la actividad de una ADN polimerasa, que comprende añadir una cantidad eficaz de un ligando de ácido nucleico de ADN polimerasa de afinidad elevada a una reacción de polimerización de ADN que se mantiene a temperaturas ambientes.
11. El método del párrafo 10, en el que dicho ligando de ácido nucleico de ADN polimerasa se identifica según el método del párrafo 1. 60
12. El método del párrafo 10, en el que dicha ADN polimerasa es Taq polimerasa.
13. El método del párrafo 12, en el que dicho ligando de polimerasa es un ADN seleccionado entre uno de los ligandos
de la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74).
14. El método del párrafo 10, en el que dicha ADN polimerasa es Tth polimerasa.
15. El método del párrafo 14, en el que dicho ligando de polimerasa es un ADN seleccionado de uno de los ligandos de Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID 5 No: 74).
16. Un ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado para una polimerasa.
17. El ligando de ácido nucleico del párrafo 16 identificado según el método del párrafo 1.
18. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 16, en el que dicha polimerasa es Taq polimerasa y en el que dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 10 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
19. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 16, en el que dicha polimerasa es Taq polimerasa y en el que dicho ligando es un ADN sustancialmente homólogo a la Taq polimerasa y tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la misma que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las 15 secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
20. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 16, en el que dicha polimerasa es Taq polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico tiene sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de unirse a Taq polimerasa que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias 20 establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
21. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 16, en el que dicha polimerasa es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la 25 Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
22. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 16, en el que dicha polimerasa es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico es sustancialmente homólogo a la Tth polimerasa y tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la misma que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 30 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
23. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 16, en el que dicha polimerasa es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico tiene sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de unirse a Tth polimerasa que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la 35 Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
24. Un ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado para una transcriptasa inversa.
25. El ligando de ácido nucleico para la transcriptasa inversa del párrafo 24 identificado según el método que comprende:
a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos; 40
b) poner en contacto la mezcla candidata de ácidos nucleicos con la transcriptasa inversa, donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la transcriptasa inversa en relación con la mezcla candidata se pueden separar del resto de la mezcla candidata;
c) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla candidata; y
d) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos 45 enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad y especificidad relativamente superior para la unión a la transcriptasa inversa, mediante lo cual se pueden identificar los ligandos de ácido nucleico de la transcriptasa inversa.
26. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 24, en el que dicha transcriptasa inversa es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las secuencias 50 establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
27. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 24, en el que dicha transcriptasa inversa es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico es sustancialmente homólogo a la Tth polimerasa y tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la misma que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las 55 secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
28. El ligando de ácido nucleico no natural purificado y aislado del párrafo 24, en el que dicha transcriptasa inversa es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico tiene sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de unirse a Tth polimerasa que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias 60 establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
29. Un método para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) que comprende:
a) mezclar una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico que va a amplificarse con cebadores que son complementarios a las secuencias que flanquean la secuencia a amplificar, una polimerasa termoestable, y un ligando de ácido nucleico que es capaz de inhibir la polimerasa a temperaturas ambientes, aunque permite que la polimerasa se active a temperaturas elevadas; y 5
b) realizar las etapas de PCR estándar de fusión del ácido nucleico diana, hibridar los cebadores al ácido nucleico diana y sintetizar el ácido nucleico diana, mediante ciclado térmico de la mezcla.
30. El método del párrafo 29, en el que dicha polimerasa termoestable es Taq polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes 10 de secuencias complementarias de las mismas.
31. El método del párrafo 29, en el que dicha polimerasa termoestable es Taq polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico es sustancialmente homólogo a la Taq polimerasa y tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la misma que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las 15 correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
32. El método del párrafo 29, en el que dicha polimerasa termoestable es Taq polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico tiene sustancialmente la misma estructura que la Taq polimerasa y tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la misma que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID 20 No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
33. El método del párrafo 29, en el que dicha polimerasa termoestable es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas. 25
34. El método del párrafo 29, en el que dicha polimerasa termoestable es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico es sustancialmente homólogo a la Tth polimerasa y tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la misma que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas. 30
35. El método del párrafo 29, en el que dicha polimerasa termoestable es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico tiene sustancialmente la misma estructura que las Tth polimerasas y tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a las mismas que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas. 35
36. Un kit de PCR que comprende una ADN polimerasa termoestable y un ligando de ácido nucleico que inhibe dicha polimerasa a temperaturas ambientes, aunque permite que la polimerasa se active a temperaturas elevadas.
37. El kit de PCR del párrafo 36, en el que dicha ADN polimerasa termoestable es Taq polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las 40 correspondientes de secuencias complementarias de las mismas.
38. El kit de PCR del párrafo 36, en el que dicha ADN polimerasa termoestable es Tth polimerasa y en el que dicho ligando de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes de secuencias complementarias de las mismas. 45
39. Un método mejorado para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en el que dicha mejora comprende la etapa de añadir a la polimerasa termoestable un ligando de ácido nucleico que inhibe dicha polimerasa a temperaturas ambientes, aunque permite que la polimerasa se active a ciclos de temperaturas elevada del proceso de PCR.
40. Un método de identificación de un interruptor de ácido nucleico, que comprende: 50
a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos;
b) poner en contacto la mezcla candidata de ácidos nucleicos con un compuesto diana, donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la diana en relación con la mezcla candidata se pueden separar del resto de la mezcla candidata;
c) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad de las condiciones del resto de la mezcla 55 candidata, mediante lo cual los ácidos nucleicos de mayor afinidad se separan posteriormente en base a su falta de afinidad con la diana después de la variación en un parámetro del medio; y
d) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad y especificidad relativamente superior para la unión a la polimerasa, mediante lo cual se pueden identificar los ligandos de ácido nucleico de la polimerasa. 60
- TABLA 1
- Grupo de Partida de ADNss de Secuencia Aleatoria:
- 5'-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-[N]30-TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3 (SEC. Nº ID.: 1)
- Conjunto I de CEBADOR de PCR para SELEX:
- 5'-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3' (SEC. Nº ID.: 2)
- (SEQ ID NO: 2)
- 5'-BBBTAGGGAAAAGCGAATCATACACAAGA-3' (SEC. Nº ID.: 3)
- (SEQ ID NO:3)
- (B representa Biotina)
- Conjunto II de CEBADOR de PCR para SELEX:
- 5'-GGCGAATTCTTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3'
- EcoRI (SEC. Nº ID.: 4)
- 5'-CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAGCGAATCATACACAAGA-3'
- BamHI (SEC. Nº ID.: 5)
- TABLA 2
- SEC. Nº ID.:
- Nº de CLON SECUENCIA (5'-3')
- CLASE I
- 7
- 2: TATCGTTTACTCATT GTTTTG TGTGT
- 8
- 34: ACATTACCCGAGACATTCCTGAC GTTTTG
- 9
- 21: TGCTGCTCCTTGTTC GTTTTG TCT
- 10
- 18: AGCTTTTGGGGACATTCTAAC GTTTTG TCA
- 11
- 19: AGATGCTTCA GTTTTC-TCTCCGTG
- 12
- 16: T CTTTTG GACTGAAGGTTTGTTGGT
- 13
- 12: ATGGTC TTTTTG TTGTTTGTTTG
- 14
- 9: GTGA CTTTTT ACTTGTCCTAGGCTG
- 15
- 15: CATCTAT GTCTTC TTTATATTTGG
- 16
- 14: ACTACCTGG TTGTGTG CTTTCCAT
- 17
- 25: ATCCATGAGACTAG GTTGGT TAGGGTGGTG
- 18
- 1: CCCTCATA GTTTAA CTTTACCTGGCTTATC
- 19
- 10: AGTGAACACCTTCT GTTTCG TGAGTC
- 20
- 23: CGTGT GTCTTA GTTAGCTCGTGG
- 21
- 24: TAACGTTGTGT GTTCTG TGCTA
- 22
- 26: AACAGATTTGGTCATAT TCCTTG G
- 23
- 27: TGTGTTAT GCTCCG GTAACAATGCCCTT
- 24
- 30: AATTGTA ATTTCG GTATCTCTG
- 25
- 33: GCA ATTTCC TGTCCAATCATTGTAG
- 26
- 36: GCTTGAA GCTTTC ACCCATCCTA/GA
- 27
- 41: CTTCTCCTTTATAT GTCTTA CCA
- 28
- 42: TATCGAGTAGACCCTGTT GTTCGT G
- 29
- 44: CGC GTCTAG CTAAGATTTCTACTGATGCAT
- 30
- 46: ATG ATTTTA TGTTTATCCTGTTT
- SEC. Nº ID.:
- Nº de CLON SECUENCIA (5'-3')
- CLASE II
- 31
- 45: CAGTCGCTGTACGTGCTCTCCCTATGTAAC
- 32
- 6: CAATCGGTGTACAATATCTTCC
- 33
- 28: CGTTAGCTGGTTAGTTAGTACTAG
- 34
- 35: AGGTAAGCGATTATGGGGTTATCG
- 35
- 40: TAGTTACATGAACTAATCGTGGAG
- TABLA 4
- SEC. Nº ID.:
- CLON SECUENCIA
- 50
- TQ30 5'-ttctcggttggtctctggcggagca AAGACCAGACAATGTACAGTATTGGCCTGA tcttgtgtatgattcgcttttccc-3'
- 59
- TQ21 5'-ttctcggttggtctctggcggagca GATCATCTCAGAGCATTCTTAGCGTTTTGT tcttgtgtatgattcgcttttccc-3'
- 67
- Trnc.1-30 5'-GGGACCAGACAATGTACAGTATTGTCTGGTCCC-3'
- 68
- Trnc.2-30 5'-GCCGGCCAATGTACAGTATTGGCCGGC-3'
- 69
- Trnc.3-30 5'-GGCCAATGTACAGTATTGGCC-3'
- 70
- Trnc-21 5'-tggcggagc GATCATCTCAGAGCATTCTTAGCGTTTTGT tcttgtgtatga-3'
- 71
- D.30-D.30
- 72
- D.21-D.30
- 73
- D.30-D.21 3'-agtatgtgttct TGTTTTGCGATTCTTACGAGACTCTACTAG cgaggcggtT
- TABLA 5
- SEC. Nº ID.:
- Nº DE CLON Estructura secundaria1 K2d (nM) T3M (°C)
- 74
- Trnc.A-30 (30-meros) 0,6 ± 0,1 51
- 67
- Trnc.1-30 (33-meros) 2,0 ± 0,3 77
- 68
- Trnc.2-30 (27-meros) 3,1 ± 0,3 81,5
- 69
- Trnc.3-30 (24-meros) 2,8 ± 0,4 65,5
1 La región recuadrada indica el elemento de secuencia conservada con la estructura de tallo-bucle predicha identificada en las secuencias de la Familia I; las líneas verticales significan emparejamientos de bases del tipo Watson-Crick; los círculos muestran un emparejamiento de bases G-T poco habitual. 5
2 Los valores de Kd se midieron mediante la técnica de unión a filtro de nitrocelulosa descrita en el EJEMPLO I.
3 Las transiciones por fusión (Tm) se midieron en un tampón de PCR que contenía Tris-HCl 10 mM, KCl 10 50 mM, MgCl2 2 mM, pH 8,3, con una rampa de temperatura de 1˚C/min.
15
[0091]
(A) SOLICITANTE: Swanson and Bratschun, L.L.C. 25
(B) CALLE: 8400 East Prentice Ave.,Suite 200
(C) CIUDAD: Denver
(D) ESTADO: Colorado
(E) PAIS: USA
(F) CÓDIGO POSTAL: 80111 30
(A) TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 1,44 MB de capacidad (B) ORDENADOR: Compatible IBM
(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
(D) PROGRAMA: WordPerfect 6.0
5
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/______
(B) FECHA DE REGISTRO:
(C) CLASIFICACIÓN: 10
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/487.426
(B) FECHA DE REGISTRO: 7-JUNE-1995 15
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/487,720
(B) FECHA DE REGISTRO: 7-JUNE-1995 20
(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 08/484,557
(B) FECHA DE REGISTRO: 7-JUNE-1995 25
(A) NOMBRE: Barry J. Swanson
(B) NÚMERO DE REGISTRO: 33,215 30
(C) NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: NEX43C/PCT
(A) TELEFONO: (303) 793-3333 35
(B) TELEFAX: (303) 793-3433
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 45
(ix) CARACTERÍSTICA:
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 1:
50
NNNNNNNNNN NNNNTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
55
(A) LONGITUD: 24 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 60
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 2:
TTCTCGGTTG GTCTCTGGCG GAGC 24
5
(A) LONGITUD: 29 pares de bases 10
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERÍSTICA:
(D) OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 1, 2, y 3 es biotina
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 3: 20
NNNTAGGGAA AAGCGAATCA TACACAAGA 29
25
(A) LONGITUD: 33 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 30
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 4:
GGCGAATTCT TCTCGGTTGG TCTCTGGCGG AGC 33 35
40
(A) LONGITUD: 50 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
45
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 5:
ATACACAAGA 50
(A) LONGITUD: 49 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 60
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 6:
TAGCCGCGT 49 5
10
(A) LONGITUD: 74 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
15
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 7:
TTTTGTGTGT TCTTGTGTAT GATTCGCTTT TCCC 74 20
25
(A) LONGITUD: 76 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
30
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 8:
CCTGACGTTT TGTCTTGTGT ATGATTCGCT TTTCCC 76 35
40
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
45
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 9:
TTTTGTCTTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72 50
55
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
60
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 10:
CTAACGTTTT GTCATCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 10
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 11: 15
TCTCCGTGTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
(A) LONGITUD: 73 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 25
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 12: 30
TTTGTTGGTT CTTGTGTATG ATTCGCTTTT CCC 73
(A) LONGITUD: 71 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 40
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 13: 45
TTGTTTGTCT TGTGTATGAT TCGCTTTTCC C 71
(A) LONGITUD: 73 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 55
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 14: 60
CCTAGGCTGT CTTGTGTATG ATTCGCTTTT CCC 73
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 10
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 15:
ATATTTGGTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 25
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 16:
CTTTCCATTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 40
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 17:
TGGTTAGGGT GGTGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 18:
TTACCTGGCT TATCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 74 pares de bases 5
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 19:
TTCGTGAGTC TCTTGTGTAT GATTCGCTTT TCCC 74
15
(A) LONGITUD: 71 pares de bases 20
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 20:
TTCTCGGTTG GTCTCTGGCG GAGCCGTGTG TCTTAGTTAG 40
CTCGTGGTCT TGTGTATGAT TCGCTTTTCC C 71
30
(A) LONGITUD: 70 pares de bases 35
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 21:
GTGCTATCTT GTGTATGATT CGCTTTTCCC 70
45
(A) LONGITUD: 72 pares de bases 50
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 22:
TTCCTTGGTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
60
(A) LONGITUD: 76 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 5
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 23:
10
AACAATGCCC TTTCTTGTGT ATGATTCGCT TTTCCC 76
15
(A) LONGITUD: 70 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 20
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 24:
25
TCTCTGTCTT GTGTATGATT CGCTTTTCCC 70
30
(A) LONGITUD: 73 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 35
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 25:
40
TCATTGTAGT CTTGTGTATG ATTCGCTTTT CCC 73
45
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 50
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 26:
55
CATCCTRATC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
60
(A) LONGITUD: 71 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
5
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 27:
CTTACCATCT TGTGTATGAT TCGCTTTTCC C 71 10
15
(A) LONGITUD: 73 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 28:
TTGTTCGTGT CTTGTGTATG ATTCGCTTTT CCC 73 25
30
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
35
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 29:
TTCTACTGAT GCATTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78 40
45
(A) LONGITUD: 71 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 30:
CCTGTTTTCT TGTGTATGAT TCGCTTTTCC C 71 55
60
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 31: 5
TCTCCCTATG TAACTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 70 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 15
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 32: 20
TCTTCCTCTT GTGTATGATT CGCTTTTCCC 70
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 30
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 33: 35
AGTACTAGTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 45
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 34: 50
GGTTATCGTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
(A) LONGITUD: 72 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 60
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 35:
TCGTGGAGTC TTGTGTATGA TTCGCTTTTC CC 72
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 15
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 36:
ATCGAAAGAG GCTGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 30
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 37:
ATGTCAGAGT ATCCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 45
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 38:
ATCTGAGAGT ATCCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 77 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 60
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 39:
ACGATGGGGA CGGTCTTGTG TATGATTCGC TTTTCCC 77
5
(A) LONGITUD: 78 pares de bases 10
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 40:
CCCGGTAGAG CTATTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
20
(A) LONGITUD: 78 pares de bases 25
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 41:
ATCGCTGGTG GTCATCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
35
(A) LONGITUD: 76 pares de bases 40
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 42:
CCTACGCTAG TGTCTTGTGT ATGATTCGCT TTTCCC 76
50
(A) LONGITUD: 78 pares de bases 55
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 43:
CTCATAAGAG ACCATCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
5
(A) LONGITUD: 76 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 10
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 44:
15
CCTACGCTAG TGTCTTGTGT ATGATTCGCT TTTCCC 76
20
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 25
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 45:
30
GGGTACGTCA GTAGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
35
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 40
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 46:
45
ACAGTATTGG GATCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
50
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 55
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 47:
60
AGTATCAATG CTGCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
5
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
10
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 48:
GCAGTATGTG AAGGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78 15
20
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
25
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 49:
GCAGTATTGG AAGGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78 30
35
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
40
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 50:
CAGTATTGGC CTGATCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78 45
50
(A) LONGITUD: 77 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 51:
TTTTGTCATG ATTCTTGTGT ATGATTCGCT TTTCCCT 77 60
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 5
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 52: 10
GCGTATTGGA GTCCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LENGTH: 79 base pairs
(B) TIPO: ácido nucleico 20
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 53: 25
GCGTTATGTC TCTGATCTTG TGTATGATTC GCTTTTCCC 79
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 35
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 54: 40
TAGCGTTTTG TTCCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 50
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 55: 55
GCAACCTTTT GTCATCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 5
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 56:
TCTGCGTTTA GTCGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 20
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 57:
CTTTGCGTTT TGCGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 77 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 35
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 58:
TCTAACGTTA TGATCTTGTG TATGATTCGC TTTTCCC 77
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 50
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 59:
TCTTAGCGTT TTGTTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 60:
TCTTAGCGTT TTGGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
10
(A) LONGITUD: 78 pares de bases 15
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 61:
TCTGTGCGTT TAGCTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
25
(A) LONGITUD: 78 pares de bases 30
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 62:
ATTCAAACGT TTTATCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
40
(A) LONGITUD: 78 pares de bases 45
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 63:
ATTCCAACGT TTGGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
55
(A) LONGITUD: 78 pares de bases 60
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 64:
5
ATTCTGACGT TTTGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
10
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 15
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 65:
20
ATTCCAACGT TTTGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
25
(A) LONGITUD: 78 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 30
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 66:
35
ATTCCAACGT TTTGTCTTGT GTATGATTCG CTTTTCCC 78
40
(A) LONGITUD: 33 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 45
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 67:
50
GGGACCAGAC AATGTACAGT ATTGTCTGGT CCC 33
(A) LONGITUD: 27 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal 60
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 68:
GCCGGCCAAT GTACAGTATT GGCCGGC 27
(A) LONGITUD: 21 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 10
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 69: 15
GGCCAATGTA CAGTATTGGC C 21
20
(A) LONGITUD: 51 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 25
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 70:
30
CTTGTGTATG A 51
35
(A) LONGITUD: 55 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 40
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERÍSTICA: 45
(D) OTRAS INFORMACIÓN: N en la posición 28 es un fosforamidito con orientación invertida (enlace 3'-3')
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 71: 50
ACATGTAACC GGCCG 55
(A) LONGITUD: 81 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 60
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 72:
C 81
10
(A) LONGITUD: 81 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 15
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 73:
20
A 81
(A) LONGITUD: 36 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 30
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 74: 35
AAGACCAGAG GCCAATGTAC AGTATTGGCC GCCTGA 36
40
(A) LONGITUD: 97 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple 45
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 75:
50
TACCTCAGTT TCCCACC 97
(A) LONGITUD: 30 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico 60
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 76:
TCAATACACA AATTGATGTA CAGTGTCGAT 30 5
10
(A) LONGITUD: 30 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE HEBRA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
15
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 77:
CATTGGGCCA GAGGAACACA ACCTCAACAG 30
20
Claims (20)
- REIVINDICACIONES1.- Ligando de ácido nucleico para una ADN polimerasa termoestable, en el que el ligando de ácido nucleico se une a dicha polimerasa e inhibe a la misma a temperaturas ambientes, aunque permite que la polimerasa se active a temperaturas elevadas. 5
- 2.- Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que la temperatura ambiente es la temperatura de la habitación o inferior a 40oC.
- 3.- Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el que la temperatura 10 elevada es superior a 40oC.
- 4.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ligando de ácido nucleico es ADN.15
- 5.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ligando de ácido nucleico es de cadena sencilla.
- 6.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha polimerasa deriva de la especie Thermus. 20
- 7.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha ADN polimerasa termoestable es polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) o una transcriptasa inversa.25
- 8.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico comprende la secuencia de consenso:5’-A/GA/GTGTG/ACAGTAT/GC-3’.
- 9.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido 30 nucleico comprende la secuencia de una cualquiera de las SEC ID Nos. 50, 67, 68, 69 ó 74.
- 10.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico es uno cualquiera de las SEC ID Nos. 50, 67, 68, 69 ó 74 o un ligando de ácido nucleico que tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse e inhibir la actividad de Taq o Tth polimerasa que una de las 35 SEC ID Nos: 50, 67, 68, 69 ó 74.
- 11.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico comprende la secuencia consenso:5’-A/GCGTTTTG-3’. 40
- 12.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico comprende la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nos. 59 ó 70.
- 13.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido 45 nucleico es la SEC ID Nos. 59 ó 70 o un ligando de ácido nucleico que tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse e inhibir la actividad de Taq o Tth polimerasa que la SEC ID No: 59 ó 70.
- 14.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ligando de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 3 (SEC ID 50 Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes secuencias complementarias de las mismas.
- 15.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ligando de ácido nucleico tiene un grado de homología de secuencia primaria superior al 70% y tiene sustancialmente 55 la misma capacidad de unirse a Taq o Tth polimerasa que un ligando seleccionado del grupo que consiste en las secuencias establecidas en la Tabla 3 (SEC ID Nos: 36-66, 76, 77), Tabla 2 (SEC ID Nos. 7-35), Tabla 4 (SEC ID Nos. 67-73) o la Tabla 5 (SEC ID No: 74), o las correspondientes secuencias complementarias de las mismas.60
- 16.- Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una caperuza en 3’.
- 17.- Reactivo de PCR que comprende un ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
- 18.- Método de producción de un ligando de ácido nucleico para un compuesto diana, en el que el ligando de ácido nucleico es un interruptor de ácido nucleico, comprendiendo dicho método la etapa de producir un 5 ligando de ácido nucleico basado en una secuencia de ácido nucleico identificada por un proceso que comprende las etapas de:a) preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos;b) poner en contacto la mezcla candidata de ácidos nucleicos con un compuesto diana, donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la diana en relación con la mezcla candidata 10 se pueden separar del resto de la mezcla candidata;c) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla candidata, mediante lo cual los ácidos nucleicos con una mayor afinidad se separan posteriormente en base a su falta de afinidad con la diana después de la variación de un parámetro del medio; yd) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad separados posteriormente en la 15 etapa c) para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad y especificidad relativamente superior para la unión a la diana y la falta de afinidad con la diana después de la variación de un parámetro del medio,mediante lo cual se pueden identificar los ligandos de ácido nucleico de la diana.20
- 19.- Método según la reivindicación 18, en el que el parámetro del medio es la temperatura.
- 20.- Método según la reivindicación 18 ó 19, en el que la diana es una ADN polimerasa termoestable.25
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US484557 | 1983-04-13 | ||
| US487720 | 1995-06-07 | ||
| US487426 | 1995-06-07 | ||
| US08/484,557 US5693502A (en) | 1990-06-11 | 1995-06-07 | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2358235T3 true ES2358235T3 (es) | 2011-05-06 |
Family
ID=43880337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES09000032T Expired - Lifetime ES2358235T3 (es) | 1995-06-07 | 1996-06-05 | Ligandos de ácido nucleico que se unen a adn polimerasas y las inhiben. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2358235T3 (es) |
-
1996
- 1996-06-05 ES ES09000032T patent/ES2358235T3/es not_active Expired - Lifetime
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2321243T3 (es) | Ligandos de acido nucleico que se unen a las adn polimerasas y las inhiben. | |
| ES2349213T3 (es) | Ligandos de ácido nucleico inhibidores de las adn polimerasas. | |
| US5763173A (en) | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases | |
| US5693502A (en) | Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases | |
| Dang et al. | Oligonucleotide inhibitors ofTaqDNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR | |
| Lin et al. | Modified RNA sequence pools for in vitro selection | |
| US5674685A (en) | High affinity PDGF nucleic acid ligands | |
| US6001577A (en) | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex | |
| AU781234B2 (en) | High affinity TGF beta nucleic acid ligands and inhibitors | |
| ES2259800T3 (es) | Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico. | |
| Burmeister et al. | 2-Deoxy purine, 2-O-methyl pyrimidine (dRmY) aptamers as candidate therapeutics | |
| CA2264246A1 (en) | Catalytic nucleic acid and its medical use | |
| US5686592A (en) | High-affinity oligonucleotide ligands to immunoglobulin E (IgE) | |
| EP1889910A2 (en) | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex | |
| ES2358235T3 (es) | Ligandos de ácido nucleico que se unen a adn polimerasas y las inhiben. | |
| US5837456A (en) | High affinity oligonucleotide ligands to chorionic gonadotropin hormone and related glycoprotein hormones | |
| CA2146859A1 (en) | Method for selecting nucleic acids on the basis of structure | |
| WO2003089650A2 (en) | Allosteric nucleic acid sensor molecules | |
| GREEN et al. | ligands that inhibit the interaction of vascular permeability |