JPS63294800A - Ｈｔｌｖウイルス及びｈｔｌｖ２ウイルスの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒトＴ細胞白血病ウィルス−タイプ■及び
ＩＩ　（ＨＴＬＶＩ及びＨＴＬＶ　ＩＩ　）の保存され
た核酸配列の存在又は不存在の検出のための方法に関す
る。この発明はまた、このような検出のための、プライ
マー及びラベルされたハイブリダイゼーションプローブ
を有するキットに関する。

〔従来の技術〕

ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）として知られて
いるＴ細胞熱帯レトロウィルスの一群は幾つかのＴ細胞
性異性腫瘍の発病に関与することが知られている。最近
３種類のタイプのＨＴＬＶが知られている。第一のタイ
プＩ　　（ＨＴＬＩＮ）は、日本、カリブ地方及びアフ
リカにおいて見出されたヒト成人Ｔ−細胞白血病一すン
バｌ１ｆｆｉ　（ＡＴＬＬ）に関連する発癌ウィルスで
ある。第二のタイプｎ　（Ｉ（ＴＬＶｎ）は、ハーリー
（ｈａｉｒｙ）細胞白血病のＴ−細胞変異体を有する２
人の患者から単離された発癌ウィルｔｈ　Ｉ　フ１．Ｎ
　１　嬉ｅｌ仲／７％　ＪＩＢ　ｌ蚤ｍ　Ｚ　／　ｔ、
ｗ　ｂ　１％　フｌ−＋　ｂＺ　辻Ｍｌ（１９８４）、
及びＲｏｓｅｎｂｌａｔｔ、Ｊ、Ｄ、等、ＮｅｗハＬム
虹Ｍｅｄ、、　１９８６年８月を参照のこと、第３のタ
イプ■（ＨＴＬＶ　Ｉ［［）はレンチウィルスであり、
そしてしばしば致命的な日和見感染をもたらす細胞性免
疫系の伝染性疾患である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）の病固体である。

ＡＩＤＳのごときＨＴＬＶ−関連ウィルスに対する抗体
を含む血清を同定するための最近の免疫診断試験（Ｇａ
１１ｏ等の米国特許ｍ４，５２０．１１３を参照のこと
）が潜在的に感染性の血液を除去するために血夜銀行に
おいて使用されている。　ＨＴＬＶ群のレトロウィルス
を検出するためのモノクローナル抗体を製造するために
有用なレトロウィルスポリペブチ・ドについては１９８
６年３月２７日に公開されたーｏ８６１０１８３４（カ
リホルニア大学）をも参照のこと、これらのウィルスは
有意な量のウィルス粒子を生産することなく　ＤＮ＾Ｎ
ｅ−として存在することができるため、ＨＴＬＶ　Ｉ及
び■−関連ウィルスを検出するための直接的な免疫的ア
プローチは、持続的に感木１＋／ｕ　Ｖ　１Ｐ＠１崗７
Ｌ１Ａ　”７１１１１１　庁ｖＪｙＮ　〜ｄｒＪ　Ｖ　
１−Ｗ−％Ｊ　帽＾をもたらさない、感染された組織及
び血液中のウィルス粒子の数は少ないため（ウィルス休
止のため）、感染細胞を受容Ｔ細胞系と共に同時培養し
ない限り、ウィルス粒子又はＲＮＡ／ＤＮＡを直接検出
することは不可能ではないにしても困難である。

１９８７年７月２８日発行のに、Ｍｕｌｌｉｓの米国特
許磁４．６８３，２０２は、ラベル化ＲＮＡ又はＤＮＡ
ハイブリダイゼーションプローブを用いることによる、
核酸配列の検出を容易にするためにそれを増幅する方法
を記載している。この方法においては、プライマーを用
いてプライマー延長生成物を得、この生成物を鋳型とし
て用いてヌクレオチドの存在下で追加の相補鎖を合成す
る。上記の特許出願はまた次の様な技法を記載している
。すなわち、この方法においては、プローブが目的の配
列にハイブリダイズした後制服酵素の添加によりハイブ
リドが目的の配列内の部位において開裂され、そして次
に制限消化物がラベル化断片について分析される。

１９８７年７月２８日発行の米国特許Ｎａ４．６８３，
１９４　、及びＨ，Ｂｒ１ｉｃｈ等及び５ａｉｋｉ寺、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　　＊　３　：１００８−１０
１２　（１９８５）は後者の技法を非常に詳細に記載し
ている０両特許出願は鎌形赤血球貧血及びβ−サラセミ
アのごとき遺伝的疾患の検出のためのこの方法の使用を
例示している。これらの方法、及び核酸配列を増幅する
ための方法はまた、５ａｉｋｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　
２３０．１３５０−１３５４　（１９８５）にも記載さ
れている。

Ｌａｎｄｒｙ等、Ｃｌ１ｎ、↓ａｂ　Ｍｅｄ　　（１９
８５）Ｊｌ−、５１３−５２９による総説論文は、ウィ
ルスの検出に使用される酸ハイブリダイゼーシヨンの分
野を記載している。　１９８６年３月１３日に公開され
た−０８６１０１５３５、及び１９８６年３月５日に公
開されたＥＰ　１７３．５２９はＨＴＬＶ　ＩＩＩの分
子クローニング、及び＾１０５を検出するためのプロー
ブとしての該クローンの使用を記載している。　１９８
６年３月５日に公開されたヨーロッパ特許出願−１７３
，３３９は、外来微生物による感染を検出するためにＤ
ＮＡプローブを用いる遺伝子分析を開示している。　１
９８６年６月２５日に公開されたＥＰ　１８５，４４４
は、細胞溶解物中１７）　ＨＴＬＶ　ＩＩウィルスノ検
出のためのプローブとして使用するための組換ペプチド
を開示している。　　０ｎｃｏｒ社は１９８６年９月に
、ＡＩＤＳウィルスを検出するための放射性血液試験を
開発した旨発表した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

発癌ウィルスＨＴＬＶ　Ｉ及び■を検出するためのハイ
ブリダイゼーシヨンプローブの使用は、持続的に感染し
ているがしかしウィルスを生産しない個体又は抗体陰性
であるが培養陽性である固体の同定、並びに感染された
細胞の検出を、ウィルスの培養を必要としないで可能に
するであろう。増幅によるウィルスのウィルス核核酸コ
ピー数の増加は感染された個体におけるウィルス核酸の
同定を促進するであろう。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ＨＴＬＶ　ｎ核酸もしくはＨＴＬＶ　ｎ核酸
、又はＨＴＬＶ　ｎ核酸及びＨＴＬＶ　ｎ核酸の両者の
単離物の間で実質的に保存されており、そしてＨＴＬＶ
　Ｉもしくプル虐りす０畿舎盲小２柄２飴尤挟荊ふ１プ
Ｒ１１，％ブイはＨＴＬＶ　Ｉｆ、又はＨＴＬＶ　Ｉ及
びＨＴＬＶ　Ｉｆ　（７）両者の単離体中の核酸に特異
的な核酸配列の、サンプル中での存在又は不存在を検出
又は監視するための方法であって、 （ａ）前記サンプルを、一緒に又は別々に、前記核酸配
列の各類のためのオリゴヌクレオチドプライマー、４種
類の異るヌクレオシドトリホスフェート及び重合用試薬
によりハイブリダイゼーション条件下で処理し、該核酸
配列の各類について、検出又は監視されるべき核酸配列
の各類に対して実質的に相補的である各プライマーのの
延長生成物が合成され、一方のプライマーから合成され
た延長生成物がその相補体から分離された場合に他方の
プライマーの延長生成物のための鋳型として機能するよ
うにし； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理して、検出され
るべき配列が存在する場合にはプライマー延長生成物を
それらの鋳型から分離せしめ；（ｃ）段階（ｂ）の生成
物をオリゴヌクレオチドプライマーで処理することによ
り、段段（ｂ）におい−工／４１１１　ｖＩ％−”Ｆ”
ＩＩＲＩ／ｊ　−Ｌ　４　Ｌｌ−−４（１−Ｃ−ス３６
Ｃ−１＋／　　Ｌ　／’＋３　Ｖ　’　％−ノライマー
延長生成物を合成して、検出されるべき配列が存在すれ
ばそれを増幅し；そして（ｄ）検出されるべき配列が存
在するとすればそれを検出する； ことを含んで成る方法に関する。

生成物を検出するための１つの方法は、段階（ｃ）の生
成物に、増幅された核酸配列とハイブリダイズすること
ができるラベルされたプローブを添加し；そして該プロ
ーブが核酸サンプル中の増幅された配列にハイブリダイ
ズしたか否かを決定することによる。１つの態様におい
て、この決定は、（１）前記プローブ中の配列内の部位
を認識する制限酵素により前記ハイブリダイズした混合
物を消化し；そして （２）この制限消化物がＨＴＬＶ　Ｉ又はＨＴＬＶ　Ｉ
Ｉ配列の存在と関連する制限断片を含有するか否かを決
定すること； により行うことができる。

段階（ａ）の前に、患者のサンプル中の核酸を抽出し、
抽出された核酸の混合物をサンプルとして実階に処理す
ることができる。さらに、段階（ａ）において処理する
サンプル中のウィルスをあらかじめ培養する必要はない
。

他の態様において、この発明は、ＨＴＬＶ　ｎ核酸もし
くはＨＴＬＶ　Ｉｎ核酸、又はＨＴＬＶ　ｎ核酸及びＨ
ＴＬＶ　Ｉｆｎ核酸両者の単離体の間で実質的に保存さ
れており、ＨＴＬＶ　ＩもしくはＨＴＬＶ　ＩＩ、又は
ＨＴＬＶ　Ｉ及びＨＴＬＶ　Ｉｆ　（７）両者の単離体
中の核酸に特異的な核酸配列のサンプル中での存在又は
不存在を検出又は監視するためのキットであって、 （ａ）検出されるべき核酸配列の各類のためのオリゴヌ
クレオチドプライマー（この１又は複数のプライマーは
各特定の核酸配列の各類に対して実質的に相補的であっ
て、一方のプライマーから合成された延長生成物がその
相補体から分離された場合、他方のプライマーの延長生
成物の合成のための鋳型として機能することができる）
：及び（ｂ）前記核酸配列とハイブリダイズすることが
できるラベル化プローブ； を含んで成るキットに関する。

好ましくは、このキットはさらに、重合用試薬４種類の
異るヌクレオチド、及びプローブと配列とのハイブリド
を検出するための手段を含む。

この発明の試験キットは研究試験、臨床試験、及び他の
診断的用途に用いることができる。さらに、このキット
はウィルスを培養することなく、感染された細胞をモニ
ターするために使用することができ、これは感染を解消
するために種々の療法剤により治療された患者をモニタ
ーするのに有用な特徴である。

この発明は、ＨＴＬＶ　Ｉ及びＨＴＬＶ　Ｉｆウィルス
のいずれか又は両者に関連する核酸配列を含有すること
が疑かわれるサンプル中の該核酸配列を検出し又はモー
ターするための方法及びキットに関する。

ＨＴＬＶ　Ｉ及びＨＴＬν■ウィルスの単離体は配列決
定されている。増幅されるべき配列は）ＩＴＬＶ　Ｉ及
び／又は■ウィルスに特異的でなければならない。すな
わち、ＨＴＬＶ　ＩＩＩウィルス又は非−ＨＴＬＶ　Ｉ
もしくは非−ＨＴＬＶ　ＩＩウィルスと反応してはなら
ない。

〔具体的な説明〕

ＨＴＬＶ　Ｉウィルスの全ゲノムは５ｅｉｋｉ等、ｈμ
二Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０　：　３
６１Ｂ−３６２２（１９８３）により与えられている。

　ＨＴＬν■ウィルスの全ゲノムはＳｈｉｍｏｔｏｈｎ
ｏ等、Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ＋　　旦２：３１０１−３１０５　（１９８５）に
より与えられている。

検出されるべき配列について適用される“実質的に保存
されている”という語は、配列が、検出されるべきウィ
ルス中の核酸に対して、重合用試薬及び４種類のヌクレ
オシドトリホスフェートの存在下で重合を開始するのに
十分に相補的でなければならないことを意味する。

用いられるプライマーは、ＨＴＬＶ　Ｉ及び／又は■ウ
ィルス中の有意な数の核酸上での重合の特異的な開始を
提供するための任意の長さ及び配列のオリゴヌクレオチ
ドである。具体的には、この明細書において使用する“
プライマー”なる語は、２個以上の、さらに好ましくは
３個より多くの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌ
クレオチドから成る分子であって、核酸鎖に対して実質
的に相補的であるプライマー延長生成物の合成が誘導さ
れる条件下に置かれた場合に、すなわちヌクレオシドト
リホスフェート及び重合用試薬、例えばＤＮＡポリメラ
ーゼ、の存在下、適当な温度及びｐＨにおいて、合成の
開始点として機能することができるものである。プライ
マーは好ましくは、増幅の最大効率のために単鎖である
が、しかし二本鎖であってもよい。二本鎖であれば、プ
ライマーをまず処理してその鎖に分離し、次にこれを用
いて延長生成物を調製する。好ましくは、プライマーは
オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは
、重合用誘導剤の存在下で延長生成物の合成を開始する
ために十分な長さを有しなければならない。プライマー
の正確な長さは、温度、緩衝液、ヌクレオチド組成及び
プライマーの由来等、多くの因子に依存するであろう。

この発明の目的のため、オリゴヌクレオチドプライマー
は典型的には１５〜２５又はこれより多くのヌクレオチ
ドを含有する。但しさらに少数のヌクレオチドを含有す
ることもできる。

この発明においてプライマーは、増幅されるべき特定の
配列の各類に対して“実質的に”相補的である様に選択
される。このことは、重合用試薬が機能する条件下でプ
ライマーがそれらの対応する鎖とハイブリダイズするた
めに十分に相補的でなければならないこと、すなわち、
プライマーが増幅されるべき鎖の配列との十分な相補性
を有することによりそれとハイブリダイズし、これによ
って他の鋳の延長生成物の合成のための鋳型を構成する
ことを意味する。プライマーは鎖との間に若干のミスマ
ツチを含有することができる。

ＨＴＬＶ　Ｉ及びＨＴＬν■ウィルスの間で実質的に保
存されている領域中から増幅されるべき配列を選択する
ことができる。従って、任意の適当な手段でプライマー
及びプローブを同定しそして選択することができる。こ
れは、ＨＴＬＶ　Ｉ及びＨＴＬＶ　Ｉｆウィルスゲノム
の公表されている核酸配列の領域を比較することにより
手仕事で行うことができる。　ＨＴＬＶ■及びＨＴＬＶ
　ＩｆウィルスのＸｅＩ域間の相同性がＳｈｉｍｏｔｏ
ｈｎｏ′ｈ４、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃ
ｉ、ＵｓＡ　　　８１　　：６６５７−６６０１（１９
８４）により公表されている。他の方法はコンピュータ
ープログラムを用いて配列を比較することである。この
目的のため、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより提供さ
れる、ドツトマトリクスを用いる基本コンピューターア
ルゴリズムの市販プログラムを用いるのが便利である。

このプログラムは、ＩＩＴＬＶ　Ｉ及びＨＴＬＶ　ＩＩ
ウィルスの核酸配列をインプットし、そして塩基対相同
性についてウィンドウサイズを決定することを含む、こ
のプログラムはグラフィックを用いて異る軸上の配列を
比較し、そして少なくとも実質的な相同性が存在する場
合にドツトが現われる。

好ましくは、ウィンドウサイズは６塩基より大である。

ゲノムのＸ領域は、２種類のウィルス中のコード領域間
で最も保存されている。これがコード領域間で最も保存
されているので、配列を検出するための、これがプロー
ブ及びプライマーを選択するための好ましい領域である
。蛋白質をコードしていないウィルスゲノムの領域を用
いて、使用すべきプライマーの配列を決定することもで
きる。

この発明の目的のため、感度及び特異性を最大にするた
めに、検出されるべき配列は、関連ウィルス間で、特に
プローブ及び制限酵素が使用される場合には制限酵素開
裂部位において実質的に保存されている、特異的ブライ
ミングを可能にするのに十分な長さを有する配列と相同
なものである。

増幅しそしてその後で生成物を検出するために使用され
る技法は米国特許＆４，６８３，２０１及び隘４．６８
３，１９４（前記）　　；　　５ａｉｋｉ等、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏ江（前掲）；及び５ａｉｋｉ等５ｃｉｅ
ｎｃｅ　（前掲）に詳細に記載されている。一般に、増
幅工程は特定の核酸配列を調製するための酵素的連鎖反
応を含み、用いられた反応段階の数に対して指数的量で
核酸配列が調製される。但し、要求される配列の末端が
十分に詳細に知られており、それとハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドプライマーを合成することができる
こと、及び連鎖反応を開始するために少量の配列が入手
可能であることが条件となる。一方のプライマーは負（
−）鎖に対して相補的であり、そして他方は正（＋）鎖
に対して相補的である。変性された核酸へのプライマー
のアニーリング、並びにこれに続く、ＤＮＡポリメラー
ゼＩの大断片（Ｋｌｅｎｏｗ）のごとき酵素及びヌクレ
オチドを用いる延長が標的配列を含有する新しく合成さ
れた十及び−鎖をもたらす。これらの新しく合成された
配列はさらにプライマーのための鋳型となるから、変性
、プライマーアニーリング及び延長の反復サイクルが、
プライマーにより規定される領域の指数的蓄積をもたら
す。連鎖反応の生成物は、使用された特定のプライマー
の末端に対応する末端を有する別個の核酸デュプレック
スである。

次に増幅工程を模式的に示すが、ここでは相補的な鎖〔
Ｓ゛〕及び〔Ｓ−〕を含んで成る所望の配列（Ｓ）を含
有する２本鎖ＤＮＡが核酸として使用される。第１の及
びこれに続く各反応サイクルの間、もとの鋳型上での各
オリゴヌクレオチドプライマーの延長が、プライマーの
１つのみにより停止する無限長の新しい５ｓＤＮＡ分子
生成物を生成する。今後“長生成物”と称するこれらの
生成物は直線的に蓄積するであろう、すなわち、ある数
のサイクルの後に存在する量がサイクル数に比例するで
あろう。

こうして生成された長生成物は、その後のサイクルの間
一方又は他方のオリゴヌクレオチドプライマーの鋳型と
して機能し、そして所望の配列〔Ｓ０〕又は〔Ｓ−〕の
分子を生成するであろう。

これらの分子もまた、一方又は他方のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの鋳型として機能してさらに〔Ｓ０〕及び
（Ｓ−）を生成し、そしてそれ故に、サイクル数に対し
て指数的速度での（Ｓ）の蓄積をもたらすであろう鎖反
応が継続され得る。

意図されるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
以外のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによ
り生成される副産物は自己触媒的ではなく、そしてそれ
故に直線的速度で蓄積する。

以下余白 増幅されるべき特異的配列 〔Ｓ〕 を次の様に模式的に表すことができる。

（Ｓ”）５’ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸ
ＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ３’（Ｓ−）３’ＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ５
’対応するオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りで
あろう。

プライマ−１：３　’　ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ　５　’
プライマ−２：５　’　　ＡＡＡＡＡＡＡＡ八八　３　
′従って、（Ｓ）を含有するＤＮＡ　＝ −−−−ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＡＡ＾八Ａ
ＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ−・−−・−・・Ｚ
ＺＺＺＺＺＺＺＺＺＺ２ＺＺ２ＺＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＺＺＺＺＺ
ＺＺ２ＺＺＺＺＺＺＺＺ−・−・が単鎖に分離され、そ
してその単鎖がプライマ−１及び２とハイブリダイズし
、４種類のデオキシリボヌ タレオシドトリホスフェートの存在下、ＤＮＡポリメラ
ーゼの存在下で次の延長反応が触媒され得る。

３′５′ 延長・ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧプラ イ マー −−・・２２２２２２２２２２２２ ｚｚｚ ＺＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＺＺＺＺｚｚｚｚ ｚｚｚｚｚｚ一伊畢 もとの鋳型鎖゛ もとの鋳型鎖一 ●・・・ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ ｚｚｚ ｚＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧｚｚｚｚｚｚ ｚｚｚｚ ＺＺＺＺ２ｚ●−争 プライマー ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ延長 ５′３′ 生成した２つのデュブレックスの変性の後、次の生成物
が生ずる。

３′ ５′ −−●ｌｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ ｚｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ新たに合成
された 生成物ｌ ５′ ３′ ●●−●ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ ｚｚｚｚＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ●●参ψ もとの鋳型鎖９ ３′ ５′ ●●ｅ●２２２２２２２２２２２２ ｚｚｚＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｅ赤●争 もとの鋳型鎖一 ５′ ３′ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＾ ｘＸχＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣｚｚｚｚｚ
ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｌ−●● 新たに合成 された長生成物２ 次のサイクルにおいて、これら４つの鎖をプライマ−１
及び２とハイブリダイズせしめれば、重合用試薬は次の
反応を触媒するであろう。

ブライマ−２５′ 八ＡＡＡＡＡＡＡＡ八 ここまで延長 ３’−−＠ｌ２２２２２２２２２２２２２２２２２２Ｔ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹ ＹＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ５′ 新たに合成された長生成物 延長電 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ５′ プライマー１ ５’・−−−ｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸ ＸＸＸＸＸＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＺ ｚｚｚ ｚｚｚｚｚｚ ｚｚｚｚＴ● ３′ もとの鋳型鎖゛ ブライマ−２５′ ＡＡＡＡＡＡ＾＾＾八 ・延長 ３′・・・・２２２２２２２２２２２２２２２２２２Ｔ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＹＹＹＹ ＹＹＹＹＹＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ｚｚｚｚｚｚｚｚｚ２９暢１１５′ もとの鋳型鎖一 ここまで延長・ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ５′プライマー１
５′ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣｚＺｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚｚ２壽儂３
′新たに合成された長生成物２ １つのプライマーのオリゴヌクレオチド配列で停止する
各類及び他方の相補鎖は生成することが所望される特定
の核酸ＩＩ（（Ｓ）であることがわかる。

この工程の段階は無限に反復することができ、プライマ
ー１及び２、誘導剤及び存在するヌクレオチドによって
のみ限定される。もとのヌクレオチドは複製されないの
で、その量は全工程を通じて一定に維持される。長生酸
物はもとの核酸からのみ生成されるのでその量は直線的
に増加する。

特異的配列の量は指数的に増加する。すなわち、特異的
配列は支配的な種となる。これは次の表に示される。こ
の表は、各サイクルの効率を１００％として、ｎサイク
ル後に存在する種の相対量を示す。

以下余白 ０〜ｎサイ　ル′の２　′の １５　　　　１　　　１５　　　３２．７５２゜２０　
　　　１　　　２０　　１．０４８．５５５ｎ　　　　
　ｌ　　　　　ｎ　　　　（２’−ｎ−１）鋳型として
単鎖ヌクレオチドが使用される場合、サイクル当り１個
のみの長生酸物が生成する。

この明細書において使用する場合、“制限エンドヌクレ
アーゼ”及び“制限酵素”なる語は、特定のヌクレオチ
ド配列において又はその近傍において２本鎖ＤＮＡを切
断する細菌酵素に関する。

この発明のプライマーは次の規準により選択する、これ
は考慮すべき要素であるが、これらのみではなく、又は
絶対的なものではない、第一に、プライマーはＨＴＬＶ
　Ｉ及びＨＴＬＶ　ＩＦゲノムの保存された領域から選
択される。Ｘｆｉｌ域がコード領域の内の最も保存され
ている領域であり、そしてそれ故に最初の研究のために
Ｘ領域を選択した。

第二に、プライマーは、試験を傷つけると予想されるウ
ィルスゲノムのあらゆる配列、例えば５ｔａｒｃｉｃｈ
等、５ｃｉｅｎｃｅ、　’ｌ＠７：　　５３８−５４０
（１９８５）により公表されているＨＴＬＶ　ＩＩＩの
配列との相同性を欠くものである。

第三に、プライマーは好ましくは増幅される核酸中に二
次構造を形成しないものであり、この二次構造は増幅酵
素、例えばＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはに
Ｉｅｎｏ−断片と称されるＤＮＡポリメラーゼの部分に
よる延長を妨害するであろう、これは、約１５重量％ま
での、好ましくは５〜１５重量％のジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）を増幅媒体中に用いることにより、そし
て／又は増幅温度を３０〜４０℃に、好ましくは３５〜
４０℃に上昇せしめることにより達成することができる
。

第四に、プライマーは好ましくは、約５０％のグアニン
及びシトシンを含有し、そしてプライマーの３′に多数
の連続するアデニン及びチミジン残基を含有しないもの
である。これは不安定なハイブリドをもたらす、最後に
、増幅された生成物が制限酵素を用いて検出される場合
、プローブは内部の（非−末端）制限部位を有さなけれ
ばならない。

オリゴヌクレオチドは、例えば、前記のホスホトリエス
テル法及びホスホジエステル法、又はこれらの自動化さ
れた方法を用いて調製することができる。１つのこの様
な自動化された方法においては〜Ｂｅａｕｃａｇｅ等、
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）
、２２７１８５９−１８６２により記載されているよう
に、ジエチルホスホラミダイトが出発物質として使用さ
れ、そして合成される。修飾された固体支持体上でオリ
ゴヌクレオチドを合成するための１つの方法は米国特許
Ｎ１４．４５８．０６６に記載されている。生物源から
単離されたプライマー（例えば、制限エンドヌクレアー
ゼ消化物）を使用することもできる。

ＨＴＬＶ　Ｉ及び／又はＨＴＬＶ　ＩＩと関連する特定
の核酸配列を含有しているか、又は含有していることが
疑われるものである限り、精製された形又は精製されて
いない形のあらゆる核酸源を出発核酸として使用するこ
とができる。すなわち、この方法においては、ＤＮＡ又
はメツセンジャーＲＮＡのごときＲＮＡを使用すること
ができ、このＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖でも二本鎖でも
よい、　　ＲＮＡが鋳型として使用される場合、そのＲ
ＮＡをＤＮＡに逆転写するために最適な酵素及び／又は
条件が使用される。さらに、それぞれの鎖を１本ずつ含
むＤＮＡ　−ＲＮ＾ハイブリドを用いることもできる。

これらの核酸の任意の混合物、あるいは同一の又は異る
プライマーを使用する予備増幅反応から生成した核酸を
使用することもできる。

増幅されるべき特定の核酸配列は大きな分子の一部分で
あることができ、あるいは個別の分子として存在し、特
定の配列が核酸全体を構成していてもよい、増幅される
べき配列が最初に純粋な形で存在する必要はな（、例え
ば複雑な混合物の小部分、例えば全体ヒ）　ＤＮＡ中に
含有されるウィルス−コード配列の一部分であってもよ
い、出発核酸は、同一の又は異る１個より多くの特定の
核酸配列を含有することができる。従って、この発明の
方法は、１つの特定の核酸配列を多量に調製するための
みならず、同一の又は異る核酸分子上に位置する１個よ
り多くの特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用
である。

核酸配列は、任意の入手源、例えば動物のごとき高等生
物からの天然ＤＮＡ又はＲＮＡから得ることができる。

　　ＤＮＡ又はＲＮＡは体サンプル、例えば血液、組織
材料、例えば絨毛、又は羊膜細胞から種々の技法により
、例えばＭａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１
ｏｎｉｎ　　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕ
ａｌ（−ニーヨーク：コール・トスプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−１１９８２）２８０−２８１　、により
記載されている技法により抽出することができる。

サンプルが不純な、例えば血漿又は血液である場合、増
幅の前にそれを、サンプルの細胞、液体、組織、ウィル
スカプセル又は動物細胞膜を開き、そして核酸の鎖を露
出しそして／又は分離するために有効な一定量の試薬に
より処理することができる。鎖を露出しそして分離する
ためのこの細胞溶解及び核酸変性段階は、さらに容易に
増幅が起こることを可能にするであろう、さらに、サン
プルを増幅試薬により処理する前に、サンプル中のＨＴ
ＬＶ　Ｉ及びＨＴＬＶ　Ｉｆウィルスを培養する必要が
ない。

サンプルを遠心分離してバフィーコートを得、次にこれ
をカラムに通して白血球を得ることができる０次に、白
血球を処理してそれから核酸を抽出し、増幅用サンプル
として使用することができる。

この発明の方法により、任意の特定の核酸配列を調製す
ることができる。必要なことは、配列の両端の十分な数
の塩基が十分に詳細に知られており、所望の配列の異る
鎖と、その配列にそう一定の相対位置においてハイブリ
ダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーであっ
て、それがその鋳型（相補体）から分離された場合に規
定された長さの核酸への他のプライマーの延長のための
鋳型として機能することができるもの、が調製され得る
ことである。配列の両端における塩基についての知識が
多くなるに従って、標的核酸配列のためのプライマーの
特異性も大きくなることができ、そしてそれ故に工程の
効率が高くなる。今後使用する場合、プライマーなる語
は、特に、増幅されるべき断片の末端配列に関する情報
がいく分子明瞭な場合、複数のプライマーを意味するこ
とができると理解すべきである。例えば、核酸配列が蛋
白質配列情報から得られる場合、遺伝子コードの縮重に
基くすべての可能性あるコドン変化を代表する配列を含
有するプライマーの集合が各類について用いられるであ
ろう。この集合からの１つのプライマーが、増刷される
べき目的の配列の末端と共に実質的に保存されるであろ
う。

特定の核酸配列が、鋳型としてその配列を含有する核酸
を用いることにより調製される。サンプルの標的核酸配
列が２つの鎖を含有する場合、それを鋳型として使用す
る前に、別個の段階として、又はプライマー延長生成物
の合成と同時に、核酸の鎖を分離する必要がある。この
鎖分離は、ある適当な変性条件、例えば物理的、化学的
又は酵素的手段を用いて達成することができ、この発明
において使用する“変性”なる語はこの様な手段のすべ
てを包含する。核酸の鎖を分離するための１つの物理的
方法は、核酸をそれが変性するまで加熱することである
。典型的な加熱変性は、約１〜１０分間にわたる約８０
〜１０５℃の温度を用いる。

鎖の分離はまた、ヘリカーゼと称される酵素類、又はへ
りカーゼ活性を有しそしてリボＡＴＰの存在下でＤＮＡ
を変性せしめることが知られている酵素Ｒｅｃ＾からの
１つの酵素により誘導することもできる。へりカーゼを
用いて核酸の鎖を分離するために適当な反応条件は、に
ｕｈｎ　Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ。

川Ｈ−（ｌｕ並扛組旦胆」植Ｒ■、剣し６３（１９７８
）により記載されており、そしてＲｅｃＡを使用するた
めの技法はＣ，Ｒａｄｄｉｎｇ、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、　１６　：　　４０５−３７（１９Ｂ２
）に総説されている。

増幅されるべき配列を含むもとの核酸配列が単鎖である
場合、その相補体が１又は２個のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いることにより合成される。適切な１つの
プライマーが添加される場合、そのプライマー、重合用
試薬及び下記の４種類のヌクレオシドトリホスフェート
の存在下でプライマー延長生成物が合成される。この生
成物は単鎖核酸と部分的に相補的であり、そして核酸鎖
とハイブリダイズして異る長さのデュプレックスを形成
し、このデュプレックスが次に前記のようにして単鎖に
分離されて、鎖に相補的な２つの分離された単鎖を生成
するであろう。あるいは、２つの適切なプライマーを単
鎖核酸に加え、そして反応を行うことができる。

オリゴヌクレオチドが増幅されるべき配列を構成する場
合、生成するプライマー延長生成物はもとの核酸の鎖と
完全に又は実質的に完全に相補的であり、そしてそれと
ハイブリダイズして同じ長さの鎖のデュプレックスを形
成し、これが単鎖分子に分離されるであろう。

核酸がもともと二本鎖であろうと単鎖であろうと、核酸
の相補的な２つの鎖が分離された場合、それらの鎖は追
加の核酸鎖の合成のための鋳型として使用され得る状態
となる。この合成は、鋳型へのプライマーのハイブリダ
イゼーションが起ることを許容する条件下で行われる。

一般にこれは、緩衝化水溶液中で、好ましくは７〜９の
ｐＨにおいて、最も好ましくはおよそｐＨ８において起
こる。

好ましくは、一定モル過剰の（ゲノム核酸の場合には通
常、プライマー：鋳型が１０”：ｌ）　２種類のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、分離された鋳型鎖を含有す
る緩衝液に加える。しかしながら、この発明の方法が診
断用に用いられる場合には相補的鎖の量は知られず、従
って相補鎖の量に対するプライマーの量は正確には決定
され得ないと理解される。しかしながら実際には、増幅
されるべき配列が複雑な長い核酸鎖の混合物中に含まれ
る場合、添加されるプライマーの量は相補鎖（鋳型）の
量に比べてモル過剰であろう、工程の効率を改良するた
めには大モル過剰が好ましい。

デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰもまた、プライマーとは
別個に又はこれと一緒に、適当な量で合成混合物中に添
加され、そして得られた溶液が約９０〜１００℃にて、
約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間加熱される。こ
の加熱期間の後、溶液を室温に放冷する。この温度はプ
ライマーハイブリダイゼーションのために好ましい。こ
の冷却された混合物に、プライマー延長反応を行うため
の適当な試薬（この明細書において重合用試薬と称する
）を添加し、そして当業界において知られている条件下
で反応を行う。重合用試薬は、もしそれが熱安定性であ
れば、他の試薬と一緒に添加することもできる。この合
成反応は室温から、重合用試薬がそれ以上では機能しな
くなる温度までにおいて起こることができる。すなわち
、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが試薬として使用される
場合、温度は一般に約４０℃より高くはない。最も便利
には、反応は室温にて行う。

重合用試薬はプライマー延長生成物の合成を達成するた
めに機能する任意の化合物又は系であることができ、こ
れには酵素が包含される。この目的のために適当な酵素
には、例えばＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ、コリ
ＤＮＡポリメラーゼ！のＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４　ＤＮ
Ａポリメラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ、
ポリメラーゼミニ−ティン、逆転写酵素、及び他の酵素
、例えば熱安定性酵素（すなわち、変性を生じさせるた
めに十分に上昇した温度に暴露した後にプライマー延長
を行う酵素）が今まれ、これらは適切な態様でのヌクレ
オチドの結合を促進し、各核酸鎖に相補的なプライマー
延長生成物を生成せしめるであろう、一般に、合成は各
プライマーの３′末端から始まりそして鋳型鎖にそって
合成が停止するまで５′方向に進行し、異る長さの分子
を生成する。しかしながら、上記の同じ方法を用いて、
５′末端において合成を開始しそして他の方向に進行せ
しめる重合用試薬も存在し得る。

新たに合成された鎖及びその相補的核酸鎖は、標的配列
が存在すれば前記のハイブリダイゼーション条件下で二
本鎖分子を形成し、そしてこのハイブリドがこの方法の
次の段階において使用される０次の段階において、ハイ
ブリダイゼーション条件下で処理されたサンプルを、前
記のいずれかの方法を用いて変性条件にかけ、標的配列
が存在するとすれば単鎖分子を得る。

新しい核酸が単鎖分子上に合成される。前記の条件下に
反応が進行することが必要であれば、追加の重合用試薬
、ヌクレオチド及びプライマーを添加することができる
。やはり、合成は各オリゴヌクレオチドの一端から開始
されそして鋳型の単鎖にそって進行し、追加の核酸を生
成するであろう、この段階の後、反応生成物の半分は２
つのプライマーにより挾まれた特定の核酸配列から成る
であろう。

検出のために必要な程度に標的核酸配列を増幅するため
に必要な回数だけ、変性及び延長生成物合成の段階を反
復する。さらに詳細に後記するように、生産された特定
の核酸配列の量が指数的に蓄積するであろう。

最初の核酸又は核酸の混合物から１種類より多くの特定
の核酸配列を調製することが望まれる場合には、適切な
数の異るオリゴヌクレオチドプライマーを用いる０例え
ば、２種類の異る特定の核酸配列が調製されるべき場合
、４種類のプライマーが使用される。２つのプライマー
は特定の核酸配列の１つに特異的であり、他の２つのプ
ライマーは第二の特定の核酸配列に特異的である。この
ようにして、２種類の異る特定の配列を、この発明の方
法により指数的に調製することができる。

この発明は、各段階の後に新たな試薬を加えながら段階
的に、すべての試薬を最初の段階で加えて同時的に、あ
るいは所定数の段階の後に新たな試薬を加えながら半ば
段階的且つ半ば同時的に行うことができる。熱感受性酵
素の場合のように、重合用試薬を不活性化するであろう
変性方法、例えば熱を用いる場合、各鎖分離段階の後に
試薬を更新する必要がある。鎖分離段階に酵素的手段を
用いる場合、同時的方法を用いることができる。

同時的方法においては、反応混合物は、所望の配列を含
有する核酸鎖に加えて、鎖分離酵素（例えば、へりカー
ゼ）、該鎖分離酵素のための適切なエネルギー源、例え
ばｒＡＴＰ、　４種類のヌクレオシドトリホスフェート
、モル過剰のオリゴヌクレオチドプライマー、及び重合
用試薬、例えばＥ、コリＤＮＡ　ポリメラーゼＩのＫｌ
ｅｎｏｗ断片を含有することができる。

同時的方法において変性のために加熱が使用される場合
、核酸が平衡状態の単鎖及び二本鎖から成る温度である
上昇した温度、例えば試薬に依存して５０℃〜１０５℃
において機能するであろう熱安定性試薬、例えば熱安定
性ポリメラーゼが用いられる。長さの短い核酸のために
は約４０℃〜５０℃の低い温度を用いることができる。

上限温度は、酵素が分解する温度、又はそれより高温で
はプライマーハイプリダイゼーシッンが十分なレベルで
起らない温度に依存するであろう、この様な熱安定性酵
素は例えばＡ、Ｓ、Ｋａｌｅｄｉｎ等、肚並…鮭ｎ＋　
４５＋６４４−６５１　（１９８０）により記載されて
いる。この定温反応が継続するためには、プライマーは
お互の６〜８塩基対以内にそれらの３′末端を有する。

この方法の各段階は、すべての試薬が最初に存在するに
もかかわらず逐次的に生ずる。必要に応じて追加の材料
を添加することができる。所望の量の特定の核酸配列を
生じさせるのに適切な時間が経過した後、既知の方法で
酵素を不活性化することにより、又は反応成分を分離す
ることにより反応を停止させることができる。

温度サイクル反応を用いて増幅を行うこともでき、この
場合熱安定性酵素を用いて延長、アニーリング及び変性
を行うために温度を次第に上昇せしめる。

この発明の方法は連続的に行うことができる。

自動化された方法゛の具体例においては、変性領域、試
薬添加領域、及び反応領域を通して反応を循環すること
ができる。他の態様においては、プライマー延長生成物
の合成のために使用される酵素をカラム中に固定化する
ことができる。他の反応成分はポンプによりカラム及び
加熱コイルを直列的に通して連続的に循環せしめ、そし
て酵素を不活性化することなく繰り返し変性せしめるこ
とができる。

増幅された生成物は、放射性プローブを用いることなく
サザンプロットによってそれを分析することにより、検
出することができる。この様な方法においては、例えば
、非常に低レベルのＨＴＬＶ　Ｉ及び／又は■を含有す
る末梢血リンパ球からのＤＮＡの小サンプルを増幅し、
そしてサザンプロット法により分析する。高レベルの増
幅されたシグナルにより非放射性プローブの使用が容易
になる。

検出のための他の方法は、増幅された核酸配列とハイブ
リダイズすることができるラベルされたプローブを用い
、そして該プローブがハイブリダイズしたか否かを決定
することを含む。この様なプローブは）ＩＴＬＶ　Ｉ及
び／又はＨＴＬν■ウィルスのゲノムからの実質的に保
存された核酸配列を必然的に含有し、そしてプライマー
及び増幅される配列について前記したようにして選択さ
れる。好ましくはＨＴＬＶ　Ｉ及び／又はＨＴＬＶ　Ｉ
ＩのＸＮ域から選択される。

１つのこの様なプローブ法は米国特許患４．６８３，１
９４（前掲）に記載されている様なオリゴマー制限酵素
技法を含む、この方法においては、増幅された核酸を変
性せしめ、そして標的配列（プライマーにより含有され
る特定の保存された領域を含む）に特異的にハイブリダ
イズし且つ注目の少なくとも１つの制限部位を含むラベ
ルされたオリゴヌクレオチドに溶液中でハイブリダイズ
せしめる。標的及びプローブ間に形成されたデュプレッ
クスが制限部位を再構成し、そして制限酵素、例えばシ
ｄＩ、Ｐｖｕ　ＩＦ、又はＦｌｉｎｆ　Ｉで開裂された
場合、ゲル電気泳動により全長プローブから容易に分離
され得るラベルされた制限断片を放出する。

次に、得られたゲルをオートラジオグラフィーにかける
。この方法による増幅された生成物の分析は迅速である
。すなわち数時間で結果が得られる。

好ましくは、プローブは３０〜４５塩基の長さを有し、
そしてラベルされている。また、制限酵素としてシ佳■
、ハ遺■、又はＨｉｎｆ　Ｉが好ましい。

増幅された生成物を分析するために使用することができ
る他の方法はドツトプロット法である。

この方法においては、増幅されたサンプルを膜に直接ス
ポットし、そしてラベル化プローブとハイブリダイズせ
しめる。このラベルは、分光法、光化学法、又は生化学
的、免疫化学的もしくは化学的手段により検出すること
ができる。この例には酵素、例えばアルカリ性ホスファ
ターゼ、放射性ラベル、例えば３２Ｐ１蛍光ラベル、又
はビオチンが含まれる。１つの態様においては、このプ
ローブはビオチン化プローブであって、ビオチンが次の
式： ％式％ （式中、ＹはＯ，ＮＨ又はＮ−Ｃｌｌ０であり、Ｘは１
〜４の数であり、そしてｙは２〜４の数である）で表わ
されるスペーサーアームにより連結されている。このス
ペーサーアームは、次の式：で表わされるプソラレン成
分に連結される。プソラレン成分は、Ｃｏｕｒａｇｅ−
Ｔｅｂｂｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ。

肛吐肚し肢田、６９７（１９８２）　１−５により記載
されているように、“ギャップを有するサークル”プロ
ーブに入り込みそして架橋し、ここでギャップを有する
サークルの単鎖ハイブリダイゼーション領域はプライマ
ー間に含まれる領域を含む。このビオチン化及びドツト
プロット法の詳細は、米国特許隘４，５８２．７８９及
び尚４．６１７．２６１にさらに詳細に記載されている
。ビオチン化プローブは放射性同位元素の使用の必要性
を排除する。

別の方法として、プローブをまず膜に、必要であればプ
レハイプリダイゼーシッン条件下でスポットし、そして
次にこの前処理された膜に増幅された生成物を、“逆”
ドツトプロット方式で、ハイブリダイゼーション条件下
で加える。

このドツトプロット法は前記のオリゴマー制限酵素法に
比べて時間を要する。膜をまずプレハイブリダイズせし
め、そして次にプローブとハイブリダイズさせなければ
ならないからである。しかしながら、急速に変異するウ
ィルスについては限定された塩基のミスマツチを含有す
る配列が適切なハイブリダイゼーション条件下でなお検
出されるという利点をドツトプロット法は有し、これに
対してオリゴマー制限酵素法においては、制限部位の破
壊をもたらす変異を有するウィルスはウィルスの可変性
の故に検出されないであろう。

この発明はまた、使用される各プライマー及びプローブ
の容器を有する包装された多容器ユニットを有するキッ
トに関する。このキットはまた、プライマー延長生成物
を合成するための重合用試薬例えば酵素の容器、４種類
のヌクレオシドトリホスフェートのそれぞれのための容
器、及びラベルを検出する手段（ラベルがビオチンの場
合には、例えばアビジン−酵素複合体）の容器を含有す
ることができる。さらに、キットはまた、ＨＴＬＶ　Ｉ
及び／又はＨＴＬＶ　ｎウィルスゲノムの配列を有する
１又は複数の核酸を含有する陽性対照の容器、及び／又
はこの様な核酸を含まない陰性対照の容器を有すること
ができる。さらに、キットは、標的配列を含有する核酸
をプローブの配列中に含まれる部位において開裂するこ
とができる各制限酵素の容器を有することができる。

次に、例によりこの発明の種々の態様を例示するが、こ
の発明の範囲がこれらに限定されるものではない。この
例において、特にことわらない限り、すべての部及び％
は固体については重量により、そして液体については容
量による。温度は℃で示す。

■上 増幅されるべき目的配列は、Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｏｎｃ
ｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ、５ＵＮＹ　Ｕｐｓｔａｔｅ　
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　シラカス、ニューヨ
ーク１３２１０のＢｅｒｎａｒｄ　Ｐｏ１ｅｓｚ博士か
ら入手した１１個の印を付されたＤＮＡサンプル、１９
４８に、３４２，３６７．３６１．３６８Ｈ，２０７，
３０７，３０８Ｂ、３２３．３２６及び３４０中に含ま
れていた。プライマー及びプローブは、Ｓｈｉｍｏｔｏ
ｈｎｏ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ　８１：６６５７−６６６１　（１９８４）　ニ
より同定されたＨＴＬｖ■ウィルス及びわずかなミスマ
ツチを伴うＨＴＬＶ　ＩＩウィルスのＸｆ、７Ｊ域を用
いて選択した。

まず、標識を付されたサンプルはＰｏｅｉｓｚ博士によ
りインターロイキンの存在下で培養された。次に、下記
の方法によりサンプルからＤＮＡを抽出した。

１．１〜２Ｘ１０”個の培養細胞を試薬管中で、２０＋
ｄのドデシル硫酸ナトリウム細胞溶解緩衝液（１％ＳＯ
５，１５０ａｅＭ　ＮａｃＡ　、２５ｍＭ　Ｎａｚ　Ｅ
ＤＴＡ）により溶解した。

２、試験管当り５■／　ｔｔｌのプロテイナーゼに溶液
４００１１１を加え、そして３７℃にて一夜インキユベ
ートした。

３、　　ＯＮ八をフヱノール、及びＣＨ（１３：イソア
ミルアルコールにより逐次抽出し、次にエタノールで沈
澱せしめた。

４、　　ＤＮＡをガラス棒に巻き取り、そしてＩＸＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１　ｍＭ　Ｎａｚ　Ｅ
ＤＴＡ、ｐｔ１７．５）中に再懸濁し、そしてＩＸＴＥ
緩衝液に対して十分に透析した。

！、ブラ！仁！二！ヒＥ皮 それぞれ５Ｋ４３及び５Ｋ４４と称する２種類のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドプライマー：５’−ＣＧＧＡ
ＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＴＧＴ−３’　　（ＳＫ４
３）５’−ＧＡＧＣＣＧＡＴＡＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＣ
Ｇ−３’　（ＳＫ４４）を前記の方法により合成した。

Ａ、自動合成法 Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ　（Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１）２２　：
　１８５９−１８６２）に従って合成されたジエチルホ
スホラミダイムを次々に、ビオサーチＳＡＭ−１を用い
て、ヌクレオチドで誘導体化された調節された孔のガラ
ス支持体に縮合せしめた。この方法は、ジクロロメタン
中トリクロロ酢酸による脱トリチル化、活性化陽子供与
体としてベンゾトリアゾールを用いる縮合、並びにテト
ラヒドロフラン及びピリジン中無水酢酸及びジメチルア
ミノピリジンを用いるキャッピングを含む。サイクル時
間は約３０分であった。各段階の収量は実質的に定量的
であり、そしてトリチル化の間に放出されるジメトキシ
トリチルアルコールの収集及び分光測定により決定され
た。

以下余白 Ｂ、オリゴデオキシリボヌクレオチドの脱保護及び精製
方法 固体支持体をカラムから取り出し、そして１−の濃水酸
化アンモニウムに室温にて４時間密閉チューブ中で暴露
した。次に支持体を濾過により除去し、そして部分的に
保護されたオリゴデオキシヌクレオチドを含有する溶液
を５時間５５℃にした。アンモニアを除去し、そして残
渣を分取用ポリアクリルアミドゲルに適用した。　３０
ν／１にて９０分間電気泳動を行い、その後で生成物を
含有するバンドを蛍光プレートのＵｖシャドイングによ
り同定した。バンドを切り出し、そして１＋ｎ７の蒸留
水で４℃にて一夜溶出した。この溶液をＡ　１　ｔｅｃ
ｈＲＰ１８カラムに適用し、そして１％酢酸アンモニウ
ム（ｐＨ６，０）緩衝液中アセトニトリルの７〜１３％
のグラジェントにより溶出した。溶出液を２６０Ｈｍで
のＵＶ吸収によりモニターし、そして１亥当する画分を
集め、一定容量中でのＵＶ吸収により定量し、そして真
空遠心機中室温にて乾燥した。

以下余白 Ｃ，オリゴデオキシリボヌクレオチドの特徴付は 精製されたオリゴヌクレオチドの試験アリコートをポリ
ヌクレオチドキナーゼ及びγ−３仲−＾ＴＰを用いて′
Ｐでラベルした。ラベルされた化合物を、５０Ｖ／ｅ１
ｍにて４５分間の電気泳動の後１４〜２０％ポリアクリ
ルアミドゲルのオートラジオグラフィーにより試験した
。この方法により分子量が確認される。ヘビ毒ジェステ
ラーゼ及び細菌アルカリ性ホスファターゼの使用による
オリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレオシドへの消
化、並びにこれに続＜、逆相ＨＰＬＣカラム及び１０％
アセトニトリル、１％酢酸アンモニウム移動相を用いる
前記ヌクレオシドの分離及び容量により塩基組成を決定
した。

■、１Ｎ反庭 Ｐｏ１ｅｓｚ博士からの１１個の標識を付されたＤＮＡ
サンプルのそれぞれからのＤＮＡ　Ｉ　ｎを、１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＩ　　（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ塩
化ナトリウム及び１０ｍＭ塩化マグネシウムから成る緩
衝液であってＩＱＯｐｍｏｌｅのプライマー５Ｋ４３．
１００ｐａ＋ｏｌｅのプライマー５Ｋ４４並びに１５０
ｎｍずつのｄＡＴＰ　、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ及び
ＴＴＰを含有するもの１００ｕ！に加えた。

得られた溶液を１０分間１００℃に加熱し、そして２分
間室温に冷却し、次にＥ、コリＤＮＡポリメラーゼのＫ
ｌｅｎｏｗ断片１ユニツトを含有する２Ｊｉを加えた。

反応を室温にて２分間進行せしめ、次に９５℃にて２分
間加熱することにより酵素を不活性化した０段階当り２
分間ずつの変性、プライマーのアニーリング、及びＫｌ
ｅｎｏｗにより延長、並びにポリメラーゼの添加を１９
回反復した。

次の配列： ５’−”ＡＣＧＣＣＣＴＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＣ
ＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧ−３’（Ｉは
ラベルを表わす）を有するラベル化ＤＮＡプローブＳに
４５を、■、において記載した方法に従って合成した。

１Ｑｐａ＋ｏｌｅのプローブを４ユニツトのＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ及び１０ｐｍｏｔｅのＴ−”Ｐ−Ａ
ＴＰ（約７２００　Ｃｉ　／　ｍｓｏ　ｌ　ｅ）と、７
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）、１０ｔａＭ　ＭｇＣ
１ｔ　、　１．５ｍＭスペルミン及び２．５１ジチオス
レイトールを含有する４０ｍの反応容量中で３７℃にて
９０分間接触せしめることによりラベルした。次に、全
容量を２５ｍＭ　ＢＤＴＡにより１００Ｉ１１に調整し
、そしてアリコートを採り、ＡＴＣ沈澱により比活性を
決定した。ラベルされたプローブを５ｐｅｅｄ−ｖａｃ
を用いて濃縮し、そしてＴｒｉｓ　−硼酸−ＥＤＴＡ　
（ＴＨＥ）緩衝液（８ｈＭ　Ｔｒｉｓ、８９ｍＭ硼酸、
２．５ａ＋Ｍ　ＢＤＴＡ、　ｐＨ８，３）中１８％ポリ
アクリルアミドゲル（アクリルアミド：　　ＢＩＳ＝１
９：　　１）上での電気泳動により５００ｖｈｒで精製
した。オートラジオグラフィーにより位置を決定した後
、ラベル化プローブを含有するゲルの部分を切り出し、
破砕し、そして０．２−のＴＥ緩衝液に４℃にて一夜溶
出した。

反応生成物のＴＣＡ沈澱は、比活性が２　Ｃｉ／＋＋ｍ
ｏｌｅでありそして最終濃度が２０ｐｍｏｌｅ／−であ
ることを示した。

以下余白 ■、　　　れたゲノムＤＮＡのプローブとのバイブＡ、
溶液中での検出 １０ｄの増幅されたＤＮ＾（７１ｍｇのゲノムＤＮＡの
増幅同等物を含有する）を１．５−のマイクロフユージ
チューブに分配し、そして１０μｌのＴＥ緩衝液により
３０ｕ１の最終容量とした。サンプルを９５℃にて１０
分間変性した。０．０２ｐｍｏｌｅの５Ｋ４５プローブ
を含有する０、６Ｍ　Ｎａｃｌ　１０μｌをチューブに
加え、ゆっくり混合し、そして鉱油を重層し、そしてす
ぐに５６℃のヒートブロックに移して１時間置いた。

１０ｕ！の５（１ｗＭ　ＭｇＣｌ　２及び１　ｔｒｌの
シＬＬ　Ｉ　　（８−Ｌ−１−／ト）を加え、そして再
アニールしたＤＮＡを５６℃にて３０分間消化した。４
Ｉｌｌの７５ｉ＋Ｍ　ＢＤＴＡ及び６Ｉの追跡色素を加
えて最終容量６０４とした。鉱油を０．２−のクロロホ
ルムで抽出し、そして１３ｍの反応混合物（〜１５ｎｇ
のゲノムＤＮＡ）をＨｏｅｆｆｅｒ　５Ｅ２００装置中
の３０％ポリアクリルアミドミニ−ゲル（１９：　１）
上に負荷した。ゲルを約３００ｖにて１時間、ブロムフ
ェノールブルー色素が原点から３、０　ｅｌｌ泳動する
まで電気泳動した。ゲルの先端１．５Ｃ１１を除去し、
そして残りのゲルを少なくとも一夜、２個の強化スクリ
ーンを用いて一７０℃にて暴露した。

Ｂ、ドー　プロ・・　に　る 増幅されたＤＮＡをＮａＯＨとＨａｔ　ＥＤＴＡとの緩
衝液に加えて、最終濃度を４００ｍＭ　ＮａＯＨ及び２
５ｍＭ　Ｎａｇ　ＥＤＴＡとし、そして最終容量を２０
Ｑｕ１とした。

イオン性の膜を水中で湿し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄイム
ノプロット真空装置に入れた０次に真空を引き、装置を
平衡にし、そして前記のＤＮＡサンプルを膜に負荷した
。膜を２０　Ｘ　５ＳＰＥで洗浄した。　５ＳＰＥはＮ
ａＣ１％リン酸ナトリウム、ＥＤＴ＾及びＮａＯＨから
成る標準緩衝液である０次に、膜を取り出し、そして２
０　Ｘ　５ＳＰＥに入れて２〜５分間攪拌した０次に、
膜を乾燥し、ＵＶ光に６分間暴露してＤＮＡを膜に架橋
せしめた。

次に、膜を５−のフレハイブリダイゼーション溶液（３
Ｘ５ＳＰＥ、　５　ｘデンハート溶液、０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）　、３０％ホルムアミド、
ガラス蒸留水により１０Ｉ＆ｌにする〕に入れ４２℃に
て３０分間攪拌した。次に、プレハイブリダイゼーショ
ン溶液を絞り取り、そして５−のハイブリダイゼーショ
ン溶液（ブレハイブリダイゼーション溶液にＱ、５ｐｍ
ｏｌｅの５Ｋ４５を添加したもの）を加えた。４２℃に
て１時間、攪拌しながらインキュベーションを行った。

ハイブリダイゼーションの後、２ｘＳＳＰＥ、　０．１
％ＳＤＳ中で１５分間ずつ２回、室温にて攪拌しながら
洗浄した０次に、これを０．２　Ｘ　５ＳＰＥ、０．１
％ＳＤＳにより５０℃にて５分間、攪拌しながら洗浄し
た。膜を乾燥し、そしてフィルムに暴露した。

■、益果坐挟計 溶液中及び膜上での両方の検出のオートラジオグラフは
、サンプ／１，３４２（ＨＴＬＶ　Ｉ　）　、３６７（
ＩＩＴＬＶ　Ｉ　）、３６１（ＨＴＬＶ　Ｉ　）　、３
０７（ＨＴＬＶ　Ｉ　）　、３０８Ｂ　（Ｉｔ几νＩ）
、３２３　（ＨＴＬＶ　ｎ　）及び３２６（ＨＴＬＶ　
Ｉ　）中ニ＋７）　ミＩＩＬＴＶ　Ｉ及びＩＩ　ＤＮＡ
配列が存在することを示した。これらのサンプルのすべ
てがＨＴＬＶ　Ｉ又はＨＴＬＶ　ｎ陽性ＤＮＡであるこ
とが後で見出された。他の４個のサンプルは、１９４８
に一白血病患者（ウィルス単離されない）からのＤＮＡ
、２０７−攻撃的白血病患者（皮膚包含）からのＤＮＡ
、３４〇−攻撃的白血病患者（２０７とは異る）からの
もの、及び３６８Ｈ−ＨＴＬＶ　ＩＩＩ　テあった。

従って、使用したプライマーはＤＮＡを増幅することが
可能であり、プローブが配列を実際に検出することを可
能にした。

３７℃にて１０％ＤＭＳＯの存在下での増幅（二次構造
の形成を最少にする）もまた）ＩＴＬＶ　Ｉ及び■サン
プルを陽性サンプルとして示した。

ＨＴＬＶ　１ ｐｏｌｊｉｌ域３３６５−３４８３を増幅するＨＴＬＶ
　Ｉ−特異的プライマーを用いて、例１の増幅／ハイブ
リダイゼーション／消化実験を行た。これらのプライマ
ーは次の２種類であった。

５’−ＣＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＧＣ−３
’　（ＳＫ５４）５’−ＣＧＧＣＡＧＴＴＣＴＧＴＧＡ
ＣＡＧＧＧ−３’　（ＳＫ５５）下記のプローブ５Ｋ５
６を制限酵素Ｐｖｕ　Ｕと共に使用した。

５’−ＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＡＡＴＧＡＴ丁ＧＡ
ＡＣＴＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴ−３’　　（ＳＫ５６）オ
ートラジオグラフは、ＨＴＬＶＩ　　ＤＮＡ配列が、後
でＨＴＬＶ　ｎ陽性［ＩＮＡとして同定されたサンプル
中にのみ存在することを示した。

１１ＴＬＶ　ＩＩ ｐｏｌｊｉＪｌ域４１９８−４３００を増幅するＨＴＬ
Ｖ　ＩＩ−特異的プライマーを用いて、例１の増幅／ハ
イブリダイゼーション／消化実験を行った０次のプロー
ブを使用した。

５’−ＡＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧ−３
’　（ＳＫ５Ｂ）５゛−↑ＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡＡＧＧ
ＧＧＡＧＣＴ−３’　（ＳＫ５９）下記のプローブ５Ｋ
６０を制限酵素）１ｉｎｆ　Ｉと共に使用した。

５−ＴＡＡＧＧＧＡＧＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＧ
ＡＡＧＧＴＧＧａＡＡＴＴＧＧＧｔＣ−３１（ＳＫ６０
）オートラジオグラフは、１ｌＴＬＶｎ　ＤＮＡ配列が
後でＨＴＬＶ　ｎ陽性［ＩＮＡとして同定されたサンプ
ル３２３中にのみ存在することを示した。

以下金白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＨＴＬＶ I 核酸もしくはＨＴＬＶII核酸、又はＨ
   ＴＬＶ I 核酸及びＨＴＬＶII核酸の両者の単離物の間
   で実質的に保存されており、そしてＨＴＬＶ I もしく
   はＨＴＬＶII、又はＨＴＬＶ I 及びＨＴＬＶIIの両者
   の単離体中の核酸に特異的な核酸配列の、サンプル中で
   の存在又は不存在を検出又は監視するための方法であっ
   て、（ａ）前記サンプルを、一緒に又は別々に、前記核
   酸配列の各鎖のためのオリゴヌクレオチドプライマー、
   ４種類の異るヌクレオシドトリホスフェート及び重合用
   試薬によりハイブリダイゼーション条件下で処理し、該
   核酸配列の各鎖について、検出又は監視されるべき核酸
   配列の各鎖に対して実質的に相補的である各プライマー
   のの延長生成物が合成され、一方のプライマーから合成
   された延長生成物がその相補体から分離された場合に他
   方のプライマーの延長生成物のための鋳型として機能す
   るようにし； （ｂ）前記サンプルを変性条件下で処理して、検出され
   るべき配列が存在する場合にはプライマー延長生成物を
   それらの鋳型から分離せしめ；（ｃ）段階（ｂ）の生成
   物をオリゴヌクレオチドプライマーで処理することによ
   り、段段（ｂ）において生成した単鎖のそれぞれを鋳型
   として用いてプライマー延長生成物を合成して、検出さ
   れるべき配列が存在すればそれを増幅し；そして （ｄ）検出されるべき配列が存在するとすればそれを検
   出する； ことを含んで成る方法。 ２、段階（ｄ）が、 （１）前記の増幅された核酸配列とハイブリダイズする
   ことができるラベル化プローブを段階（ｃ）の生成物に
   添加し；そして （２）前記プローブが前記核酸サンプル中の増幅された
   配列にハイブリダイズするか否かを決定する段階を含ん
   で成る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１回反復し、そ
   して前記プライマーがＨＴＬＶ I ゲノム及びＨＴＬＶ
   IIゲノムのＸ領域から選択されたものである、特許請求
   の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４、重合のための前記試薬がＥ．コリ　ＤＮＡポリメラ
   ーゼ、Ｅ．コリ　ＤＮＡポリメラーゼ I のＫｌｅｎｏ
   ｗ断片、逆転写酵素、又は核酸を変性するのに十分な温
   度に暴露した後に、段階（ａ）及び（ｃ）の間に反応温
   度において前記延長生成物を生成するためのその酵素活
   性を維持している酵素から成る群から選ばれた酵素であ
   る、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記
   載の方法。 ５、段階（ａ）の前に、前記サンプルを該サンプル中に
   含まれる核酸の鎖を露出せしめることができる試薬で処
   理し、そして鎖を同時に又は逐次に分離する、特許請求
   の範囲第１項〜第４項に記載の方法。 ６、段階（２）が、 （１）段階（ｄ）からのハイブリダイズした混合物を、
   前記プローブ中の配列内の部位を認識する制限酵素によ
   り消化し；そして （２）制限消化物が、検出されるべきＨＴＬＶ I 及び
   ／又はＨＴＬＶII配列の存在と関連する制限断片を含有
   するか否かを検出する； 段階を含んで成る、特許請求の範囲第２項に記載の方法
   。 ７、段階（１）及び（２）において、ＨＴＬＶ I 及び
   ／又はＨＴＬＶIIウイルスゲノムの配列を有する１又は
   複数の核酸を含有する陽性対照、及び／又はＨＴＬＶ
   I 及び／又はＨＴＬＶIIウィルス間からの配列を有する
   核酸を含有しない陰性対照を用いる、特許請求の範囲第
   ６項に記載の方法。 ８、ＨＴＬＶ I 核酸もしくはＨＴＬＶII核酸又はＨＴ
   ＬＶ I 核酸及びＨＴＬＶII核酸の両者の単離物間で実
   質的に保存されており、そしてＨＴＬＶ I もしくはＨ
   ＴＬＶII、又はＨＴＬＶ I 及びＨＴＬＶIIの両者の単
   離体中の核酸に特異的な、増幅された核酸配列を含有す
   る組成物であって、 （ａ）未増幅の形の前記核酸配列を含有するサンプルを
   、一緒に又は別々に、該核酸配列の各鎖のためのオリゴ
   ヌクレオチドプライマー、４種類の異るヌクレオジドト
   リホスフェート及び重合用試薬によりハイブリダイゼー
   ション条件下で処理し、該ヌクレオチド配列の各鎖につ
   いて、検出又は監視されるべき核酸配列の各鎖に対して
   実質的に相補的な各プライマーの延長生成物が合成され
   、一方のプライマーから合成された延長生成物がその相
   補体から分離された場合に他方のプライマーの延長生成
   物のための鋳型として機能するようにし；（ｂ）前記プ
   ライマー延長生成物を、該延長生成物がその上で合成さ
   れた鋳型から分離することにより、単鎖分子を生成せし
   め；そして （ｃ）段階（ｂ）の生成物をオリゴヌクレオチドプライ
   マーにより処理して、段階（ｂ）において生成した単鎖
   を鋳型として使用してプライマー延長生成物が合成され
   るようにし、こうして前記核酸配列の増幅を得る、こと
   により製造したものである当該組成物。 ９、ＨＴＬＶ I 核酸もしくはＨＴＬＶII核酸、又はＨ
   ＴＬＶ I 核酸及びＨＴＬＶII核酸の両者の単離体の間
   で実質的に保存されており、ＨＴＬＶ I もしくはＨＴ
   ＬＶII、又はＨＴＬＶ I 及びＨＴＬＶIIの両者の単離
   体中の核酸に特異的な核酸配列のサンプル中での存在又
   は不存在を検出又は監視するためのキットであって、（
   ａ）検出されるべき核酸配列の各鎖のためのオリゴヌク
   レオチドプライマー（この１又は複数のプライマーは各
   特定の核酸配列の各鎖に対して実質的に相補的であって
   、一方のプライマーから合成された延長生成物がその相
   補体から分離された場合、他方のプライマーの延長生成
   物の合成のための鋳型として機能することができる）；
   及び（ｂ）前記核酸配列とハイブリダイズすることがで
   きるラベル化プローブ； を含んで成るキット。 １０、重合用試薬、４種類のヌクレオシドトリホスフェ
   ートのそれぞれ、及び前記プローブと前記配列とのハイ
   ブリドを検出するための手段をさらに含んで成る特許請
   求の範囲第９項に記載のキット。