PT1171632E - Inibidores ligandos de ácido nucleico para adn-polimerases - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Inibidores ligandos de ácido nucleico para ADN-polimerases"

CAMPO DO INVENTO São aqui descritos métodos para identificação e preparação de ligandos de ácidos nucleicos de elevada afinidade para ADN-polimerases, especificamente ADN-polimerases termoestáveis. A ADN-polimerase pode ser polimerase Taq, uma polimerase termoestável isolada a partir de Thermus aquaticus; polimerase Tth, uma ADN-polimerase termoestável isolada a partir de Thermus thermophilus; ou a polimersase TZ05, isolada a partir de outra espécie de Thermus. No entanto, o método pode ser alargado à identificação e preparação de qualquer ADN-polimerase termicamente estável. Algumas destas ADN-polimerases termoestáveis também têm a capacidade de transcrever de forma inversa ARN em ADN cópia. Exemplos de ADN-polimerases com capacidade de transcrição inversa incluem a polimerase Tth e TZ05. 0 método aqui utilizado para identificação de tais ligandos de ácido nucleico é designado SELEX, um acrónimo para Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (Evolução Sistemática de Ligandos através de Enriquecimento Exponencial). É também aqui descrito um método melhorado para a realização de Reacção em Cadeia pela Polimerase utilizando os ligandos de ácido nucleico do presente invento. São aqui especificamente divulgados ligandos de ácido nucleico de elevada afinidade para a polimerase Taq, polimerase Tth, e polimerase TZ05. 0 presente invento inclui ligandos de ADN de elevada afinidade que se ligam à polimerase TZ05, inibindo desse modo a sua actividade de polimerase num intervalo predeterminado de temperaturas. Ainda incluídos dentro deste invento estão interruptores de ácido nucleico. Os ligandos de ácido nucleico para ADN-polimerases com ligação dependente da temperatura deste invento são exemplos de ligandos cujas propriedades desejáveis podem ser ligadas ou desligadas com base em qualquer número de condições reaccionais, tais como pH e concentração salina. 2 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

ANTECEDENTES DO INVENTO A Reacção em Cadeia pela Polimerase (PCR) é uma técnica recentemente desenvolvida que teve um impacto significativo em muitas áreas da ciência. A PCR é um método rápido e simples para amplificar especificamente uma sequência de ADN alvo de uma forma exponencial. (Saiki et al., Science 230: 1350, 1985; Mullis e Faloona, Methods Enzymol. 155: 335, 1987). Resumidamente, o método consiste em sintetizar um conjunto de iniciadores que possuem sequências nucleotidicas complementares ao ADN que flanqueia a sequência alvo. Os iniciadores são depois misturados com uma solução do ADN alvo, uma ADN-polimerase termoestável, e todos os quatro desoxinucleótido-trifosfatos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP). A solução é então aquecida a uma temperatura suficiente para separar as cadeias complementares de ADN (aproximadamente 95°C) e depois arrefecida a uma temperatura suficiente para permitir que os iniciadores se liguem às sequências flanqueadoras. A mistura reaccional é então aquecida de novo (até aproximadamente 72°C) para permitir que a síntese de ADN prossiga. Após um curto período de tempo, a temperatura da mistura reaccional é novamente aumentada para uma temperatura suficiente para separar o ADN de cadeia dupla formado de novo, completando assim o primeiro ciclo de PCR. A mistura reaccional é então arrefecida e o ciclo é repetido. Assim, a PCR consiste em ciclos repetitivos de desnaturação, hibridação e síntese de ADN. vinte ciclos de replicação podem produzir uma amplificação de até um milhão de vezes da sequência de ADN alvo. A capacidade de amplificar uma única molécula de ADN por PCR tem aplicações em microbiologia ambiental e alimentar (Wernars et al., Appl. Env. Microbiol. 57: 1914-1919, 1991; Hill e Keasler, Int. J. Food Microbiol. 12: 67-75, 1991), microbiologia clínica (Wages et al., J. Med. Virol. 33:58-63, 1991; Sacramento et al., Mol. Cell Probes 5: 229-240, 1991; Laure et al., Lancet 2: 538, 1988), oncologia (Kumar e Barbacid, Oncogene 3: 647-651, 1988; McCormick, Câncer Cells 1: 56-61, 1989; Crescenzi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4869, 1988), prognóstico de doenças genéticas (Handyside et al., Nature 344: 768-770, 1990), bancos de sangue (Jackson, Transfusion 30: 51-57, 1990) e ciência forense (Higuchi et al., Nature (London) 332: 543, 1988). 3 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ A disponibilidade de ADN-polimerases termoestáveis tais como a ADN-polimerase Taq simplificou e melhorou a PCR. Originalmente apenas polimerases sensíveis ao calor, tais como a ADN-polimerase de E. coli estavam disponíveis para utilização em PCR. As polimerases sensíveis ao calor, no entanto, são destruídas às temperaturas necessárias para desnaturar o ADN de cadeia dupla e tem de ser adicionada mais polimerase após cada ciclo de PCR. A ADN-polimerase Taq, isolada a partir da bactéria termófila Thermus aquaticus, é estável até 95°C e a sua utilização em PCR eliminou a necessidade de adição repetitiva de polimerases sensíveis à temperatura após cada ciclo térmico. Adicionalmente, uma vez que a polimerase Taq pode ser utilizada a temperaturas mais elevadas, melhorou especificidade e sensibilidade da PCR. A razão para a melhor especificidade é que a temperaturas mais elevadas a ligação de iniciadores a locais diferentes dos desejados (referido como iniciação errada) é significativamente reduzida.

Desde a sua descoberta, a Reacção em Cadeia pela Polimerase foi modificada para várias aplicações, tais como PCR in situ, na qual o limite de detecção da hibridação in situ tradicional foi levado até ao nível de uma única cópia (Haase et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4971-4975, 1990), e transcriptase inversa-PCR (RT-PCR), em que uma sequência de ARN é convertida no seu ADN cópia (ADNc) através da transcriptase inversa (RT) antes de ser amplificado por PCR, tornando o ARN um substrato para PCR (Kawasaki (1991) "Amplification of RNA in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", Innis et al., Eds. Academic Press Inc., San Diego, CA, 21-27). As transcriptases inversas virais mesófilas, no entanto, são frequentemente incapazes de sintetizar moléculas de ADNc inteiras porque não conseguem "ler através de" estruturas secundárias estáveis das moléculas de ARN. Esta limitação foi recentemente superada através da utilização de um polimerase isolada a partir de Thermus thermophilus (polimerase Tth). A polimerase Tth é uma polimerase termoestável que pode funcionar como transcriptase inversa e ADN-polimerase (Myers e Gelfand, Biochemistry 30: 7661-7666, 1991) . A transcrição inversa realizada a uma temperatura elevada utilizando a polimerase Tth elimina as 4 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ estruturas secundárias do ARN molde, tornando possível a síntese de ADNc inteiro.

Embora tenha sido feito um progresso significativo na tecnologia de PCR, a amplificação de oligonucleótidos não alvo devido a reacções secundárias, tais como iniciação errada do ADN de fundo e/ou oligomerização de iniciadores apresenta ainda um problema significativo. Isto é especialmente verdade em aplicações de diagnóstico, nas quais a PCR é realizada num meio contendo ADN de fundo enquanto o ADN alvo podem estar presente numa única cópia (Chou et al., Nucleic Acid Res. 20: 1717-1723, 1992). A geração de produtos amplificados não especificamente foi atribuída à actividade da polimerase à temperatura ambiente que prolonga iniciadores ligados não especif icamente. (Chou et al., Nucleic Acid Res. 20: 1717- 1723, 1992; Li et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4580, 1990) . Assim, a inibição da actividade da polimerase à temperatura ambiente é importante para controlar a geração de produtos não específicos.

Foram relatados dois métodos que minimizam estas reacções secundárias. No primeiro método, designado PCR de "início quente manual", um componente crítico para a actividade da polimerase (p.ex. iões bivalentes e/ou a própria polimerase) não é adicionado à mistura reaccional até a temperatura da mistura ser suficiente para prevenir ligação não específica dos iniciadores. (Chou et al., Nucleic Acid Res. 20: 1717- 1723, 1992; D'Aquila et al., Nucleic Acid Res. 19: 3749, 1991) . Assim, todos os reagentes são aquecidos a 72°C antes da adição do reagente final, habitualmente a polimerase. Na PCR de "início quente" mediada por cera, um ou mais componentes cruciais para a actividade da polimerase são fisicamente separados do resto da mistura reaccional a baixa temperatura através de uma camada de cerca que se derrete após aquecimento no primeiro ciclo. (Chou et al., Nucleic Acids Res. 20: 1717, 1992; Horton et al., BioTechniques 16: 42, 1994). A PCR de "início quente" tem certos inconvenientes; o requisito de reabertura dos tubos antes do início dos ciclos térmicos aumenta a contaminação cruzada e a pipetagem repetitiva torna fastidioso o manuseamento de um grande número de amostras. Um reagente que pudesse ser colocado directamente na mistura reaccional com todos os outros componentes da reacção e 5 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ inibisse a polimerase à temperatura ambiente poderia ser útil para ultrapassar as limitações associadas à PCR de "inicio quente". Embora este método aumente a especificidade, reduzindo desse modo produtos secundários, o método é inconveniente para lidar com um grande número de amostras, a mistura reaccional pode tornar-se mais facilmente contaminada, e o método tende para o erro.

No segundo método, designado de "inicio quente in situ" um reagente que se liga e inibe a polimerase a baixa temperatura, mas não a temperatura elevada, (p.ex., um anticorpo neutralizante para a polimerase Taq (TagStart) ou um oligonucleótido aptâmero) é adicionado à mistura reaccional completa. (Birch et al., Nature 381: 445, 1996; Dang e

Jayasena, J. Mol. Biol. 264: 268, 1996; Kellogg et al., BioTechníques 16: 1134-1137, 1994). Este anticorpo inibe a actividade da polimerase à temperatura ambiente, mas é inactivado através de desnaturação térmica quando se inicia o ciclo térmico da reacção, tornando a polimerase activa. A desvantagem desta abordagem para redução de produtos secundários é que o anticorpo anti-Iag deve ser armazenado a -20°C até à sua utilização, o que significa que os estojos de detecção devem ser embalados e expedidos sob ambiente controlado aumentando o seu custo. Adicionalmente, é necessária uma quantidade significativa de anticorpo (* 1 pg de anticorpo/5 U de polimerase Taq), diluído num tampão especificado pelo vendedor, para uma única PCR. 0 desenvolvimento de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidade capazes de inibir as polimerases termoestáveis Taq e Tth obviaria a necessidade do método de "início quente" e superaria as limitações associadas ao segundo método. Podem ser desenvolvidos inibidores de ácidos nucleicos que sejam extremamente específicos e tenham elevada afinidade. Uma vez que os ácidos nucleicos são mais estáveis que as proteínas à temperatura ambiente, os problemas de expedição e embalamento associados à utilização de anticorpos podem ser superados. Adicionalmente, podem ser identificados ácidos nucleicos, tal como anticorpos, que perderão a sua afinidade para a polimerase a temperaturas mais elevadas, permitindo que a polimerase seja activada quando desejado. 0 potencial para iniciação errada mediada pelos próprios 6 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ inibidores baseados em ácidos nucleicos funcionando como iniciadores (além dos iniciadores específicos utilizados na reacção) na PCR pode ser eliminado cobrindo as suas extremidades 3'.

Estruturas cristalinas de raios X de várias ADN-polimerases indicaram que estas se dobram em estruturas tridimensionais semelhantes. (Para uma revisão, ver Joyce e Steitz, Annu. Rev. Biochem. 63: 777, 1994). 0 domínio C-terminal responsável pela polimerização é organizado em três subdomínios representando "palma", "dedos" e "polegar," anatomicamente análogo a uma mão direita. A polimerase Tth e a polimerase Taq são 93% semelhantes e 88% idênticas ao nível da sequência de aminoácidos (Abramson (1995) em "PCR Strategies" (Academic Press, New York). Ambas são desprovidas de actividade exonucleásica 3 '-»5', mas contêm actividade exonucleásica 5'-*3' (Abramson (1995) em "PCR Strategies" (Academic Press, New York); Tindall e Kunkel, Biochemistry 27: 6008, 1988) . Assim, pode-se esperar que os inibidores ligandos de ácido nucleico se comportem semelhantemente em relação a ambas estas enzimas, bem como a outras polimerases termoestáveis. Isto tornaria possível a utilização de um único inibidor para várias enzimas termoestáveis.

As sequências de ARN são convertidas em ADNc através de transcrição inversa antes de serem amplificadas por PCR. Inicialmente, isto foi conseguido em dois passos utilizando duas enzimas diferentes: uma transcriptase inversa e uma ADN-polimerase termoestável. Estudos recentes mostraram que certas ADN-polimerases termoestáveis têm a capacidade de transcrever de forma inversa o ARN, permitindo a utilização de uma única enzima para amplificar amplicões de ARN (Myers e Gelfand, Biochemistry 30: 7661-7666, 1991). Uma vez que o ARN é lábil a alta temperatura na presença de iões bivalentes, a transcrição inversa é realizada a uma temperatura mais baixa (50-60°C) do que a síntese de ADN. Por isso, seria desejável ter um reagente que fosse utilizado para inibir a actividade ambiente da polimerase e que reactivasse a polimerase a uma temperatura mais baixa. Este requisito elimina a utilização de um anticorpo que exige temperaturas elevadas (70-90°C) para inactivação para gerar condições de início a quente in situ em amplificações baseadas em ARN. 7 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ SELEX™

Foi desenvolvido um método para a evolução in vitro de moléculas de ácido nucleico com ligação altamente especifica a moléculas alvo. Este método, Evolução Sistemática de Ligandos através de Enriquecimento Exponencial, designado SELEX , e descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/536428, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment," agora abandonado, Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/714131, apresentado a 10 de Junho de 1991, intitulado "Nucleic Acid Ligands" agora Patente dos Estados Unidos N.° 5475096, e Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/931473, apresentado a 17 de Agosto de 1992, intitulado "Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5270163 (ver também WO 91/19813, publicada a 26 de Dezembro de 1991). Cada uma destas aplicações, colectivamente aqui referidas com os Pedidos de Patente de SELEX, descreve um método fundamentalmente novo para produzir um ligando de ácido nucleico para qualquer molécula alvo desejada. O método SELEX envolve a selecção a partir de uma mistura de oligonucleótidos candidatos e iterações de ligação, partição e amplificação em etapas, utilizando o mesmo esquema geral de selecção, para alcançar virtualmente qualquer critério desejado de afinidade e selectividade de ligação. A partir de uma mistura de ácidos nucleicos, de preferência compreendendo um segmento de sequência aleatória, o método SELEX inclui os passos de contacto da mistura com o alvo sob condições favoráveis para ligação, partição de ácidos nucleicos não ligados dos ácidos nucleicos que se ligaram especificamente a moléculas alvo, dissociação dos complexos de ácido nucleico-alvo, amplificação dos ácidos nucleicos dissociados dos complexos de ácido nucleico-alvo para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligandos, reiterando depois os passos de ligação, partição, dissociação e amplificação através de tantos ciclos quanto desejado para produzir ligandos de ácidos nucleicos de elevada afinidade altamente específicos para a molécula alvo. 8 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ Ο método SELEX básico foi modificado para alcançar vários objectivos específicos. Por exemplo, um Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/960093, apresentado a 14 de Outubro de 1992, intitulado "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure" agora abandonado (ver Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N°. de Série 08/198670, apresentado a 22 de Fevereiro de 1994, intitulado "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5707796), descreve a utilização de SELEX em conjunto com electroforese em gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico com características estruturais específicas, tais como ADN dobrado. O Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/123935, apresentado a 17 de Setembro de 1993, intitulado "Photoselection of Nucleic Acid Ligands," agora abandonado (Ver Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/612895, apresentado a 8 de Março de 1996, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5736177), descreve um método baseado em SELEX para seleccionar ligandos de ácido nucleico contendo grupos fotorreactivos capazes de se ligar e/ou fotorreticular e/ou fotoinactivar uma molécula alvo. O Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/134028, apresentado a 7 de Outubro de 1993, intitulado "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", abandonado a favor do Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/443957, apresentado a 18 de Maio de 1995, intitulado "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5580737), descreve um método para identificação de ligandos de ácido nucleico altamente específicos capazes de discriminar entre moléculas intimamente aparentadas, designado Counter-SELEX. O Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/143564, apresentado a 25 de Outubro de 1993, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", abandonado a favor do Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/461069, apresentado a 5 de Junho de 1995, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5567588, descreve um método baseado em SELEX que alcança uma partição 9 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ altamente eficiente entre oligonucleótidos possuindo uma afinidade elevada e baixa para uma molécula alvo. 0 Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/964624, apresentado a 21 de Outubro de 1992, intitulado "Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5496938, descreve métodos para obtenção de ligandos de ácido nucleico melhorados após ter sido efectuado SELEX. O Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/400440, apresentado a 8 de Março de 1995, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5705337, descreve métodos para ligar covalentemente um ligando ao seu alvo. O método SELEX engloba a identificação de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidade contendo nucleótidos modificados conferindo caracteristicas melhoradas ao ligando, tal como estabilidade in vivo melhorada ou caracteristicas de distribuição melhoradas. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas na ribose e/ou fosfato e/ou posições das bases. Ligandos de ácidos nucleicos identificados por SELEX contendo nucleótidos modificados são descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/117991, apresentado em 8 de Setembro de 1993, intitulado "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", abandonado a favor do Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/430709, apresentado a 27 de Abril de 1995, intitulado "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", agora Patente dos Estados Unidos N°. 5660985, que descreve oligonucleótidos contendo derivados nucleotídicos quimicamente modificados nas posições 5- e 2' das pirimidinas. A Patente dos Estados Unidos N.° 5580737, supra, descreve ligandos de ácido nucleico altamente específicos contendo um ou mais nucleótidos modificados com 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'—F), e/ou 2'-O-metil (2'-OMe). O Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/264029, apresentado a 22 de Junho de 1994, intitulado "Novel Method of Preparation of Known and Novel Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displacement", agora abandonado, descreve oligonucleótidos contendo várias pirimidinas modificadas em 2'. 10 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ Ο método SELEX engloba a combinação de oligonucleótidos seleccionados com outros oligonucleótidos seleccionados e unidades funcionais não oligonucleotídicas tal como descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/284063, apresentado a 2 de Agosto de 1994, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX", agora Patente dos Estados Unidos N°. 5637459 e no Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/234997, apresentado a 28 de Abril de 1994, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5683867, respectivamente. Estes pedidos permitem a combinação da ampla série de formas e outras propriedades, e das propriedades de amplificação e replicação eficientes, de oligonucleótidos com as propriedades desejáveis de outras moléculas. WO96/41010, apresentado a 5 de Junho de 1996, intitulado "Nucleic acid ligands that bind to and inhibit DNA polimerases", divulga ligandos de ácido nucleico de elevada afinidade que se ligam e inibem ADN-polimerases, em particular as polimerases Taq e Tth, e a sua utilização num método para inibição da actividade de uma ADN-polimerase ou num método para realização de PCR. Os ligandos são seleccionados à temperatura ambiente, e não inibem nenhuma das polimerases a temperaturas acima de 40°C.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO A presente invenção inclui métodos de identificação e produção de ligandos de ácido nucleico para ADN-polimerases. Estão especificamente incluídos métodos para identificação de ligandos de ácido nucleico para ADN-polimerases termoestáveis úteis na Reacção em Cadeia pela Polimerase, incluindo as polimerases Taq, Tth e TZ05 e os ligandos de ácido nucleico assim identificados e produzidos. Mais particularmente, são proporcionadas sequências de ADN que são capazes de se ligar especificamente às polimerases Taq, Tth e TZ05, respectivamente, inibindo desse modo a sua capacidade de catalisar a síntese de ADN. Utilizando o método desta divulgação são seleccionados in vitro ligandos de ácido nucleico sob as condições definidas pelo utilizador, que assim, proporciona a oportunidade de seleccionar ligandos que se liguem e inibam uma polimerase a uma temperatura 11 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ predeterminada ou próximo desta. São proporcionadas sequências de ADN que se ligam e inibem a polimerase Taq e Tth a temperaturas ambiente e que se ligam e inibem a polimerase Taq e TZ05 próximo de 55°C. 0 método pode ser estendido à identificação e produção de ligandos de ácido nucleico para qualquer ADN-polimerase termoestável até qualquer temperatura predeterminada e aos ligandos assim identificados e produzidos.

Está ainda incluido nesta divulgação um método de identificação de ligandos de ácido nucleico e sequências de ligandos de ácido nucleico para as polimerases Taq, Tth e TZ05 compreendendo os passos de (a) preparação de uma mistura de candidatos de ácidos nucleicos, (b) partição entre membros da referida mistura de candidatos com base na afinidade para as polimerases Taq, Tth e TZ05 a uma temperatura predeterminada e (c) amplificação das moléculas seleccionadas para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácido nucleico com uma afinidade relativamente mais elevada para ligação às polimerases Taq, Tth e TZ05, respectivamente.

Está ainda incluído neste invento um método melhorado de realização da Reacção em Cadeia pela Polimerase compreendendo o passo de inclusão de um ligando de ácido nucleico que iniba a polimerase termoestável a temperaturas ambiente, mas que se dissocie da polimerase a temperaturas elevadas. Tais ligandos de ácido nucleico são identificados de acordo com o método desta divulgação.

Mais especificamente, o presente invento inclui os ligandos de ADNcs para a polimerase TZ05 de acordo com a reivindicação 1. Estão também incluídos ligandos de ADN para a polimerase TZ05 que são substancialmente homólogos a qualquer um dos dados ligandos e que têm substancialmente a mesma capacidade para se ligarem e inibirem a actividade da polimerase TZ05. Ainda incluídos neste invento estão ligandos de ADN para a polimerase TZ05 que têm substancialmente a mesma forma estrutural que os ligandos aqui apresentados e que têm substancialmente a mesma capacidade para se ligarem e inibirem a actividade da polimerase TZ05. 12 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ A presente divulgação inclui também sequências nucleotidicas modificadas baseadas nos ligandos de ADN aqui identificados e misturas dos mesmos.

Os ligandos de ácido nucleico do presente invento podem funcionar como "interruptores" porque "ligam" ou "desligam" a Reacção em Cadeia pela Polimerase, dependendo da temperatura da mistura reaccional. A presente divulgação, portanto, inclui também um método para identificação e preparação de sequências de ligando de ácido nucleico que funcionam como interruptores compreendendo os passos de (a) preparação de uma mistura de candidatos de ácidos nucleicos, (b) partição entre os membros da referida mistura de candidatos com base na afinidade para as polimerases Taq, Tth ou TZ05 e (c) amplificação das moléculas seleccionadas utilizando a molécula alvo para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácido nucleico com uma afinidade relativamente mais elevada para ligação às polimerases Taq, Tth e TZ05 apenas a temperaturas abaixo da temperatura de amplificação, respectivamente. A presente divulgação, portanto, inclui métodos para identificação de interruptores de ácido nucleico. Os interruptores de ácido nucleico são ácidos nucleicos identificados através do processo SELEX em que a propriedade desejada do ácido nucleico pode ser "ligada" ou "desligada" dependendo da manipulação de algum parâmetro ambiental. Os interruptores de ácido nucleico podem ser identificadas através da manipulação do passo de partição de SELEX para seleccionar ácidos nucleicos que dão resultados opostos -frequentemente ligando-se ao alvo - com base numa alteração num parâmetro do meio reaccional. Os exemplos neste caso demonstram interruptores de ácido nucleico que são ligados e desligados com base na temperatura, no entanto, o método pode ser estendido à identificação e preparação de ligandos nucleicos que funcionem como interruptores com base noutras condições para além da temperatura, incluindo mas não estando limitadas a, pH, concentração de iões específicos, isto é, Mg++. 13 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura IA mostra as afinidades de ligação de bancos de ADN enriquecidos após 12 ciclos de SELEX (o) e o banco aleatório não seleccionado (·) de ADN para a polimerase Taq. A Figura 1B mostra as afinidades de ligação de bancos de ADN enriquecidos após 10 ciclos de SELEX (o) e o banco aleatório não seleccionado (·) de ADN para a polimerase Tth. A Figura 2A mostra uma análise de ligação cruzada do banco de ADN enriquecido para a polimerase Taq (o) e do banco de ADN enriquecido para a polimerase Tth (·) à polimerase Tth. A Figura 2B mostra uma análise de ligação cruzada do banco de ADN enriquecido para a polimerase Taq (o) e do banco de ADN enriquecido para a polimerase Tth (·) à polimerase Taq.

A Figura 3A representa uma curva de ligação para o ligando 30 (TQ30 SEQ ID NO:50) (·) e o ligando 21 (TQ21 (SEQ ID NO:59) (o) à polimerase Taq. A Figura 3B representa uma curva de ligação para o ligando 30 (·) e o ligando 21 (o) à polimerase Tth.

As Figuras 4A-E representam as curvas de ligação de vários ligandos inteiros à polimerase Taq medidas a 55°C. As Figuras 4A-D mostram a interacção de ligandos pertencendo à

Família I, enquanto a Figura 4E mostra a ligação de um ligando representativo da Família II.

As Figuras 5A-D representam interacções de ligação de vários ligandos inteiros à polimerase TZ05. A Figura 6 ilustra o substrato de ADN em gancho e o seu produto utilizado para ensaiar a actividade da polimerase. A Figura 7A ilustra um ensaio de actividade da polimerase para as polimerases Taq e Tth realizado a diferentes temperaturas com diferentes tempos de incubação. O substrato de ADN marcado nas extremidades mostrado na Figura 6 é separado num gel de poliacrilamida a 15% sob condições desnaturantes. Os dados no Painel I foram obtidos com a polimerase Taq e o banco enriquecido seleccionado para a polimerase Taq, enquanto os mostrados no Painel 2 foram obtidos com a polimerase Tth e o banco enriquecido 14 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ seleccionado para a polimerase Tth. O molde em gancho de ADN marcado na extremidade 5', não tratado (pista 1); e o molde marcado numa mistura reaccional sem a polimerase (pista 2); incubação da mistura reaccional completa durante 25 minutos à temperatura ambiente na ausência de (pista 3) e na presença do banco enriquecido (pista 4). As pistas 5, 6 e 7 mostram as incubações de misturas reaccionais completas na presença do banco enriquecido durante 5 minutos a 37°C, 50°C e 60°C, respectivamente. As pistas 8 e 9 mostram as incubações das misturas reaccionais completas na presença (pista 8) e ausência (pista 9) do banco enriquecido a 70°C durante 5 minutos. A pista 10 mostra a mobilidade em gel do ADN do banco marcado nas extremidades. Os esquemas à direita dos géis representam as posições do ADN marcado nas extremidades curto inicial e do produto prolongado pela polimerase.

As Figuras 7B e 7C ilustram um segundo ensaio de actividade da polimerase para as polimerases Taq e Tth, efectuado a três temperaturas diferentes. O ADN é separado num gel de poliacrilamida a 15% sob condições desnaturantes. Os dados da Figura 7B foram obtidos com a polimerase Taq e os dados da Figura 7C foram obtidos com a polimerase Tth. As pistas 1-3 mostram os produtos obtidos na ausência de qualquer inibidor após incubação à temperatura ambiente, 30°C e 37°C, respectivamente, durante 5 minutos. As pistas 4-6 mostram os dados obtidos com o banco de sequências aleatórias não seleccionadas; pistas 7-9 com o banco enriquecido para a polimerase Taq: pistas 10-12 com o banco enriquecido para a polimerase Tth·, pistas 13-15 com o anticorpo Taqstart durante incubações de 5 minutos às três temperaturas indicadas. Os esquemas à direita indicam o ADN de extremidades marcadas curto inicial e o produto prolongado pela polimerase.

As Figuras 7D e 7E ilustram uma inibição reversível das polimerases Taq e Tth através do banco enriquecido. A Figura 7D mostra a actividade da polimerase Taq na presença do banco enriquecido que não foi sujeito a ciclos térmicos, enquanto a Figura 7E exibe a actividade da polimerase Taq na presença do banco enriquecido que foi sujeito a ciclos térmicos antes de ser adicionado à reacção. As pistas 1-5 indicam a quantidade de produto formada durante incubações de 5 minutos a 20°C, 25°C, 30°C, 35°C e 40°C, respectivamente. As 15 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ pistas 6-10 exibem actividade de polimerase Taq na presença do banco enriquecido ao longo de incubações de 5 minutos a 20°C, 25°C, 30°C, 35°C e 40°C, respectivamente. Os esquemas à direita representam o adn marcado nas extremidades curto inicial e o produto prolongado pela polimerase. A Figura 8 representa o efeito da temperatura na inibição da polimerase Taq (Figura 8A) e da polimerase Tth (Figura 8B) através dos ligandos TQ30 (SEQ id NO:50) e TQ21 (SEQ ID NO:59) (pistas 1-10). O ADN é separado num gel de poliacrilamida a 10% sob condições desnaturantes. As pistas 11-15 representam a formação de produto na ausência de um inibidor. O lado direito dos autorradiogramas representa esquematicamente o molde marcado em 5' antes e após a extensão pela polimerase. As Figuras 8C e 8D mostram a percentagem do produto formado na presença do ligando TQ21 (o) e do ligando TQ30 (·) utilizando polimerase Taq (Figura 8C) e polimerase Tth (Figura 8D), respectivamente. A quantidade de produto foi quantificada através de Phosphorimager e normalizada para o produto formado na ausência de um inibidor à mesma temperatura para obter a percentagem de produto (Figuras 8C e D (abcissas)).

As Figuras 9A e B ilustram a inibição reversível da polimerase Taq através do ligando TQ30 (SEQ ID NO:50). O ADN é separado num gel de poliacrilamida a 10% sob condições desnaturantes. As pistas 1-5 mostram os produtos obtidos na ausência de qualquer inibidor após incubação entre 20°C-40°C. As pistas 6-10 mostram os produtos formados após incubação entre 20°C-40°C na presença do ligando TQ30 que não tinha sido sujeito a ciclos térmicos (Figura 9A) e do ligando TQ30 que tinha sido sujeito a 25 ciclos térmicos (Figura 9B).

As Figuras 10A e B representam o efeito da concentração de ligando na inibição da polimerase Taq (Figura 10A) e da polimerase Tth (Figura 10B) através dos ligandos TQ30 (SEQ ID NO:50) (·) e TQ21 (SEQ ID NO:59) (o). A quantidade de produto formado na presença de concentrações variáveis de inibidor nos ensaios de extensão do molde foram quantificadas através de Phosphorimager e normalizados para a quantidade de produto formada na ausência de um inibidor para obter a percentagem do produto (abcissas). 16 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ A Figura 11 representa ο efeito da temperatura na

inibição da polimerase Taq através dos ligandos 6 (SEQ ID

NO:78), 15 (SEQ ID NO:86), 10 (SEQ ID NO:85) e 18 (SEQ ID NO:83). Os produtos da extensão foram analisados em géis de poliacrilamida a 10% gel corridos sob condições desnaturantes seguido de autorradiografia.

As Figuras 12A e B mostram a percentagem de produto formado na presença do ligando 6 (·), ligando 10 (A) e ligando 15 () (Figura 12A) e do ligando 18 (·), ligando 19 (A) e ligando 20 () (Figura 12B) utilizando polimerase Taq. A quantidade de produto foi quantificada através de Phosphorimager e normalizada para o produto formado na ausência de um inibidor à mesma temperatura para obter a percentagem de produto.

As Figuras 13A-F representam o efeito da temperatura na inibição da polimerase TZ05 através dos ligandos TZl (SEQ ID

NO: 94) , TZ2 (SEQ ID ΝΟ:9β), TZ3 (SEQ ID ΝΟ:10β), TZ8 (SEQ ID NO:100), TZ9 (SEQ ID NO:101) e TZ13 (SEQ ID NO:89). Os produtos da extensão foram analisados através de electroforese em gel sob condições desnaturantes seguida de autorradiografia.

A Figura 14 representa o efeito da concentração de ligando na inibição da polimerase Taq utilizando vários ligandos obtidos após selecção de afinidade a elevada temperatura (ligando 6 (SEQ ID NO: 78) {·), ligando 22 (SEQ ID NO:81) (A) e ligando 28 (SEQ ID NO:87) (!)) . O ensaio de extensão de gancho foi realizado tal como descrito no Exemplo 2. O produto da extensão do substrato de gancho foi quantificado através de Phosphorimager e normalizado para o produto formado na ausência de um inibidor para obter a percentagem de produto.

As Figuras 15A e B representam o efeito da temperatura nos valores de CI50 dos ligandos 6 (SEQ ID NO:78) (·), 22 (SEQ ID NO: 81) (A) e 28 (SEQ ID NO:87) () no tampão Tris (Figura 15A) e no tampão Tricina (Figura 15B). A Figura 16 ilustra esquematicamente a clivagem da sequência de ADN de 97 nucleótidos (Exo-Sub) (5'- 17 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ TTCGAGCGTGAATCTGAATTCGCGGCTAGCCAGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGGTGGGAAACT GAGGTAGGTGTTTTCACCTACCTCAGTTTCCCACC-3' (SEQ ID ΝΟ:75)), C0IT1 dois ganchos previstos com uma cadeia deslocada, catalisada pela actividade exonucleásica 5'->3' da polimerase Taq e Tth. A polaridade da sequência dobrada é indicada através da seta pequena. Espera-se que a clivagem mediada pela actividade exonucleásica das ADN-polimerases ocorra próximo da junção da cadeia deslocada e da hélice, resultando em dois fragmentos de adn de 20 nucleótidos e 77 nucleótidos. Os círculos a cheio nas duas extremidades da molécula indicam radiomarcadores. A Figura 17 representa a análise do efeito dos ligandos TZ13 (SEQ ID NO:89), TZ13 truncado (51 nucleótidos) e TZ36 (SEQ ID NO:99) na actividade exonucleásica da polimerase TZ05. A pista U mostra a mobilidade do Exo-Sub não tratado marcado nos dois terminais. A pista C mostra os produtos de clivagem (78 nucleótidos e 24 nucleótidos) que resultam da clivagem exonucleásica da polimerase TZ05 na ausência de ligandos. As pistas 1-4, 5-8 e 9-12 mostram a clivagem do Exo-Sub na presença de concentrações crescentes dos ligandos TZ13, TZ13-Trnc e TZ36, respectivamente. As concentrações de aptâmero variaram de 250 nM a 2000 nM. Todas as reacções indicadas nas pistas C a 12 foram realizadas sob condições idênticas. A Figura 18 ilustra o efeito da polimerase Taq nos ligandos marcados a 5' 6 (SEQ ID NO: 78), 22 (SEQ ID NO: 81) e 28 (SEQ ID NO:87). Para cada ligando as pistas 1 e 4 são os controlos nos quais a incubação foi realizada em apenas tampão. As pistas 2 e 5 mostram os resultados após incubação com polimerase Taq e as pistas 3 e 6 mostram o resultado após incubação com polimerase Taq e todos os quatro dNTP. As setas de baixo indicam os produtos de clivagem resultantes da clivagem exonucleásica, enquanto as setas de cima indicam os produtos da extensão dos ligandos.

As Figuras 19A e B representam a inibição do fragmento de Stoffel através de ligandos inteiros (·) e truncados () de TQH6 (SEQ ID NO:78) (Figura 19A) e TQH22 (SEQ ID NO:81) (Figura 19B). O produto da extensão do substrato de gancho foi quantificado através de Phosphorimager e normalizado para o produto formado na ausência de um inibidor à mesma temperatura 18 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ para obter a percentagem de produto. A temperatura à qual era formado 50% do produto é o valor TI50 de um ligando.

As Figuras 20A e B representam a inibição da polimerase Tth através de ligandos inteiros (·) e truncados () de TQH6 (Figura 20A) e TQH22 (Figura 20B) . O produto da extensão do substrato de gancho foi quantificado através de Phosphorimager e normalizado para o produto formado na ausência de um inibidor à mesma temperatura para obter a percentagem de produto. A temperatura à qual era formado 50% do produto é o valor TI5o de um ligando.

As Figuras 21A e B representam a inibição da polimerase TZ05 através de ligandos inteiros (·) e truncados () de TQH6 (Figura 21A) e TQH22 (Figura 21B). O produto da extensão do substrato de gancho foi quantificado através de Phosphorimager e normalizado para o produto formado na ausência de um inibidor à mesma temperatura para obter a percentagem de produto. A temperatura à qual era formado 50% do produto é o valor TI50 de um ligando.

As Figuras 22A e B representam a análise de ligação de TZ13 (SEQ ID NO:89) () e TZ54 truncado (51 nucleótidos) (·) à polimerase Taq (Figura 22A) e polimerase Tth (Figura 22B).

As Figuras 23A-C representam a análise da inibição de várias ADN-polimerases termoestáveis através dos ligandos TZl (SEQ ID NO: 94) (·), TZ13 (SEQ ID NO:89) () e TZ36 (SEQ ID NO:99) (A), que foram seleccionados para se ligarem à polimerase TZ05 a elevada temperatura. A Figura 23A representa o efeito dos ligandos na actividade da polimerase Tth; a

Figura 23B representa o efeito dos ligandos na actividade da polimerase Taq e a Figura 23C representa o efeito dos ligandos na actividade do fragmento de Stoffel.

As Figuras 24A-C ilustram a detecção de um alvo de baixo número de cópias utilizando amplificação por PCR padrão, PCR de "início quente" e amplificação por PCR na presença dos inibidores oligonucleotídicos TQ30 (SEQ ID NO:50) e TQ21 (SEQ ID NO:59) ("PCR NeXstart"). A Figura 24A ilustra uma comparação da amplificação efectuada sob condições padrão (pistas 1-3) com as da PCR de "início quente" (pistas 4-6) na 19 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ detecção do alvo a *10 e 50 cópias. A Figura 24B ilustra uma comparação das amplificações por PCR conduzidas na presença de um oligonucleótido não específico (NS) (pistas 1-3) com as de TQ21 (pistas 4-6) e TQ30 (pistas 7-9) na detecção do alvo a »10 e 50 cópias. A Figura 24C ilustra a detecção de um número muito baixo de cópias alvo (tal como indicado) na presença dos inibidores oligonucleotidicos TQ21 e TQ30. Tanto em (B) como em (C) os inibidores oligonucleotidicos foram utilizados a uma concentração de 50 nM. M indica padrões de peso molecular. A setas em cada painel mostram a posição do ADN de 203 pb especifico do alvo nos géis. A Figura 25 ilustra a detecção de um alvo de baixo número de cópias utilizando amplificação por PCR na presença de inibidores oligonucleotidicos truncados dos ligandos TQH6 (SEQ ID NO: 78) , TQH22 (SEQ ID NO:81) e TQH28 (SEQ ID NO:87) ("PCR NeXstart"). Todas as amplificações por PCR foram realizadas na presença de 1 pg de ADN de placenta humana sem "início quente" manual. As pistas 1-4 mostram os resultados da amplificação por PCR realizada na ausência de um ligando. As reacções mostradas nas pistas com números ímpares não continham ADN molde de HIV-2, enquanto as indicadas com número pares continham 10 cópias de ADN genómico de HIV-2. A seta indica o amplicão específico. A Figura 26 ilustra a detecção de um alvo de baixo número de cópias utilizando um sistema de PCR que amplifica o amplicão de 104 pb do gene humano K-ras. Todas as reacções de amplificação contendo ADN-polimerase TZ05 foram realizadas sem condições de início quente manual. Na pista 1 não foi adicionado ADN molde; na pista 2 não foi adicionado aptâmero; nas pistas 3-9 foi efectuada uma PCR completa utilizando concentrações crescentes do ligando TZ1 truncado de 51 nucleótidos. A concentração do ligando foi duplicada de uma reacção para a seguinte partindo de uma concentração de 1,3 nM. A pista M representa padrões de tamanho de ADN.

As Figuras 27A e B representam a amplificação do gene humano K-ras através da polimerase TZ05 na presença dos truncados de 30 nucleótidos de TZl (Figura 27A) e TZ13 (Figura 27B). Todas as reacções de amplificação contendo ADN-polimerase TZ05 foram realizadas sem condições de início 20 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ quente manual. Na pista 1 não foi adicionado ADN molde. Na pista 2 não foi adicionado ligando. As pistas 3-9 mostram PCR completa com concentrações crescentes do respectivo ligando. A concentração de ligando foi duplicada em cada reacção sucessiva partindo de uma concentração de 1,3 nM. A Figura 28 representa a amplificação do gene humano K-ras através da ADN-polimerase Tth na presença do truncado de 51 nucleótidos de TZ36. Todas as reacções de amplificação continham ADN-polimerase Tth e foram realizadas sem condições de inicio quente manual. Na pista 1 não foi adicionado ADN molde. Na pista 2 não foi adicionado ligando. As pistas 3-9 mostram os resultados da PCR completa com concentrações crescentes de ligando. A concentração de ligando foi duplicada em cada reacção sucessiva partindo de uma concentração de 1,3 nM. A Figura 29 representa o efeito da concentração de ligandos truncados Trunc.1-30 (SEQ ID NO:75) (·), Trnc.2-30 (SEQ ID NO:76) () e Trnc.3-30 (SEQ ID NO:77) (A) na actividade da polimerase Taq. A quantidade de produto formado na presença de concentrações variáveis de inibidor foi quantificada através de Phosphorimager e normalizada para a quantidade de produto formada na ausência de um inibidor para obter a percentagem de produto (abcissas). A Figura 30 representa o efeito da concentração inibidora dos ligandos truncados Trunc.1-30 (·), Trnc.2-30 () e Trnc.3-30 (A) na actividade do fragmento de Stoffel. A quantidade de produto formada na presença de concentrações variáveis de inibidor foi quantificada através de Phosphorimager e normalizada para a quantidade de produto formada na ausência de um inibidor para obter a percentagem de produto (abcissas).

As Figuras 31A-C ilustram as caracteristicas de afinidade e inibição do ligando truncado Trnc.21 (SEQ ID NO:70). A Figura 31A representa uma curva de ligação para o ligando Trnc.21 à polimerase Taq. A Figura 31B ilustra o efeito da concentração de Trnc.21 na actividade da polimerase Taq (·) e da polimerase Tth (o) . Os valores de CI50 para a polimerase Taq e a polimerase Tth são de 21 e 36,5 nM, respectivamente. A Figura 31C representa o efeito da temperatura na inibição da 21 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ polimerase Taq (·) e da polimerase Tth (o) através de Trnc.21. A quantidade de produto formada na presença do inibidor a uma dada temperatura foi normalizada para a formada na ausência de um inibidor à mesma temperatura para obter a percentagem de produto. Os valores de TI50 calculados para a polimerase Taq e a polimerase Tth são de 34°C e 35,6°C, respectivamente. A Figura 32 ilustra o efeito da polimerase Taq em formas truncadas dos ligandos 6 (SEQ ID NO:78), 22 (SEQ ID N0:81) e 28 (SEQ ID NO:87). Foram utilizados nesta experiência ligandos marcados na extremidade 5'. Para cada ligando as pistas 1 e 4 são os controlos, em que a incubação foi realizada apenas em tampão. As pistas 2 e 5 mostram os resultados após incubação com polimerase Taq e as pistas 3 e 6 mostram o resultado após incubação com a polimerase Taq e todos os quatro dNTP. As setas indicam os produtos da extensão dos ligandos. A Figura 33 expõe as sequências de truncados de ligandos para a polimerase TZ05. As bases nucleotídicas que estão sublinhadas provêm de regiões fixas a 5' e 3'. Os asteriscos indicam ligações fosfotioato.

As Figuras 34A e B ilustram o efeito da temperatura na inibição da polimerase TZ05 através de diferentes truncados do ligando TZ13 (SEQ ID NO:89). 0 produto da extensão do substrato de gancho foi quantificado através de Phosphorimager e normalizado para o produto formado na ausência de um inibidor à mesma temperatura para obter a percentagem de produto. A temperatura à qual era formado 50% do produto é o valor de TI50 de um aptâmero. A Figura 35 ilustra o efeito da polimerase TZ05 em ligandos truncados marcados na extremidade 5' de TZl e TZ13. As pistas 1-3 e as pistas 4-6 mostram os resultados obtidos com o truncado de 51 nucleótidos e 30 nucleótidos de cada um respectivo ligando. As reacções nas pistas 1 e 4 não tinham dNTP, enquanto as das pistas 2, 3, 5 e 6 continham dNTP. As setas indicam os produtos de clivagem resultantes da clivagem exonucleásica.

A Figura 36 representa as caracteristicas de afinidade e inibição do homodimero (D.30-D.30) (SEQ ID NO:71). A 22 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Figura 36Α representa uma curva de ligação para o homodimero (D.30-D.30) à polimerase Taq (Kd = 47,5±5 pM) . A Figura 36B ilustra o efeito de concentrações do ligando dimérico (·) e monomérico (o) na actividade da polimerase Taq. 0 valor de CI5o de Trnc.2-30 (monómero) é de 48 nM, enquanto o de D. 30-D.30 (dimero) é de 14 nM.

As Figuras 37A e B representam as caracteristicas de inibição do heterodímero D.21-D.30 (SEQ ID NO:72). A Figura 37A ilustra o efeito da concentração de D.21-D.30 na actividade da polimerase Taq (·) e da polimerase Tth (0). Os valores de CI50 para a inibição destas duas polimerases são de aproximadamente 30 nM. A Figura 37B ilustra o efeito da temperatura na inibição da polimerase Taq (·) e da polimerase Tth (0) através do heterodímero D.21-D.30. O valor de TI50 para a polimerase Taq é de 41°C, enquanto que para a polimerase Tth é de 34,5°C. A Figura 38 representa as sequências e estruturas liganteas de três dimeros do ligando de ácido nucleico TZ13 (SEQ ID NO:89).

As Figuras 39A e B representam a análise da ligação e da inibição do monómero TZ13 (SEQ ID NO:89) e dos três dimeros expostos na Figura 38. A Figura 39A representa a análise de ligação do filtro de nitrocelulose dos três dimeros e do monómero à polimerase TZ05 e a Figura 39b representa a análise da inibição da actividade de polimerase de TZ05 através dos três dimeros e do monómero em função da temperatura da reacção.

As Figuras 40A e B ilustram o efeito de dNTPs e do ADN molde em gancho na afinidade de ligação de Trnc.21 à polimerase Taq. A Figura 40A representa a análise da ligação por filtro de nitrocelulose de Trnc.21 na presença de dNTPs 1 mM. Os círculos a cheio (·) indicam a ligação na ausência de molde de adn em gancho, enquanto os círculos vazios (o) indicam a ligação na presença de molde de ADN em gancho a 250 nM. Os valores de Kd calculados sob estas condições são de aproximadamente 2,5 nM. A Figura 40B ilustra o efeito da concentração de dNTP na ligação de Trnc.21 à polimerase Taq. Nesta experiência a ligação do Trnc.21 radiomarcado à 23 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ polimerase Taq a 1 ηΜ foi monitorizada na presença de concentrações variáveis dos dNTP.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente pedido descreve o isolamento de ligandos de ácido nucleico para ADN-polimerases. Especificamente, este pedido descreve o isolamento de ligandos de ácido nucleico para polimerases termoestáveis úteis na Reacção em Cadeia pela Polimerase. Numa concretização preferida a ADN-polimerase é a polimerase TZ05, no entanto o método desta divulgação pode ser estendido à identificação e purificação de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidade para qualquer ADN-polimerase termoestável. Os ligandos de ácido nucleico são identificados através do método conhecido como SELEX. SELEX é descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/536428, intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", agora abandonado, Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/714131, apresentado a 10 de Junho de 1991, intitulado "Acid Nucleic Ligands", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5475096 e Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/931473, apresentado a 17 de Agosto de 1992, intitulado "Methods for Identifying Acid Nucleic Ligands", agora Patente dos Estados Unidos N.° 5270163 (ver também WO 91/19813, publicado a 26 de Dezembro de 1991). Estes pedidos de patente são colectivamente designados de Pedidos de Patente de SELEX.

Na sua forma mais básica, o processo SELEX pode ser definido através da seguinte série de passos: 1) É preparada uma mistura de candidatos de ácidos nucleicos de diferentes sequências. A mistura de candidatos inclui geralmente regiões de sequências fixas (i.e., cada um dos membros da mistura de candidatos contém as mesmas sequências na mesma localização) e regiões de sequências aleatórias. As regiões de sequências fixas são seleccionadas para: (a) ajudar nos passos de amplificação descritos abaixo, (b) imitar uma sequência que se sabe ligar-se ao alvo, ou (c) aumentar a concentração de um dado arranjo estrutural dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos. As sequências aleatórias podem ser totalmente aleatórias (i.e., sendo a 24 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ probabilidade de encontrar uma base em qualquer posição de um em quatro) ou apenas parcialmente aleatórias (p.ex., a probabilidade de encontrar uma base em qualquer posição pode ser seleccionada a qualquer nível entre 0 e 100 por cento). 2) A mistura de candidatos é colocada em contacto com o alvo seleccionado sob condições favoráveis para a ligação entre o alvo e os membros da mistura de candidatos. Nestas circunstâncias, a interacção entre o alvo e os ácidos nucleicos da mistura de candidatos pode ser considerada como formando pares de ácido nucleico-alvo entre o alvo e os ácidos nucleicos com a afinidade mais elevada para o alvo. 3) Os ácidos nucleicos com a afinidade mais elevada para o alvo são separados dos ácidos nucleicos com menor afinidade para o alvo. Como existe apenas um número extremamente pequeno de sequências (e possivelmente apenas uma molécula de ácido nucleico) correspondendo aos ácidos nucleicos de afinidade mais elevada na mistura de candidatos, é geralmente desejável estabelecer os critérios de partição, para que seja mantida uma quantidade significativa dos ácidos nucleicos na mistura de candidatos (aproximadamente 5-50%) durante a partição. 4) Os ácidos nucleicos seleccionados durante a partição como possuindo a afinidade relativamente mais elevada para o alvo são então amplificados para criar uma nova mistura de candidatos que seja enriquecida em ácidos nucleicos possuindo uma afinidade relativamente mais elevada para o alvo. 5) Repetindo os passos de partição e amplificação de cima, a mistura de candidatos formada de novo contém cada vez menos sequências únicas e o grau médio de afinidade dos ácidos nucleicos para o alvo aumentará geralmente. Levado ao seu extremo, o processo SELEX produzirá uma mistura de candidatos contendo um ou um pequeno número de ácidos nucleicos únicos representando os ácidos nucleicos da mistura de candidatos original possuindo a afinidade mais elevada para a molécula alvo.

Os Pedidos de Patente de SELEX descrevem e pormenorizam este processo em grande detalhe. Estão incluídos alvos que podem ser utilizados no processo; métodos para partição de 25 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ ácidos nucleicos dentro de uma mistura de candidatos; e métodos para amplificação de ácidos nucleicos separados para gerar a mistura de candidatos enriquecida. Os Pedidos de Patente de SELEX também descrevem ligandos obtidos para várias espécies alvo, incluindo alvos proteicos onde a proteína tanto é como não uma proteína de ligação a um ácido nucleico. 0 processo SELEX proporciona ligandos de elevada afinidade de uma molécula alvo. isto representa um feito sem precedentes no campo da investigação de ácidos nucleicos. 0 presente invento aplica o processo SELEX aos alvos específicos de inibidores de ácido nucleico de ADN-polimerases, particularmente da polimerase Taq, polimerase Tth e polimerase TZ05. Na secção de exemplos abaixo, são descritos os parâmetros experimentais utilizados para isolar e identificar os inibidores de ácido nucleico para as polimerases Taq, Tth e TZ05.

No Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 07/964624, apresentado a 21 de Outubro de 1992, co-pendente e cedido conjuntamente, agora Patente dos Estados Unidos N.° 5496938 (Patente '938), são descritos métodos para obtenção de ligandos de ácido nucleico melhorados após realização de SELEX.

Certos termos utilizados para descrever aqui o presente invento são definidos como se segue: "Ligando de Ácido Nucleico", tal como aqui se utiliza, é um ácido nucleico de ocorrência não natural possuindo uma acção desejável num alvo. Uma acção desejável inclui, mas não se limita a, ligação ao alvo, alterando cataliticamente o alvo, reagindo com o alvo de um modo que modifica/altera o alvo ou a actividade funcional do alvo, unindo-se covalentemente ao alvo tal como num inibidor suicida, facilitando a reacção entre o alvo e outra molécula. Na concretização preferida, a acção tem afinidade de ligação específica a uma molécula alvo, sendo tal molécula alvo uma estrutura química tridimensional diferente de um polinucleótido que se liga ao ligando de ácido nucleico através de um mecanismo que depende predominantemente de emparelhamento de bases de Watson/Crick ou de ligação de 26 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ tripla hélice, em que o ligando de ácido nucleico não é um ácido nucleico possuindo a função fisiológica conhecida de se ligar à molécula alvo. Os ligandos de ácido nucleico incluem ácidos nucleicos que são identificados a partir de uma mistura de ácidos nucleicos candidatos, sendo o referido ligando de ácido nucleico um ligando de um dado alvo através do método compreendendo: a) colocação da mistura de candidatos em contacto com o alvo, em que os ácidos nucleicos possuindo uma maior afinidade para o alvo relativamente à mistura de candidatos podem ser separados do restante da mistura de candidatos; b) partição dos ácidos nucleicos de maior afinidade do restante da mistura de candidatos; e c) amplificação dos ácidos nucleicos de maior afinidade para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligando. "Mistura de Candidatos" é uma mistura de ácidos nucleicos de diferentes sequências dos quais se selecciona um ligando desejado. A fonte de uma mistura de candidatos pode ser de ácidos nucleicos de ocorrência natural ou fragmentos destes, ácidos nucleicos sintetizados quimicamente, ácidos nucleicos sintetizados enzimaticamente ou ácidos nucleicos produzidos através de uma combinação das técnicas anteriores. Numa concretização preferida, cada ácido nucleico tem sequências fixas em torno de uma região aleatória para facilitar o processo de amplificação. "Ácido Nucleico" significa ADN, ARN, cadeia simples ou cadeia dupla e quaisquer modificações destes. As modificações incluem, mas não se limitam às que proporcionam outros grupos quimicos que incorporam carga, polarizabilidade, pontes de hidrogénio, interacção electrostática e fluxionalidade adicionais às bases do ligando de ácido nucleico ou ao ligando de ácido nucleico como um todo. Tais modificações incluem, mas não se limitam a modificações na posição 2' do açúcar, modificações na posição 5 da pirimidina, modificações na posição 8 da purina, modificações em aminas exociclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo-uracilo, modificações da estrutura, metilações, combinações de pares de bases invulgares tais como as isobases isocitidina e isoguanidina e semelhantes. As modificações podem também incluir modificações 3' e 5' tais como cobertura. 27 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ A metodologia "SELEX" envolve a combinação de selecção de ligandos de ácido nucleico que interagem com um alvo de um modo desejável, for exemplo ligação a uma proteína, com amplificação dos ácidos nucleicos seleccionados. Ciclos iterativos dos passos de selecção/amplificação permitem a selecção de um ou de um pequeno número de ácidos nucleicos que interagem mais fortemente com o alvo de um banco que contém um número muito grande de ácidos nucleicos. Os ciclos do procedimento de selecção/amplificação são continuados até ser alcançado um objectivo seleccionado. No presente invento, a metodologia SELEX é empregue para obter ligandos de ácido nucleico para as polimerases Taq, Tth e TZ05. A metodologia SELEX é descrita nos Pedidos de Patente de SELEX. "Alvo" significa qualquer composto ou molécula de interesse para a qual é desejado um ligando. Um alvo pode ser uma proteína, péptido, hidrato de carbono, polissacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antigénio, anticorpo, vírus, substrato, metabolito, análogo de estado de transição, cofactor, inibidor, fármaco, corante, nutriente, factor de crescimento, etc. sem limitação. Neste pedido, o alvo é uma ADN-polimerase. Numa concretização preferida a ADN-polimerase é a polimerase TZ05.

Um "Ligando lábil" tal como aqui se utiliza é um ligando de ácido nucleico identificado através do processo SELEX que tem uma afinidade muito menor para o seu alvo com base no ajuste de um parâmetro ambiental. Na concretização preferida, o parâmetro ambiental é temperatura, e a afinidade de um ligando para o seu alvo é menor a temperaturas elevadas. "ADN-polimerase", tal como aqui se utiliza, refere-se a qualquer enzima que catalise a síntese de ADN através da adição de unidades de desoxirribonucleótidos a uma cadeia de ADN utilizando ADN ou ARN (transcriptase inversa) como molde. As ADN-polimerases termoestáveis são isoladas de organismos que se desenvolvem em temperaturas superiores a 40°C. 28 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Um "Interruptor" refere-se a qualquer composto que funcione para "ligar" ou "desligar" uma reacção dependendo de alguma ou algumas condições reaccionais especificas. No presente invento os ligandos de ácido nucleico funcionam para "ligar" ou "desligar" a PCR dependendo da temperatura da reacção. Um interruptor pode operar com base noutras condições reaccionais incluindo pH, força iónica ou a presença ou ausência de iões específicos. Os interruptores de ácido nucleico são identificados através do método SELEX através da selecção apropriada de técnicas de partição. São determinados os parâmetros de partição para que sejam seleccionados ácidos nucleicos que tenham as características de interruptor desejadas.

Na presente divulgação, foi efectuada uma experiência SELEX para identificar ligandos de ácido nucleico com afinidade específica e elevada para as polimerases Taq e Tth a partir de uma biblioteca degenerada contendo 30 posições aleatórias (30N) (Exemplo 1). Embora possam ser identificados para este fim ligandos de ARN ou ADN, os exemplos abaixo descrevem a identificação de ligandos de ADN. Esta experiência SELEX foi desenhada para identificar oligonucleótidos que se ligam e inibem as polimerases a baixa temperatura (temperatura ambiente), mas não a temperaturas mais elevadas (>40°C) . Isto foi alcançado utilizando a polimerase alvo para amplificar moléculas seleccionadas por afinidade em PCR a uma temperatura elevada. Sob estas condições, não se esperava que as sequências de ADN que inibem as polimerases Taq e Tth a elevada temperatura se amplificassem e propagassem durante a selecção. Este invento inclui os ligandos de ADNcs específicos para a polimerase Tth mostrados na Tabela 2 (SEQ ID NOS :7-35) e para a polimerase Taq mostrados na Tabela 3 (SEQ ID NOS:36-66, 76, 77) e os ligandos de ácido nucleico mostrados nas

Tabelas 10 e 11 (SEQ ID NOS:67-74), identificados através dos métodos descritos no Exemplo 1. Este invento inclui ainda ligandos de ADN para a polimerase Taq e Tth que inibem a função da polimerase Taq e Tth.

No presente invento, foi também efectuada uma experiência SELEX de temperatura elevada para identificar ligandos de ácido nucleico com elevada afinidade específica para as polimerases Taq e TZ05 a partir de uma biblioteca degenerada 29 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ contendo 30 posições aleatórias (3 0N) (Exemplo 1). Esta experiência SELEX foi desenhada para identificar oligonucleótidos que se liguem e inibam as polimerases a aproximadamente 55°C. Este invento inclui ligandos de ADNcs específicos para a polimerase Taq mostrados nas Tabelas 4 e 5 (SEQ ID NOS :78-88) e para a polimerase TZ05 mostrados na Tabela 6 (SEQ ID NOS:89-106) e Figura 33 (SEQ ID NOS:107-115), identificados através dos métodos descritos no Exemplo 1. Este invento inclui ainda ligandos de ADN para a polimerase Taq e TZ05 que inibem a função da polimerase Taq e TZ05. O âmbito dos ligandos rematados por esta divulgação estende-se a todos os ligandos de ácido nucleico das polimerase Taq, Tth e TZ05, modificados e não modificados, identificados de acordo com o procedimento SELEX utilizando uma selecção de afinidade de baixa temperatura e elevada temperatura. Mais especificamente, esta divulgação inclui sequências de ácido nucleico que são substancialmente homólogas aos ligandos mostrados nas Tabelas 2-6, 10 e 11 e Figura 33. Por substancialmente homólogo entenda-se um grau de homologia da sequência primária de mais de 70%, de preferência de mais de 80%. Uma revisão das homologias de sequência dos ligandos de Taq, Tth e TZ05 mostrados nas Tabelas 2-6, 10 e 11 e Figura 33 mostra que as sequências com pouca ou nenhuma homologia primária podem ter substancialmente a mesma capacidade para se ligarem à polimerase Taq, Tth e TZ05, respectivamente. Por esta razão, esta divulgação inclui também ligandos de ácido nucleico que têm substancialmente a mesma capacidade para se ligarem à polimerase Taq, Tth e TZ05 que os ligandos de ácido nucleico mostrados nas Tabelas 2-6, 10 e 11 e Figura 33. Substancialmente a mesma capacidade para se ligarem à polimerase Taq, Tth e TZ05 significa que a afinidade está dentro de poucas ordens de grandeza da afinidade dos ligandos aqui descritos. Está bem dentro da perícia na arte determinar se uma dada sequência - substancialmente homóloga à especificamente aqui descrita - tem substancialmente a mesma capacidade para se ligar à polimerase Taq, Tth e TZ05, respectivamente.

Esta divulgação inclui também os ligandos tal como descritos acima, em que os referidos ligandos inibem a função de outras ADN-polimerases termoestáveis, incluindo, mas não se 30 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ limitando ao fragmento de Stoffel, polimerase Tbr (isolada a partir de Thermus brockianus), polimerase Tfl (isolada a partir de Thermus flavus) e transcriptase inversa M-MLV (isolada a partir de virus da leucemia de moloney de murídeo).

Esta divulgação inclui também os ligandos tal como descritos acima, em que são feitas certas modificações quimicas para aumentar a estabilidade in vivo ou in vitro do ligando ou para aumentar ou mediar a ligação ou outras caracteristicas desejáveis do ligando ou a distribuição do ligando. Exemplos de tais modificações incluem substituições quimicas nas posições de açúcar e/ou fosfato e/ou base de uma dada sequência de ácido nucleico. Ver, p.ex., Pedido de

Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/117991, apresentado a 8 de Setembro de 1993, intitulado "Nucleic Acid Ligands of High affinity Containing Modified Nucleotides", abandonado a favor do Pedido de Patente dos Estados Unidos com o N.° de Série 08/430709, agora Patente dos Estados Unidos N.° 5660985. Um perito na arte conhece outras modificações. Tais modificações podem ser feitas após SELEX (modificação de ligandos não modificados identificados anteriormente) ou através de incorporação no processo SELEX.

Os ligandos de ácido nucleico para as polimerases Taq, Tth e TZ05 aqui descritos são úteis como reagentes na Reacção em Cadeia pela Polimerase. O presente invento inclui um método melhorado para realização da Reacção em Cadeia de Polimerase, em que a amostra contendo uma sequência de ácido nucleico a amplificar é misturada com 1) iniciadores que são complementares a sequências que flanqueiam a sequência a amplificar, 2) uma polimerase termoestável, e 3) um ligando de ácido nucleico que é capaz de inibir a polimerase a temperaturas ambiente. O inibidor ligando de ácido nucleico pode ser imobilizado num suporte sólido. Os passos normais de PCR são então seguidos -desnaturação, ligação e síntese - através de sujeição da mistura a ciclos térmicos. A presença do ligando de ácido nucleico impede a mistura de amplificar ADN de fundo através da prevenção de qualquer síntese a temperaturas reduzidas antes ou durante os ciclos. O presente invento inclui também um estojo de PCR compreendendo uma ADN-polimerase termoestável 31 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ e um ligando de ácido nucleico que inibe a referida polimerase a temperaturas ambiente, permitindo contudo que a sintese ocorra durante os ciclos de temperatura elevada do processo de PCR. 0 presente invento inclui também um método para melhoria da PCR, conforme entendido pelos peritos na arte, incluindo o passo de adição à polimerase termoestável de um ligando de ácido nucleico que inibe a referida polimerase a temperaturas ambiente, permitindo contudo que a sintese ocorra durante os ciclos de temperatura elevada do processo de PCR.

Ligandos de Ácido Nucleico para a Polimerase Taq, Tth e TZ05 0 Exemplo 1 descreve os procedimentos experimentais utilizados na selecção de ligandos de ácido nucleico a ambas as polimerases Taq e Tth à temperatura ambiente e às polimerases Taq e TZ05 a temperaturas elevadas. As sequências de ADNcs obtidas a partir de 10 ciclos de selecção efectuados com polimerase Tth à temperatura ambiente são expostas na Tabela 2. Foram sequenciados vinte e nove clones individuais a partir da selecção da polimerase Tth (apenas a região variável de 30 nucleótidos é mostrada na Tabela 2) . Os ligandos foram agrupados em famílias com base na homologia da sequência primária.

As sequências de ADNcs obtidas a partir de 12 ciclos de selecção efectuados com polimerase Taq à temperatura ambiente são expostas na Tabela 3. Das quarenta e duas sequências analisadas da selecção de polimerase Taq, trinta e três eram únicas. As letras maiúsculas representam a região aleatória de 30 nucleótidos que é flanqueada pelas regiões de sequências fixas 5'-ttctcggttggtctctggcggagc- e -tcttgtgtatgattcgcttttccc-3' para formar sequências inteiras. As letras minúsculas nalgumas das sequências representam a sequência fixa a 5'. O número de clones possuindo a mesma sequência está indicado dentro de parênteses. As sequências foram agrupadas em três famílias com base na semelhança das sequências. Os motivos da sequência conservados nas Famílias I e li estão em caixas. Ambas as famílias continham uma sequência de consenso diferente: 5 ' -A/gA/gTGT G/aCAGTAT/gC-3 ' para a Família I e 5 '-A/GCGTTTTG-3 ' para a Família II. Na Família I, as regiões 5' e 3' da sequência de consenso mostraram potencial para emparelhamento de bases uma com a outra (sublinhado na Tabela 3) . 32 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Adicionalmente, a covariação observada nestas regiões sugere a existência de uma possível estrutura de haste-volta. Na maioria dos ligandos as potenciais regiões de emparelhamento de bases estendem-se para além da região de consenso. Em contraste, os ligandos da Família II não possuem um motivo estrutural secundário óbvio.

As curvas de ligação representativas obtidas através de ligação a um filtro de nitrocelulose à temperatura ambiente para o clone 30 (TQ30 (SEQ ID NO:50)) da Família I e o clone 21 (TQ21 (SEQ ID NO:59)) da Família II, são mostrados na Figura 3. Em ambos os casos, os ligandos mostram uma ligação íntima às duas polimerases, com valores de Kd no intervalo picomolar inferior; os valores de Kd de TQ30 são 40±1 pM para a polimerase Taq e de 28±4 pM para a polimerase Tth, enquanto os de TQ21 são 36±4 pM e 10±2 pM para a polimerase Taq e a polimerase Tth, respectivamente. Foram pesquisados vários outros ligandos das duas famílias. Os valores de Kd variaram de 0,04 a 9 nM para a polimerase Taq e de 0,01 a 0,3 nM para a polimerase Tth.

As interacções de ligação das sequências individuais com a polimerase Taq foram medidas através de ligação a um filtro de nitrocelulose a 55°C. Várias curvas de ligação representativas são mostradas na Figura 4A-E. As Figuras 4A-D mostram curvas de ligação de quatro sequências pertencentes à Família I (ver Tabelas 4 e 5). Os clones 6 (SEQ ID NO:78), 22 (SEQ ID NO:81) e 28 (SEQ ID NO:87) mostram todos ligação de elevada afinidade à polimerase Taq a 55°C tal como caracterizado através dos seus valores de Kd no intervalo picomolar inferior. O clone 18 (SEQ ID NO:83), no entanto, contendo a sequência de consenso identificada entre outras na família não mostra elevada afinidade. O clone 18 é quatro nucleótidos mais curto na região aleatória, sugerindo que os nucleótidos suprimidos têm aparentemente um papel significativo na interacção com a polimerase. O clone 19 (SEQ ID NO:84) caiu na Família II e não tem a sequência de consenso identificada nas sequências da Família I. Ainda, mostra ligação de elevada afinidade (Figura 4E) de forma semelhante à maioria das sequências da Família I, indicando que existe outra solução de sequências para ligação de elevada afinidade, diferente da verificada nas sequências da Família I. 33 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ A análise de ligação mostrada nas Figuras 4A-E foi efectuada no tampão Tris a 55°C. As afinidades dos clones 6, 22 e 28 foram comparadas nos tampões Tris e Tricina a 40°C e 55°C (Tabela 7) . Em ambos os tampões, a afinidade de ligação de todos os três clones foi superior a 40°C que a 55°C. Valores de Kd muito semelhantes foram observados em ambos os tampões a 40°C, embora de algum modo tenha sido observada uma afinidade reduzida no tampão de Tricina a 55°C.

As interacções de ligação de sequências individuais com a polimerase TZ05 foram medidas através de ligação a um filtro de nitrocelulose a 55°C tal como descrito no Exemplo 2. As Figuras 5A-D mostram curvas de ligação representativas de quatro sequências diferentes clones 1 (TZ1 (SEQ ID NO:94), 13 (TZ13 (SEQ ID NO:89), 36 (TZ36 (SEQ ID NO:99) e 2 (TZ2 (SEQ ID NO:96) (Tabela 6). Os valores de Kd e TI50 dos clones individuais estão resumidos na Tabela 8. Os valores de TI50 foram obtidos utilizando ensaios de extensão de ganchos tal como descrito no Exemplo 2. A maioria dos ligandos mostra ligação de elevada afinidade à polimerase TZ05 a 55°C, conforme caracterizado pelos seus valores de Kd no intervalo picomolar inferior. A sequência de TZ2 possuindo 26 nucleótidos na sua região aleatória (quatro nucleótidos mais curta que o esperado) não interage eficazmente com a polimerase a 55°C (Figura 5D e Tabela 8), sugerindo que os nucleótidos suprimidos são necessários para a ligação de elevada afinidade.

Ensaios de Inibição da Polimerase

0 Exemplo 2 (Figuras 7-10) descreve vários ensaios de inibição da polimerase, que demonstram que os ligandos do presente invento identificados utilizando selecção de afinidade de baixa temperatura são capazes de inibir a interacção tanto da polimerase Taq como da Tth, a temperaturas inferiores a 40°C. O Exemplo 2 (Figuras 11-15) descrevem também vários ensaios de inibição da polimerase, que demonstram que os ligandos do presente invento identificados utilizando selecção de afinidade de elevada temperatura são capazes de inibir a interacção de ambas as polimerases Taq e TZ05 a temperaturas de aproximadamente 55°C. No Exemplo 2, o ADN em gancho desenhado (DNA-HP; 5'-ATGCCTAAGTTTCGAACGCGGCTAGC 34 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ CAGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGT-3' (SEQ ID ΝΟ:6; Figura 6) foi utilizado como molde para medição da capacidade dos bancos de ADN enriquecidos, bem como, dos ligandos específicos identificados de acordo com o método deste invento para inibir a actividade da polimerase, sob uma variedade de condições. Este ensaio detecta a síntese de preenchimento dirigida pelo molde de 15 nucleótidos num gancho de ADN rebatido.

Ligandos Seleccionados para Reconhecer a Polimerase Taq e Tth a Baixas Temperaturas A Figura 7A mostra os resultados de ensaios de inibição realizados a diferentes temperaturas com diferentes tempos de incubação utilizando os bancos enriquecidos de ligandos de ADN. A actividade de ambas as polimerases Taq e Tth é geralmente baixa a baixas temperaturas e aumenta à medida que a temperatura é aumentada, tal como pode ser observado através da comparação da pista 3 (reacção à temperatura ambiente) com as pistas 6-9 (reacção a 50, 60 e 70°C, respectivamente) . Os bancos enriquecidos inibem a actividade das suas respectivas polimerases à temperatura ambiente (pista 4), mas não a 50°C-70°C. A pista 10 mostra a mobilidade do banco radiomarcado como referência para detectar a possível extensão de moléculas de ADN no banco que serve de molde às polimerases. A ausência de bandas radiomarcadas migrando próximas ou acima do banco marcado nas pistas 6-9 indica a ausência de polimerização do banco de ADNcs.

Uma vez que a actividade de polimerases termoestáveis é baixa à temperatura ambiente, o período de incubação no ensaio foi aumentado para 16 horas. As Figuras 7B e 7C mostram os resultados da incubação de 16 horas do molde com duas polimerases na presença de bancos seleccionados e do banco aleatório. Adicionalmente, a inibição mediada por bancos seleccionados foi comparada com a do anticorpo anti-Tag (Tagstart). Os dados da Figura 7B foram obtidos com a polimerase Taq e os dados na Figura 7C foram obtidos com a polimerase Tth. Ao longo das três temperaturas estudadas, temperatura ambiente, 30°C e 37°C, o banco aleatório não mostrou inibição das duas polimerases (compare-se as pistas 1-3 com 4-6), sugerindo que a inibição causada pelo banco enriquecido é específica da sequência. O banco seleccionado 35 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ para a polimerase Taq inibiu completamente a actividade da polimerase ao longo de uma incubação de 16 horas apenas à temperatura ambiente (pista 7), mas não a 30°C e acima (pistas 8 e 9). Embora o banco seleccionado para a polimerase Tth tenha mostrado ligação à polimerase Taq, foi incapaz de inibir a polimerase Taq (pistas 10-12). Tal como esperado, o anticorpo Tagstart inibiu a actividade da polimerase a todas as três temperaturas investigadas (pistas 12-15). O banco de ADNcs seleccionado para a polimerase Tth, no entanto, não inibiu a actividade enzimática ao longo de uma incubação de 16 horas (compare-se as pistas 1-3 com 4-6). Em contraste, o mesmo banco foi capaz de inibir a actividade enzimática ao longo de curtos períodos de incubação. O banco seleccionado para a polimerase Taq foi capaz de inibir parcialmente (>50%) a actividade de Tth ao longo de uma incubação de 16 horas à temperatura ambiente (pista 10). O anticorpo Tagstart não teve qualquer efeito na actividade de Tth (pistas 13-15). A utilização de anticorpo Tagstart é limitada a um momento numa reacção de PCR. Uma vez desnaturado a elevada temperatura não se consegue renaturar na sua forma nativa. Os ligandos de ácido nucleico com estruturas secundárias simples, no entanto, têm o potencial de renaturar para a sua forma nativa após passarem por um ciclo térmico. Foi realizada uma experiência para investigar se a capacidade inibidora do banco de ADN seleccionado para a polimerase Taq pode ser restaurada após aquecimento (Figuras 7D e 7E). A Figura 7D mostra a inibição da actividade de Taq entre 20°C-40°C através de um banco de ADN seleccionado que não tenha sido sujeito a ciclos térmicos. Ao longo de 45 minutos de incubação, o banco inibe completamente a actividade de Taq a 20°C e 25°C. Dentro deste período de tempo de incubação relativamente curto, o banco exibiu >70% de inibição a 30°C. Um perfil de inibição muito semelhante pode ser observado com o banco de ADN que foi sujeito a dois ciclos de PCR com a polimerase Taq na ausência do ADN molde. Este resultado demonstra que a inibição mediada por ADNcs é reversivelmente sensível à temperatura e pode ser restaurada mesmo após a PCR. A Figura 8 mostra o intervalo de temperaturas em que as sequências, TQ30 (SEQ ID NO:50) e TQ21 (SEQ ID NO:59) (Tabela 3), são inibidoras para as ADN-polimerases Taq e Tth. 36 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Os ensaios de extensão de ganchos representados nesta figura foram efectuados às temperaturas indicadas durante 1 hora utilizando 250 nM do respectivo ligando (pistas 1-10) . Conforme antecipado, os ligandos de adncs não inibiram nenhuma das ADN-polimerases a temperaturas >40°C (Figuras 8A e 8B). As temperaturas a que são gerados 50% do produto durante o ensaio de uma hora (valores de TI50) para o ligando TQ30 são 41 °C e 29°C para a polimerase Taq e a polimerase Tth, respectivamente. Os respectivos valores para o ligando TQ21 são 37°C e 29°C (Figuras 8C e 8D) . As afinidades de ligação dos dois ligandos para estas polimerases diminuem a temperaturas mais elevadas (dados não mostrados), de acordo com a sua reduzida actividade inibidora a elevada temperatura. Nos ensaios de extensão do gancho, aproximadamente 2% do molde de ganchos introduzido não foram prolongados pela ADN-polimerase, presumivelmente devido a dobragem incorrecta. A Figura 9 ilustra que a inibição da polimerase Taq através de ligando TQ30 (SEQ id NO:50) é termicamente reversível e pode ser restaurada mesmo após a PCR. Os ensaios de extensão de moldes em gancho representados nesta figura foram efectuados às temperaturas indicadas durante 10 minutos num volume reaccional de 100 pL com 5 U de polimerase Taq, na ausência de (pistas 1-5) e na presença de ligando TQ30 (50 nM) (pistas 6-10). Na Figura 9A, o ligando TQ30 não foi sujeito a ciclos térmicos. Na Figura 9B, o ligando TQ30 foi sujeito a 25 voltas de ciclos térmicos com polimerase Taq (30 segundos a 90°C; 1 minuto a 50°C, 30 segundos a 72°C) e arrefecido até à temperatura ambiente antes da adição do molde em gancho radiomarcado (250 nM). Tal como se pode observar na Figura 9, em ambos os casos o ligando TQ30 inibiu a polimerase a temperaturas abaixo de 40°C. Adicionalmente, a amostra que sofreu ciclos térmicos mostrou uma inibição idêntica ou mais eficaz que a amostra não sujeita a ciclos térmicos.

A Figura 10 demonstra o efeito da concentração de ligando na inibição das polimerases Taq e Tth. A concentração de inibidor necessária para produzir 50% do produto no ensaio de gancho (valores de CI5o) para TQ30 (SEQ ID NO:50) e TQ21 (SEQ ID NO: 59) foi de 6,5 nM e 10 nM, respectivamente, para inibição da polimerase Taq à temperatura ambiente (aproximadamente 22°C) ao longo de um período de incubação de 16 horas (Figura 10A) . Uma vez que a concentração de 37 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ polimerase Taq utilizada no ensaio é de 12,5 nM, a inibição da enzima por TQ30 (SEQ ID NO:50) é provavelmente um resultado de ligação estequiométrica. Quando ensaiado a 30 °C durante 1 hora, os valores de CI50 aumentaram aproximadamente três vezes (22 nM para TQ30 e 67 nM para TQ21; dados não mostrados) . Os valores de CI50 de TQ30 e TQ21 para a inibição da polimerase Tth foram de 60 e 36 nM, respectivamente, à temperatura ambiente (Figura 10B). Globalmente, estes oligonucleótidos são inibidores mais eficazes para a polimerase Taq, a enzima utilizada na selecção, que para a polimerase Tth.

Para excluir a possibilidade da inibição observada da extensão do molde ser devida a ligação preferencial dos ligandos seleccionados à polimerase e subsequente utilização como substratos, foram incubados os ligandos TQ21 e TQ30 radiomarcados na extremidade 5' com as duas ADN-polimerases durante 16 horas (Exemplo 2, dados não mostrados). O ligando TQ30 não mostrou extensão dos produtos após incubação com qualquer uma das enzimas, indicando que não é um substrato para a actividade da polimerase. TQ21, no entanto, deu uma banda de peso molecular mais elevado indicando extensão da sequência após incubação com ambas as polimerases. A extensão parcial observada do ligando TQ21 foi eficazmente eliminada através do bloqueio da disponibilidade do grupo OH a 3' através de cobertura da extremidade 3' com um ligante de etilenoglicol utilizando condições padrão. As construções oligonucleotidicas com remate a 3' são igualmente inibidores eficazes tal como as moléculas não rematadas (dados não mostrados). Estes resultados indicam que os ligandos de ADNcs são substratos fracos para a actividade da polimerase e que os dois tipos de ligandos estão provavelmente posicionados de forma diferente nas ADN-polimerases; TQ21 liga-se às polimerases de modo a que a sua extremidade 3' possa ser prolongada (embora fracamente), enquanto TQ30 não se pode prolongar após ligação.

Ligandos Seleccionados para Reconhecerem as Polimerases Taq e TZ05 a Elevadas Temperaturas A Figura 11 mostra a extensão do substrato em gancho marcado na extremidade catalisado pela polimerase Taq ao longo de um intervalo de temperaturas na presença de quatro ligandos 38 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ obtidos após selecção de afinidade a elevada temperatura: clones 6 (SEQ ID NO:78), 15 (SEQ ID NO:86), 10 (SEQ ID NO:85) e 18 (SEQ ID NO:83). Nem todos os quatro ligandos inibiram a polimerase Taq no mesmo grau. O clone 18, que não mostrou ligação de elevada afinidade à polimerase Taq, não mostrou uma inibição significativa da enzima mesmo a 40°C. A potência da inibição da polimerase através destes ligandos segue a ordem das suas afinidades; clone 6> 15 > 10 >>>> 18.

As Figuras 12A e B mostram a percentagem de produto formada na presença destes ligandos em função da temperatura. Os valores de TI50 destes ligandos estão entre 40°C-56°C, excepto para o ligando 18, que mostrou um valor de <40°C. Este resultado é consistente com a sua reduzida afinidade. De acordo com a sua ligação de elevada afinidade, a sequência da Familia II, clone 19 (SEQ ID NO:84), mostrou também um elevado valor de TI50. A Tabela 9 resume os valores de Kd para o clone 6 (TQH6) e 28 (TQH28) . Os dados na Tabela 9 demonstram claramente que os ligandos obtidos após selecção de afinidade a elevada temperatura possuem as caracteristicas esperadas, nomeadamente a ligação e inibição a elevada temperatura. Este resultado reforça ainda o significado da definição das condições de selecção apropriadas para obter ligandos com as propriedades desejadas.

As Figuras 13A-F mostram a extensão do substrato marcado na extremidade catalisado pela polimerase TZ05 na presença de vários ligandos obtidos após selecção de afinidade a elevada temperatura ao longo de um intervalo de temperaturas. A interacção de elevada afinidade observada dos ligandos com a polimerase TZ05 espelha a sua capacidade para inibir a actividade de polimerase da enzima. Excepto para o clone 2 (TZ2 (SEQ ID NO: 96)), que não se ligou à polimerase com elevada afinidade, os outros ligandos mostraram valores de TI50 entre 40-59°C (ver Tabela 8) . A sequência de TZ2 com uma região aleatória mais curta (quatro nucleótidos mais curta que o esperado) não inibiu eficazmente a polimerase mesmo a 35°C. Os ligandos TZ13 (SEQ ID NO:89) e TZ26 (SEQ ID NO:93), pertencentes à Familia I, mostraram dois valores extremos de TI50 (58,5°C versus 41°C). Ao nível da sequência estas duas sequências são muito semelhantes, no entanto, a sua potência inibidora, especialmente a temperatura mais elevada é bastante 39 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ diferente. Embora exista um elevado grau de semelhança das sequências entre TZ13 e TZ26, as diferenças menores nas duas sequências podem ser responsáveis pela sua diferença na capacidade de inibir a polimerase. A Figura 14 demonstra o efeito da concentração de três ligandos obtidos utilizando selecção de afinidade de elevada temperatura na inibição da polimerase Taq. Os valores de CI50 dos três ligandos são aproximadamente de 20 nM. A Figura 15 ilustra a alteração nos valores de CI50 em função da temperatura para os ligandos 6 (SEQ ID NO: 78), 22 (SEQ ID NO:81) e 28 (SEQ ID NO:87) no tampão Tris (Figura 15A) e no tampão Tricina (Figura 15B). Em tampão Tris, os valores de CI50 de todos os três ligandos são bastante resilientes dentro do intervalo de temperaturas de 40°C a 50°C (Figura 15A) . No entanto, no tampão Tricina os valores de CI50 são sensíveis a temperaturas acima de 45°C (Figura 15B). Nestes ensaios a concentração da polimerase Taq foi de 2,5 nM e os valores de CI50 permaneceram a 20-40 nM de 30°C a 45°C. Portanto, dentro deste intervalo de temperaturas aproximadamente um excesso de 20 vezes da concentração de ligando em relação à concentração da enzima é suficiente para inibir completamente a enzima.

Experiência de Captura por Afinidade A reversibilidade térmica da interacção dos ligandos de ácido nucleico com a polimerase Taq e Tth levanta a possibilidade da utilização de uma matriz de afinidade gerada com tais ligandos, para capturar a polimerase após uma amplificação, para reutilização numa amplificação subsequente. Para investigar a possibilidade de captura por afinidade, foram preparadas contas de afinidade contendo os ligandos TQ30 (SEQ ID NO:50) e TQ21 (SEQ ID NO:59) tal como descrito no Exemplo 1. Após extensão do molde em gancho com as polimerases Taq e Tth num tampão de PCR contendo heparina a reacção foi misturada com contas de afinidade ou contas de controlo tal como descrito no Exemplo 2, as contas foram lavadas cuidadosamente e depois expostas a uma aliquota fresca de mistura reaccional contendo todos os reagentes, excepto a polimerase. Após incubação durante mais 5 minutos a 70°C para permitir a extensão do molde adicionado de novo, as misturas 40 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ reaccionais foram analisadas num gel de poliacrilamida a 8% sob condições desnaturantes. Nas misturas reaccionais que continham as contas de controlo não há extensão do molde no segundo ciclo de amplificação. Em contraste, não há diferença nos produtos de extensão tanto no primeiro como no segundo ciclos de amplificação nas misturas reaccionais que continham contas de afinidade, indicando que as contas de afinidade contendo tanto o ligando TQ30 como o TQ21, capturaram com sucesso as duas polimerases após o primeiro ciclo de PCR.

Efeito dos Ligandos de Ácido Nucleico na Actividade Exonucleásica das Polimerases

Para além da sua capacidade para catalisar a síntese de polinucleótidos, as polimerases Tag, Tth e TZ05 também possuem actividade exonucleásica 5'-3' (Joyce e Steitz, Trends Biochem. Sei. 12: 288, 1987; Longley et ai., Nucleic Acids

Res. 18: 7317, 1990). O substrato preferido para a actividade exonucleásica 5'-3' é um ADNcs deslocado (ou uma estrutura semelhante a uma forquilha) com a clivagem a ocorrer próximo da junção dúplex/ADNcs. Para estudar o efeito dos inibidores oligonucleotídicos na actividade exonucleásica 51 —»31 das polimerases, foi desenhado um substrato de ADN (Exo-Sub) contendo um ADNcs deslocado num gancho (Exemplo 3, Figura 16) . A radiomarcação do substrato Exo-Sub em ambas as extremidades 5' e 3' permite a detecção dos dois fragmentos de ADN produzidos através da actividade exonucleásica.

Efeito dOS Ligandos T030 (SEP ID NQ:50) e TQ21 (SEQ ID NO:59) na Actividade Exonucleásica da Polimerase Tag e Tth

Os dois fragmentos de ADN marcados originários da actividade exonucleásica surgiram tanto na presença como na ausência dos inibidores oligonucleotídicos (dados não mostrados), no entanto, a quantidade de produtos de clivagem gerada na presença dos inibidores oligonucleotidicos foi de algum modo inferior à produzida na ausência de inibidores, indicando que os inibidores oligonucleotídicos exercem algum efeito inibidor contra a actividade exonucleásica das enzimas. Uma vez que estes oligonucleótidos inibiram completamente as actividades de polimerase das duas enzimas a 250 nM, o seu efeito na actividade exonucleásica é considerado marginal. 41 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Efeito dos Liqandos TZ13 (SEP ID NO:89), TZ13 truncado (51 nucleótidos) e TZ36 (SEP ID NO:99) na Actividade Exonucleásica da Polimerase TZ205 A Figura 17 mostra os resultados de um ensaio realizado com três ligandos para a polimerase TZ05: TZ13 inteiro, TZ13 truncado (51 nucleótidos) (ver abaixo) e TZ36 inteiro. A pista C mostra os produtos de clivagem (78 nucleótidos e 24 nucleótidos) resultantes da clivagem exonucleásica da polimerase TZ05 na ausência de ligandos. As pistas 1-4, 5-8 e 9-12 mostram a clivagem do Exo-Sub na presença de concentrações crescentes dos ligandos TZ13, TZl3-Trnc e TZ36, respectivamente. A clivagem do substrato através da actividade exonucleásica da enzima foi inibida por todos os três ligandos. A inibição da actividade exonucleásica não é 100% nem a concentrações de ligando de 2 μΜ. Deve observar-se que a concentrações de ligando de 250 nM, a actividade de polimerase é completamente inibida. Portanto, com base na concentração de ligandos necessária para completa inibição da actividade de polimerase e actividade exonucleásica, estes ligandos não são tão eficazes como inibidores da actividade exonucleásica da enzima como o são para a actividade de polimerase.

Efeito da polimerase Taq e da polimerase TZ05 nos Ligandos idealmente, os ligandos de ácido nucleico funcionarão apenas como inibidores para a actividade de polimerase da enzima, tornando-os assim reagentes adequados para controlar amplificação não específica indesejável em PCR. Dependendo da natureza das suas estruturas dobradas, no entanto, os próprios ligandos podem ser substratos para a actividade de polimerase ou actividade exonucleásica 5'->3' ou ambas. Para estudar o efeito da polimerase Taq nos ligandos, os ligandos marcados na extremidade 5', 6 (TQH6 (SEQ ID NO: 78)), 22 (TQH22 (SEQ ID NO:81)) e 28 (TQH28 (SEQ ID NO:87)), foram incubados com polimerase Taq na presença e ausência de dNTP e os produtos da reacção foram analisados através de electroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes. A Figura 18 ilustra o efeito da polimerase Taq em cada um destes ligandos. Para cada ligando as pistas 1 e 4 são os controlos onde a incubação foi realizada no tampão. As pistas 2 e 5 mostram os 42 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ resultados após incubação com polimerase Taq e as pistas 3 e 6 mostram o resultado após incubação com polimerase Taq e todos os quatro dNTP. Tal como se pode observar na Figura 18, quando incubados com a polimerase Taq, pistas 2, 3, 5 e 6, todos os três ligandos serviram como substratos para a actividade exonucleásica, tal como indicado pelo surgimento de pequenos fragmentos de ADN rápidos. 0 que é de facto observado, é a actividade endonucleásica específica da estrutura da actividade exonucleásica 5'->3' da polimerase Taq que foi descrita por Holland et al., Proc. Natl. Aca. Sei USA 88: 7276-7280, 1991. Para além de serem substratos para a actividade exonucleásica, cada um dos ligandos foi também prolongado através da actividade de polimerase quando incubado na presença dos dNTP (pista 3) . Isto é claramente observável no ligando 6, em que foi gerada uma banda lenta após incubação com a polimerase e os dNTP. Tal como mostrado nas pistas 4-6, as extensões pela polimerase foram completamente paradas através do bloqueio da disponibilidade dos grupos OH a 3' de cada ligando. Neste estudo, as extremidades 3' foram rematadas com grupos fosfato durante a síntese química dos ligandos. Para além dos grupos fosfato, outras entidades moleculares tais como ligantes de etilenoglicol e ligação 3'-3'dT podem também ser utilizadas para cobrir as extremidades 3' dos ligandos eficazmente. A cobertura das extremidades 3' dos ligandos elimina o potencial problema dos ligandos que actuam como iniciadores não específicos em PCR. A cobertura das extremidades 3' dos ligandos não afectou a função dos ligandos (Dang e Jayasena, J. Mol. Biol. 264: 268, 1996).

Para estudar o efeito da polimerase TZ05 nos ligandos, ligandos marcados na extremidade 5' para TZ05 foram incubados com polimerase TZ05 na presença dos dNTP. A maioria dos ligandos quando incubados com os dNTP e a polimerase TZ05 mostrou produtos de extensão, indicando que os ligandos servem como substratos para a actividade da polimerase. Adicionalmente, todas as sequências dos ligandos testadas foram clivadas em dois fragmentos através da actividade exonucleásica 5'->3' da polimerase TZ05 (dados não mostrados). Apesar do local exacto da clivagem não ter sido mapeado, pareceu estar algures na região fixa a 5'. Tal como discutido acima, a extensão pela polimerase nos ligandos pode ser eficazmente controlada através do bloqueio dos grupos 43 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ hidroxilo a 3' dos ligandos. No entanto, a clivagem dos ligandos através da actividade exonucleásica da polimerase gerará novas extremidades 3' in situ, conduzindo a duas possíveis consequências. Primeiro, a clivagem pode potencialmente inactivar a função dos ligandos, e segundo, os fragmentos de ADN com novas extremidades 3' não rematadas podem actuar como iniciadores não específicos em PCR. Estas observações conduziram à identificação dos ligandos truncados descritos abaixo.

Inibição de Várias ADN-polimerases através de TQ21 (SEP ID NO:59) e TQ30 (SEQ ID NQ:50)

Ensaios de inibição utilizando várias outras ADN-polimerases comercialmente disponíveis e os ligandos TQ21 (SEQ ID NO:59) e TQ30 (SEQ ID NO:50) como inibidores são descritos no Exemplo 4. Quatro enzimas termoestáveis (polimerase Tbr de Thermus brockianus, polimerase Tfl de Thermus flavus, polimerase Tma de Thermotoga marítima e polimerase Tli de Thermococcus litoralis); três enzimas mesófilas (fragmento de Klenow de E. coli DNAPl (KF), ADN-polimerase T4 e ADN-polimerase T7); e quatro transcriptases inversas (RT) (RT de HIV-I, RT de AMV (vírus da mieloblastose aviária) e RT de M-MLV (vírus da leucemia de moloney de murídeo) e o seu mutante sem actividade de ARNase H (Superscript II) foram examinadas.

Das seis polimerases termoestáveis examinadas (incluindo a polimerase Taq e Tth), as quatro polimerases derivadas de espécies de Thermus {Taq, Tth, Tbr e Tlf) foram inibidas por ambos os oligonucleótidos seleccionados, sugerindo que estas enzimas partilham um elevado grau de semelhança. Tal como afirmado acima, está relatado que a polimerase Tth e a polimerase Taq são 93% semelhantes e 88% idênticas ao nível dos aminoácidos (Abramson (1995) em "PCR Strategies" (Academic Press, New York) ) . Está relatado que a polimerase Tfl é 93% semelhante e 86% idêntica à polimerase Taq ao nível dos aminoácidos (D. Gelfand, comunicação pessoal). A polimerase Tma de Thermotoga marítima e a polimerase Tli de Thermococcus litoralis, por outro lado, não foram inibidas por nenhum dos ligandos. A polimerase Tli partilha pouca homologia de sequência com enzimas eubacterianas (Ito e Braithwaite, 44 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Nucleic Acids Res. 19: 4045, 1991). Está relatado que a polimerase Tma é 61% semelhante e 44% idêntica à polimerase Taq ao nivel dos aminoácidos (Abramson (1995) em "PCR Strategies" (Academic Press, New York)), contudo os ligandos oligonucleotidicos não inibem a polimerase Tma.

Das quatro transcriptases inversas (RT) testadas, as RT de HIV-I e AMV (virus da mieloblastose aviária) não foram inibidas. Por outro lado, a RT de M-mlv (virus da leucemia de moloney de murideo) e o seu mutante sem actividade de ARNase H (Superscript II) foram inibidos através dos dois ligandos oligonucleotidicos.

As ADN-polimerases mesófilas, tais como o fragmento de Klenow de DNAPl de E. coli (KF), DNAP de T4 e DNAP de T7, não foram inibidas através de nenhum dos ligandos a uma concentração de 0,5 μΜ, apesar da semelhança dos domínios de polimerase da polimerase Taq e KF (Kim et al., Nature (London) 376: 612, 1995; Lawyer et al.r J. Biol. Chem. 264: 6427, 1989). Assim, parece que os inibidores oligonucleotidicos são geralmente razoavelmente específicos. Estes resultados são semelhantes ao comportamento dos ligandos de ácido nucleico identificados através de selecção in vitro para outras transcriptases inversas (Tuerk e MacDougal, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 6988, 1994; Chen e Gold, Biochemistry 33: 8746, 1994; Schneider et al., Biochemistry 34: 9599, 1995).

Inibição de Várias ADN-polimerases por TQH6 (SEQ ID NO:78) e TQH22 (SEQ ID NO:81)

Foram estudadas tanto a forma inteira como a truncada de TQH6 e TQH22 para determinar a sua capacidade para inibir o fragmento de Stoffel da polimerase Taq, polimerase Tth e polimerase TZ05. Ambos os ligandos inibiram o fragmento de Stoffel com um valor de TI50 de 48°C (Figuras 19A e B) . Em ambos os casos os ligandos inteiros e truncados exibiram valores de Tl50 idênticos. Este resultado é bastante diferente de uma inibição da polimerase Taq por estes dois ligandos em que os ligandos truncados exibiram valores de TI50 menores que as moléculas inteiras. 45 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

As características inibidoras das formas inteiras e truncadas dos dois ligandos na polimerase Tth são muito semelhantes aquelas na polimerase Taq. Em ambos os casos os ligandos truncados mostraram valores de TI50 inferiores (6°C ou 10°C) (Figuras 20A e B). A inibição da polimerase TZ05 pelos dois ligandos foi investigada na presença de iões Mg2+ ou Mn2+. Foram observados resultados muito semelhantes na presença de cada um dos iões metálicos. As Figuras 21A e B mostram a inibição da polimerase TZ05 na presença de iões Mg2+.

Inibição de Várias ADN-polimerases por TZl (SEQ ID NO:94), TZ8 (SEP ID NO:100), TZ13 (SEP ID NO:89) e TZ54 (SEP ID NQ:103) Vários ligandos derivados de uma selecção de afinidade da polimerase TZ05 foram utilizados para investigar a inibição da polimerase Taq, polimerase Tth e do fragmento de Stoffel por estes ligandos. Dos vários ligandos inteiros testados de diferentes famílias, os ligandos possuindo o consenso com quatro timinas contíguas, i.e. sequências categorizadas na Família III, (T Z 8 (SEQ ID NQ:100) e TZ54 (SEQ ID NO:103)) inibiram eficazmente ambas as polimerases Taq e Tth (dados não mostrados). Este resultado não é tão surpreendente com base no facto de que os ligandos da Família II identificados através de selecção de afinidade na polimerase Taq (Tabela 4) inibiram também a polimerase Tth, bem como as polimerases de Thermus brokianus e Thermus flavus. A inibição observada através de TZ54, um ligando contendo um motivo de consenso com quatro timinas, mas não através de TZ13 (SEQ ID NQ:89), um ligando com sete guanosinas contíguas espelha as suas afinidades de ligação às polimerases Taq e Tth (Figuras 22A e B) . Tal como mostrado na Figura 22, TZ13 não se liga com elevada afinidade a nenhuma das polimerases, enquanto TZ54 sim. Por outro lado, TZl e TZ13, que contém sete guaninas contíguas não mostra inibição eficaz destas duas polimerases acima de 30 °C (Figuras 23A e B) . P ligando TZ36 (SEQ ID NQ:99) é único por não possuir nem sete guanosinas contíguas nem as quatro timinas contíguas e inibir ambas as polimerases Taq e Tth eficazmente. Por isso, é provável que os ligandos contendo sete guaninas contíguas sejam específicos da polimerase TZ05, a polimerase que foi utilizada na selecção de afinidade. 46 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Nenhum dos três ligandos testados (TZl, TZ13 e TZ36) inibiu o fragmento de Stoffel (Figura 23C) . Este resultado é surpreendente para TZ36, que inibiu eficazmente a polimerase Taq. Isto sugere que o local de ligação de TZ36 à polimerase Taq é suprimido ou reorganizado no fragmento de Stoffel.

Amplificação de Alvos de Baixo Número de Cópias 0 Exemplo 5 descreve várias amplificações por PCR comparando técnicas de PCR padrão, PCR de "início quente" e PCR utilizando os ligandos identificados através do método deste invento para facilitar a detecção de um alvo de baixo número de cópias através de PCR na ausência de condições de "inicio quente". Foi utilizado um sistema iniciador-molde desenhado para detectar um fragmento de ADN de 203 pares de bases a partir da LTR (repetição terminal longa) de HIV-2 tal como descrito por Respess et al. (1994) em "Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy", 94: 110. A Figura 24 ilustra os resultados utilizando os ligandos TQ30 (SEQ ID NO:50) e TQ21 (SEQ ID NO:59). As amplificações por PCR foram realizadas com 0, 10 e 50 cópias de LTR de HIV-2 alvo. Sob condições de PCR normais, a identificação da banda correcta do alvo foi comprometida pela presença de várias bandas não específicas (Figura 24A, pistas 1-3). A amplificação realizada sob condições de "início quente" eliminou as bandas não especificas (Figura 24A, pistas 4-6). Os resultados da amplificação efectuada na presença de uma sequência de ADNcs de 78 nucleótidos não específica contendo sequências fixas a 5' e 3' idênticas como TQ21 e TQ30 (Figura 24B, pistas 1-3) foram semelhantes aos obtidos através de PCR sem utilização de condições de "início quente". No entanto, a adição de TQ21 (Figura 24B, pistas 4-6) ou de TQ30 (Figura 24B, pistas 7-9) realizada sob condições padrão (sem "inicio quente") eliminou as bandas não especificas sem afectar o rendimento da banda específica do alvo. De particular importância foi a observação de que quando o número de cópias alvo era baixo, a detecção do sinal era muito eficiente (Figura 24B, compara a pista 2 com as pistas 5 e 8). O efeito dos inibidores oligonucleotidicos foi semelhante quando a polimerase Tth foi utilizada em vez da polimerase Taq (dados não mostrados) na detecção da LTR de HIV-2 de baixo 47 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ número de cópias. A maior produção da banda especifica do alvo obtida com os inibidores oligonucleotidicos na PCR aumenta a sensibilidade da reacção, facilitando a detecção do alvo presente com apenas aproximadamente 3 cópias (Figura 24C).

Os inibidores oligonucleotidicos utilizados na experiência descrita na Figura 24 não foram rematados nas suas extremidades 3', potencialmente permitindo-lhes iniciar amplificação de forma não específica e complicar mais o resultado da PCR. No entanto, não foram detectadas bandas adventícias, sugerindo que neste sistema, a cobertura a 3' dos inibidores oligonucleotidicos não foi necessária para eliminar a criação de bandas não específicas. A Figura 25 ilustra os resultados utilizando ligandos truncados rematados a 3': TQH6, TQH22 e TQH28. As amplificações foram realizadas com e sem 10 cópias de LTR de HIV-2 alvo misturadas com 1 pg de ADN de placenta humana. Todas as amplificações representadas na Figura 25 foram efectuadas na ausência de condições de início quente. As pistas 1-4 mostram o resultado de reacções de controlo que não continham ligandos. Nestas reacções foram geradas múltiplas bandas de ADN devido a amplificação não específica. Estes produtos amplificados de forma não específica estão presentes em reacções com e sem o ADN molde. O resultado é claramente diferente quando os ligandos são adicionados à mistura reaccional (pistas 5-10). No caso de todos os três ligandos, não houve um único produto de amplificação nas reacções que não contivesse o alvo (pistas 5, 7 e 9) . Nas reacções de PCR que continham apenas alvo o amplicão específico foi amplificado quando o ligando TQH6 (pista 6) foi adicionado à mistura reaccional e quando foram adicionados os ligandos TQH22 e TQH28, estava presente uma banda de baixo peso molecular adicional, presumivelmente devido à ligação não específica do iniciador ao alvo (pistas 8 e 10). Estes resultados indicam que estes ligandos truncados são eficazes no controlo da amplificação não específica através da geração de condições de início quente in situ.

Para testar a capacidade dos ligandos para a polimerase TZ05 para melhorarem o resultado da PCR que amplifica uma sequência alvo de baixo número de cópias, foi utilizado um 48 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ sistema de PCR desenhado para amplificar o gene K-ras a partir de ADN genómico humano (Nilsson et al., BioTechniques 22: 744-751, 1997). Os ligandos truncados de 51 nucleótidos de TZl (TZl-Tr (SEQ ID NO :107)), TZ13 (TZl3-Tr (SEQ ID NO:108)) e TZ36 (SEQ ID NO:109)) (Figura 33) foram testados. O grupo OH a 3' destes ligandos foi rematado com um resíduo 3'dT a 3' para prevenir a extensão pela polimerase dos ligandos. Para além disso, estes ligandos continham oito ligações fosforotioato no terminal 5' para bloquear a clivagem exonucleásica através da polimerase TZ05. Nas reacções de amplificação, o ligando estava presente no tampão reaccional completo contendo a polimerase e iniciadores antes da adição de ADN genómico humano molde. Após PCR, os produtos amplificados foram analisados num gel de agarose a 3%. Os resultados da PCR efectuada na presença do ligando TZl truncado ao longo de um intervalo de concentrações são mostrados na Figura 26. Na ausência ou a baixa concentração de ligando, o gene K-ras não foi amplificado (pistas 2-6). À medida que a concentração do ligando é aumentada, pode ser observada a geração do amplicão específico com quantidades decrescentes de fundo (pistas 7-8). A PCR foi completamente inibida após maior aumento da concentração de ligando (pista 9) . Os resultados indicam que para uma amplificação desejável é necessária uma concentração óptima de ligando que cai entre 20-40 nM. Os resultados utilizando os outros dois ligandos foram muito semelhantes aos resultados mostrados na Figura 26.

Resultados semelhantes foram obtidos com os truncados de 30 nucleótidos de TZl e TZ13 (Figuras 27A e B). Estes truncados não tinham ligações fosforotioato nas extremidades 5', mas foram rematados nas extremidades 3'. Com os truncados de 30 nucleótidos a concentração necessária para alcançar o resultado desejável foi de aproximadamente o dobro da necessária para os truncados de 51 nucleótidos. Foram observados resultados semelhantes com o truncado de 26 nucleótidos de TZ13 a uma concentração ainda mais elevada (660 nM) que o truncado de 30 nucleótidos. As concentrações eficazes de ligando truncado necessárias para produzir o amplicão específico do alvo diminuem com a diminuição do comprimento de um ligando. Este resultado correlaciona-se com os seus valores de TI50, que também diminuem com o aumento no comprimento de um ligando. 49 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

As amplificações mostradas nas Figuras 26 e 27 foram realizadas com a polimerase TZ05. Vários ligandos seleccionados para reconhecerem a polimerase TZ05 também inibiram a polimerase Tth. 0 ligando TZ36 (truncado de 51 nucleótidos) foi testado no mesmo sistema de PCR realizado com polimerase Tth. Tal como mostrado na Figura 28, o ligando também é bastante eficaz na geração de amplicões especificos com a polimerase Tth.

Identificação de Ligandos Truncados com Actividade Inibidora

Tipicamente, nem todos os nucleótidos numa sequência inteira são necessários para a sua função. É, portanto, desejável a identificação de sequências de ADN truncadas que mantenham a função da sequência inteira. Adicionalmente, tal como discutido acima, as sequências inteiras sofrem clivagem específica do local através da actividade endonucleásica específica da estrutura associada à polimerase. isto coloca um potencial problema em aplicações de PCR devido à geração de extremidades prolongáveis a 3' ou à possível inactivação da função do ligando após clivagem ou ambas. Como resultado, são desejáveis ligandos que não sejam substratos para actividade exonucleásica. Uma vez que o local de clivagem fica próximo da extremidade 5' da sequência, a truncagem pode eliminar este local. A truncagem é também desejável devido à economia de fabrico dos ligandos.

Identificação de Ligandos Truncados de TQ3Q e TQ21

Os ligandos TQ30 (SEQ ID NO:50) da Família I e TQ21 (SEQ ID NO:59) da Família II (ver Tabela 10) foram escolhidos para experiências de truncagem. As selecções de afinidade em fragmentos internos marcados na extremidade de sequências inteiras de ambos os ligandos, seguidas de análise de sequenciação em gel, tal como descrito no Exemplo 2, não deram limites identificáveis. Os dois ligandos foram portanto sujeitos a análise de deleção. As formas sequencialmente suprimidas foram testadas quanto à sua capacidade para inibir polimerases no ensaio de extensão de gancho para identificar truncados funcionais. 50 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Truncados do ligando TQ30 (SEQ ID NO:50) A região variável de 30 nucleótidos de TQ30 contendo o motivo de sequência conservada com a estrutura de haste-volta prevista (Tmc.A-30 (SEQ ID NO:74); Tabela 11) inibe a polimerase Taq a 25°C na mesma extensão que a sequência inteira (dados não mostrados). A temperaturas mais elevadas, no entanto, a eficiência da inibição é menor que a da sequência inteira. A 30°C, por exemplo, a inibição da polimerase Taq através de Trnc.A-30 (250 nM) é de aproximadamente 82%, enquanto que a sequência inteira inibiu completamente a enzima a esta temperatura e concentração. A maior sensibilidade térmica de Trnc.A-30 pode ser devida à presença de uma hélice interrompida com pares de bases A-T, uma hélice com propensão para desnaturar a uma temperatura baixa.

Foram portanto desenhadas três variantes de haste-volta de Trnc.A-30 contendo hastes não interrompidas com pares de bases ricos em G-C. Nestas variantes o motivo de sequência conservado identificado na Família I foi inalterado (Tabela 11), mas as hastes tinham comprimentos variáveis. A uma concentração de inibidor de 250 nM, Tic.1-30 (SEQ ID NO:67) e Tic.2-30 (SEQ ID NO:68) inibiu aproximadamente 95% da actividade da polimerase Taq, enquanto Tic.3-30 (SEQ ID NO:69) inibiu apenas cerca de 60% da actividade da polimerase (ver abaixo). Trnc.3-30 contendo a haste mais curta (7 pares de bases) das três variantes foi um inibidor fraco para a polimerase Taq, indicando que contactos adicionais na haste são necessários para a interacção ser produtiva. Para determinar se a menor inibição observada com Trnc.3-30 é devida à sua reduzida afinidade para se ligar à polimerase, foram calculadas as afinidades de todas as três variantes para ligação à polimerase Taq. Os valores de Kd caíram dentro de 2-3 nM (Tabela 11), indicando que todas as três variantes tinham afinidades de ligação semelhantes. Assim, a falta de inibição causada por Trnc.3-30 não foi devida a falta de ligação, mas presumivelmente devido à sua incapacidade para bloquear o local activo. As afinidades das três variantes para ligação à polimerase Taq são cerca de 75 vezes inferiores à molécula inteira (a Kd da sequência inteira é de 40 pM), e cerca de 3-5 vezes inferiores a Trnc.A-30. Os valores de Cl50 para as 51 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ três construções diminuíram com a diminuição do comprimento da haste; 25, 50 e 186 nM para Tic.1-30, Trnc.2-30 e Trnc.3-30, respectivamente (Figura 29). Este resultado está de acordo com a noção de que os ligandos com hastes maiores são inibidores mais eficazes. O valor de CI50 da sequência inteira é de 22 nM. Os ensaios de extensão do gancho foram efectuados a 30°C durante 1 hora. Nem Trnc.1-30 enm Trnc.2-30 inibiram a polimerase Tth, apesar do facto da enzima ser completamente inibida pelo ligando inteiro. O fragmento de Stoffel (61 kDa) é uma forma truncada de polimerase Taq que não tem actividade exonucleásica 5'—3' e é semelhante à ADN-polimerase KlenTaq (67 kDa). A actividade de polimerase do fragmento de Stoffel foi completamente inibida pelas formas inteiras, bem como as três truncadas de TQ30. Os valores de CI50 para os três truncados são Trnc.1-30 = 2,7 nM, Trnc.2-30 = 5,9 nM e Trnc.3-30 = 10,3 nM (Figura 30).

Globalmente, as três formas truncadas de TQ30 são mais eficazes na inibição do fragmento de Stoffel que a polimerase Taq (compare-se a Figura 29 com a Figura 30) . Os valores de CI50 destes truncados para a inibição do fragmento de Stoffel são uma ordem de grandeza melhores que aqueles para a polimerase Taq. O valor de TI50 para a inibição do fragmento de Stoffel através de Trnc.2-30 foi de 38°C (dados não mostrados). Surpreendentemente, a sequência de TQ21, que inibe tanto a polimerase Taq como a Tth não inibe o fragmento de Stoffel. Isto sugere que o local de ligação de TQ21 no fragmento de Stoffel é parcialmente ou completamente suprimido ou foi reorganizado após truncagem da proteína.

Truncados de ligando TQ21 (SEP ID NO:59)

Ao contrário dos ligandos da Família I, tais como TQ30, a região variável de 30 nucleótidos do ligando da Família II, TQ21, não inibe a polimerase Taq nem a Tth (dados não mostrados), indicando que os nucleótidos adicionais das regiões fixas são necessários para a inibição. A análise de deleção da sequência TQ21 inteira conduziu à identificação de uma sequência 51-mero (Trnc.21 (SEQ ID NO:70) (Tabela 10)) que manteve a capacidade para inibir tanto a polimerase Taq como a Tth. Para além da região aleatória inteira de 30 nucleótidos, a sequência de Trnc.21 continha 9 e 12 nucleótidos das regiões fixas a 5' e 3', respectivamente (Tabela 10). Em contraste com 52 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ os truncados de TQ30, que mostraram menor afinidade para a polimerase Taq, Trnc.21 mostrou maior afinidade; a Kd de Trnc.21 para ligação à polimerase Taq é de 9 pM (Figura 31A), cerca de 4 vezes mais elevada que a da sequência inteira. O valor de CI50 de Trnc.21 para inibição da polimerase Taq é de 21 nM (Figura 31B), cerca de 3 vezes inferior ao valor para a sequência inteira. Os valores calculados de TI50 para a polimerase Taq e a polimerase Tth são de 34°C e 35,6°C, respectivamente (Figura 31C) . Os ensaios de extensão do gancho foram realizados entre as temperaturas de 35 e 50°C durante 1 hora com Trnc.21 250 mM. Assim, com base na afinidade e nos valores de CI50 e TI50, a forma truncada de TQ21 é um melhor inibidor que a sequência inteira. Semelhante à sequência inteira, Trnc.21 não inibiu a actividade do fragmento de Stoffel.

Truncados dos Liqandos 6 (TOH6 (SEP ID NO:78)), 22 (TOH22 (SEP ID NO:81)) e 28 (TOH28 (SEQ ID NO:87))

Os truncados funcionais foram identificados através de análise de deleção sistemática das sequências inteiras. Os truncados continham 9 e 12 nucleótidos das regiões 5' e 3' fixas, respectivamente, ligados à região variável, resultando em sequências de 50 ou 51 nucleótidos. Assim, em cada truncado a região variável está flanqueada por 5'-TGGCGGAGC- e -TCTTGTGTATGA-3'. Os ligandos truncados não foram clivados pela actividade exonucleásica 5'-3' quando incubados com polimerase Taq (Figura 32), o que sugere que após truncagem, quaisquer locais de clivagem foram eliminados ou os ligandos adaptam-se a uma estrutura não reconhecida pela actividade exonucleásica.

As afinidades dos ligandos truncados TQH6-Tr e TQH28-Tr para a polimerase Taq foram medidas nos tampões Tris e

Tricina. Os valores de Kd dos ligandos inteiros e truncados nos dois tampões a 55°C são expostos na Tabela 9. A afinidade do ligando 6 (TQH6) diminuiu 3-4 vezes em ambos os tampões após truncagem e a afinidade do ligando 28 (TQH28) diminuiu 3-4 vezes no tampão Tris. Globalmente, a diminuição moderada na afinidade após truncagem indica que os nucleótidos suprimidos contribuem com algum nível de energia de ligação 53 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ nas sequências inteiras, presumivelmente através de interacção não especifica.

Tal como exposto na Tabela 12, os valores de Ti50 dos ligandos truncados TQH6-Tr, TQH22-Tr e TQH28-Tr diminuíram 5-9°C após a truncagem. A comparação dos valores de CT50 medidos em tampão Tricina a 45°C para os ligandos truncados e inteiros revela que os valores de CT50 (a concentração à qual 50% do substrato de gancho que deu entrada são convertidos em produto completamente prolongado a uma dada temperatura) aumentaram 2-3 vezes após truncagem (Tabela 12).

Globalmente, os resultados desta análise indicam que os ligandos truncados não são clivados através da actividade exonucleásica 5'->3' da polimerase Taq. Além disso, exibem elevada afinidade de ligação à polimerase Taq e inibem a actividade da polimerase a temperaturas mais elevadas. Estas características dos ligandos truncados são desejáveis para amplificações por PCR para controlar amplificações não específicas.

Ligandos de Ácido Nucleico Truncados para a Polimerase TZ05

Os ligandos truncados que inibem a actividade de polimerase da polimerase TZ05 foram identificados através de análise de deleção sistemática das sequências inteiras. Estes ligandos não têm a maior parte das duas regiões fixas e têm 51 nucleótidos de comprimento (Figura 33). Os truncados requerem 9 e 12 nucleótidos das regiões fixas a 5' e 3', respectivamente, para uma inibição eficaz da actividade da polimerase. A Tabela 13 compara os valores de Kd de ligandos truncados para TZl, TZ13 e TZ36 com as dos respectivos ligandos inteiros. Pode observar-se que as afinidades destes ligandos não foram drasticamente alteradas após truncagem para 51 nucleótidos. As reacções de ligação representadas na Tabela 13 foram efectuadas em tampão de TZ05 a 55°C. Este resultado indica que os nucleótidos suprimidos nas duas regiões fixas não são críticos para a ligação do ligando à polimerase. Além dos truncados de 51 nucleótidos, os truncados de 30 nucleótidos contendo apenas as regiões variáveis dos ligandos 54 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ inteiros foram também testados quanto à sua capacidade para inibir a polimerase (Figura 33).

Os valores de Ti50 dos truncados de 51 e 30 nucleótidos dos ligandos TZl, TZ13 e TZ36 são expostos na Tabela 14. Para calcular os valores de TI50 foram realizados ensaios de extensão de gancho tal como descrito no Exemplo 2. Tal como se pode observar na Tabela 14, todos os três truncados de 51 nucleótidos inibiram a actividade da polimerase acima de 40°C. Os valores de TI50 de TZ13 e TZ36 diminuíram 7,5°C e 4°C após truncagem, enquanto o valor de TI50 de TZl não se alterou após truncagem. Globalmente, os valores de TI50 e as afinidades dos truncados de 51 nucleótidos tornam-nos candidatos atractivos para amplificações por PCR.

No caso do ligando TZ13, uma maior truncagem para 30 nucleótidos diminuiu a afinidade em aproximadamente 5 vezes (Kd = 145 pM) . A afinidade deste truncado iguala o seu valor baixo de Tl50 ( 42°C). A deleção de mais quatro nucleótidos da extremidade 3' do truncado de 30 nucleótidos de TZ13 diminuiu o valor de TI50 em 17°C (Figuras 34A e B) . Interessantemente, os truncados de 30 nucleótidos de TZl e TZ13 exibiram valores de TI50 acima de 40°C, enquanto o truncado de 30 nucleótidos de TZ36 não. Assim, os truncados de 30 nucleótidos de TZl e TZ13 com valores de TI50 >40°C podem também ser úteis em aplicações por PCR.

Os truncados de 51 nucleótidos destes ligandos mantêm valores desejáveis para a afinidade (¾) e inibição da polimerase (Tl50) . Tal como mostrado na Figura 35, os truncados de 51 nucleótidos foram clivados através da actividade exonucleásica da polimerase. A incubação dos truncados de 30 nucleótidos com a polimerase TZ05, no entanto, não resultou em clivagem, sugerindo que 0 local de clivagem no truncado de 51 nucleótidos está provavelmente dentro do intervalo de nove nucleótidos da região fixa a 5'. Embora o truncado de 30 nucleótidos não fosse clivado pela enzima, os seus valores de Kd (145 pM) e de TI50 (42°C) podem não ser atractivos para certas aplicações de PCR em que a activação da polimerase é desejável a temperaturas próximas de 50°C. Numa tentativa para bloquear a clivagem dos truncados de 51 nucleótidos, foram introduzidas ligações fosforotioato. 55 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Verificou-se que os truncados contendo ligações fosforotioato nos primeiros oito nucleótidos das suas extremidades 5' (Figura 33) eram resistentes a clivagem exonucleásica. Os valores de TI50 dos truncados com ligações fosforotioato eram comparáveis com aqueles sem fosforotioatos, sugerindo que a introdução de oito ligações fosforotioato neste truncado não afectou a sua capacidade para inibir a polimerase TZ05.

Formas Diméricas dos Truncados A multimerização dos ligandos aumenta a concentração local eficaz, resultando num tempo residente maior com o alvo (avidez). Com base na sua afinidade moderada para a polimerase Taq, Trnc.2-30 foi seleccionado para síntese de um homodímero (Tabela 10). O homodímero (D.30-D.30) (SEQ ID NO:71) (Tabela 10) de Trnc.2-30 (SEQ ID NO:68) foi sintetizado na orientação cauda-com-cauda (ligado nas extremidades 3') utilizando o dimero simétrico CPG como suporte em síntese química de fase sólida utilizando métodos padrão. A afinidade do dimero D.30-D.30 para ligação à polimerase Taq é de 40 pM (Figura 36A), cerca de 75 vezes superior que a sua forma monomérica. O valor de CI50 do homodímero é de 14 nM, cerca de 3,5 vezes inferior que a forma monomérica (Figura 36B). Assim, a dimerização do truncado TQ30 produziu um inibidor mais eficaz para a polimerase Taq.

Foram também preparadas duas sequências heterodiméricas nas quais os dois truncados monoméricos, Trnc.2-30 e Trnc-21 (Tabela 10), foram unidos através de um ligante contendo 3 timinas. Em D.21-D.30 (SEQ ID NO:72) a sequência de Trnc-21 é colocada na extremidade 5' da molécula, enquanto em D. 30-D.21 (SEQ ID NO: 73) esta ocupa a extremidade 3' da molécula. Ao contrário do TQ30 inteiro, as suas formas truncadas não inibiram a polimerase Tth. Trnc-2, por outro lado, inibiu tanto a polimerase Taq como a Tth, mas não o fragmento de Stoffel. Assumindo que as unidades monoméricas são capazes de funcionar independentemente, após serem ligadas numa única sequência, a combinação dos dois ligandos truncados proporcionaria uma única sequência que poderia inibir todas as três polimerases. À menor concentração de inibidor (62,5 nM) o efeito inibidor dos dois heterodímeros na polimerase Taq é 56 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ superior ao dos dois monómeros. O efeito dos heterodímeros na polimerase Tth é idêntico ao do monómero Trnc-21. 0 fragmento de Stoffel não pode prolongar completamente o molde de gancho na presença dos dois heterodímeros. Em contraste, produtos parcialmente prolongados eram menos abundantes na presença da sequência monomérica de Trnc.2-30. A falta de extensão completa do molde de gancho sugere que os heterodímeros suprimem a actividade do fragmento de Stoffel. 0 heterodímero D.21-D.30 tem um valor CI50 de aproximadamente 30 nM para a inibição das polimerases Taq e Tth (Figura 37A) . Os valores de TI50 para a inibição da polimerase Taq e Tth são de 41 e 34,5°C, respectivamente (Figura 37B). D.21-D.30 inibe o fragmento de Stoffel com um valor de CI50 de 15,5 nM e um valor de TI50 de 38°C (dados não mostrados). A Kd do ligando heterodímero D.21-D.30 para ligação à polimerase Taq é semelhante à do Trnc-21 (10 pM), sugerindo que a proteína se liga de preferência ao motivo de sequência com ligação de elevada afinidade. O posicionamento das duas unidades monoméricas no dímero parece não ter qualquer efeito global na inibição de nenhuma das três polimerases. As duas unidades monoméricas diferentes não mostraram qualquer efeito adverso quando foram combinadas num dímero. Tal como esperado, os heterodímeros mostraram a capacidade para inibir todas as três polimerases bastante eficazmente, indicando que, em grande medida, as funções das unidades monoméricas nos heterodímeros são mutuamente exclusivas. O truncado de 30 nucleótidos do ligando de ácido nucleico TZ13 (SEQ ID NO: 89) foi sintetizado como um dímero em três formas diferentes (Figura 38) . A cadeia de TZ13 (SEQ ID NO:116) foi obtida através da colocação de duas unidades do truncado de 30 nucleótidos num modo em cadeia, ligadas através de três unidades de timina. O Dímero simétrico-1 de TZ13 (SEQ ID NO:117) foi sintetizado através de ligação das extremidades 3' dos dois ligandos por uma porção glicerol. No terceiro dímero, o Dímero simétrico-2 de TZ13 (SEQ ID NO:118), as duas unidades monoméricas foram ligadas nas suas extremidades 3' através de uma porção glicerol, mas foi colocado um ligante de seis unidades de etilenoglicol entre a 57 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ extremidade 3' e a porção glicerol. Tal como mostrado na Figura 39A e Tabela 15, todos os três dimeros mostram uma afinidade mais elevada (valores de Kd entre 18-80 pM) para ligação à polimerase TZ05 que o ligando monomérico cujo valor de Kd era de 145 pM. Espera-se que a avidez desempenha um papel nas interacções dos dimeros com a polimerase e aumente deste modo a afinidade. As três construções de dimeros do mesmo monómero apresentam diferentes afinidades. O Dimero simétrico-1 sem o ligante mostrou a afinidade mais elevada, enquanto o Dimero simétrico-2 com o ligante de etilenoglicol tem a afinidade mais baixa dos três dimeros. As afinidades observadas dos três dimeros correlacionam-se bem com a sua potência de inibição medida através dos valores de TI50 (Figura 39B e Tabela 15).

Os seguintes exemplos são proporcionados para explicar e ilustrar o presente invento e não se pretende que sejam limitantes do presente invento.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Procedimentos Experimentais A. Materiais e Métodos A polimerase Taq recombinante (rTaq; Mr 94 kDa) suspensa num tampão consistindo em KC1 100 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 0,1 mM, glicerol a 50% (v/v) e Tween 20 a 0,2%; a polimerase Tth recombinante {rTth-, Mr 94 kDa) suspensa num tampão consistindo em Bicina-KOH 50 mM (pH 8,3), KC1 90 mM e glicerol a 50% (v/v); e Z05 de espécies de Thermus (pol TZ05) foram adquiridas em Roche Molecular Systems, Inc. (Alameda, CA). As ADN-polimerases Taq, Tth e UITma DNA foram obtidas em Perkin Elmer. A polimerase Ultma é uma forma suprimida da polimerase Tma que não tem a actividade exonucleásica 5 '->3' de tipo selvagem. As ADN-polimerases Tli e Tfl foram adquiridas em Promega. A polimerase Tbr (Termalase Tbr) foi obtida em Amresco Inc. CPG de ramificação simétrica ligando 3'-3' e Fosforamiditos C-6 modificadores de tiol foram obtidos em Clontech (Paio Alto, CA) . Contas de Iodoacetilo ULTRALINK™ foram adquiridas em Pierce Chemicals (Rockford, IL). As enzimas utilizadas em radiomarcação de ADN foram obtidas em 58 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Todos os outros reagentes e químicos foram de grau analítico e adquiridos em fontes comerciais padrão.

Preparação de Oligonucleótidos. Os oligonucleótidos foram sintetizados através de química do fosforamidito de cianoetilo de fase sólida padrão e purificados através de electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante até à homogeneidade de tamanho ou cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa. 0 homodímero simétrico foi sintetizado com CPG de Ramificação Simétrica ligando 3'-3' As concentrações de ADN foram baseadas em 33 pg/ml = 1 Unidade de A260 ·

Preparação de Contas de Afinidade. Vinte e cinco nanomoles de ligando TQ21 (SEQ ID NO:59) ou TQ30 (SEQ ID NO:50) (Tabela 3) contendo um grupo tiol na extremidade 5' foram desprotegidos com AgN03 e ditiotreitol (DTT) de acordo com as instruções do fabricante. O excesso de DTT foi removido através de quatro extracções sequenciais com volumes iguais de acetato de etilo. O ligando desprotegido foi então misturado com 500 μΐ de contas de iodoacetilo ULTRALINK™ que tinham sido lavadas duas vezes num tampão consistindo em Tris-HCl 50 mM (pH 8,3) e EDTA 5 mM. A mistura reaccional foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas numa plataforma de rotação. Os locais que não reagiram nas contas de iodoacetilo foram rematados fazendo reagir a mistura com 50 μΐ de uma solução de cisteína 0,5 M no mesmo tampão durante 15 minutos. Foram preparadas contas de controlo fazendo reagir 500 μΐ de contas de iodoacetilo com 500 μΐ de cisteína 0,5 M. Após a reacção, as contas foram lavadas cinco vezes com 500 μΐ de um tampão de PCR consistindo em heparina 75 μΜ, MgCl2 12,5 mM, KC1 50 mM e Tris-HCl 10 mM (pH 8,3).

B. SELEX O procedimento SELEX foi descrito em detalhe na Patente dos Estados Unidos N.° 5270163. As experiências SELEX foram efectuadas à temperatura ambiente e a temperaturas elevadas utilizando o molde e os iniciadores mostrados na Tabela 1.

Temperatura Ambiente. A selecção em polimerase Taq foi realizada à temperatura ambiente num tampão consistindo em 59 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Tris-HCl 10 mM (ρΗ 8,3; a 22°C), KC1 50 mM e MgCl2 2,5 mM (tampão de ligação de Taq) . A selecção em polimerase Tth foi realizada num tampão contendo Bicina-KOH 50 mM (pH 8,3; a 25°C), KC1 90 mM e Mn(OAc)2 3,5 mM (tampão de ligação de Tth).

Cada experiência SELEX foi iniciada com 5 nmol de ADN de cadeia simples (ADNcs) de um banco de sequências aleatórias sintéticas purificadas em gel consistindo na região aleatória de 30 nucleótidos, flanqueada por regiões 5' e 3' de estrutura fixa (Tabela 1). Num ciclo típico de selecção, o ADNcs suspenso no tampão de ligação apropriado foi aquecido a 90°C durante 3 minutos, arrefecido em gelo, e depois trazido para a temperatura ambiente. Uma vez equilibrado à temperatura ambiente, o ADN foi incubado durante 15 minutos com a polimerase alvo apropriada na presença de 2 nmol de ARNt como competidor e albumina do soro humano (hSA) a 0,01%. Os complexos polimerase-ADN foram separados do ADN não ligado através de filtração em nitrocelulose através de um filtro de nitrocelulose pré-humedecido (0,45 μΜ, Millipore) sob sucção. O filtro foi imediatamente lavado com 20 ml do tampão de ligação, 20 ml de ureia 0,5 M no tampão de ligação, e ureia em água 0,5 Μ. O ADN retido no filtro foi eluído e isolado através de precipitação em etanol na presença de ARNt transportador (5 pg). O ADN isolado foi amplificado por PCR com o Conjunto de iniciadores I (Tabela 1). Uma das cadeias dos iniciadores continha três biotinas contíguas na extremidade 5'. A cadeia não biotinilada do ADN duplex resultante foi isolada através de electroforese em gel sob condições desnaturantes (Pagratis, Nucleic Acid Res. 24: 3645-3646, 1996) e utilizada para o ciclo de selecção seguinte. Em ciclos subsequentes, antes da incubação com a polimerase alvo, os bancos de ADN foram passados através de filtros de nitrocelulose (contra-selecção) para remover as sequências de ADN que não se ligaram ao filtro de nitrocelulose. O número de picomoles da polimerase alvo foi gradualmente diminuído durante o curso de SELEX para aumentar a pressão selectiva para sequências com ligação de elevada afinidade. A quantidade de ADN em cada selecção foi mantida pelo menos cinco vezes mais elevada que a quantidade de proteína para assegurar competição por sequências de ADN de ligação de elevada afinidade. 60 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ Ο progresso de SELEX foi monitorizado através de análise da ligação ao filtro de nitrocelulose dos bancos enriquecidos. Os bancos enriquecidos que mostraram a ligação de afinidade mais elevada foram amplificados por PCR com o Conjunto de Iniciadores II para incorporar os locais de restrição BamHl e EcoRI nos terminais do ADN dúplex resultante. Este ADN foi purificado em gel e digerido com BamB.1 e EcoRI e clonado no vector plasmídico pUCl8 previamente digerido com as mesmas enzimas utilizando técnicas padrão. (Sambrook et al. (1989) em Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2a ed., Parte 3, pC.l, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Os clones foram isolados e sequenciados através da técnica de sequenciação didesoxi padrão (estojo Sequenase de U.S. Biochemical, Cleveland, OH). SELEX de Elevada Temperatura. A selecção de afinidade a elevada temperatura na polimerase Taq foi efectuada num tampão de ligação consistindo em Tricina-KOH 50 mM (pH 8,0), KOAc 50 mM (pH 7,5), Mg(OAc)2 2,5 mM e glicerol a 10% a 55°C (tampão Tricina). A biblioteca de partida desta selecção foi a biblioteca de ADNcs do 12° ciclo derivada da selecção de afinidade efectuada à temperatura ambiente no tampão de ligação consistindo em Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KC1 50 mm e MgCl2 2,5 mM (Tabela 3 (Dang e Jayasena, J. Mol. Biol. 264: 268, 1996). As letras maiúsculas indicam a região aleatória de 30 nucleótidos (nt) que é flanqueada pelas sequências fixas 5'-TTCTCGGTTGGTTCTCTGGCGGAGC- e -TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3'. As regiões sublinhadas nas sequências da Família I são complementares para emparelhamento de bases). A última biblioteca foi enriquecida a partir de uma biblioteca de ADNcs de sequência aleatória sintética utilizando a sequência 5'-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-[N] 30-TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3' (SEQ ID NO:1; Tabela 1). A selecção de afinidade de elevada temperatura foi iniciada com 5 nmol da biblioteca de ADNcs do 12° ciclo suspensa no tampão de ligação Tricina. Esta suspensão foi aquecida a 95°C durante 3 minutos, arrefecida em gelo durante 5 minutos e trazida até 55°C. Foram adicionados à suspensão de ADN 2 nmol de ARNt (utilizado como competidor), 0,01% (p/v; concentração final) de hSA (albumina do soro humano) e 61 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ polimerase Taq (125 ηΜ) e incubou-se durante 15 minutos a 55°C. O ADN ligado à polimerase foi recuperado através de uma filtração rápida através de um filtro de nitrocelulose previamente humedecido (0,45 pm; Millipore) sob sucção. O filtro foi imediatamente lavado com volumes de 20 ml de tampão de ligação, seguido de um volume igual de ureia 0,5 M no tampão de ligação. Ambos os tampões de lavagem foram previamente aquecidos a 60°C antes da utilização. O ADN retido no filtro foi eluído e isolado através de precipitação em etanol na presença de 5 pg de ARNt utilizado como transportador. O ADN isolado foi amplificado por PCR utilizando o Conjunto de Iniciadores I (Tabela 1) tal como descrito acima.

Para assegurar o enriquecimento de sequências de ADN de ligação de elevada afinidade a pol Taq, a pressão selectiva foi gradualmente aumentada durante o curso da selecção. Isto foi alcançado através de diminuição gradual na quantidade de polimerase Taq e ADN utilizados em cada ciclo, bem como, lavagem rigorosa do ADN retido no filtro. A afinidade de bibliotecas de enriquecimento foi monitorizada através da ligação ao filtro de nitrocelulose (descrita abaixo). Não foi observada uma melhoria significativa da afinidade após oito ciclos de selecção. A biblioteca do 8o ciclo foi amplificada por PCR com o Conjunto de Iniciadores II (Tabela 1) tal como descrito acima. A complexidade da biblioteca enriquecida foi analisada através de sequenciação das inserções de ADN dos transformantes através da técnica de sequenciação didesoxi (estojo Sequenase de USB). A selecção de afinidade na polimerase TZ05 foi efectuada a 55°C num tampão de ligação consistindo em Tricina-KOH 50 mM, KOAc 125 mM, Mn(OAc)2 2,5 mM e glicerol a 8% (tampão de pol TZ05). O tampão de ligação foi preparado através da mistura das soluções de reserva de Tricina-KOH 1 M (pH 8,0), KOAc 3 M (pH 7,5), Mn(OAc)2 25 mM e glicerol a 80%. Foram efectuadas duas selecções de afinidade sob condições idênticas, partindo de bibliotecas de ADNcs diferentes. Foi iniciada uma selecção com 5 nmol da biblioteca de ADNcs de sequência aleatória sintética; 5'-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-[N] 30-TCTTGTGTATGATTCGC TTTTCCC-3' (SEQ ID NO:1; Tabela 1). A biblioteca de partida para a outra selecção foi a biblioteca de ADNcs do 12° ciclo 62 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ derivada de uma selecção de afinidade efectuada na polimerase Taq à temperatura ambiente (Tabela 3).

As bibliotecas de adncs suspensas no tampão de ligação foram aquecidas a 95°C durante 3 minutos, arrefecidas em gelo durante 5 minutos e depois trazidas até 55°C. Foram

adicionadas à suspensão de ADN 2 nanomoles de ARNt (utilizado como competidor), 0,01% (p/v; concentração final) de hSA (albumina do soro humano) e polimerase TZ05 (125 nM) e incubou-se durante 15 minutos a 55°C. O ADN ligado à polimerase foi recuperado através de uma filtração rápida através de um filtro de nitrocelulose previamente humedecido (0,45 pm; Millipore) sob sucção. O filtro foi imediatamente lavado com 20 ml de tampão de ligação e 20 ml de ureia 0,5 M no tampão de ligação. Ambos os tampões de lavagem foram previamente aquecidos a 60°C antes da utilização. O ADN retido no filtro foi eluido e isolado através de precipitação em etanol na presença de 5 pg de ARNt utilizado como transportador. O ADN isolado foi amplificado por PCR utilizando o Conjunto de Iniciadores I (Tabela 1) tal como descrito acima. Foi utilizada amplificação por PCR padrão para a selecção iniciada com a biblioteca completamente aleatória, enquanto que foram utilizadas condições de PCR mutagénicas para a selecção iniciada com a biblioteca pré-seleccionada em pol Taq. A PCR mutagénica, com que se pretendia aumentar a diversidade de nucleótidos nos produtos de PCR resultantes, foi realizada como se segue. O ADN recuperado foi primeiro amplificado por PCR num volume de 100 pL contendo KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MnCl2 1,1 mM, MgCl2 7 mM, dCTP 1 mM, dTTP 1 mM, dGTP 0,2 mM, ATP 0,2 mM e 1 U de polimerase Taq com parâmetros de ciclos de 50 segundos a 94°C, 45 segundos a 45°C e 45 segundos a 72°C durante 5 ciclos. Treze pl da PCR de cima foram utilizados como molde para uma nova PCR de 100 pl realizada durante 5 ciclos sob as mesmas condições tal como descrito acima. O último passo foi repetido mais três vezes. Foram utilizados 13 pl da quarta PCR mutagénica como molde para uma PCR de 500 pl para gerar o banco de ADNcs a utilizar na selecção seguinte. A cadeia não biotinilada dos produtos de PCR dúplex resultantes separados num gel de poliacrilamida 63 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ desnaturante foi isolada e utilizada para o ciclo de selecção seguinte.

Para assegurar o enriquecimento de sequências de adn de ligação de elevada afinidade a pol TZ05, a pressão selectiva foi gradualmente aumentada durante o curso da selecção. Isto foi alcançado através de diminuição gradual na quantidade de polimerase TZ05 e ADN utilizados em cada ciclo, bem como, lavagem rigorosa dos filtros. 0 enriquecimento da afinidade foi monitorizado através da medição das constantes de dissociação em equilíbrio das bibliotecas de enriquecimento. A biblioteca enriquecida foi então amplificada por PCR utilizando o Conjunto de Iniciadores II (Tabela 1) tal como descrito acima. A complexidade da biblioteca enriquecida foi analisada através de sequenciação das inserções de ADN dos transformantes através da técnica de sequenciação didesoxi (estojo de Sequenase de USB). C. Ensaio de Ligação a Filtro de Nitrocelulose

Temperatura Ambiente. Para avaliar a afinidade das bibliotecas oligonucleotidicas e de cada ligando, foi utilizada a técnica de ligação a filtro de nitrocelulose. Resumidamente, bancos de ADNcs com P purificados em gel marcados na extremidade 5' foram suspensos no tampão de ligação, aquecidos a 80°C, arrefecidos em gelo e depois trazidos para a temperatura ambiente. O DNA (5-10 pM) foi então incubado durante 15 minutos à temperatura ambiente com quantidades variáveis da polimerase alvo em 50 μΐ do tampão de ligação apropriado contendo 0,1 pg de ARNt e hSA a 0,01%. As concentrações de ADN foram mantidas inferiores a 100 pM para assegurar o equilíbrio na presença de concentrações de proteína em excesso. Após 15 minutos as misturas reaccionais de ligação foram passadas através de filtros de matriz mista de nitrocelulose/acetato de celulose previamente humedecidos (tamanho do poro de 0,45 pm, Millipore Corporation, Bedford, MA) e os filtros foram imediatamente lavados com 5 mL de tampão de ligação. A quantidade de ADN ligada aos filtros foi quantificada através da medição da radioactividade dos filtros através de contagem de cintilações líquidas. A quantidade de ADN ligada aos filtros na ausência de proteína foi utilizada 64 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ para correcção do fundo. A percentagem de ADN de entrada retido em cada filtro foi representada contra o correspondente logaritmo da concentração de polimerase (Figuras 1 e 2). 0 método dos minimos quadrados não linear foi utilizado para obter as constantes de dissociação (Kd) dos ligandos de ADN à polimerase Taq e Tth, respectivamente. (Schneider et al., Biochemistry 34: 9599, 1995; Jellinek et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 90: 11227-11231, 1993). O banco de sequências aleatórias não seleccionadas liga-se à polimerase Tth com uma Kd estimada de aproximadamente 70 nM (Figura 1B, (·)), enquanto a Kd deste banco que se liga à polimerase Taq é de aproximadamente 50-100 nM (Figura IA, (o)). Após 12 ciclos de selecção, a Kd da ligação à polimerase Taq foi de 3,5 nM (Figura IA, (o)). Ciclos adicionais de selecção não resultaram em mais melhoria da afinidade. Assim, a afinidade resultante do banco enriquecido para a polimerase Taq foi significativamente melhorada em comparação com o banco aleatório não seleccionado. Resultados semelhantes foram obtidos com a polimerase Tth onde o banco do 10° ciclo mostrou uma Kd de 5 nM (Figura 1B, (o)). O banco de ADNcs seleccionado para polimerase Taq mostrou uma ligação muito forte à polimerase Tth com uma Kd de 0,2 nM (Figura 2A, (o) ) . Este resultado não é surpreendente, uma vez que a identidade da sequência de aminoácidos entre as duas polimerases é de aproximadamente 87% (Asakura et al., J. Ferment. Bloeng. 76: 265-269, 1993). O banco seleccionado para a polimerase Tth ligou-se à polimerase Taq de um modo diferente, com a saturação de ligação em torno do nivel de 50% (Figura 2B, (o)), sugerindo que cerca de metade das sequências no banco não está a interagir com a polimerase Taq. Com base numa saturação de 50% a Kd estimada é de 0,3 nM.

As sequências de ADNcs obtidas a partir de 10 ciclos de selecção efectuados com polimerase Tth são expostas na Tabela 2. Vinte e nove clones individuais foram sequenciados a partir da selecção na polimerase Tth (apenas a região variável de 30 nt é mostrada na Tabela 2). As sequências foram agrupadas em duas familias com base na semelhança das sequências. As sequências de ADNcs obtidas a partir de 12 ciclos de selecção efectuados com polimerase Taq são 65 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ expostas na Tabela 3. Foram isoladas trinta e três sequências únicas. As letras minúsculas nalgumas das sequências representam a sequência fixa a 5' e as letras maiúsculas representam a região aleatória de 30 nucleótidos. As sequências foram agrupadas em três famílias com base na semelhança das sequências.

Temperatura Elevada. As afinidades de ligação dos aptâmeros à polimerase Taq e TZ05 foram medidas através da técnica de ligação a filtro de nitrocelulose a 55°C. Resumidamente, foi incubado um aptâmero marcado na extremidade em 50 μΐ de tampão de ligação a 55°C durante 15 minutos com concentrações variáveis de polimerase Taq ou TZ05, respectivamente. As misturas aptâmero-polimerase foram passadas através de filtros de nitrocelulose (0,45 pm) previamente humedecidos com o tampão de ligação previamente aquecido a 55 °C. Os filtros foram imediatamente lavados com 5 ml do mesmo tampão aquecido a 55°C. Foram utilizados dois tampões para cada polimerase: tampão Tris consistindo em KC1 50 mM, MgCl2 2,5 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a 22°C), 2 ng/μΐ de ARNt e hSA a 0,01%; e tampão de Taq consistindo em Tricina-KOH 50 mM (pH 8,3), KOAc 50 mM (pH 7,5), Mg(OAc)2 2,5 mM, glicerol a 10%, 2 ng/μΐ de ARNt e hSA a 0,01% ou tampão de TZ05 consistindo em Tricina-KOH 50 mM, KOAc 125 mM, Mn(OAc)2 2,5 mM, glicerol a 8%, 2 ng/μΐ de ARNt e hSA a 0,01%. As constantes de dissociação em equilíbrio (valores de Kd) foram calculadas através da utilização do método dos mínimos quadrados não linear.

As sequências de ADNcs e a sua frequência de ocorrência obtida após 8 ciclos de selecção efectuada com polimerase Taq a 55°C são expostas na Tabela 4. As sequências individuais são expostas na Tabela 5. Apenas a região aleatória de 30 nt é mostrada para cada sequência. Nos aptâmeros inteiros a região aleatória é flanqueada pelas sequências fixas expostas na Tabela 1 (SEQ ID NO:l). Tal como se pode observar na Tabela 4, a complexidade da biblioteca de partida foi significativamente reduzida; e surpreendentemente, apenas se verificaram seis sequências. Os dados na Tabela 4 foram derivados da análise de 63 sequências individuais legíveis. Os aptâmeros foram agrupados em duas famílias com base na semelhança das suas sequências. Os aptâmeros da Família I são intimamente 66 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ aparentados com as sequências da Família II da biblioteca de partida (compare-se as Tabelas 3 e 4); estas duas famílias possuem motivos da sequência de consenso semelhantes tal como mostrado dentro de caixas em cada tabela. Todas as sequências da Família I presentes na biblioteca de partida (Tabela 3) desapareceram completamente após a selecção a elevada temperatura, indicando que a sua interacção com a polimerase Taq era altamente sensível à temperatura. A única sequência agrupada como da Família II na biblioteca final representa aproximadamente 10% das sequências analisadas. Esta sequência é bastante diferente das sequências da Família I e não tem o motivo de consenso. A comparação das complexidades das sequências das bibliotecas de partida e final indica que certas sequências da biblioteca de partida não sobrevivem às novas condições de selecção e certas outras sequências que adaptam alterações de nucleótidos suportaram as novas condições.

Durante o curso das duas selecções efectuadas utilizando a polimerase TZ05, as bibliotecas de enriquecimento foram testadas quanto à sua capacidade tanto para se ligarem como para inibirem a polimerase TZ05. A selecção iniciada com a biblioteca de sequências aleatórias mostrou uma melhoria significativa da afinidade e da capacidade para inibir a polimerase TZ05 após catorze ciclos de selecção. Em comparação com esta selecção, a biblioteca enriquecida da selecção obtida através de PCR mutagénica mostrou uma melhoria ainda maior na capacidade para inibir a polimerase TZ05 após apenas 4 ciclos de selecção. As sequências de ADNcs obtidas após 4 ciclos de selecção seguidos de PCR sob condições mutagénicas a 55°C são expostas na Tabela 5. A região aleatória de 30 nt na tabela é flanqueada pelas sequências fixas expostas na Tabela 1 (SEQ ID NO:1). O número dentro de parênteses indica o número de vezes que a sequência foi identificada.

As sequências foram agrupadas em três famílias com base na semelhança das sequências. Uma inspecção cuidada revela que estas sequências caiem em duas amplas categorias; sequências que são ricas em guanina (Famílias I-II) e sequências que são pobres em guanina (Família III) . A distribuição da guanina em 67 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ sequências ricas em guanina é tal que podem ser dobradas em estruturas intramoleculares G quaternárias. Interessantemente, estas sequências ricas em guanina não estavam presentes (muito provavelmente não foram detectadas através de clonagem devido à sua baixa abundância) na biblioteca de partida cuja complexidade é mostrada na Tabela 3. As sequências na Familia III não são ricas em guanina, mas possuem o motivo de consenso CGTTTTG próximo da extremidade 3' da região aleatória. Um motivo de consenso semelhante foi identificado nas sequências da Familia II na biblioteca de partida (Tabela 3), sugerindo que estas duas famílias são aparentadas e derivadas uma da outra. As sequências da Família I presentes na biblioteca de partida desapareceram após selecção de elevada temperatura em polimerase TZ05. Um resultado semelhante foi observado quando a mesma biblioteca foi sujeita a selecção de afinidade de elevada temperatura em polimerase Taq, sugerindo que a interacção dos aptâmeros da Família I verificados na biblioteca de partida com as duas polimerases era sensível à temperatura, e não sobrevivia a selecções a elevada temperatura. Treze outras sequências sem semelhanças de sequência entre elas ou com as mostradas na Tabela 5 foram também identificadas e classificadas como sequências órfãs (dados não mostrados).

Exemplo 2. Ensaios de Inibição da Polimerase

Os ensaios de inibição da polimerase foram efectuados utilizando O ADN molde (DNA-HP; 5'-ATGCCTAAGTTTCGAACGCGGCTAGCC AGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGT-3' (SEQ ID NO:6)), marcado na extremidade 5' com polinucleótido-quinase de T4 e 32Ρ-γ-ΑΤΡ e purificado através de electroforese em gel sob condições desnaturantes (Figura 6). Num procedimento experimental representativo, foram misturados 0,25 pmol de polimerase Taq (5 U) ou 0,125 pmol (2,5 U) de polimerase Tth com 5 pmol (250 nM) do banco enriquecido, banco aleatório ou um ligando de ADN específico no tampão de PCR padrão (20 μΐ). Cinco pmol (250 nM) do DNA-HP molde marcado foram adicionados e a mistura foi incubada a diferentes temperaturas durante um dado período de tempo. A reacção foi parada através da adição de EDTA a uma concentração final de 125 mM (5 μΐ de EDTA 0,5 M) . O ADN foi resolvido num gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes. Os géis foram visualizados através de autorradiografia e a percentagem de ADN ligado foi 68 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ quantificada através de phosphorimâger. As variações neste procedimento geral para reacções especificas são observadas no fascículo. A ordem em que os inibidores oligonucleotídicos são adicionados à mistura reaccional é irrelevante, desde que o molde seja adicionado por último. Os oligonucleótidos requerem iões Mg++, um componente essencial da PCR, para funcionar e parecem tolerar muitos sistemas tampão. A Figura 7 ilustra os resultados dos ensaios da actividade da polimerase utilizando os bancos enriquecidos de ADN. As Figuras 8-10 ilustram os resultados dos ensaios da actividade da polimerase utilizando os ligandos TQ30 (SEQ ID NO:50) e TQ21 (SEQ ID NO:59).

Medição dos Valores de CI50. Os valores de ΟΙ50 (a concentração de inibidor necessária para produzir 50% do produto no ensaio) foram obtidos utilizando ensaios de extensão de gancho. Num ensaio de inibição típico, uma reacção de 20 μΐ continha 0,25 (0, 04) pmol de polimerase Tâq (5 U) (1 U), 0,125 pmol de polimerase Tth (2,5 U) ou 0,05 pmol de polimerase TZ05 (1 U), inibidor oligonucleotídico (a concentrações variáveis), dNTPs 0,2 M em tampão Tris ou Tricina (pol Taq e Tth) ou tampão TZ05 (pol TZ05) . O substrato de ADN em gancho marcado na extremidade 5', purificado em gel (DNA-HP; 5'-ATGCCTAAGTTTCGAACGCGGCTAGCCAGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGT-3' (SEQ ID NO:6)) foi então adicionado até uma concentração final de 250 nM e as reacções foram incubadas durante um dado tempo à temperatura desejada tal como indicado na legenda da figura (30 minutos para pol TZ05) . A reacção foi parada através da adição de 5 μΐ de EDTA 0,5 M (pH 8,0) seguida de tampão de carga em gel de formamida. Os produtos de extensão foram resolvidos em géis de poliacrilamida a 10% sob condições desnaturantes e quantificados através de phosphorimâger. A quantidade de produtos formada na presença de inibidor foi normalizada para o produto formado na ausência de um inibidor para obter a percentagem de produto.

Medições dos Valores de TI50

Reacções de extensão de gancho foram iguais às descritas acima, excepto que a concentração do inibidor foi de 250 nM e 69 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ as reacções da polimerase TZ05 foram corridas a 37°C. O tempo de incubação a cada temperatura foi de 1 hora para a pol Taq e Tth e de 30 minutos para a pol TZ05. A quantidade de produto foi quantificada através de phosphorimager e normalizada para o produto formado na ausência de um inibidor à mesma temperatura para obter a percentagem de produto.

Determinação da Actividade do Substrato do Ligando TQ30 e do Ligando TQ21

Num procedimento experimental representativo os ligandos TQ30 (SEQ ID NO:50), TQ21 (SEQ ID NO:59) ou TQ21 (rematado a 3' com um ligante de etilenoglicol) (aproximadamente 3 pmol) marcados na extremidade 5' foram incubados em 20 μΐ do tampão de ligação e 1 mM de cada um dos dNTP na ausência e presença de 5 U de polimerase Taq ou 2,5 U de polimerase Tth durante 16 horas à temperatura ambiente. A cobertura da extremidade 3' de TQ21 foi conseguida com um ligante de etilenoglicol (suporte do 3'-Spacer de Glen Research) utilizando condições padrão conhecidas na arte.

Ensaios de Captura por Afinidade

As reacções de captura por afinidade foram efectuadas a 70°C durante 5 minutos num volume reaccional de 100 μΐ que continha: heparina 75 μΜ, MgCl2 12,5 mM, cada um dos dNTP 1 mM, KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), 5 U de polimerase Taq ou 2,5 U de polimerase Tth e molde de ensaio em gancho (DNA-HP) marcado na extremidade 5' 250 nM. Após 5 minutos a mistura reaccional foi diluída três vezes e arrefecida a 4°C. Após a síntese do ciclo 1, 15 μΐ de contas (contas de afinidade ou contas de controlo, preparadas tal como descrito acima) foram adicionadas à mistura reaccional a 4°C e suavemente misturadas durante 10 minutos. Os sobrenadantes contendo o molde marcado foram recuperados após centrifugação e guardados para análise em gel. As contas foram então lavadas cinco vezes com 100 μΐ de um tampão consistindo em heparina 75 μΜ, MgCl2 12,5 mM, KC1 50 mM e Tris-HCl 10 mM (pH 8,3). Após a síntese do ciclo 2, as contas lavadas foram misturadas com uma alíquota fresca da mistura reaccional contendo todos os reagentes excepto a polimerase. Após incubação a 70°C 70 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ durante 5 minutos, a mistura reaccional foi recuperada e analisada através de electroforese de gel.

Exemplo 3. Ensaio de Inibição da Exonuclease

Os ensaios de inibição da exonuclease foram efectuados utilizando o molde desenhado, 5'-TTCGAGCGTGAATCTGAATTCGCGGCTAG CCAGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGGTGGGAAACTGAGGTAGGTGTTTTCACCTACCTCAGTTT CCCACC-3' (Exo-sub) (SEQ ID NO:75), radiomarcado na extremidade 5' (utilizando [γ32Ρ]-ΑΤΡ e polinucleótido-quinase de T4) e na extremidade 3' utilizando ([a32P]-ddATP e desoxiterminaltransferase). Num procedimento experimental representativo para pol Taq e Tth, 5 U de polimerase Taq ou 2,5 U de polimerase Tth, respectivamente, foram misturados com 250 nM de ligando TQ30 ou ligando TQ21 no tampão de PCR padrão (20 μΐ), seguido da adição do Exo-Sub duplamente marcado (250 nM, adicionados por último). Após incubação durante 16 horas à temperatura ambiente, as reacções foram extintas através da adição de EDTA a uma concentração final de 0,1 mM. Os produtos de clivagem foram resolvidos em gel de poliacrilamida a 8% corrido sob condições desnaturantes.

Num procedimento experimental representativo para TZ05, foi misturada 1 U de polimerase TZ05 com o ligando no tampão TZ05 (Tricina-KOH 50 mM, KOAc 125 mM, Mn(OAc)2 2,5 mM, glicerol a 8%; 20 μΐ), seguido da adição do Exo-Sub duplamente marcado (250 nM, adicionado por último). Após incubação durante 20 minutos a 45°C, as reacções foram extintas através da adição de EDTA a uma concentração final de 0,1 mM. Os produtos de clivagem foram resolvidos em géis de poliacrilamida a 8% corridos sob condições desnaturantes.

Exemplo 4. Ensaios de Inibição da Polimerase A inibição através de TQ21 (SEQ ID NO:59) e TQ30 (SEQ ID NO:50) foi testada em (A) ADN-polimerases termófilas, (B) ADNP mesófilas (polimerase Taq como controlo), e transcriptases inversas, e (C) transcriptases inversas (RTs). Todas as reacções foram realizadas num volume de 20 μΐ com o molde de gancho HP (Exemplo 2) na presença de 1 mM de cada um dos dNTP, utilizando 250 ou 500 nM de ligando TQ21 ou TQ30. As condições 71 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ de reacção específicas para cada polimerase foram como se segue:

Polimerases Termoestáveis: polimerase Tma: polimerase UITma (6 U), Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, KC1 10 mM, MgCl2 2,5 mM e Tween 20 a 0,002% (v/v); polimerase Tbr (2 U), Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM e Triton X-100 a 0,01%; polimerase Tli (3 U) e polimerase Tfl (5 U), Tris-HCl 10 mM; pH 9,0, KC1 50 mM e Triton X-100 a 0,1%.

Polimerases Mesófilas: Todas as incubações incluindo polimerase Taq (5 U) (um controlo interno para o tampão) foram efectuadas num tampão consistindo em Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, KC1 40 mM, MgCl2 5 mM e DTT 7,5 mM (fragmento de Klenow (5 U); ADN-polimerase de T4 (4 U); ADN-polimerase de T7 (7 U)).

Transcriptases Inversas. Todas as incubações foram efectuadas num tampão consistindo em Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, NaCl 6 0 mM, Mg(OAc)2 6 mM e dtt 10 mM. (RT de Hiv-1 (0,56 pmol); AMV RT (IU); RT de M-MLV (10 U) ; Superscript II (Ssript II) (10 U).

Exemplo 5. Detecção de Alvo de Baixo Número de Cópias

As amplificações por PCR foram efectuadas utilizando um sistema que amplifica um produto específico do alvo de 203 pb da ltr de hiv-2 tal como descrito por Respess et al. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy 94: 110, 1994 sem condições de "início quente". Todas as amplificações por PCR foram realizadas na presença de 1,3 pg do ADN de placenta humana, cada dNTP 0,4 mM, 25 pmol de cada iniciador, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 2,5 mM, glicerol a 10%, 0,2 pmol de polimerase Taq (5 U) e o molde (número de cópias aproximado tal como indicado nas

Figuras 10A-10C) em 100 μΐ de volume reaccional. Os ciclos térmicos foram efectuados num termociclador TC9600 (PE Applied Biosystems) a 50°C durante 2 minutos seguidos de 94°C durante 30 s; 60°C durante 30 segundos; 72°C durante 30 segundos e depois auto-prolongados a 60°C ligando em aumentos de 1°C durante 5 ciclos. A isto seguiu-se uma amplificação de 35 ciclos a 90°C durante 30 segundos; 65°C durante 30 segundos; 72°C durante 30 segundos. 72 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Alternativamente, as amplificações por PCR desenhadas para detectar a repetição terminal longa (LTR) de HIV-2 foram realizadas na presença de 1 pg de adn de placenta humana (Respess et al. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy 94: 110, 1994) sem condições de "inicio quente" ("hot start"). A PCR continha Tricina-KOH 15 mM (pH 8,0), KOAc 48 mM (pH 7,5), Mg(OAc)2 3,5 mM, glicerol a 10%, dNTP 0,4 mM e 0,2 pmol (5 U) de polimerase Taq num volume de 100 μΐ. Os ligandos foram utilizados a uma concentração de 50 nM e estiveram presentes na mistura reaccional antes do molde ser adicionado. O molde continha zero ou aproximadamente 10 cópias de ADN molde de HIV-2 misturadas com 1 pg de ADN de placenta humana num volume de 50 pl. Os ciclos térmicos foram efectuados num termociclador TC9600 (PE Applied Biosystems) a 50°C durante 2 minutos, 94°C durante 30 segundos; 60°C durante 30 segundos(com auto-extensão a l°C/ciclo durante cinco ciclos); 72°C durante 30 segundos seguido de 35 ciclos de 90°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos e 72°C durante 30 segundos. No final, as reacções foram incubadas a 72°C durante 10 minutos. Foram analisados vinte microlitros de PCR em electroforese em géis de poliacrilamida a 8% sob condições nativas. Os géis foram visualizados através de coloração com brometo de etídio.

O desempenho dos aptâmeros seleccionados em pol TZ05 foi avaliado num sistema de PCR desenhado para amplificar o gene K-ras humano a partir de ADN genómico humano (Nilsson et al., 1997) sem condições de "inicio quente". A amplificação por PCR foi realizada utilizando os iniciadores 5'-TGAAAATGACTGAATATAA ACTT-3' e 5'-GATCATATTCGTCCACAAAATGA-3'. Todas as PCR foram realizadas num volume reaccional de 30 pl em GeneAmp PCR System 9600 (Perkin-Elmer). A PCR continha Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KC1 50 mM, MgCl2 2,5 mM, cada iniciador 1 pM, cada um dos dNTP 200 pM ou Tricina-KOH 50 mM, KOAc 125 mM, Mn(OAc)2 2,5 mM, glicerol a 8%, cada iniciador 1 pM e cada um dos dNTP 200 pM. Os aptâmeros estiveram presentes em reacções contendo o tampão e 2,5 U de polimerase TZ05, antes de serem adicionados 25 ng de ADN de placenta humana como molde. Após 2 minutos de desnaturação a 94°C, foram efectuados 34 ciclos de amplificação a 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, 75°C durante 45 s. Isto foi seguido de uma única incubação a 72°C 73 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ durante 5 minutos. Os produtos amplificados foram analisados correndo 5 μΐ de PCR em géis de agarose a 3% (NuSieve GTG; FMC BioProducts) em tampão TBE. Os géis foram visualizados sob luz UV após coloração com brometo de etidio. A PCR de "inicio quente" foi efectuada através da utilização de contas "AmpliWax" (de Perkin Elmer) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as outras amplificações por PCR foram realizadas sem condições de "inicio quente". A PCR "NeXstart" foi efectuada utilizando os ligandos TQ30 e TQ21 (concentração final 50 nM) como inibidores. Foi efectuada uma amplificação na presença de um oligonucleótido não especifico (concentração final 50 nM) para fins de comparação.

Tabela 1

Início da Sequência Aleatória de ADNcs: 5 ' -TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC- [N] 30-TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCO3 ' (SEQ ID NO:1)

Conjunto I de Iniciadores de PCR SELEX: 51-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3' (SEQ ID NO:2) 5'-BBBTAGGGAAAAGCGAATCATACACAAGA-3' (SEQ ID NO:3) (B represents Biotin)

Conjunto II de Iniciadores de PCR SELEX: 5'-GGCGAATTCTTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3'

EcoRI (SEQ ID NO:4) 5'-CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAGCGAATCATACACAAGA-3' BamHI (SEQ ID NO:5) 74 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Tabela 2

SEQ ID CLONE NO: N. 2 SEQUÊNCIA (5'^. 3') Família I 7 2: TATCGTTTACTCATT GTTTTG TGTGT 8 34: ACATTACCCGAGACATTCCTGAC GTTTTG 9 21: TGCTGCTCCTTGTTC GTTTTG TCT 10 18: AGCTTTTGGGGACATTCTAAC GTTTTG TCA 11 19: AGATGCTTCA GTTTTC TCTCCGTG 12 16: T CTTTTG GACTGAAGGTTTGTTGGT 13 12: ATGGTC TTTTTG TTGTTTGTTTG 14 9: GTGA CTTTTT ACTTGTCCTAGGCTG 15 15: CATCTAT GTCTTC TTTATATTTGG 1 6 14 : ACTACCTGG TTGTGTR GTTTCCAT 17 25: ATCCATGAGACTAG GTTGGT TAGGGTGGTG 18 1: CCCTCATA GTTTAA CTTTACCTGGCTTATC 19 10 : AGTGAACACCTTCT GTTTCG TGAGTC 20 23: CGTGT GTCTTA GTTAGCTCGTGG 21 24 : TAACGTTGTGT GTTCTG TGCTA 22 26: AACAGATTTGGTCATAT TCCTTG G 23 27: TGTGTTAT GCTCCG GTAACAATGCCCTT 24 30: AATTGTA ATTTCG GTATCTCTG 25 7 -7 . kJ m gca ATTTCC TGTCCAATCATTGTAG 26 36: GCTTGAA GCTTTC ACCCATCCTA/GA 27 41: CTTCTCCTTTATAT GTCTTA CCA 28 42: TATCGAGTAGACCCTGTT GTTCGT G 29 44 : CGC GTCTAG CTAAGATTTCTACTGATGCAT 30 46: ATG ATTTTA TGTTTATCCTGTTT SEQ ID CLONE NO: N. 2 SEQUÊNCIA (5'^ 3') Família II 31 4 5: CAGTCGCTGTACGTGCTCTCCCTATGTAAC 32 6: CAATCGGTGTACAATATCTTCC 33 28: CGTTAGCTGGTTAGTTAGTACTAG 34 35: AGGTAAGCGATTATGGGGTTATCG 35 4 0: TAGTTACATGAACTAATCGTGGAG 75 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Tabela 3

SEQ ID CLONE NO: N • 0 SEQUÊNCIA (5' +3') Família I 36 12 (4) aacaaaac GATGTACAGTATC GCTATCGAAAGAGGCTG 37 15 aacaaaac AGTGTGCAGTAGT GTGATGTCAGAGTATCC 38 18 aacaaaac AGTGTGCGGTÂGT GTGATCTGAGAGTATCC 39 26 aacaaaac AGTGTGTAGTAGT GTTACGATGGGGACGG 40 40 aacaaaac AGTGTACAGTAGT GTTCCCGGTAGAGCTAT 41 27 aacaaaac AATGTGCAGTATT GATATCGCTGGTGGTCA 42 10 (2) aacaaaacA AGTGTACAGTAGT TGCCTACGCTAGTG 43 6 aacaaacrcA AGTGTGCAGTAGT TACTCATAAGAGACCA 44 34 aacaaaacA AGTGTACAGTAGT TGCCTACGCTAGTG 45 28 qqcqqaqcAC AATGTGAAGTATT GGGGTACGTCAGTAG 46 5 CAAGCGGAAAC AATGTACAGTATT GGGATC 47 33 ÃAGGCCATT GATGTACAGTATC AATGCTGC 48 29 AATTGGGAAAC AATGTGCAGTATG TGAAGG 49 44 AAATGGGAAAC AATGTGCAGTATT GGAAGG 50 30 (3) AAGACCAGAC AATGTACAGTATT GGCCTGA 76 3 TCAATACACAAATT GATGTACAGTGTC GAT Família II 51 42 TACGCTGACAGGCC ACGTTTTG TCATGAT 52 22 GAGAACTCCGTTCTTA GCGTATTG GAGTCC 53 2 AGGTGGGACATTCTTT GCGTTATG TCTCTGA 54 49 GGGCTCGGAACATTCTTA GCGTTTTG TTCC 55 50 ATAGGCAGGGGACATTGCA ACCTTTTG TCA 56 7 AATTGAAGTGACTTTCTCT GCGTTTAG TCG 57 3 9 AGGAAT CTGGGGCATTCTTT GCGTTTTG CG 58 41 CTCAGGATAAGGTCATTCTA ACGTTATG A 59 21 GATCATCTCAGAGCATTCTTA GCGTTTTG T 60 31 GATCATCTAAGAGCATTCTTA GCGTTTTG G 61 43 CAAAACGAGAGAGCTTTCTGT GCGTTTAG C 62 23 GACCAAGCGTCAAGATATTCAA ACGTTTTA 63 25 AGAAGCATACGAAGACATTCCA ACGTTTGG 64 9 (2) AATCGATTGTTGAACATTCTC- ACGTTTTG T 65 17 (2) AGAAGCATACGAAGACATTCCA ACGTTTTG 66 36 AGAAGCATACGAAGACATTCCA ACGTTTTG Família III 77 4 (2) CATTGGGCCAGAGGAACACAACCTCAACAG 76 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ nj -Η ϋ C <000 Uh0 73 ο\° η Η Η σι a « ΐη Ο Η Γ» ΓΊ Η fl η Η Η ιη σι (ΰ Η ΦΛΛ Μ

0 -ΗΟ α <0 σ0 CQ

ΡΊ LO 0 CS 0 CS CS CS Η Ε-< Η Ει Ei Ei Εη Η Ei Ei Ei Ei Eí Ei Ei Ei Ei Ei Ei Eí Ei Ei Ei Ei 0 υ cj CS 0 CS υ 4 4 CJ CJ CJ 4 ο CS CS CS cs ο ο 4 4 4 1 1 Ei υ ο CJ Ei Ei Ei υ ο CD υ U υ η Ei Ei Ei Ei Ei Ei Eí Ei Ei Ei Ei 4 4 «Ι 4 4 4 υ CJ υ cj CJ CJ Ο£00 Ο I-1 ο

4 4 rij Ei Ei Ei CS CS Λ CS 4 CS 4 4 Ã CJ CJ CS CS 4 CS 4 CS CJ CJ CS 4 CS υ 4 4 CJ 4 CJ 4 υ CJ fl! u 4 Ei 4 4 U CJ 4 CS O 4 f£ 4 cj 4 4 Ei rtj Ei Ei cj CJ 4 CD 4 4 Ei Ei 4 4 4 CS CS O CD GO KD oo r-t C\ H Ηυ CS Ei Ο 4 υο 4 υυ t* &οοο ί Ei 4 υclου n 5 ο <Λ ιΗ

Ctí Η ι—I . , Η—Η

w 2 C/5 Ζ Μ Ον Ο — Ρΐ ^ Γ- Γ^- 00 00 00 00 rr οο 77 EP 1 171 632/PT Tabela

O 0 00 KD cn O V v ϊ—1 KD CN CN o LO CN cn LO LO LO LO ^r1 LO LO H H cn co co o LO LO 2 a ϊ—1 ON +1 +1 c—1 i—1 I-1 o o +1 +1 +1 +1 +1 o 00 CN] +1 C-1 * LO O V V LO LO ϊ—1 Λ τ) 2 00 00 c—1 o 00 Λ 03 c—1 c—1 c—1 ϊ—1 13 cn

LO

< H O 2 <W 2 O H GO

O H H H H O O < < U O H H < O < O

O H H H H O < O O u o H H <3 υ

O υ < H C u H O o u <3 o

<1 o <3 o H

«3 O O o o H O H H H H O O O <3 O H υ H H <3 O <3 O o o <3 o «3 o O H <3

H O O H O <3 u O

O H H H H O «3 O O U O H H <3 U

<3 O υ «3 o <3 O < o H <3 O O U <3 O H H H H O U O < H U H H <3 O H O υ <3 o o < o <3 H rt3 Η H rt3 rt3 o o O H H H H H H H H H H H H o O O u U U o O O <3 <3 <3 H H H H H O o O H H H H H H «3 <3 <3 O o O H H H O <1 <i U <] <] <3 o o O <1 <1 o <] <] <3 o o o o o rt3 «3 «3 H o «3 «3 o O <3 <3

CD

LO \—I

os c—I Ο Cs] CN Cs] 00 Cs] KD cn

co \—I o 2 Q H o H co 00 LO Γ" 00 00 ao o ao T-1 ao r- ao ao cn ao ao

78 EP 1 171 632/PT

07 I V LO fti H O α <(U σ (D C0 O O u Eh 4 4 o o 4 4 υ υ ο ο ο ο ο 4 υ ο 4 4 ο ο ο ο ο ο Εη Εη Εη Εη Ο Ο υ υ ο ϋ ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο υ n Εη ο 4 υ ο 4 4 Ο Ο E· CJ Ο Ο U 4 © Εη Εη u C5 Ο Ο Ο Ο 4 4 Ο Ο rtuuou ΟΟΟϋϋ Ο Ο Ο Ο Ο oáooo ο 4 υ 4 4 υ 2 4 4 4 4 ο ο υ 4 ο ο ο υ ο ο ο ο ο ο Ο Ο Ο Ο Ο Εη Εη Εη CJ Ο Εη Ε< Ο Ο Ο Ο Ο Ο Εη Ε< U U U U U Ο Ο Ο Ο Ο ο Ο β ο ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο (5 00 00 Ο (5 Ο Ο (5 (30000 υ υ υ υ υ Εη Εη Εη υ υ CD 4 Ο 4 4 Εϋϋϋϋ 4 4 4 4 4 υ υ ο ο 4 4 ο ο cs ο ο ο υ υ υ υ ο ο ο ο ο υ υ υ ο ο ο ο Ο Ο Ο Ο Eh Ε< Εη H Ο Ο Ο Ο Ο 0 Ο Ο Ο Ο Ο Ο Εη Εη Εη Εη Ο Ο (9 Q U Ο 4 4 (9 0 0 0 Ο Ο Ο Ο Εη Εη Εη Εη Ο Ο Ο © Εη Εη Εη ΕΗ 0(300 Ο Ο (9 (9 Ο Ο (3 (3 4 4 4 4 Ο4οο υ υ ο ο ο ο ο ο υ υ 4 4

Tabela

O (D £ S=S £ (D C O Ν ιη Η η Ο Ό 4 ΟΟΟΟηΟΟ Εη Εη Ε< Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη |η Η Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο U 4 Ο Ο η U Ο η ^ ^ > η 3522324 ο ο υ ο ο υ Εη UOOOuOO Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Εη Ε< Εη Εη 44444^^ (JUUUoUO 4 4 4 4 << Ε Ο Ο Ο Ο ο Ο Ο 3333333 ο ο ο ο ο ο Ο 0400UO0 4044444 Εη 4 Εη Εη p Εη U 4044444 CJ 4 Ο U ο U Ε< Ο Ο Ο Ο ο 4 4 33333Í 0 0 4 0 0 Ο Ο 4 Μ η η ιη ο w <ν ΗΐΠΜίΐηΗΙΟ ιο ο 10 Μ ιο «η <η ιη «3 ο σι οο σι 05 m ιο i£> m Ο fd Η £ fd Õ 2 Q σω c/3 σ> ο η cm m ιη C0 <Λ (Λ Λ Oi à\ C* VD Γ** 00 <Λ Λ <Λ (Λ <Λ Ο Η CSI ΓΟ ** ΙΠ Φ ο ο ο ο Ο Ο Ο rH γ4 Η rH γΗ »Η γΗ 79 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Tabela 7 Número do Clone em Tampão Tris em Tampão Tricina 40 °C 55 °C 40 °C 55 °C 6 5 ± 0,6 8,5 ± 1,3 4,6 ± 1,4 36 ± 2,5 22 3,8 ± 0,6 14 ± 1,5 5,6 ± 0,7 18 ± 2 28 5 ± 1 13,5 ± 1,5 9,4 ± 1,5 116 ± 11

Tabela 8 Número do Clone Kd (pM) £ IT50 (°C)+ TZ 1 16 + 5 52,5 TZ 2 »1000 «35 TZ 3 9 ± 3 52 TZ 8 5 ± 3 52 TZ 9 5 ± 3 52 TZ 13 17 ± 3 58,5 TZ 26 »500 41 TZ 36 20 ± 4 51 TZ 54 23 + 4 52 TZ 69 20 ± 5 46

f: As interacções de ligação foram medidas a 55°C +: Medido com uma concentração de aptâmero de 250 nM

Tabela 9 2¾ (pM) em Tampão Tris em Tampão Tricina Comprimentos Truncados Comprimentos Truncados completos completos TQH 6 = 8,5 ± 1,3 38 ± 7 36 ± 2,5 128 ± 8 TQH 28 = 13,5 ± 1,5 43 ± 3 116 ± 11 93 ± 10 80ΕΡ 1 171 632/ΡΤ tf Εη - Ο 0 ro Εη Εη Η Ε-Ι I Εη Η Εη Εη υ Ε-* rd <ο 0 0 4-1 υ Ει σ> ÍJI 0 0 σ 0 Ε-ι Ρ Ρ 0 0 θ' 0 Ο rd rd 0 Ο υ Ε-> 0 Ρ Ρ 0 0 σ' Ε-ι 0 Cn σ 0 ο tn tf < Ρ Ρ 0 15 <d Ε-* Εη θ' σ> tf Εη θ' 0 Εη Ρ Ρ tf Εη U tf Ο Ρ Ρ Η tf 0 0 Εη υ ϋ 0 Η C tf Εη Ρ Ρ Η 0 Η η tf Εη Εη tf tf 0 ο υ 0 0 0 0 tf Ει 0 Εη Ε> tf tf Ει tf tf - Εη Εη Ο Εη 0 tf 0 η Εη Εη Η 15 Η Ο tf ι Εη Εη tf Η 0 tf 0 ο 0 0 Η tf tf CD £η 0 0 0 Η tf 0 tf 0 0 0 0 0 0 tf ο Εη Εη - tf >< tf 0 0 0 ο C 0 ΓΟ Εη / \ Εη 0 15 0 tf 0 0 1 Εη Εη 0 0 tf ο - Εη - Εη 0 0 ο 0 0 0 0 Η d tf η tf η 0 0 Εη 0 0 Εη 0 0 Η tf I 0 I Εη 0 Εη 0 0 Εη 0 0 0 Η υ υ 0 ο 0 0 - tf 0 0 tf 1 1 Η υ σ' u σ' υ Εη 0 ΓΟ 0 π 0 0 - • Εη ro υ (0 υ Εη 0 1 0 0 0 0 ΓΟ m tf <ω D σ θ' 4-1 σ' ρ tf 0 0 tf 0 0 tf 0 Ο σ> jj cn ρ Εη Εη 0 0 Εη Εη 0 0 Η 1) 4J U -U 0 Εη 0 tf Εη Εη tf 0 σ> 4J σ' 4-» tf tf 0 0 tf tf Ο Εη (d Η Φ Η σ’ υ θ' U 0 Η Εη Εη Η Εη Εη Εη W 4J θ' 4-) θ' tf 0 Εη 0 0 0 0 Εη υ u υ υ Εη tf tf Εη tf tf Εη Η 4J Ρ Ρ 4-» Ο 0 Εη tf 0 0 tf 0 Λ υ -Ρ υ 4-> Εη tf 0 0 tf tf · 0 Εη (0 4J (0 4-) π3 tf Εη tf Εη Εη Η Εη Ρ ΕΗ σ< σ> σ' σ' tf 0 0 tf 0 0 tf υ θ' 4-> cr 4J u Εη tf Ο £η Εη 0 Ρ Ρ Γ0 ρ m < tf Εη υ c tf υ 4-> U 4-1 -Ρ Ρ 0 tf 0 σ> tf tf σ> θ' σι tn σ' σ' tf 0 Εη (0 ο Ο rd Ρ σ> 4-ι σ> ρ 0 0 tf σ' 0 0 tn σ' υ θ' υ σ> 0 0 tf σ' 15 0 θ' Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ < 0 0 ϋ Ο 0 0 rd υ 4J ϋ 4J 0 0 0 θ' 0 0 σ Ρ Ρ 0 ρ α ο 0 0 σ' 0 0 σ' tn Ρ Ρ 1 Ρ Ρ 1 ο 1 Ο I ϋ 1 Ρ 1 ο 1 Ο ι Ρ ι ro ι ιη lO lD lD m ιη ιη ιη ιη ro οι ο ο ο ο ο Ρ s ΓΟ 1 ΓΟ ) ΓΟ 1 ι—1 ΓΟ ΓΟ Ον ω ι—1 <\j ΓΟ ΟΙ I Ω I Ω 1 Ω I 13 Ο ι—1 U υ U 1 υ 1 Ο 1 Ρ 1 Ο ο ΓΟ OJ C C C C ΓΟ CN ΓΟ μΐ α Ο Ρ U Μ ρ • • • U Η Εη Εη Εη Ω Ω Ω θ' * w ο 9 ο cn r* CO Ο Ρ <Ν ΓΟ ιη ιη ιο ID r- Γ*“ r* Γ*· 81 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ υο

LO •β Η Γ~ Γ- 00 r—\ η ΓΟ 3 Ο ο Ο 1β •Η +1 +1 VD ο <—1 Ν Ο <Ν ΓΟ πΐΗΦΛΦΕΗ

(Ο Η 'Φ73ββ Ο Φ CQ (0 Η3Ρΰ nΡwΗ

Ο< Ο< I ίΓ>

ο Ο Ο < < < ΗΟΰ Ε-Ό Ο Εη Ο Ο ϋοΕ-. ΟΟΕη ΟΟΕη Η —< Εη—< Εη—< <—Ε-ι <ξ—Εη < —Εη <—Ε-ι κί —Η <—Εη Ο—Ο 0—0 0—0 ο 0—0 0 — 0 ο 0—0 0 — 0 ο —υ 0—0 Ο —Ο < —Ε-ι <—Εη 0—0 0—0 0—0 0—0 < <— Ε-> ο —ο 1 0—0 1 1 _ Ο —Ο - η < —Εη 0—0 0—0 0—0 m ro < I m η 01 ζ ο ο ο (Ο — Ο — ΓΟ — ω 1 Μ 1 Μ 1 Μ 2 C Φ ιΗ αι C\J V ο ε ε • Β Ο 1 U 1 Ο 1 ο C Ο C η C Γ"- Μ (Ο Ui rn J-l CN Εηηη Εη Εη — 0 ·=Γ Γ- οο 2 Γ- \ο 82 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Φ to to TÍ μ 0 ,μ 1—1 (ti μ μ μ μ υ μ ι—ι μ -μ •μ μ υ μ to -μ μ to to 0 Φ rti Η X £ (ti μ υ μ 0 υ ι—ι μ υ I υ μ μ υ £ (ti tf 1 μ 0 to ο W UJ μ μ m Η 65. <φ μ tr da μ £ Φ 0 to to a μ μ μ μ -μ Τ> υ φ C 0 «D Τ3 Τί 3 Φ tj1 m φ φ m m > Μ Φ m C ο Φ Ο C

Φ TS Ο μ -μ Γ—ι μ m Ο Φ TS TS μ Φ rti -μ μ £ μ (ti Ο írd Ο rd & μ U iti μ tf φ υ Ά * § Φ ^ ^ φ TÍ Ο 'Φ φ a 6 g φ φ ρ 2-1

Φ TS g φ Ρ g G Ρ Ο !(β υ- d 3 ΰ Η Ρ α ου

C ο +1 00 φ 12 rd υ μ α υ 'φ -μ rd Τ3 κ Η πΐΗΦ Λ (0 Η Η π) Ή Μ -Π) Ό C ΰ Ό φ W (d H Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ η ω α

t<Ol5 UOh Ε-> —C <— Η —Ευ —ο U — υ υ —U 0—0 I I ιη co 0 -Ρ G Φ g Φ I—I φ ο (ti -μ 0 μ! (L) π3 X Η rd υ η φ μ rd tP ι—I Ρ > μ Η Η I Ο to Φ 10 Ê rd (Τ3 £ U Η ϋ) Μ-Ι Η £ Μ tJ1 rd Η a to e η ζο ΡΙυ ο ΓΟ — I 2η ΓΟ <υ ε ϋ I c «τ 2-1 <Μ Ε- — H to μ Ο ο ·Η Ifd > rd g Η | φ rd tP φ ·Η U Φ -Ρ -Ρ -Ρ μ to μ to rd Φ Ο < Λ > £ to 'φ > rd μ -μ τ—1 (ti 0 1—1 to tf 0 Τ5 £ φ μ Τ5 X! ω φ £ 0 μ £ μ μ μ -μ 0 μ Μμ μ U V to tf φ Τ3 Φ Τ5 Φ to 0 to ι—1 φ μ μ 1—ι 0 Φ 1—I Ό μ 0 > μ -μ to μ ο μ Β m Φ >0 , Ο· , to < μ to μ (ti μ -μ I—ι · υ μ χ ·μ ι £ to \ μ ο μ ο Η Η <Ν 00 «.οδ 83 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

Tabela 12 IT50 (°C) TC50 (@ 45°C) nM Comprimentos completos Truncados Comprimentos completos Truncados TQH 6 54,8 46 30 97 TQH 22 56,1 47 37 100 TQH 28 52 47 37 75 Tabela 13 Clone Kd (PM) Comprimentos completos Truncados (51- -nt) TZ 1 16 26 TZ 13 17 22 TZ 36 20 28

Tabela 14 _IT5o°C_

Clone Comprimentos completos Truncados TZ13 SymDl 20 ± 3 56 TZ13 SymD2 82 ± 10 448 TZ13 Tandem 18 ± 2 54 51 nt 30 nt TZ 1 52,5 52 48 TZ 13 58,5 51 42 TZ 36 51 47 <30 Tabela 15 Clone Kd (pM) o LO H 1—1 (°C) TZ13 monómero 30-nt 145 ± 10 43 84 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> NeXstar Pharmaceuticals, Inc. <120> Inibidores de Ligandos de Ácido Nucleico a ADN-Polimerases

<130> NEX 43C/PCT-CIP/PCT <140> <141> <150> 09/258,797 <151> 1999-03-01 <16 0 > 119 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <220> <221> base modificada <222> (25)..(54) <223> n nas posições 25-54 é qualquer base < 4 0 0 > 1 ttctcggttg gtctctggcg gagcnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnntcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 2 ttctcggttg gtctctggcg gagc 24

<210> 3 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 3 tagggaaaag cgaatcatac acaaga 26

<210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial 85 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 4 ggcgaattct tctcggttgg tctctggcgg age 33

<210> 5 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 5 cgcggatcct aatacgactc actataggga aaagcgaatc atacacaaga 50

<210> 6 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 6 atgcctaagt ttcgaacgcg gctagccagc ttttgctggc tagccgcgt 49 < 210 > 7 <211> 74

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 7 ttctcggttg gtctctggcg gagetategt ttactcattg ttttgtgtgt tcttgtgtat 60 gattegettt tccc 74

<210> 8 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 8 ttctcggttg gtctctggcg gagcacatta cccgagacat tcctgacgtt ttgtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 9 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 86 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 4 Ο Ο > 9 ttctcggttg gtctctggcg gagctgctgc tccttgttcg ttttgtcttc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

< 210 > 10 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 10 ttctcggttg gtctctggcg gagcagcttt tggggacatt ctaacgtttt gtcatcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 11 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 11 ttctcggttg gtctctggcg gagcagatgc ttcagttttc tctccgtgtc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

< 210 > 12 <211> 73 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 12 ttctcggttg gtctctggcg gagctctttt ggactgaagg tttgttggtt cttgtgtatg 60 attcgctttt ccc 73

<210> 13 <211> 71 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 13 ttctcggttg gtctctggcg gagcatggtc tttttgttgt ttgtttgtct tgtgtatgat 60 tcgcttttcc c 71

<210> 14 <211> 73 <212> ADN <213> Sequência Artificial 87 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 14 ttctcggttg gtctctggcg gagcgtgact ttttacttgt cctaggctgt cttgtgtatg 60 attcgctttt ccc 73

<210> 15 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 15 ttctcggttg gtctctggcg gagccatcta tgtcttcttt atatttggtc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

<210> 16 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 16 ttctcggttg gtctctggcg gagcactacc tggttgtgtg ctttccattc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

<210> 17 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 17 ttctcggttg gtctctggcg gagcatccat gagactaggt tggttagggt ggtgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 18 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 18 ttctcggttg gtctctggcg gagcccctcs tagtttaact ttacctggct tatctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78 88 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

<210 > 19 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 19 ttctcggttg gtctctggcg gagcagtgaa caccttctgt ttcgtgagtc tcttgtgtat 60 gattcgcttt tccc 74

<210> 20 <211> 71 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 20 ttctcggttg gtctctggcg gagccgtgtg tcttagttag ctcgtggtct tgtgtatgat 60 tcgcttttcc c 71

<210> 21 <211> 70 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 21 ttctcggttg gtctctggcg gagctaacgt tgtgtgttct gtgctacccc gcgcatgatt oc cgcttttccc 70

<210> 22 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 22 ttctcggttg gtctctggcg gagcaacaga tttggtcata ttccttggtc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

<210> 23 <211> 76 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 89 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 4 Ο Ο > 23 ttctcggttg gtctctggcg gagctgtgtt atgctccggt aacaatgccc tttcttgtgt 60 atgattcgct tttccc 76

<210> 24 <211> 70 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 24 ttctcggttg gtctctggcg gagcaattgt aatttcggta tctctgtctt gtgtatgatt 60 cgcttttccc 70

<210> 25 <211> 73 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 25 ttctcggttg gtctctggcg gagcgcaatt tcctgtccaa tcattgtagt cttgtgtatg 60 attcgctttt ccc 73

<210> 26 <211> 73 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 26 ttctcggttg gtctctggcg gagcgcttga agctttcacc catcctagat cttgtgtatg 60 attcgctttt ccc 73

<210> 27 <211> 71 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 27 ttctcggttg gtctctggcg gagccttctc ctttatatgt cttaccatct tgtgtatgat 60 tcgcttttcc c 71

<210> 28 <211> 73 <212> ADN <213> Sequência Artificial 90 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 28 ttctcggttg gtctctggcg gagctatcga gtagaccctg ttgttcgtgt cttgtgtatg 60 attcgctttt ccc 73

<210> 29 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 29 ttctcggttg gtctctggcg gagccgcgtc tagctaagat ttctactgat gcattcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 30 <211> 71 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 30 ttctcggttg gtctctggcg gagcatgatt ttatgtttat cctgttttct tgtgtatgat 60 tcgcttttcc c 71

<210> 31 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 31 ttctcggttg gtctctggcg gagccagtcg ctgtacgtgc tctccctatg taactcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 32 <2ll> 70 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 32 ttctcggttg gtctctggcg gagccaatcg gtgtacaata tcttcctctt gtgtatgatt 60 70 cgcttttccc 91 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

<210> 33 <211> 72 <2l2> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 33 ttctcggttg gtctctggcg gagccgttag ctggttagtt agtactagtc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

<210> 34 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 34 ttctcggttg gtctctggcg gagcaggtaa gcgattatgg ggttatcgtc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

<210> 35 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 35 ttctcggttg gtctctggcg gagctagtta catgaactaa tcgtggagtc ttgtgtatga 60 ttcgcttttc cc 72

<210> 36 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 36 ttctcggttg gtctctggcg gagcgatgta cagtatcgct atcgaaagag gctgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 37 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 37 ttctcggttg gtctctggcg gagcagtgtg cagtagtgtg atgtcagagt atcctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78 92 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

<210> 38 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 38 ttctcggttg gtctctggcg gagcagtgtg cggtagtgtg atctgagagt atcctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 39 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 39 ttctcggttg gtctctggcg gagcagtgtg tagtagtgtt acgatgggga cggtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 40 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 40 ttctcggttg gtctctggcg gagcagtgta cagtagtgtt cccggtagag ctattcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

< 210 > 41 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 41 ttctcggttg gtctctggcg gagcaatgtg cagtattgat atcgctggtg gtcatcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 42 <211> 76 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 42 ttctcggttg gtctctggcg gagcaagtgt acagtagttg cctacgctag tgtcttgtgt 60 atgattcgct tttccc 76 93 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

<210> 43 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 43 ttctcggttg gtctctggcg gagcaagtgt gcagtagtta ctcataagag accatcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 44 <211> 76 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 44 ttctcggttg gtctctggcg gagcaagtgt acagtagttg cctacgctag tgtcttgtgt 60 atgattcgct tttccc 76

<210> 45 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 45 ttctcggttg gtctctggcg gagcacaatg tgaagtattg gggtacgtca gtagtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78 <210> 46

<211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 46 ttctcggttg gtctctggcg gagccaagcg gaaacaatgt acagtattgg gatctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 47 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 47 ttctcggttg gtctctggcg gagcaaggcc attgatgtac agtatcaatg ctgctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78 94 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

<210> 48 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 48 ttctcggttg gtctctggcg gagcaattgg gaaacaatgt gcagtatgtg aaggtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 49 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 49 ttctcggttg gtctctggcg gagcaaatgg gaaacaatgt gcagtattgg aaggtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 50 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 50 ttctcggttg gtctctggcg gagcaagacc agacaatgta cagtattggc ctgatcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 51 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 51 ttctcggttg gtctctggcg gagctacgct gacaggccac gttttgtcat gattcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 52 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 95 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 4 Ο Ο > 52 ttctcggttg gtctctggcg gagcgagaac tccgttctta gcgtattgga gtcctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 53 <211> 79 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 53 ttctcggttg gtctctggcg gagcaggtgg gacattcttt gcgttatgtc tctgatcttg 60 tgtatgattc gcttttccc 79

<210> 54 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 54 ttctcggttg gtctctggcg gagcgggctc ggaacattct tagcgttttg ttcctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 55 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 55 ttctcggttg gtctctggcg gagcataggc aggggacatt gcaacctttt gtcatcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 56 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 56 ttctcggttg gtctctggcg gagcaattga agtgactttc tctgcgttta gtcgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78 <210> 57 <211> 78

<212> ADN <213> Sequência Artificial 96 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 57 ttctcggttg gtctctggcg gagcaggaat ctggggcatt ctttgcgttt tgcgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 58 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 58 ttctcggttg gtctctggcg gagcctcagg ataaggtcat tctaacgtta tgatcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 59 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 59 ttctcggttg gtctctggcg gagcgatcat ctcagagcat tcttagcgtt ttgttcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 60 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 60 ttctcggttg gtctctggcg gagcgatcat ctaagagcat tcttagcgtt ttggtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 61 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 61 ttctcggttg gtctctggcg gagccaaaac gagagagctt tctgtgcgtt tagctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 62 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial 97 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 62

ttctcggttg gtctctggcg gagcgaccaa gcgtcaagat attcaaacgt tttatcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 7B

<210> 63 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 63 ttctcggttg gtctctggcg gagcagaagc atacgaagac attccaacgt ttggtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 64 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 64 ttctcggttg gtctctggcg gagcaatcga ttgttgaaca ttctgacgtt ttgttcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 65 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 65 ttctcggttg gtctctggcg gagcagaagc atacgaagac attccaacgt tttgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 66 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 66 ttctcggttg gtctctggcg gagcagaagc atacgaagac attccaacgt tttgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 67 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial 98 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 67 gggaccagac aatgtacagt attgtctggt ccc 33

<210> 68 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 68 gccggccaat gtacagtatt ggccggc 27

<210> 69 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 69 ggccaatgta cagtattggc c 21

<210> 70 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 70 tggcggagcg atcatctcag agcattctta gcgttttgtt cttgtgtatg a 51

<210> 71 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <220> <221> base modificada <222> (32) <223> n na posição 32 é uma ligação glicerol <400> 71 gccggccaat gtacagtatt ggccggccgg cncggttatg acatgtaacc ggccg 55

<210> 72 <211> 81 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 99 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 4 Ο Ο > 72 tggcggagcg atcatctcag agcattctta gcgttttgtt cttgtgtatg atttgccggc 60 caatgtacag tattggccgg c 81

<210> 73 <211> 81 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 73 gccggccaat gtacagtatt ggccggcttt tggcggagcg atcatctcag agcattctta 60 gcgttttgtt cttgtgtatg a 81

<210> 74 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 74 aagaccagac aatgtacagt attggcctga 30 <210> 75 <211> 97

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 75 ttcgagcgtg aatctgaatt cgcggctagc cagcttttgc tggctagccg cggtgggaaa 60 ctgaggtagg tgttttcacc tacctcagtt tcccacc 97

<210> 76 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 76 ttctcggttg gtctctggcg gagctcaata cacaaattga tgtacagtgt cgattcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 77 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 100

ΕΡ 1 171 632/PT <400> 77 ttctcggttg gtctctggcg gagccattgg gccagaggaa cacaacctca acagtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 78 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 78 ttctcggttg gtctctggcg gagcgaatca tacgaagaca ttccaacgtt ttgtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 79 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 79 ttctcggttg gtctctggcg gagcggatca gacacgagac attgcggact tttgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 80 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 80 ttctcggttg gtctctggcg gagcgatcag acacgaaaca ttgcggactt ttgtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

< 210 > 81 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 81 ttctcggttg gtctctggcg gagcatacac gacgtcattc tagcgttttg acgtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 82 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 101 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ <400> 82 ttctcggttg gtctctggcg gagcagaaac aagaatcatt cttagcgttt tgattcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 83 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 83 ttctcggttg gtctctggcg gagcatacac gacgtcattc tagcgttttg tcttgtgtat 60 gattcgcttt tccc 74

<210> 84 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 84 ttctcggttg gtctctggcg gagcgaatcg gacatcaagg gttccagcag tgcttcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 85 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 85 ttctcggttg gtctctggcg gagcggatca gacacgaaac attgcggact tttgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 86 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 86 ttctcggttg gtctctggcg gagcatgcac agcgacattc tcagcgtttt gtcgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 87 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 102 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ <400> 87 ttctcggttg gtctctggcg gagcaggagc aagaatcatt cttagcgttt tgattcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 88 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 88 ttctcggttg gtctctggcg gagcagaagc aagaatcatt cttagcgttt tgattcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 89 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 89 ttctcggttg gtctctggcg gagcacgtcg ggggggcgtt gggacgggca gacgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 90 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 90 ttctcggttg gtctctggcg gagcacatcg ggggggcgtt gggacaggca gatgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 91 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 91 ttctcggttg gtctctggcg gagcatgtcg ggggggcgtt gggacgggca ggctcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 92 <211> 79 <212> ADN <213> Sequência Artificial 103 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 92 ttctcggttg gtctctggcg gagcacatcg ggggggcgtt ggggaaaggc agatgtcttg 60 tgtatgattc gcttttccc 79

<210> 93 <211> 79 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 93 ttctcggttg gtctctggcg gagcacgtcg ggggggccct ggggacgggc aggcgtcttg 60 tgtatgattc gcttttccc 79

<210> 94 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 94 ttctcggttg gtctctggcg gagcacaccg ggggggctgc gggcaaggcg ggtgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 95 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 95 ttctcggttg gtctctggcg gagcacaccg ggggggctgg gggaaaggcc ggtgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 96 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 96

ttctcggttg gtctctggcg gagcgcgagg gtgtggcgtg ggtggcgcga tcttgtgtat 60 gattcgcttt tccc 7A 104 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

<210> 97 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 97 ttctcggttg gtctctggcg gagcgoaagg gtgtggcgtg ggtggcgcga tcttgtgtat 60 çattcgcttt tccc 74

<210> 98 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 98 ttctcggttg gtctctggcg gagcacggga gggtgtggag tgggtggcgc gggctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 99 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 99 ttctcggttg gtctctggcg gagcacggga gggtgtggag tgggtggcgc gggctcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 100 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 100 ttctcggttg gtctctggcg gagcgaagca tacgaagaca ttccaacgtt ttgtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 101 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 105 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 4 0 0 > 101 ttctcggttg gtctctggcg gagcggatca gacacgagac attgcggact tttgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 102 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 102 ttctcggttg gtctctggcg gagcgaaagc atacgaagac attccaacgt tttgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 103 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 103 ttctcggttg gtctctggcg gagcgaagca tacgaagaca ttccaacgtt ttgtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 104 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 104 ttctcggttg gtctctggcg gagcagaagc atacgaagac attccaacgt tttgtcttgt 60 gtatgattcg cttttccc 78

<210> 105 <211> 76 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 105 ttctcggttg gtctctggcg gagcgaacat acgaagacat tccaacgttt tgtcttgtgt 60 atgattcgct tttccc 76

<210> 106 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial 106 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 106 ttctcggttg gtctctggcg gagcatacac gacgtcattc tagcgttttg acgtcttgtg 60 tatgattcgc ttttccc 77

<210> 107 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 4 0 0 > 107 tggcggagca caccgggggg gctgcgggca aggcgggtgt cttgtgtatg a 51

<210> 108 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 108 tggcggagca cgtcgggggg gcgttgggac gggcagacgt cttgtgtatg a 51

< 210 > 109 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 109 tggcggagca cgggagggtg tggagtgggt ggcgcgggct cttgtgtatg a 51

<210> 110 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <220> <221> base modificada <222> (1)..(10) <223> bases nas posições 1-10 estão ligadas por ligações fosforotioato <400> 110 tggcggagca caccgggggg gctgcgggca aggcgggtgt cttgtgtatg a 51

<210> 111 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial 107 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <220> <221> base modificada <222> (1)..(10) <223> bases nas posições 1-10 estão ligadas por ligações fosforotioato <400> 111 tggcggagca cgtcgggggg gcgttgggac gggcagacgt gttgtgtatg a 51

<210> 112 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <220> <221> base modificada <222> (1)..(10) <223> bases nas posições 1-10 estão ligadas por ligações fosforotioato < 4 0 0 > 112 tggcggagca cgggagggtg tggagtgggt ggcgcgggct gttgtgtatg a 51

<210> 113 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 113 acaccggggg ggctgcgggc aaggcgggtg 30

<210> 114 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 114 acgtcggggg ggcgttggga cgggcagacg 30

<210> 115 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 115 acgggagggt gtggagtggg tggcgcgggc 30 108 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ

<210> 116 <211> 63 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética <400> 116 acgtcggggg ggcgttggga cgggcagacg tttacgtcgg gggggcgttg ggacgggcag 60 acg 63

<210> 117 <211> 67 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 2 2 0 > <221> base modificada <222> (34) <223> n na posição 34 é uma ligação 1,3-glicerol <400> 117 acgtcggggg ggcgttggga cgggcagacg tttntttgca gacgggcagg gttgcggggg 60 ggctgca 67 < 210 > 118 <211> 63

<212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética < 2 2 0 > <221> base modificada <222> (31)..(33) <223> n nas posições 31 e 33 é uma unidade de hexaetilenoglicol; n na posição 32 é uma ligação 1,3-glicerol < 4 0 0 > 118 acgtcggggg ggcgttggga cgggcagacg nnngcagacg ggcagggttg cgggggggct 60 gca 63

<210> 119 <211> 64 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência Sintética 109 ΕΡ 1 171 632/ΡΤ < 4 0 0 > 119 atgcctaagt ttcgaacgcg gctagccagc ttttgctggc tagccgcgtt cgaaacttag 60 gcat 64

Lisboa, 2010-11-17

Claims (13)

1. ΕΡ 1 171 632/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico, em que a sequência nucleotídica do ácido nucleico: (i) é a sequência nucleotídica primária de uma de SEQ id NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID N0:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NOrlll, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, OU (ii) tem mais de 80% de homologia da sequência primária com uma das referidas SEQ ID NOs de (i), ou (iii) tem a correspondente sequência nucleotídica complementar com uma sequência de (i) ou (ii).
2. 2. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 em que o ácido nucleico é um de SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118.
3. 3. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o ácido nucleico é um ligando de ácido nucleico de elevada afinidade para com uma ADN-polimerase.
4. 4. Ligando de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 em que o ligando de ácido nucleico exibe ligação dependente da temperatura a uma ADN-polimerase.
5. 5. Ligando de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 ou 4 em que o ligando de ácido nucleico é um inibidor da capacidade da ADN-polimerase para catalisar a síntese de ADN.
6. 6. Ligando de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5 em que a ADN-polimerase é a polimerase TZ05. ΕΡ 1 171 632/ΡΤ 2/3
7. 7. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que o ácido nucleico é purificado e isolado.
8. 8. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em que o ácido nucleico é ADN de cadeia simples.
9. 9. utilização de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 parte (i) ou (ii) ou qualquer uma das reivindicações 2 a 8 dependente da reivindicação 1 parte (i) ou (ii) numa Reacção em Cadeia pela Polimerase (PCR).
10. 10. Estojo de Reacção em Cadeia pela Polimerase (PCR) compreendendo uma ADN-polimerase termoestável e um ligando de ácido nucleico que inibe a referida polimerase a temperaturas ambientes, permitindo contudo que a síntese ocorra durante os ciclos de temperatura elevada do processo de PCR, em que a sequência nucleotídica do ligando de ácido nucleico (i) é a sequência nucleotídica primária de uma de SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:lll, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, ou (ii) tem mais de 80% de homologia da sequência primária com uma das referidas SEQ ID NOs de (i).
11. 11. Estojo de PCR de acordo com a reivindicação 10 em que a ADN-polimerase é a polimerase TZ05.
12. 12. Método para realização da Reacção em Cadeia pela Polimerase (PCR) compreendendo: a) mistura de uma amostra contendo uma sequência de ácido nucleico a amplificar com iniciadores que sejam complementares às sequências que flanqueiam a sequência a amplificar, uma polimerase termoestável, e um ligando de ácido nucleico que é capaz de inibir a polimerase a 55°C mas permite que a polimerase seja activada a temperaturas acima de 55°C: e ΕΡ 1 171 632/ΡΤ 3/3 b) realização dos passos de PCR padrão de desnaturação do ácido nucleico alvo, ligação dos iniciadores ao ácido nucleico alvo, e síntese do ácido nucleico alvo, através de ciclos térmicos da mistura, em que a sequência nucleotídica do ligando de ácido nucleico: (i) é a sequência nucleotídica primária de uma de SEQ id NO: 89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:lll, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118, OU (ii) tem mais de 80% de homologia da sequência primária com uma das referidas SEQ ID NOs de (i).
13. 13. Método da reivindicação 12 em que a referida polimerase termoestável é a polimerase TZ05. Lisboa, 2010-11-17